Name: Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-12T10:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj test siły działania limfocytów T CAR w czasie rzeczywistym przeciwko nowotworom litym i hematologicznym. Ta metoda umożliwia ilościową ocenę cytolizy komórek nowotworowych przez komórki efektorowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują ProMab Biotechnologies i ACEA Biosciences za dostarczenie odczynników i narzędzi wykorzystanych w tym badaniu.

1. Generacja lentiwirusa kodującego CAR
UWAGA: Po zakończeniu budowy plazmidu specyficznego dla limfocytów T CAR (CD47 i inne), lentiwirusowe CAR są generowane zgodnie ze standardową procedurą, przy użyciu 293 komórek FT, mieszanki opakowań lentiwirusowych i środków transfekcyjnych (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z opisem29. Następnie należy użyć ilościowego zestawu do reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) i termocyklera (patrz tabela materiałów) w celu określenia miana wirusa poprzez pomiar ilości lentiwirusowego RNA zgodnie z protokołem producenta. Ważne jest, aby wszystkie zabiegi lentiwirusowe były przeprowadzane ściśle zgodnie z wymogami bezpieczeństwa.
<ol>
	<li>Wysiewać 15 x 106 HEK293FT komórek w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco i inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C na jednym naczyniu o średnicy 150 mm w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	<li>Przygotuj dwie probówki o pojemności 15 ml z kompleksem transfekcji. Pierwsza probówka zawiera plazmidowe DNA wektora lentiwirusowego (5 μg) i mieszaninę opakowaniową lentiwirusa (22,5 μg) w 2,5 ml roztworu do rozcieńczania transfekcji. Druga probówka zawiera 82,5 μl odczynnika do transfekcji w 2,5 ml roztworu do rozcieńczania transfekcji (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Odpipetować zawartość probówki 1 do probówki 2 i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Przenieść zawartość probówki kroplami do naczynia z HEK293FT komórkami i inkubować próbkę przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze o stężeniu 5%CO2</li>.
	<li>Następnego dnia zastąpić istniejącą pożywkę 19 ml świeżej pożywki hodowlanej DMEM i kontynuować inkubację komórek przez noc w nawilżonym inkubatorze 5%CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieś pożywkę z naczynia do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Probówkę z pożywką zawierającą wirusa należy przechowywać w lodówce.</li>
	<li>Powtórz powyższą procedurę, dodając świeży DMEM i zbierając go ponownie po 1 dniu.</li>
	<li>Połącz dwie kolekcje pożywek w jedną probówkę wirówkową. Odwirować probówkę o stężeniu 2 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść większość supernatantu zawierającego lentiwirusa do ultraprzezroczystej probówki wirówkowej. Pozostawić minimalną objętość, około 1 ml, supernatantu, aby uniknąć naruszenia osadu, który może zawierać komórki i/lub zanieczyszczenia.</li>
	<li>Ultraodwirować wyżej oczyszczony supernatant w temperaturze 110 000 x g przez 100 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant i delikatnie dodać 100 μl pożywki DMEM do osadu wirusa na dnie probówki. Pozostaw probówkę na lodzie na 15 minut. Delikatnie wymieszać roztwór i podzielić roztwór lentiwirusa na porcje do wstępnie schłodzonych sterylnych probówek. Probówki z wirusem należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Użyj ilościowego zestawu RT-PCR, aby określić miano lentiwirusa zgodnie z protokołem producenta, który ekstrahuje i mierzy lentiwirusowe RNA.</li>
</ol>
2. Generowanie i rozbudowa komórek CAR T
<ol>
	<li>Aktywować uprzednio zamrożone ludzkie PBMC (około 1 x 106 do 2 x 106 komórek) w 1 ml pożywki z komórek T CAR z równą liczbą mikrogranulek pokrytych CD3/CD28 (patrz tabela materiałów) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Rozmrozić podwielokrotność zapasu lentiwirusa na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 1 μl środka zwiększającego transdukcję do studzienki z komórkami i wymieszaj.</li>
	<li>Dodaj lentiwirusa do komórek przy wielokrotności infekcji (MOI) 5:1 i delikatnie wymieszaj. Następnego dnia powtórz ten krok (24 godziny po pierwszej transdukcji).</li>
	<li>Monitoruj wzrost limfocytów T co 2-3 dni. Dodaj więcej świeżej pożywki z komórek T CAR, aby utrzymać komórki w gęstości 1 x 106 do 2 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Zamrażać limfocyty CAR T za pomocą standardowego protokołu przy użyciu roztworu do zamrażania (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Rozmrozić limfocyty CAR T przy użyciu standardowej metody i wstępnie wyhodować je w pożywce CAR T-cell przez około ~ 2-4 godziny z IL-2 (300 jednostek / ml) przed zastosowaniem ich do testu.</li>
</ol>
3. Wykrywanie ekspresji CAR za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przenieś 3 x 10 5 limfocytów T CAR i nietransdukowane limfocyty T do dwóch oddzielnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować probówki o masie 300 x g przez 2 minuty i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) zawierającego 1% surowicy ludzkiej.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl roztworu komórkowego do dwóch probówek FACS z polistyrenu o pojemności 5 ml i trzymać probówki na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Dodaj 1 μl biotynylowanego koziego anty-mysiego F(ab')2 do jednej probówki każdego typu komórek. Następnie dodaj 2 μl przeciwciała anty-znacznikowego znakowanego PE (patrz tabela materiałów) do drugiej probówki każdego typu komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj je na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyć komórki 3 ml buforu FACS w każdej probówce i odwirować probówki o stężeniu 300 x g przez 5 minut; odrzucić supernatanty i bardzo krótko przemieszać lub krótko wstrząsnąć probówkami w celu ponownego zawieszenia komórek w pozostałej cieczy.</li>
	<li>Dodać 2 μl anty-CD3 APC i 2 μl roztworu przeciwciała 7-AAD (patrz tabela materiałów) do każdej probówki. Do probówki z komórkami wybarwionymi anty-F(ab')2 Ab dodać 1 μl streptawidyny znakowanej PE. Krótko wymieszaj i inkubuj probówki na lodzie jeszcze przez 30 minut.</li>
	<li>Użyj buforu FACS, aby ponownie umyć komórki, jak opisano w kroku 3.5 i dodaj dodatkowe 200 μl buforu FACS do każdej probówki.</li>
	<li>Użyj cytometrii przepływowej do analizy komórek, najpierw bramkując na komórkach T na wykresie rozproszenia do przodu w stosunku do wykresu punktowego bocznego, a następnie bramkując na żywych komórkach (7-AAD-ujemnych) na wykresie CD3 w porównaniu z 7-AAD. Ostatnim krokiem jest analiza anty-tag, anty-ScFv lub anty-F(ab')2 w porównaniu z CD3.</li>
</ol>
4. Test siły cytolizy w czasie rzeczywistym
UWAGA: Wykonaj test RTCA zgodnie z warunkami zalecanymi przez producenta. Krótko mówiąc, najpierw umieść komórki docelowe w dołkach E-Plate, a następnie dodaj komórki CAR T następnego dnia. Aktywność cytolizy limfocytów CAR T w stosunku do komórek docelowych jest monitorowana w czasie rzeczywistym. Limfocyty T i imitowane limfocyty T (pozorowane limfocyty T CAR) są używane jako negatywne kontrole komórek efektorowych. Poniższy protokół opisuje test siły działania cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym dla przylegających linii komórek nowotworowych.
<ol>
	<li>Dodać 100 μl pożywki do hodowli komórek docelowych do każdego dołka płytki xCELLigence E-Plate, umieścić płytkę wewnątrz urządzenia xCELLigence i wykonać odczyt tła. Następnie przenieś E-Plate do kaptura do hodowli tkankowej w celu wysiewu komórek.</li>
	<li>Użyj standardowego protokołu do trypsynizacji docelowych komórek rakowych z urządzenia do hodowli. Następnie przenieś komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj świeżą pożywkę hodowlaną do 15 ml. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut przy 200 x g. Odrzucić supernatant, dodać 5 ml świeżej pożywki i użyć pipety serologicznej, aby delikatnie zawiesić osad komórkowy. Policz gęstość żywych komórek za pomocą hemocytometru i mikroskopu.</li>
	<li>Odpowiednio dostosuj gęstość komórek, a następnie dodaj 100 l zawiesiny komórek do każdego dołka E-Plate. Docelowa liczba komórek wynosi zwykle około 10 000 komórek / studzienkę dla przylegających linii komórkowych (BxPC3, Hela-CD19 i SKOV3) lub 30 000 komórek / studnię dla komórek zawiesinowych, takich jak Raji (poniżej znajdują się szczegółowe informacje dotyczące wstępnego powlekania studzienek przeciwciałami w celu związania płynnych komórek rakowych).</li>
	<li>Równoważ E-Plate w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby komórki równomiernie osiadły na dnie studzienki (jest to krytyczne; nie pomijaj tego kroku).</li>
	<li>Umieść E-Plate w przyrządzie xCELLigence wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych i rozpocznij pomiar impedancji, wyświetlanej jako wskaźnik komórki w funkcji czasu, automatycznie co 15 minut.</li>
	<li>Następnego dnia przygotuj efektorowe limfocyty CAR T. Upewnij się, że przygotowałeś odpowiednie kontrole (tj. pozorowane limfocyty CAR T, nietransdukowane kontrolne limfocyty T i/lub niepowiązane limfocyty CAR T) z wyprzedzeniem, aby upewnić się, że wszystkie komórki są gotowe w tym samym czasie. Dostosuj komórki efektorowe i komórki kontrolne do odpowiedniej gęstości i przygotuj seryjne rozcieńczenia, aby zapewnić osiągnięcie pożądanych proporcji E:T po dodaniu 100 μl zawiesiny komórek efektorowych do każdej studzienki w kroku 9.</li>
	<li>Wstrzymaj gromadzenie danych xCELLigence i przenieś płytkę E-Plate z inkubatora do okapu do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Usunąć 100 μl pożywki z każdej studzienki. Ilość pozostałego podłoża w każdym dołku wynosi teraz 100 μL.</li>
	<li>Dodać 100 μl seryjnie rozcieńczonych efektorowych komórek CAR T lub innych komórek kontrolnych (tj. makiet komórek CAR T), aby osiągnąć pożądane proporcje E:T.</li>
	<li>Równoważ E-Plate w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić osięcie komórek efektorowych, a następnie umieść E-Plate z powrotem w przyrządzie xCELLigence. Wznawianie pobierania danych.</li>
	<li>W razie potrzeby w kluczowych momentach można wstrzymać gromadzenie danych xCELLigence i usunąć płytkę w celu pobrania małych próbek do analizy za pomocą testów ortogonalnych (tj. pomiaru produkcji cytokin za pomocą testu ELISA lub cytometrii przepływowej).</li>
	<li>W eksperymencie z limfocytami T CAR EGFR-GITR-CD3 zmierz wydajność INFγ za pomocą zestawu ELISA (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta; patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA DOTYCZĄCA STOSOWANIA NOWOTWORÓW PŁYNNYCH: W celu badania nieprzylegających hematologicznych komórek nowotworowych, przed dodaniem komórek, studzienki E-Plate są najpierw powlekane przeciwciałem, które jest specyficzne dla antygenu, który ulega ekspresji na powierzchni komórek rakowych. W przypadku linii komórek Raji B stosuje się odczynnik do wiązania na bazie anty-CD40 (patrz zestaw do oznaczania zabijania płynnych nowotworów w Tabeli materiałów). Poniżej znajduje się procedura powlekania płyty:</li>
	<li>Rozcieńczyć odczynnik do wiązania (anty-CD40) buforem do wiązania do stężenia 4 μg/ml.</li>
	<li>Pracując w kapturze do hodowli tkankowych, dodaj 50 μl rozcieńczonego odczynnika do wiązania do każdego dołka E-Plate. Pozostaw E-Plate w temperaturze pokojowej lub w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 3 godziny.</li>
	<li>Usuń odczynnik do wiązania i umyj E-Plate co najmniej 2x buforem do mycia. W tym momencie E-Plate jest gotowy do wysiewu komórek docelowych Raji (30 000 komórek/studzienkę).</li>
	<li>Kontynuuj krok 4.1 (powyżej), aby wykonać pozostałą część procedury.</li>
</ol>

