Monitorowanie przeżycia neuronów za pomocą podłużnej mikroskopii fluorescencyjnej
19 stycznia 2019
Tutaj prezentujemy protokół monitorowania przeżywalności na podstawie pojedynczej komórki i identyfikowania zmiennych, które znacząco przewidują śmierć komórki.
Protokół ten umożliwia naukowcom monitorowanie przeżycia na podstawie pojedynczej komórki i identyfikowanie zmiennych, które znacząco przewidują śmierć lub przeżycie komórki. Konwencjonalne testy cytotoksyczności oceniają populacje komórek i nie mają możliwości rozróżnienia pojedynczych komórek. Mikroskopia podłużna pozwala na przypisanie czasu śmierci dla każdej komórki w populacji.
Technika ta doskonale nadaje się do oceny nowych terapii chorób neurodegeneracyjnych i innych schorzeń. Metoda ta okazała się nieoceniona w badaniu mechanizmów chorobowych w stanach neurodegeneracyjnych i może być stosowana z równą skutecznością w przypadku innych zaburzeń, w których śmierć komórek jest przedmiotem zainteresowania. Badacze mogą mieć trudności z osiągnięciem odpowiedniej wydajności transfekcji bez nadmiernej toksyczności.
Praktyka z pipetą wielokanałową i znajomość protokołu powinny z czasem zmniejszyć te trudności. Mikroskopia jest z natury metodologią wizualną. Dlatego technika ta może być łatwiej zrozumiana, oglądając nie tylko czytanie.
Na początek połącz odpowiednią ilość zredukowanej pożywki surowicy i odczynnika do transfekcji w jednej probówce, a zredukowaną pożywkę surowicy i DNA w osobnej probówce. Inkubuj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie połącz zawartość obu probówek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
Użyj wielokanałowej pipety i sterylnych plastikowych koryt, aby dwukrotnie przemyć neurony korowe 100 mikrolitrami podstawowych pożywek nerwowych na studzienkę. I przechowuj kondycjonowane media i inne pozostałe media w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zastąp NBM 100 mikrolitrami wcześniej przygotowanego roztworu NBKY na studzienkę.
Po 20 minutach wlej kroplami 50 mikrolitrów odczynnika do transfekcji i mieszaniny DNA do każdej studzienki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Przepłucz komórki dwa razy roztworem NBKY.
Następnie dodaj 100 mikrolitrów kondycjonowanej pożywki i 100 mikrolitrów roztworu NBC do studzienek. Aby rozpocząć obrazowanie komórek, umieść 96-dołkową płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym. Użyj znaku powierniczego unikalnego dla każdej płyty jako odniesienia dla przyszłego wyrównania i zapisz obraz do wykorzystania w przyszłości.
Następnie przejdź do obszarów zainteresowania i zapisz ich współrzędne x i y względem znaku. Użyj znaku powierniczego unikalnego dla każdej płyty jako odniesienia dla przyszłego wyrównania i zapisz obraz do wykorzystania w przyszłości. Na koniec skup się na transfekowanych komórkach wyrażających znacznik fluorescencyjny.
Wykonaj wiele zdjęć w regularnych odstępach czasu w odpowiednich kanałach fluorescencyjnych. Aby rozpocząć przetwarzanie obrazu, kliknij dwukrotnie ikonę Fidżi. Następnie kliknij i przeciągnij makro przetwarzania podkreślenia obrazu na pasek Fidżi, aby otworzyć makro na Fidżi.
Dostosuj linie od drugiej do siódmej makra przetwarzania podkreślenia obrazu zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie kliknij ściegi, a następnie zszywanie siatki/kolekcji. Dostosuj ustawienia w menu rozwijanych, wpisz i porządkuj, aż zostanie utworzony dokładnie zszyty obraz.
Dostosuj typ siatki i zmienne kolejności ściegów w wierszach ósmym i dziewiątym zgodnie z tymi wyborami. Następnie dostosuj linię 10, aby określić liczbę obrazów na studzience i w razie potrzeby ustaw opcję odejmowania tła w wierszu 14 na true. Dostosuj linię 15, aby ustawić promień toczącej się kuli zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie kliknij przycisk Uruchom.
Na koniec otwórz stosy obrazów wyjściowych i ręcznie zidentyfikuj martwe neurony zgodnie z protokołem tekstowym. Zapisz dane w pliku arkusza kalkulacyjnego. Aby przeprowadzić analizę statystyczną, kliknij dwukrotnie ikonę przeżycia.
Skrypt języka R. Zaznacz drugą linię i kliknij przycisk uruchom, aby załadować bibliotekę przetrwania. Następnie zmień ścieżkę w wierszu piątym, aby wywołać wejściowy arkusz kalkulacyjny, i kliknij przycisk Uruchom.
