Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Analiza komórek w czasie rzeczywistym xCELLigence umożliwia ilościowe monitorowanie zabijania komórek nowotworowych przez komórki odpornościowe w warunkach nieoznaczonych znacznikami i w ciągu wielu dni. System ten zapewnia pełny przebieg czasowy zabijania docelowych komórek rakowych, umożliwiając jednoczesne badania przesiewowe dużej liczby konstruktów, typów komórek efektorowych lub terapii skojarzonych przy niskich proporcjach efektorów do celu. Zacznij od wysiewu 1,5 razy 10 do siedmiu HEK293FT komórek w pożywce hodowlanej DMEM w 150-mililitrowym naczyniu do hodowli komórkowej na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla o wilgotności.

Następnego ranka wymieszaj 2,5 mililitra roztworu rozcieńczającego do transfekcji uzupełnionego pięcioma mikrogramami plazmidowego DNA wektora lentiwirusowego i 22,5 mikrograma opakowania lentiwirusowego z 82,5 mikrolitrami odczynnika do transfekcji w 2,5 mililitra roztworu do rozcieńczania transfekcji. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej przenieś reakcję kroplami do naczynia z HEK293FT komórkami i zwróć komórki do inkubatora na drugą inkubację przez noc. Następnego ranka zastąp supernatant 19 mililitrami świeżej pożywki hodowlanej DMEM i włóż komórki z powrotem do inkubatora na noc.

Zebrać supernatant do pojedynczej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów do przechowywania w czterech stopniach Celsjusza przez następne dwa dni przed sedymentacją lentiwirusa przez odwirowanie drugiego ranka w celu usunięcia wszelkich komórek lub zanieczyszczeń z roztworu. Przenieść wszystko, z wyjątkiem około jednego mililitra supernatantu zawierającego lentiwirusa, do ultra przezroczystej probówki wirówkowej w celu ultrawirowania. Po ultraodwirowaniu ostrożnie odessać resztki wirusa zawierające supernatant, delikatnie dodać 100 mikrolitrów DMEM do granulki i umieścić probówkę na lodzie na 15 minut.

Pod koniec inkubacji delikatnie wymieszać roztwór i podsycić roztwór lentiwirusa do wstępnie schłodzonych sterylnych probówek do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie oznacz miano lentiwirusa metodą ilościowego RT-PCR zgodnie z instrukcjami producenta. W celu wytworzenia i ekspansji komórek CAR-T aktywuj od jednego do dwóch razy od 10 do sześciu komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w jednym mililitrze pożywki komórkowej CAR-T z równą liczbą mikrogranulek pokrytych CD3 / CD28 w jednym dołku 24-dołkowej płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 godziny.

Następne dwa poranki wymieszaj jeden mikrolitr środka wspomagającego transdukcję z komórkami, a następnie dodaj lentiwirusa przy wielokrotności infekcji pięć do jednego. Monitoruj wzrost limfocytów T co dwa do trzech dni, dodając świeżą pożywkę komórkową CAR-T w razie potrzeby, aby utrzymać komórki w stężeniu od jednego do dwóch razy od 10 do sześciu komórek na mililitr. Aby wykryć ekspresję CAR limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej, przenieś trzy razy 10 do piątego CAR i nietransdukowanych limfocytów T do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówek.

Zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach buforu FACS uzupełnionego 1% surowicą ludzką. Podziel każdą próbkę komórkową na 100 mikrolitrowych podwielokrotności w pojedynczych pięciomililitrowych probówkach FACS z polistyrenu na lodzie. Po pięciu minutach dodać jeden mikrolitr biotynylowanych fragmentów FAB2 koziego FAB2 przeciwko myszom do jednej probówki każdego typu komórek i dwa mikrolitry przeciwciała anty-znacznikowego znakowanego PE do drugiej probówki każdego typu komórek po dokładnym wymieszaniu.

Po 30 minutach na lodzie przemyć komórki trzema mililitrami świeżego buforu FACS i po odwirowaniu zdekantować supernatanty. Zawiesić granulki w pozostałym supernatancie i dodać dwa mikrolitry APC anty-CD3 i dwa mikrolitry 7-AAD do każdej probówki. Dodać jeden mikrolitr streptawidyny znakowanej PE z krótkim mieszaniem do probówki wybarwionej przeciwciałem anty-FAB2 i inkubować wszystkie probówki na lodzie przez 30 minut.