<ol><li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+Therapy%3A+A+New+Era+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell Therapy: A New Era in Cancer Immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li>
<li>June, C. H., O’Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li>
<li>FDA. FDA approval brings first gene therapy to the United States. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm">https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm</a> (2017).</li>
<li>FDA. FDA approves CAR-T cell therapy to treat adults with certain types of large B-cell lymphoma. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm">https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm</a> (2017).</li>
<li>Celgene. Celgene Corporation and bluebird bio Announce bb2121 Anti-BCMA CAR-T Cell Therapy Has Been Granted Breakthrough Therapy Designation from FDA and Prime Eligibility from EMA for Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://ir.celgene.com/releasedetail.cfm?releaseid=1049014">http://ir.celgene.com/releasedetail.cfm?releaseid=1049014</a> (2017).</li>
<li>Liu, B., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+trials+of+CAR-T+cells+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical trials of CAR-T cells in China.</a> Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 166(2017).</li>
<li>Fry, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD22-targeted+CAR+T+cells+induce+remission+in+B-ALL+that+is+naive+or+resistant+to+CD19-targeted+CAR+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that is naive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy.</a> Nature Medicine. 24 (1), 20-28 (2018).</li>
<li>Yang, Y., Jacoby, E., Fry, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+of+allogeneic+donor-derived+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities of allogeneic donor-derived CAR T cells.</a> Current Opinion in Hematology. 22 (6), 509-515 (2015).</li>
<li>Celyad. Celyad Announces FDA Acceptance of IND Application for CYAD-101, a First-in-Class Non-Gene Edited Allogeneic CAR-T Candidate. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate">https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate</a> (2017).</li>
<li>Sheridan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogene+and+Celularity+move+CAR-T+therapy+off+the+shelf%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Allogene and Celularity move CAR-T therapy off the shelf.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 375-377 (2018).</li>
<li>D’Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cells%3A+the+long+and+winding+road+to+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors.</a> Cell Death & Disease. 9 (3), 282(2018).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy%3A+A+feasibility+strategy+for+CAR-T+cell+therapy+in+the+treatment+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Combination therapy: A feasibility strategy for CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors.</a> Oncology Letters. 16 (2), 2063-2070 (2018).</li>
<li>Xia, A. L., Wang, X. C., Lu, Y. J., Lu, X. J., Sun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric-antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cell+therapy+for+solid+tumors%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Chimeric-antigen receptor T (CAR-T) cell therapy for solid tumors: challenges and opportunities.</a> Oncotarget. 8 (52), 90521-90531 (2017).</li>
<li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li>
<li>Newick, K., O'Brien, S., Moon, E., Albelda, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+Cell+Therapy+for+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">CAR T Cell Therapy for Solid Tumors.</a> Annual Review of Medicine. 68, 139-152 (2017).</li>
<li>de Wolf, C., van de Bovenkamp, M., Hoefnagel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+perspective+on+in+vitro+potency+assays+for+human+mesenchymal+stromal+cells+used+in+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Regulatory perspective on in vitro potency assays for human mesenchymal stromal cells used in immunotherapy.</a> Cytotherapy. 19 (7), 784-797 (2017).</li>
<li>Cerignoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+immunotherapy+potency+assays+using+real-time+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis.</a> PLOS ONE. , (2018).</li>
<li>Holden, H. T., Oldham, R. K., Ortaldo, J. R., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+the+chromium-51+release%2C+cell-mediated+cytotoxicity+assay%3A+cryopreservation+of+mouse+effector+and+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Standardization of the chromium-51 release, cell-mediated cytotoxicity assay: cryopreservation of mouse effector and target cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 58 (3), 611-622 (1977).</li>
<li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLOS ONE. 10 (10), e0141074(2015).</li>
<li>Mukherjee, M., Mace, E. M., Carisey, A. F., Ahmed, N., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+Approaches+to+Study+the+CAR+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging Approaches to Study the CAR Immunological Synapse.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1757-1768 (2017).</li>
<li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li>
<li>Nelson, D. L., Kurman, C. C., Serbousek, D. E. Chapter 7, Unit 7: 51Cr release assay of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , 27(2001).</li>
<li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free%2C+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li>
<li>Glamann, J., Hansen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+detection+of+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+and+cell+adhesion+by+electrical+impedance+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Dynamic detection of natural killer cell-mediated cytotoxicity and cell adhesion by electrical impedance measurements.</a> Assay and Drug Development Technologies. 4 (5), 555-563 (2006).</li>
<li>Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+real-time+cell+electronic+sensing+%28RT-CES%29+technology+to+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays.</a> Assay and Drug Development Technologies. 2 (4), 363-372 (2004).</li>
<li>Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+label-free+monitoring+of+natural+killer+cell+cytotoxic+activity+using+electronic+cell+sensor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic and label-free monitoring of natural killer cell cytotoxic activity using electronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 309 (1-2), 25-33 (2006).</li>
<li>Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xCELLigence+system+for+real-time+and+label-free+monitoring+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability.</a> Methods in Molecular Biology. 740, 33-43 (2011).</li>
<li>Lamarche, B. J., Xi, B., Cerignoli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+Potency+of+Cancer+Immunotherapies%3A+Immune+Cell-Mediated+Killing+Kinetics+and+Efficacy+Analysis+in+Real-Time+without+the+Use+of+Labels%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Engineering+%26+Biotechnology+News+%28GEN%29%22%5BJournal%5D)">Quantifying the Potency of Cancer Immunotherapies: Immune Cell-Mediated Killing Kinetics and Efficacy Analysis in Real-Time without the Use of Labels.</a> Genetic Engineering & Biotechnology News (GEN). 36 (14), 18-19 (2016).</li>
<li>Golubovskaya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD47-CAR-T+Cells+Effectively+Kill+Target+Cancer+Cells+and+Block+Pancreatic+Tumor+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">CD47-CAR-T Cells Effectively Kill Target Cancer Cells and Block Pancreatic Tumor Growth.</a> Cancers. 9 (10), (2017).</li>
<li>Golubovskaya, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GITR+domain+inside+CAR+co-stimulates+activity+of+CAR-T+cells+against+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer.</a> Frontiers in Bioscience. 23, 2245-2254 (2018).</li>
<li>Guedan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+CAR+T+cell+persistence+through+ICOS+and+4-1BB+costimulation%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation.</a> JCI Insight. 3 (1), (2018).</li>
<li>Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+optimal+cytotoxic+activity+of+human+Her2neu+specific+CD8+T+cells+by+comparing+the+Cr51+release+assay+to+the+xCELLigence+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determining optimal cytotoxic activity of human Her2neu specific CD8 T cells by comparing the Cr51 release assay to the xCELLigence system.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3683(2012).</li>
<li>Davenport, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+Cells+Inflict+Sequential+Killing+of+Multiple+Tumor+Target+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">CAR-T Cells Inflict Sequential Killing of Multiple Tumor Target Cells.</a> Cancer Immunology Research. 3 (5), 483-494 (2015).</li>
<li>Hegde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+CAR+T+cells+targeting+HER2+and+IL13Ralpha2+mitigate+tumor+antigen+escape%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Ralpha2 mitigate tumor antigen escape.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3036-3052 (2016).</li>
<li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+clinical-scale+manufacturing+of+TCR+transduced+T-cells+using+closed+culture+system+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enhanced clinical-scale manufacturing of TCR transduced T-cells using closed culture system modules.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 13(2018).</li>
<li>Weiskopf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+targeting+the+CD47%2FSIRPalpha+axis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy targeting the CD47/SIRPalpha axis.</a> European Journal of Cancer. 76, 100-109 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Ma, Y., Gao, P., Yao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CD47%3A+the+achievements+and+concerns+of+current+studies+on+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Targeting CD47: the achievements and concerns of current studies on cancer immunotherapy.</a> Journal of Thoracic Disease. 9 (2), E168-E174 (2017).</li>
<li>Ma, S., Thorpe, P., Vitetta, E., Meyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+targeting+of+exposed+phosphatidylserine%2C+CD47+and+CD54+on+human+pancreatic+tumor+cells+in+a+mouse+xenograft+model+of+human+pancreatic+cancer+%28P4455%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Combined targeting of exposed phosphatidylserine, CD47 and CD54 on human pancreatic tumor cells in a mouse xenograft model of human pancreatic cancer (P4455).</a> The Journal of Immunology. 190 (1 Supplement), (2013).</li>
<li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+CD47-+high+expression+cells+confers+enhanced+tumorigenicity+upon+KDM6B+suppression+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Emergence of CD47- high expression cells confers enhanced tumorigenicity upon KDM6B suppression in pancreatic cancer.</a> Cancer Research. 76 (2 Supplement), (2016).</li>
<li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+CAR+design+for+tumor+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The development of CAR design for tumor CAR-T cell therapy.</a> Oncotarget. 9 (17), 13991-14004 (2018).</li>
<li>FDA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidance+for+Industry%2C+Potency+Tests+for+Cellular+and+Gene+Therapy+Products%22">Guidance for Industry, Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products</a>. , (2017).</li>
<li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability%2C+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46536(2012).</li>
<li>Chiu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+xCELLigence+biosensor+technology+and+conventional+cell+culture+system+for+real-time+monitoring+human+tenocytes+proliferation+and+drugs+cytotoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison between xCELLigence biosensor technology and conventional cell culture system for real-time monitoring human tenocytes proliferation and drugs cytotoxicity screening.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 149(2017).</li>
<li>Hillger, J. M., Lieuw, W. L., Heitman, L. H., IJzerman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+technology+and+patient+cells%3A+from+early+drug+development+to+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Label-free technology and patient cells: from early drug development to precision medicine.</a> Drug Discovery Today. 22 (12), 1808-1815 (2017).</li>
</ol>