Podświetl linie ósmą i dziewiątą, a następnie kliknij przycisk uruchamiania, aby przeprowadzić analizę proporcjonalnych zagrożeń Coxa. Podświetl linie od 12 do 16 i od 19 do 24. Kliknij przycisk uruchamiania, aby wykreślić łączne ryzyko zgonu i dane dotyczące przeżycia jako krzywą Kaplana-Meiera.
W tym badaniu neurony korowe szczura transfekowano cztery dni po posiewie plazmidem kodującym fluorescencyjne białko jabłka M. 24 godziny po transfekcji neurony obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej co 24 godziny przez 10 kolejnych dni. Po uzyskaniu obrazu obrazy zostały przetworzone i zbadane sekwencyjnie, aby oznaczyć śmierć komórki.
Czas śmierci każdej komórki był określany przez zmiany we fluorescencji, morfologii i fragmentacji ciała komórki. Analiza proporcjonalnego hazardu Coxa przeprowadzona na danych dotyczących przeżycia zmutowanych neuronów wykazała współczynnik ryzyka wynoszący 2,2. Wynik ten wskazał na szybsze tempo umierania zmutowanych neuronów w porównaniu z populacją typu dzikiego.
Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest staranne pipetowanie. Minimalizacja ekspozycji na powietrze i unikanie pęcherzyków powietrza ma kluczowe znaczenie dla udanej transfekcji. Po transfekcji podłużna mikroskopia fluorescencyjna może być stosowana do śledzenia różnych czynników, które mogą przyczyniać się do śmierci komórki, w tym lokalizacji białka, obrotu i poziomu ekspresji, a także przeżycia komórki.
W dziedzinie neurodegeneracji dynamiczny charakter mikroskopii podłużnej rzucił światło na to, czy agregacja białek związanych z chorobą stanowi zdarzenie toksyczne czy ochronne. Żaden z tych odczynników ani przyrządów nie jest niebezpieczny.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia protokół monitorowania przeżywalności komórek na poziomie pojedynczej komórki w celu zidentyfikowania czynników zapowiadających śmierć lub przeżycie komórek. Wykorzystując mikroskopię podłużną, metoda ta śledzi indywidualne neurony kory mózgu pod kątem zmian żywotności w czasie, w szczególności w kontekście chorób neurodegeneracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi
Wprowadzenie
- Konwencjonalne testy cytotoksyczności oceniają populacje komórek, lecz nie pozwalają na rozróżnienie poszczególnych komórek.
- Mikroskopia podłużna umożliwia śledzenie przeżywalności i śmierci pojedynczych komórek.
- Metoda ta jest szczególnie przydatna w badaniu mechanizmów neurodegeneracji.
- Badacze często napotykają trudności związane z wydajnością transfekcji podczas badań komórkowych.
Cel badania
- Opracowanie protokołu monitorowania przeżywalności i śmierci komórek neuronalnych.
- Zidentyfikowanie zmiennych, które istotnie wpływają na los komórek.
- Zastosowanie tych wyników w potencjalnych nowych terapiach chorób neurodegeneracyjnych.
Zastosowane metody
- Zastosowano metody hodowli komórkowych z wykorzystaniem neuronów korowych.
- Neurony przetransfekowano plazmidem fluorescencyjnym, aby umożliwić obrazowanie śmierci komórek w okresie 10 dni.
- Proces obejmował precyzyjne pipetowanie oraz etapy inkubacji w celu zapewnienia skutecznej transfekcji.
- Metody analityczne obejmowały analizę proporcjonalnych hazardów Coxa oraz wykreślanie krzywych przeżywalności Kaplana-Meiera.
Główne wyniki
- Badanie wykazało współczynnik hazardu wynoszący 2,2, co wskazuje na szybszą śmiertelność neuronów mutantów w porównaniu z typem dzikim.
- Śmierć komórek określano na podstawie zmian fluorescencji i morfologii obserwowanych w czasie.
- Zdobyto również informacje na temat dynamiki agregacji białek oraz jej wpływu na schorzenia neurodegeneracyjne.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia szczegółową analizę śmierci komórek, dostarczając informacji na temat mechanizmów przeżycia neuronów.
- Wyniki mają istotne znaczenie dla opracowywania terapii ukierunkowanych na choroby neurodegeneracyjne.