Pod koniec inkubacji przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami bramkowania komórek T przez rozproszenie do przodu w stosunku do rozproszenia bocznego i ekspresję CD3 w porównaniu z 7-AAD. Aby przeprowadzić test siły cytolizy w czasie rzeczywistym, dodaj od 50 do 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórek docelowych do każdego dołka płytki elektronicznej i zmierz impedancję tła w przyrządzie do analizowania komórek. Wykryj docelowe komórki rakowe z płytki hodowlanej za pomocą trypsyny.

Umyj komórki w 15 mililitrach świeżej pożywki hodowlanej i odwiruj. Ponownie zawiesić osad komórek rakowych w pięciu mililitrach świeżej pożywki w celu liczenia i dostosować gęstość komórek do odpowiedniego stężenia komórek docelowych. Dodaj komórki do odpowiedniej liczby dołków i pozostaw e-płytkę na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby komórki mogły równomiernie osiąść na dnie studzienek.

Pod koniec okresu równowagi umieść płytkę w analizatorze komórek w czasie rzeczywistym i rozpocznij pomiar impedancji automatycznie co 15 minut przez noc. Adhezja i proliferacja komórek docelowych może być śledzona w czasie rzeczywistym. Następnego ranka rozcieńczyć efektor CAR i kontrolne limfocyty T do odpowiedniego stężenia w poszczególnych probówkach i usunąć od 50 do 100 mikrolitrów z każdej studzienki e-płytki, tak aby końcowa objętość w każdym dołku wynosiła 100 mikrolitrów.

Następnie zasiaj efektor i kontrolne limfocyty T w odpowiednich dołkach w odpowiednich proporcjach efektora, aby osiągnąć docelowe proporcje w 100 mikrolitrach pożywki na studzienkę. Następnie równoważyć e-płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej przed powrotem do systemu analizatora komórkowego. Aby zmierzyć skuteczność zabijania docelowych komórek nowotworowych za pośrednictwem limfocytów T, należy monitorować zabijanie za pośrednictwem CAR-T przez 96 godzin.

Około 50% komórek CAR-T wybarwionych dodatnio na obecność przeciwciała o zmiennym odłamie anty-jednołańcuchowym, co wskazuje na ekspresję CAR w około 50% limfocytów T. W tym reprezentatywnym eksperymencie zastosowano stosunek efektora do celu 10 do jednego dla wszystkich grup. Tylko komórki Raji i komórki Raji traktowane limfocytami T CD22-CAR wykazywały znaczne zabijanie w porównaniu z samymi kontrolnymi komórkami T i grupami komórek Mock CAR-T.

W tym eksperymencie tylko komórki CD47-CAR-T były skuteczne w zabijaniu komórek raka trzustki. Co więcej, sygnał impedancji z samych komórek CD47-CAR-T był tylko nieznacznie wyższy od sygnału indeksu komórkowego mierzonego w samych studzienkach, co wskazuje, że sygnał impedancji wynikający z komórek zawiesinowych, takich jak komórki CAR-T, jest minimalny i nie przyczynia się do ogólnego sygnału impedancji, gdy komórki CAR-T są dodawane do docelowych komórek nowotworowych. Warto zauważyć, że domena kostymulująca GITR jest bardziej skuteczna w zwiększaniu zabijania komórek CAR-T przeciwko komórkom docelowym z dodatnim receptorem nabłonkowego czynnika wzrostu w porównaniu z oryginalnymi konstruktami CAR bez domeny GITR.

Pożywkę z dołków e-płytkowych można pobrać w celu analizy profilu cytokin w punktach czasowych w trakcie lub po teście, zgodnie z potrzebami eksperymentu. Ogólnie rzecz biorąc, projekt xCELLigence przyczynił się do poprawy skuteczności różnych immunoterapii, począwszy od bi-specyficznych komórek T i wirusów onkolitycznych, a skończywszy na inhibitorach immunologicznych punktów kontrolnych w terapiach skojarzonych.