Autorzy prowadzą badania nad rozwojem limfocytów T CAR i powiązanymi testami potencji, które są przedmiotem zainteresowania biznesowego odpowiednio ProMab Biotechnologies i ACEA Biosciences. Nie zmienia to jednak przywiązania autorów do misji JoVE, jaką jest zwiększanie rozpowszechniania wiedzy naukowej. Warunki tej publikacji zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez ProMab Biotechnologies i ACEA Biosciences zgodnie z ich polityką badawczą.

Chimeryczne receptory antygenowe to wielodomenowe białka składające się z zewnątrzkomórkowego jednołańcuchowego zmiennego fragmentu (region scFv), regionu zawiasowego, regionu transbłonowego i domeny cytoplazmatycznej złożonej z domen sygnałowych TCR i dodatkowych domen kostymulujących z receptorów takich jak CD28 i OX4011,40. Aby zaprojektować bezpieczne, selektywne i skuteczne CAR, konieczne jest, aby różne permutacje w konstrukcji CAR zostały dokładnie przetestowane przy użyciu testów siły działania in vitro, a ostatecznie modeli zwierzęcych. W tym badaniu przedstawiliśmy protokół i przepływ pracy dotyczący tego, w jaki sposób test siły działania in vitro w czasie rzeczywistym może informować o projektowaniu skutecznych CAR.
Przy projektowaniu każdego rodzaju testu siły działania, szczególnie do celów produkcyjnych, konieczne jest, aby test był czuły, solidny, spójny i jak najbardziej zbliżony do mechanizmu działania 16,17,41. Opisany tutaj test siły działania w czasie rzeczywistym jest przeznaczony do bezpośredniego pomiaru aktywności cytolitycznej komórek CAR T, a nie przy użyciu markera zastępczego, takiego jak uwalnianie cytokin. Co ważne, test nie wymaga żadnych dodatkowych składników, takich jak barwniki czy odczynniki inne niż płytka testowa (E-Plate) oraz zalecane podłoże do utrzymania komórek. Ponadto test jest wyjątkowo czuły i zapewnia wysoce powtarzalne dane w porównaniu z innymi testami opartymi na znacznikach 42,43,44. Co więcej, test xCELLigence jest podatny na stosowanie bardzo niskich proporcji efektorów do celu, co jest idealne do oceny swoistej cytolizy.
Aby zademonstrować elastyczność i użyteczność systemu xCELLigence, skupiliśmy się na dwóch typach nowotworów, a mianowicie nowotworach pochodzenia hematologicznego i guzach litych. Aby ocenić siłę działania limfocytów CAR T skierowanych do CD22, komórki Raji (tj. Linia komórkowa chłoniaka z komórek B) przywiązano do E-Plates za pomocą przeciwciała anty-CD40. Przywiązanie komórek Raji do dna E-Plates powoduje powstanie sygnału impedancji, który odzwierciedla żywotność i liczbę komórek Raji w studni. Po dodaniu limfocytów T CD22-CAR, komórki Raji są selektywnie zabijane w sposób zależny od czasu i efektora, czego kulminacją jest zależny od czasu spadek sygnału impedancji. Spadek impedancji oznacza cytolizę lub utratę żywotności komórek Raji17. To selektywne podejście do wiązania przy użyciu przeciwciał można rozszerzyć na inne linie komórek płynnego nowotworu. Alternatywną strategią do wykorzystania linii komórek nowotworowych pochodzenia hematologicznego jest użycie adherentnych komórek rakowych, które są zaprojektowane tak, aby stabilnie wyrażać antygeny nowotworowe, takie jak CD19 ulegający ekspresji w komórkach HeLa. Zaletą tego podejścia jest to, że rodzicielskie komórki HeLa są łatwo dostępne i mogą być używane jako negatywna kontrola swoistości. Takie podejście zostało już potwierdzone w przypadku komórek CHO-CD22 w porównaniu z komórkami CHO i CHO-BCMA w porównaniu z komórkami CHO29. Korzystając z tak różnych podejść, można łatwo przetestować konstrukcję i skuteczność limfocytów T CAR. Test xCELLigence jest z natury elastyczny, a warunki testu można dostosować w celu maksymalnego przybliżenia warunków fizjologicznych.
Jedną z głównych zalet opisanego przez nas testu siły działania jest to, że jest to prosty test funkcjonalny i może być stosowany w połączeniu z technikami inżynierii genetycznej w celu zaprojektowania optymalnych i skutecznych CAR w sposób wysokoprzepustowy. Jak wykazano tutaj w przypadku limfocytów CAR T zaprojektowanych do celowania w komórki nowotworowe EGFR-dodatnie, test można wykorzystać do oceny względnej aktywności różnych konstruktów/mutantów CAR. Na przykład wykazaliśmy, że gdy domena GITR znajduje się przed domeną CD3, wykazuje znacznie większą aktywność cytolityczną niż wtedy, gdy znajduje się poniżej domeny CD3.
Chociaż nie koreluje to idealnie z aktywnością komórek CAR T in vivo, uwalnianie cytokin in vitro było historycznie stosowane jako miara siły działania komórek CAR T. Chociaż opisany tutaj test siły działania oparty na xCELLigence może być wykorzystany do oceny terapii komórkowych podczas produkcji lub przed dopuszczeniem do użytku klinicznego, nie ustalono jeszcze, jak dobrze wyniki te korelują ze skutecznością in vivo. Skuteczność in vivo zależy od wielu czynników i zmiennych, które mogą nie być rekapitulowane w teście in vitro. Do takich zmiennych należą: naprowadzanie limfocytów CAR T na miejsce guza, stymulacja i aktywacja limfocytów CAR T oraz ich zdolność do utrzymywania się w organizmie pacjenta, a także mikrośrodowisko guza. Dzięki dalszym udoskonaleniom test xCELLigence może być w stanie modelować niektóre z tych złożonych procesów in vitro.
Przedstawiony tutaj protokół dotyczy większości przylegających linii komórek rakowych i niektórych linii komórkowych płynnego guza. Próbki kliniczne, takie jak pierwotne komórki rakowe, muszą być jednak dalej testowane i optymalizowane ze względu na złożoność typów i faz guza. Z pewnością warto zauważyć, że opisany tutaj system testów siły działania in vitro wykorzystuje linie komórek nowotworowych tylko w celu odzwierciedlenia potencjalnej aktywności limfocytów CAR T. Rzeczywista sytuacja guza w ludzkim ciele jest znacznie bardziej złożona, zwłaszcza gdy celem jest guz lity, ze względu na dynamiczne środowisko i rozwój guza. W związku z tym wynik oceny siły działania może nie przekładać się zbyt dobrze na skuteczność kliniczną badanych limfocytów CAR T.
Podsumowując, zaprezentowana platforma xCELLigence oparta na impedancji pozwala na bezznacznikowe monitorowanie zabijania komórek przez dłuższy okres czasu, a mianowicie do 10 dni. Ta zdolność do gromadzenia danych w tak długiej skali czasowej odróżnia tę technologię od innych testów, które są obecnie stosowane i które wymagają ustanowienia wielu powtórzeń eksperymentalnych w celu zbierania punktów czasowych i pracochłonnej manipulacji próbkami. Co więcej, minimalny wkład sygnałowy efektorowych komórek odpornościowych upraszcza analizę danych. Oprogramowanie może automatycznie przetwarzać dane i generować przydatne parametry, takie jak procent cytolizy, KT50 itp. Technologia wykazała się już wysoką czułością (ze stosunkami E:T tak niskimi, jak 1:20) i dużym zakresem dynamiki (ze stosunkami E:T od 20:1 do 1:20), co nie jest łatwe do osiągnięcia w przypadku innych testów. Ogólnie rzecz biorąc, wdrożenie tej technologii powinno umożliwić dokładniejszą analizę danych w skali o większej przepustowości, co przyczyni się do rozwoju odczynników do komórek T CAR, posuwając się naprzód w tej dziedzinie w znacznie szybszym tempie.

W ostatnich latach, terapia limfocytami T CAR była jednym z najważniejszych przełomów w immunoterapii nowotworów złośliwych i opornych na leczenie. Wraz z niedawnym zatwierdzeniem przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) limfocytów CAR T skierowanych do CD19 w ostrej białaczce limfoblastycznej, chłoniaku nieziarniczym i chłoniaku rozlanym z dużych komórek B oraz wyznaczeniu przełomowej terapii dla komórek T CAR skierowanych do antygenu dojrzewania komórek B (BCMA) w przypadku szpiczaka mnogiego, technologia ta wywołała wielkie emocje w społeczności naukowej i napędzała wiele podstawowych, Badania stosowane i kliniczne na całym świecie1,2,3,4,5. W styczniu 2019 r. w bazie badań klinicznych (clinicaltrials.gov) zarejestrowano ponad 700 badań klinicznych; Około 450 z tych badań miało się dopiero rozpocząć lub prowadziło aktywną rekrutację pacjentów. Większość badań klinicznych koncentruje się na nowotworach hematologicznych, a badania kliniczne z wykorzystaniem limfocytów CAR T ukierunkowanych na CD20, CD22 i BCMA, oprócz CD19, są również w toku6,7. Podczas gdy większość badań wykorzystuje autologiczną terapię limfocytami T CAR, znaczna liczba z nich bada również użyteczność allogenicznych limfocytów T CAR8,9,10. Pomimo obiecujących wyników w przypadku nowotworów hematologicznych, zastosowanie limfocytów CAR T do zwalczania guzów litych okazało się znacznie trudniejsze w praktyce klinicznej z różnych powodów, w tym między innymi z powodu braku dobrych celów, które są wyrażane wyłącznie w guzie, niejednorodności guzów litych i "ucieczki" guza, oraz trudności, jakie mają komórki CAR T w dostępie do mikrośrodowiska guza11,12,13,14,15. Istnieje pilna potrzeba opracowania licytów CAR T specyficznych dla nowotworu, które mogą przezwyciężyć te bariery skuteczności i problem toksyczności "guza docelowego". Podczas gdy wiele podejść in vitro i in vivo jest uzasadnionych w projektowaniu i testowaniu limfocytów CAR T, podstawowe znaczenie ma solidny i predykcyjny test siły działania in vitro16,17.
Aby ocenić siłę działania komórek CAR T, opracowano różne metody in vitro. Ogólnie rzecz biorąc, te testy siły działania można podzielić na dwie szerokie kategorie w zależności od tego, czy (i) bezpośrednio mierzą aktywność cytolityczną komórek CAR T przeciwko docelowym komórkom nowotworowym, czy (ii) mierzą markery zastępcze, takie jak cytokiny, które są uwalniane przez limfocyty CAR T, gdy zabijają komórki docelowe. Techniki, które bezpośrednio mierzą aktywność cytolityczną obejmują test uwalniania chromu-51 (CRA)18, testy oparte na obrazowaniu, które mierzą apoptozę komórek docelowych za pomocą sond fluorescencyjnych19,20, oraz testy cytometrii przepływowej, które wykrywają apoptotyczne komórki docelowe21. W tych testach limfocyty CAR T są zazwyczaj hodowane wspólnie z komórkami docelowymi, które zostały wstępnie znakowane sondami radioaktywnymi lub fluorescencyjnymi, a następnie dokonuje się odpowiedniego pomiaru. Chociaż od dawna jest uważany za złoty standard w tej dziedzinie ze względu na swoją wrażliwość, CRA ma pewne wady. Po pierwsze, jest to test końcowy i nie dostarcza informacji kinetycznych. Po drugie, komórki docelowe muszą być oznaczone chromem-51, który ma tendencję do wypłukiwania się z komórek i może znacznie zwiększyć szum tła22. Wreszcie, wymaga to odpowiednich środków ostrożności i utylizacji odpadów radioaktywnych. Alternatywne testy, które mierzą produkty uboczne interakcji limfocytów T CAR z komórkami docelowymi jako wskaźnik siły działania, obejmują ilościowe oznaczanie różnych cytokin uwalnianych przez limfocyty CAR T przy użyciu metod opartych na cytometrii przepływowej lub testów immunoenzymatycznych. Po raz kolejny są to testy końcowe, które mierzą skumulowane uwalnianie cytokin w danym punkcie czasowym, a zatem niekoniecznie muszą odzwierciedlać rzeczywistą aktywność cytolityczną limfocytów CAR T.
Podczas opracowywania testu potencji, szczególnie takiego, który definiuje kryteria uwalniania dla terapii opartej na komórkach, takiej jak limfocyt T CAR, ważne jest, aby test obejmował minimalne manipulacje i czas pracy, ponieważ każda interakcja jest kolejną zmienną, która musi być uwzględniona i może zmniejszyć ogólną solidność i spójność testu. Co więcej, interakcja limfocytów CAR T z komórkami nowotworowymi jest procesem dynamicznym, a dostarczanie informacji o tych dynamicznych interakcjach, takich jak szybkość cytolizy, ma zasadnicze znaczenie dla oceny siły działania. Mając na uwadze te kryteria, opracowaliśmy bezznacznikowy test siły kinetycznej dla komórek CAR T, który wykorzystuje platformę analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) xCELLigence. xCELLigence wykorzystuje specjalistyczne płytki do mikromiareczkowania (E-Plates), które zawierają złote biosensory wbudowane w dno każdej studzienki. Pracując z przylegającymi litymi komórkami nowotworowymi lub płynnymi komórkami rakowymi, które zostały uwiązane za pomocą specyficznych przeciwciał, te bioczujniki monitorują w czasie rzeczywistym wywołane przez limfocyty CAR T zmiany liczby komórek docelowych, wielkości komórki, siły przylegania komórka-substrat i interakcji komórka-komórka (tj. funkcja bariery)17,23,24,25,26,27,28. Przepływ pracy jest prosty i polega po prostu na umieszczeniu komórek docelowych w dołkach E-Plates, a następnie dodaniu komórek CAR T w różnych proporcjach efektora do celu (ryc. 1). Następnie, ponieważ bioczujniki stale monitorują żywotność komórek docelowych, dane są automatycznie wyświetlane w czasie rzeczywistym.
W ciągu ostatnich 15 lat test xCELLigence został zatwierdzony do oceny siły działania komórek NK (natural killer), limfocytów T, limfocytów T CAR, inhibitorów punktów kontrolnych, przeciwciał bispecyficznych, wirusów onkolitycznych i niektórych terapii skojarzonych17,29,30,31,32,33,34. Niedawno, test siły xCELLigence został oceniony pod kątem produkcji komórek T zmodyfikowanych przez receptor limfocytów T (TCR)35. W tym miejscu informujemy o zastosowaniu systemu RTCA do oceny siły działania in vitro limfocytów CAR T przeznaczonych do celowania w guzy lite i guzy płynne w terapiach klinicznych.

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>Biolegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD40, zestaw do oznaczania zabijania płynnych nowotworów</td><td>ACEA Biosciences</td><td>8100005</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzkich laboratoriów F(ab')2</td><td>Jackson Immunoresearch.</td><td>109-116-088</td><td></td></tr><tr><td>APC anty-CD3</td><td>Biolegend</td><td>317318</td><td></td></tr><tr><td>Technologie oznaczania średniej RPMI1640</td><td>żywotności. Corp</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do zamrażania komórek CAR-T CryostorCS10</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>#07930</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka komórkowa CAR-T od ProMab</td><td>AIM-V+300IFU/ml IL-2</td><td>12055-091</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokulki powlekane CD3/CD28, Dynabeads</td><td>Bufor</td><td></td> FACS Thermofisher 11131D <td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GElifesciences.com</td><td>SH30243.02</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wyprodukowany przez Promab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza.com</td><td>14-503F</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT</td><td>Thermo Fisher</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>INFg Zestaw ELISA</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lentiviral Packaging Mix</td><td>System Biosciences</td><td>VP100</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Ilościowy zestaw do miareczkowania RT-PCR (Clontech)</td><td>Takara</td><td>631235</td><td></td></tr><tr><td>Promab Pożywka dla komórek docelowych</td><td>Zróżnicowane w zależności od linii</td><td></td><td></td>komórkowych</tr><tr><td>Analizator komórkowy w czasie rzeczywistym</td><td>ACEA Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Środek wzmacniający transdukcję, Wzmacniacz transdukcji wirusa (Alstem)</td><td>Transplus, Roztwór</td> do rozcieńczania transfekcji Alstem <td>V020</td><td></td></tr><tr><td>, Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji, odczynnik NanoFect</td><td>Alstem</td><td>NF100</td><td></td></tr></tbody></table>

test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów t receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) w leczeniu raka przyniosła znaczące korzyści kliniczne w przypadku opornych i opornych na leczenie nowotworów hematologicznych, takich jak ostra białaczka limfocytowa u dzieci. Obecnie trwają prace nad rozszerzeniem tej obiecującej terapii na guzy lite, a także na inne nowotwory hematologiczne. W tym miejscu opisujemy rozwój i produkcję silnych limfocytów CAR T ukierunkowanych na antygeny o unikalnej lub preferencyjnej ekspresji na litych i płynnych komórkach nowotworowych. Siła działania tych limfocytów CAR T w warunkach in vitro jest następnie oceniana w czasie rzeczywistym za pomocą bardzo czułego testu xCELLigence opartego na impedancji. W szczególności badany jest wpływ różnych kostymulujących domen sygnalizacyjnych, takich jak białko związane z receptorem czynnika martwicy nowotworu indukowane glikokortykosteroidami (TNFR) (GITR), na potencję in vitro limfocytów CAR T. Niniejszy raport zawiera protokoły dotyczące: generowania limfocytów CAR T do badań przedklinicznych z wykorzystaniem transdukcji genów lentiwirusowych, ekspansji limfocytów CAR T, walidacji ekspresji CAR oraz przeprowadzania i analizowania testów siły działania xCELLigence.

Przygotowanie lentiwirusów CAR oraz generowanie i ocena aktywności limfocytów T CAR 
Miana preparatów lentiwirusa CAR określono przy użyciu zestawu do ilościowej RT-PCR (patrz w Tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta. Protokół miareczkowania polegał najpierw na ekstrakcji wirusowego RNA, a następnie na pomiarze liczby kopii RNA lentiwirusa, co wskazywało na ilość zakaźnych cząsteczek wirusa. Miano wirusa otrzymanego z jednej płytki 150 mm przy użyciu powyższego protokołu zazwyczaj mieści się w zakresie od 109-1010 kopie wirusa/ml Rycina 2A przedstawia liczbę cykli RT-PCR w funkcji natężenia sygnału z reprezentatywnego wyniku ilościowego PCR. Po uzyskaniu satysfakcjonującej jakości wirusa, gdy miano przekroczyło 1 x 108 pfu/ml, a następnie zamrożono w celu późniejszej transdukcji limfocytów T. Po transdukcji limfocytów CAR T lentiwirusem, komórki T hodowano przez dodatkowe 12–14 dni, utrzymując ich zagęszczenie na poziomie około 1 x 106 do 2 x 106 komórek/ml. Następnie komórki CAR T poddano analizie z użyciem przeciwciała specyficznego dla anti-ScFv za pomocą cytometru przepływowego przed dalszym zastosowaniem lub zamrożeniem. Reprezentatywny wynik z jednej z partii przedstawiono na Rycina 2BPrzy użyciu przeciwciała anty-ScFv barwienie dało wynik dodatni dla około 50% komórek CAR-T (Q2 50,6% vs. komórki T 1%), co wskazuje na ekspresję CAR w około 50% komórek T. Następnie, przed zamrożeniem każdej partii komórek CAR-T w celu ich przyszłego zastosowania, przeprowadzono test potencjalności RTCA w celu określenia cytolizy. Jeden cykl procedury projektowania, generowania i oceny komórek CAR-T trwał około 1 miesiąca.
Zabijanie komórek chłoniaka B Raji przez komórki CD2-CAR T 
Zestaw do przywiązania guzów płynnych anty-CD40 (patrz Tabela materiałów) zastosowano w stężeniu 4 µg/mL do pokrycia płytek E-Plate przez 3 h w 37 °C. Po przemyciu studzienek buforem do przywiązania, do płytek E-Plate dodano komórki chłoniaka B w zagęszczeniu 30 00 komórek/studzienkę. Po odczekaniu 30 min na osiadanie komórek, płytkę E-Plate umieszczono ponownie w urządzeniu xCELLigence i natychmiast rozpoczęto pomiary impedancji w celu rejestracji przywierania i proliferacji komórek. Następnego dnia dodano komórki CD2-CAR T, komórki Mock CAR T lub nietransdukowane komórki T. W Rysunku 3 dla wszystkich typów komórek zastosowano stosunek E:T wynoszący 10:1. Komórki Raji CD2-dodatnie, traktowane komórkami CD2-CAR T, wykazały znaczne zabijanie (zielona krzywa) w porównaniu z kontrolami negatywnymi (nietransdukowane komórki T i komórki Mock CAR T).
Efektywne niszczenie komórek raka trzustki przez limfocyty CD47-CAR T 
CD47 jest transbłonkową glikoproteiną powierzchniową z superfamilii immunoglobulin. Jako białko powiązane z integrynami jest silnie eksprimowane zarówno w nowotworach hematologicznych (białaczkach, chłoniakach i szpiczaku mnogim), jak i w nowotworach litych (takich jak rak jajnika, drobnokomórkowy rak płuca, rak trzustki, glejakmielak) oraz w innych typach nowotworów36,37. CD47 jest również znany jako sygnał „nie jedz mnie” (do-not-eat-me) dla makrofagów, co czyni go potencjalnym celem terapeutycznym w niektórych nowotworach. Limfocyty CD47-CAR T zostały wytworzone i przetestowane przeciwko komórkom raka trzustki BxPC3, które wykazują wysoką ekspresję CD4738,39. Komórki BxPC3 wysiano do płytek E-Plate w dniu 1. w gęstości 10 00 komórek/studzinkę. Monitorowanie w czasie rzeczywistym wykazało, że komórki te osiągnęły konfluencję po 16 h. W tym punkcie czasowym dodano limfocyty CAR T w stosunku efektor do celu (E:T) 10:1 (Rysunek 4A). Dodano również kontrolne komórki efektorowe, takie jak nietransdukowane limfocyty T oraz limfocyty Mock CAR T. Wyniki jednoznacznie pokazują, że limfocyty CD47-CAR T selektywnie niszczą docelowe komórki BxPC329. Ponadto Rysunek 4B pokazuje, że sygnał impedancji po dodaniu limfocytów CD47-CAR T do pustej studzienki jest znacznie niższy niż sygnał impedancji generowany przez docelowe komórki BxPC3. Wartość wskaźnika komórkowego (Cell Index) w studzinkach zawierających wyłącznie limfocyty CD47-CAR T osiągnęła maksimum 0,14, co jest tylko nieznacznie wyższe niż sygnał z samej pożywki (0,02). Wskazuje to, że w tym heterogennym teście cytotoksyczności sygnał impedancji pochodzi niemal wyłącznie z docelowych komórek nowotworowych.
Kostymulacja komórek CAR T przez domenę GITR 
W przypadku ekspresji w CAR EGFR-GITR-CD3, zgłoszono wcześniej, że kostymulacyjna domena GITR zwiększa aktywność lityczną wobec komórek nowotworowych SKOV3 wykazujących ekspresję EGFR, ale nie wobec komórek nowotworowych MCF-7 z brakiem ekspresji EGFR30. Aby lepiej wyjaśnić rolę domeny GITR, wygenerowano konstrukty CAR zawierające pełnowymiarową domenę GITR lub wersje domeny z delecjami bądź reorganizacją, a następnie przetestowano ich zdolność do koaktywacji komórek CAR T (Rycyna 5A). Dane z systemu xCELLigence przedstawione na Rycynie 5B,C wskazują, że kostymulacyjna domena GITR nasila niszczenie komórek docelowych EGFR-dodatnich przez komórki CAR T w porównaniu z oryginalnym konstruktem CAR pozbawionym domeny GITR. Co więcej, usunięcie 10 aminokwasów z domeny GITR (aminokwasy 184-193) zniosło tę aktywność stymulującą. Z kolei zmiana względnego położenia domeny GITR w obrębie konstruktu CAR okazała się mniej szkodliwa dla jej właściwości stymulujących. Wykorzystując dane z punktu końcowego, wykazano również stymulującą aktywność domeny GITR poprzez pomiar produkcji IFNγ jako wskaźnika aktywacji limfocytów T (Rycyna 5B). W przeciwieństwie do danych z punktu końcowego, które stanowią jedynie „migawkę”, ciągły profil impedancji z instrumentu xCELLigence wyraźnie ukazuje subtelne różnice w kinetyce niszczenia przy zastosowaniu różnych wariantów (Rycyna 5C). Uzyskane tutaj wyniki są zgodne z wynikami badania in vivo30.
<img alt="Analiza proliferacji komórek; mikroelektrody; indeks komórkowy; wykres czasowy; schemat eksperymentu; wyniki danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: System analizy komórkowej w czasie rzeczywistym (RTCA) xCELLigence wykrywa niszczenie komórek docelowych przez komórki efektorowe. Pomiar aktywności zabójczej komórek efektorowych CAR-T przeciwko docelowym komórkom nowotworowym składa się z trzech głównych etapów koncepcyjnych. Krok 1: Wysianie komórek docelowych (tj. komórek nowotworowych) dołka płytki E-Plate. Komórki przywierają do złotych mikroelektrod biosensora, co utrudnia przepływ prądu elektrycznego między elektrodami. Wartość tej impedancji jest mierzona i przedstawiana jako bezwymiarowy parametr nazywany indeksem komórkowym (Cell Index). Wartość indeksu komórkowego wzrasta w miarę wzrostu komórek i osiąga poziom plateau, gdy komórki zbliżają się do konfluencji. Krok 2: Następnie dodawane są komórki efektorowe – nieadherentne komórki odpornościowe. Ponieważ komórki te nie przywierają do złotych mikroelektrod, nie powodują one bezpośredniej zmiany impedancji. Krok 3: Jeśli komórki efektorowe zaatakują docelowe komórki nowotworowe, zniszczenie komórek guza odzwierciedlone zostanie poprzez spadek indeksu komórkowego w czasie. Ta aktywność cytolityczna komórek efektorowych, czyli ich potencja, może być monitorowana w sposób czuły i precyzyjny. Ciągłe pozyskiwanie danych o impedancji z systemu xCELLigence umożliwia analizę kinetyki zabijania w czasie rzeczywistym dla wielu warunków jednocześnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres Delta Rn względem cyklu; cytometria przepływowa limfocytów T, CD19-CAR-T; analiza przeciwciał; wykres danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wyznaczanie miana lentiwirusa oraz ocena komórek CAR-T za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Wyznaczanie miana lentiwirusa. Linie w różnych kolorach są reprezentatywnymi próbkami dla zależności liczby cykli od delta Rn. Niskie wartości liczby cykli wskazują na stosunkowo wysoką ilość matrycy wirusowego RNA obecnej w próbkach. (B) Po transdukcji komórki CAR-T hodowano i utrzymywano przy gęstości mniejszej niż 2 x 106 komórek/ml, a następnie poddano analizie przepływowej. yoś odzwierciedla barwienie limfocytów T, gdzie wartości dodatnie znajdują się w obszarach Q1 i Q2. Obie próbki są w 100% dodatnie w kierunku limfocytów T. Ekspresja CAR scFv jest określana przy użyciu przeciwciała specyficznego dla scFv (x-osi). Wynik wykazuje, że w przypadku komórek CD2-CAR T ponad 50% limfocytów T jest pozytywnych pod kątem scFv. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres kinetyki wzrostu komórek; znormalizowany indeks komórkowy w funkcji czasu; badanie porównawcze; wykres liniowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Dynamika zabijania komórek chłoniaka Burkitta Raji przez limfocyty T CAR przeciwko CD22. Krzywa czerwona reprezentuje same komórki Raji, natomiast krzywa zielona przedstawia komórki Raji poddane działaniu komórek CAR-T skierowanych przeciw CD2. Krzywe różowa i niebieska odpowiadają odpowiednio leczeniu komórkami Mock CAR-T oraz leczeniu nietransdukowanymi komórkami T. Stosunek E:T wynosi 10:1. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. Skala czasu została ustawiona w odstępach 2-godzinnych w celu przejrzystości prezentacji, mimo dostępności większej liczby punktów danych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres indeksu komórkowego w funkcji czasu; wpływ komórek CAR-T na linię BxPC3; analiza interakcji komórek nowotworowych; eksperyment." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Skuteczność komórek CAR-T CD47 przeciwko komórkom litego guza trzustki. (A) Kolor różowy oznacza same komórki docelowe BxPC3, natomiast kolor czerwony oznacza komórki BxPC3 z dodatkiem komórek CAR-T CD47. Kolor zielony oznacza komórki BxPC3 z dodatkiem nietransdukowanych komórek T, a kolor niebieski z dodatkiem komórek Mock CAR-T. Stosunek E:T wynosi 10:1. (BW tym samym układzie kolor czerwony oznacza studzienki kontrolne puste (pozbawione komórek docelowych) zawierające wyłącznie komórki CD47-CAR T, a kolor zielony oznacza samą pożywkę. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu inżynierii komórek CAR-T; wykresy cytotoksyczności i indeksu komórkowego pokazujące efekty EGFR-GITR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Domena GITR zwiększa aktywność cytotoksyczną komórek CAR-T przeciwko liniom komórkowym nowotworu wykazującym ekspresję EGFR. (A) Różne konstrukty CAR. (B) Wykresy słupkowe procentowej cytolizy dla różnych konstruktów CAR po 4 h (lewo) i 24 h (środek). Produkcja IFNγ po 24 h przedstawiona jest po prawej stronie. (C) Ciągła ocena cytotoksyczności dla wszystkich konstruktów. Krzywa czarna przedstawia krzywą wzrostu samych komórek raka jajnika BxPC3. Krzywa zielona przedstawia komórki docelowe traktowane wyłącznie limfocytami T, krzywa niebieska przedstawia komórki docelowe traktowane kontrolnymi komórkami Mock CAR T, krzywa czerwona przedstawia komórki docelowe traktowane komórkami EGFR-GITR-CD3-CAR T, krzywa różowa przedstawia komórki docelowe traktowane komórkami EGFR-ΔGITR-CD3-CAR T, a krzywa brązowa przedstawia komórki docelowe traktowane komórkami EGFR-CD3-GITR-CAR T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

Analiza komórek w czasie rzeczywistym xCELLigence umożliwia ilościowe monitorowanie zabijania komórek nowotworowych przez komórki odpornościowe w warunkach nieoznaczonych znacznikami i w ciągu wielu dni. System ten zapewnia pełny przebieg czasowy zabijania docelowych komórek rakowych, umożliwiając jednoczesne badania przesiewowe dużej liczby konstruktów, typów komórek efektorowych lub terapii skojarzonych przy niskich proporcjach efektorów do celu. Zacznij od wysiewu 1,5 razy 10 do siedmiu HEK293FT komórek w pożywce hodowlanej DMEM w 150-mililitrowym naczyniu do hodowli komórkowej na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla o wilgotności.Następnego ranka wymieszaj 2,5 mililitra roztworu rozcieńczającego do transfekcji uzupełnionego pięcioma mikrogramami plazmidowego DNA wektora lentiwirusowego i 22,5 mikrograma opakowania lentiwirusowego z 82,5 mikrolitrami odczynnika do transfekcji w 2,5 mililitra roztworu do rozcieńczania transfekcji. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej przenieś reakcję kroplami do naczynia z HEK293FT komórkami i zwróć komórki do inkubatora na drugą inkubację przez noc. Następnego ranka zastąp supernatant 19 mililitrami świeżej pożywki hodowlanej DMEM i włóż komórki z powrotem do inkubatora na noc.Zebrać supernatant do pojedynczej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów do przechowywania w czterech stopniach Celsjusza przez następne dwa dni przed sedymentacją lentiwirusa przez odwirowanie drugiego ranka w celu usunięcia wszelkich komórek lub zanieczyszczeń z roztworu. Przenieść wszystko, z wyjątkiem około jednego mililitra supernatantu zawierającego lentiwirusa, do ultra przezroczystej probówki wirówkowej w celu ultrawirowania. Po ultraodwirowaniu ostrożnie odessać resztki wirusa zawierające supernatant, delikatnie dodać 100 mikrolitrów DMEM do granulki i umieścić probówkę na lodzie na 15 minut.Pod koniec inkubacji delikatnie wymieszać roztwór i podsycić roztwór lentiwirusa do wstępnie schłodzonych sterylnych probówek do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie oznacz miano lentiwirusa metodą ilościowego RT-PCR zgodnie z instrukcjami producenta. W celu wytworzenia i ekspansji komórek CAR-T aktywuj od jednego do dwóch razy od 10 do sześciu komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w jednym mililitrze pożywki komórkowej CAR-T z równą liczbą mikrogranulek pokrytych CD3 / CD28 w jednym dołku 24-dołkowej płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 godziny.Następne dwa poranki wymieszaj jeden mikrolitr środka wspomagającego transdukcję z komórkami, a następnie dodaj lentiwirusa przy wielokrotności infekcji pięć do jednego. Monitoruj wzrost limfocytów T co dwa do trzech dni, dodając świeżą pożywkę komórkową CAR-T w razie potrzeby, aby utrzymać komórki w stężeniu od jednego do dwóch razy od 10 do sześciu komórek na mililitr. Aby wykryć ekspresję CAR limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej, przenieś trzy razy 10 do piątego CAR i nietransdukowanych limfocytów T do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówek.Zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach buforu FACS uzupełnionego 1% surowicą ludzką. Podziel każdą próbkę komórkową na 100 mikrolitrowych podwielokrotności w pojedynczych pięciomililitrowych probówkach FACS z polistyrenu na lodzie. Po pięciu minutach dodać jeden mikrolitr biotynylowanych fragmentów FAB2 koziego FAB2 przeciwko myszom do jednej probówki każdego typu komórek i dwa mikrolitry przeciwciała anty-znacznikowego znakowanego PE do drugiej probówki każdego typu komórek po dokładnym wymieszaniu.Po 30 minutach na lodzie przemyć komórki trzema mililitrami świeżego buforu FACS i po odwirowaniu zdekantować supernatanty. Zawiesić granulki w pozostałym supernatancie i dodać dwa mikrolitry APC anty-CD3 i dwa mikrolitry 7-AAD do każdej probówki. Dodać jeden mikrolitr streptawidyny znakowanej PE z krótkim mieszaniem do probówki wybarwionej przeciwciałem anty-FAB2 i inkubować wszystkie probówki na lodzie przez 30 minut.Pod koniec inkubacji przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami bramkowania komórek T przez rozproszenie do przodu w stosunku do rozproszenia bocznego i ekspresję CD3 w porównaniu z 7-AAD. Aby przeprowadzić test siły cytolizy w czasie rzeczywistym, dodaj od 50 do 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórek docelowych do każdego dołka płytki elektronicznej i zmierz impedancję tła w przyrządzie do analizowania komórek. Wykryj docelowe komórki rakowe z płytki hodowlanej za pomocą trypsyny.Umyj komórki w 15 mililitrach świeżej pożywki hodowlanej i odwiruj. Ponownie zawiesić osad komórek rakowych w pięciu mililitrach świeżej pożywki w celu liczenia i dostosować gęstość komórek do odpowiedniego stężenia komórek docelowych. Dodaj komórki do odpowiedniej liczby dołków i pozostaw e-płytkę na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby komórki mogły równomiernie osiąść na dnie studzienek.Pod koniec okresu równowagi umieść płytkę w analizatorze komórek w czasie rzeczywistym i rozpocznij pomiar impedancji automatycznie co 15 minut przez noc. Adhezja i proliferacja komórek docelowych może być śledzona w czasie rzeczywistym. Następnego ranka rozcieńczyć efektor CAR i kontrolne limfocyty T do odpowiedniego stężenia w poszczególnych probówkach i usunąć od 50 do 100 mikrolitrów z każdej studzienki e-płytki, tak aby końcowa objętość w każdym dołku wynosiła 100 mikrolitrów.Następnie zasiaj efektor i kontrolne limfocyty T w odpowiednich dołkach w odpowiednich proporcjach efektora, aby osiągnąć docelowe proporcje w 100 mikrolitrach pożywki na studzienkę. Następnie równoważyć e-płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej przed powrotem do systemu analizatora komórkowego. Aby zmierzyć skuteczność zabijania docelowych komórek nowotworowych za pośrednictwem limfocytów T, należy monitorować zabijanie za pośrednictwem CAR-T przez 96 godzin.Około 50% komórek CAR-T wybarwionych dodatnio na obecność przeciwciała o zmiennym odłamie anty-jednołańcuchowym, co wskazuje na ekspresję CAR w około 50% limfocytów T. W tym reprezentatywnym eksperymencie zastosowano stosunek efektora do celu 10 do jednego dla wszystkich grup. Tylko komórki Raji i komórki Raji traktowane limfocytami T CD22-CAR wykazywały znaczne zabijanie w porównaniu z samymi kontrolnymi komórkami T i grupami komórek Mock CAR-T.W tym eksperymencie tylko komórki CD47-CAR-T były skuteczne w zabijaniu komórek raka trzustki. Co więcej, sygnał impedancji z samych komórek CD47-CAR-T był tylko nieznacznie wyższy od sygnału indeksu komórkowego mierzonego w samych studzienkach, co wskazuje, że sygnał impedancji wynikający z komórek zawiesinowych, takich jak komórki CAR-T, jest minimalny i nie przyczynia się do ogólnego sygnału impedancji, gdy komórki CAR-T są dodawane do docelowych komórek nowotworowych. Warto zauważyć, że domena kostymulująca GITR jest bardziej skuteczna w zwiększaniu zabijania komórek CAR-T przeciwko komórkom docelowym z dodatnim receptorem nabłonkowego czynnika wzrostu w porównaniu z oryginalnymi konstruktami CAR bez domeny GITR.Pożywkę z dołków e-płytkowych można pobrać w celu analizy profilu cytokin w punktach czasowych w trakcie lub po teście, zgodnie z potrzebami eksperymentu. Ogólnie rzecz biorąc, projekt xCELLigence przyczynił się do poprawy skuteczności różnych immunoterapii, począwszy od bi-specyficznych komórek T i wirusów onkolitycznych, a skończywszy na inhibitorach immunologicznych punktów kontrolnych w terapiach skojarzonych.

a-real-time-potency-assay-for-chimeric-antigen-receptor-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje metodę monitorowania aktywności komórek CAR T przeciwko komórkom nowotworowym poprzez pomiary impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym. Śledzenie zmian impedancji ocenia skuteczność limfocytów CAR T w indukowaniu cytolizy komórek nowotworowych, dostarczając informacji na temat ich zdolności cytotoksycznych.

Test cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym w celu oceny siły działania limfocytów CAR T

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Ten protokół jest przeznaczony do oceny immunoterapeutycznej cytotoksyczności przekierowanych komórek T (komórek CAR T) przeciwko komórkom rakowym (sferoidom) o strukturze 3D w czasie rzeczywistym.

Test zabijania sferoidów za pomocą limfocytów CAR T

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Protokół do oceny ilościowego zabijania komórek nowotworowych przez komórki Jurkata wyrażające chimeryczny receptor antygenowy (CAR) ukierunkowany na pojedynczy antygen nowotworowy. Protokół ten może być wykorzystany jako platforma przesiewowa do szybkiej optymalizacji konstrukcji zawiasów CAR przed potwierdzeniem w limfocytach T pochodzących z krwi obwodowej.

Szybka ocena cytotoksyczności in vitro receptora antygenu chimerycznego z ekspresją Jurkata przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę generowania przejściowych limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) przy użyciu nieintegrującego mRNA do immunoterapii nowotworów i dostarcza wiarygodnych metod oceny komórek CAR-T i ich funkcji cytotoksycznej.

Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

wyrażające specyficzny dla CD19 receptor antygenu chimerycznego (CAR) są podawane jako eksperymentalne leczenie nowotworów złośliwych komórek B w naszych pierwszych badaniach klinicznych terapii genowej u ludzi. Opisujemy modyfikację genetyczną limfocytów T przy użyciu systemu Śpiącej Królewny (SB) w celu wprowadzenia specyficznego dla CD19 CAR i selektywnej propagacji na zaprojektowanych sztucznych komórkach prezentujących antygen CD19 +.

Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

Opisano najczęściej używaną metodę generowania dużej liczby autologicznych komórek dendrytycznych (DC) do wykorzystania w immunoterapii nowotworów.  Metoda wykorzystuje IL-4 i GM-CSF do różnicowania DC od monocytów.  Niedojrzałe DC są stymulowane do dojrzewania, a następnie ładowane antygenami przed wstrzyknięciem z powrotem pacjentowi.

Przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem nowotworowym do immunoterapii

Przedstawiono wytyczne dotyczące generowania zabójczych komórek prezentujących sztuczny antygen, KaAPC, skutecznego narzędzia do in vitro wyczerpywania ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu oraz alternatywnego rozwiązania dla immunoterapii komórkowej w leczeniu chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu bez narażania pozostałego układu odpornościowego.

Zabójcze sztuczne komórki prezentujące antygen (KaAPC) do skutecznego zubożania in vitro ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu

Poznaj test siły działania limfocytów T CAR w czasie rzeczywistym przeciwko nowotworom litym i hematologicznym. Ta metoda umożliwia ilościową ocenę cytolizy komórek nowotworowych przez komórki efektorowe.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe (Wideo) | JoVE Journal

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Przeglądaj więcej filmów