- Ogólnie metoda ta zwiększa zrozumienie odpowiedzi komórkowych w różnych warunkach, w których śmierć komórek ma kluczowe znaczenie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Podłużna mikroskopia fluorescencyjna umożliwia analizę przeżywalności neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek, co rozwiązuje kluczowe ograniczenie testów cytotoksyczności opartych na populacjach w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Dzięki śledzeniu poszczególnych komórek w czasie metoda ta wspiera mechanistyczną weryfikację i ograniczanie ryzyka hipotez terapeutycznych oraz zwiększa wiarygodność prognostyczną walidacji celów. Możliwość ta usprawnia selekcję projektów w portfolio poprzez odróżnianie czynników patogennych od odpowiedzi homeostatycznych w zdarzeniach podkomórkowych, takich jak agregacja lub błędna lokalizacja białek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie zdarzeń subkomórkowych z losami komórek za pomocą wnioskowania przyczynowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia rozdzielczość na poziomie pojedynczych komórek, co pozwala odróżnić czynniki patogenne od zjawisk przypadkowych w populacjach neuronalnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera szacowanie współczynnika hazardu za pomocą analizy proporcjonalnych hazardów Coxa w celu ilościowego określenia modyfikatorów ryzyka przeżycia.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje dane dotyczące czasu do wystąpienia zdarzenia dla każdej komórki, umożliwiając ilościową analizę przeżywalności wykraczającą poza pomiary żywotności w punkcie końcowym.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w obrazowaniu podłużnym z wykorzystaniem znaczników fiducjarnych i automatycznego łączenia obrazów w celu zapewnienia powtarzalnego śledzenia w wielu studzienkach.
- Gotowość testu: Wytwarza przetworzone stosy obrazów odpowiednie do ręcznego lub automatycznego oceniania śmierci komórkowej na podstawie fluorescencji, morfologii i fragmentacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Łączy perturbacje molekularne (np. ekspresję białka zmutowanego) z przeżywalnością w pierwotnych kulturach neuronalnych istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Weryfikacja mechanistyczna (de-risking): Pozwala określić, czy agregacja białek jest toksyczna, czy ochronna, poprzez korelację tworzenia się punktów (puncta) z czasem śmierci komórki.
- Ciągłość przedkliniczna: Umożliwia podłużną ocenę potencjalnych modyfikatorów w modelach neurodegeneracyjnych przed walidacją in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu molekularnego po optymalizację wiodących związków, w szczególności w programach koncentrujących się na neurodegeneracji, które wymagają dynamicznych odczytów fenotypowych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących wpływu genów lub białek na przeżywalność neuronów z wykorzystaniem fluorescencyjnie znakowanych kultur pierwotnych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe, rozdzielone w czasie wyniki, które pozwalają na modelowanie przeżywalności oraz analizę porównawczą różnych warunków.
- Analityka: Generuje dane dotyczące czasu przeżycia, kompatybilne z modelem proporcjonalnych hazardów Coxa oraz estymacją Kaplana-Meiera w celu ilościowego określenia wielkości efektu.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy przeżywalności in vitro z mechanizmami chorobowymi w pierwotnych neuronach korowych, które stanowią model translacyjny ludzkiej neurodegeneracji.
- Zastosowania instytucjonalne: Ustanawia powtarzalny proces obrazowania i analizy do podłużnych badań losów komórek w wielu systemach neuronalnych lub glejowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności w powiązaniach mechanistycznych między zdarzeniami molekularnymi a śmiercią komórek.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji etapów transfekcji, obrazowania oraz przetwarzania obrazów, w tym wyrównania znaczników referencyjnych i odejmowania tła.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez dostarczanie szacunków wielkości efektu (np. hazard ratio) zamiast binarnych wyników przeżywalności.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ilościowej modulacji przeżywalności w kontekstach neuronalnych istotnych dla organizmu ludzkiego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie pierwotnych kultur neuronalnych, optymalizacji transfekcji oraz mikroskopii fluorescencyjnej w celu zminimalizowania toksyczności i maksymalizacji detekcji sygnału.
- Zależy od stabilnej wydajności transfekcji i ekspresji białek fluorescencyjnych, co jest niezbędne dla wiarygodnego podłużnego śledzenia pojedynczych komórek.
- Wymaga ustandaryzowanych odstępów czasowych akwizycji obrazów oraz parametrów przetwarzania (np. kolejności składania obrazów, odejmowania tła), aby zapewnić spójność danych pomiędzy poszczególnymi studzienkami i płytkami.
- Konieczna jest manualna weryfikacja stwierdzeń o śmierci komórek w oparciu o kryteria morfologiczne i fluorescencyjne, co wymaga sprawdzenia zgodności między oceniającymi w celu zapewnienia skalowalności.
- Ograniczona przez ryzyko fototoksyczności podczas częstego obrazowania, co wymusza optymalizację mocy lasera, czasu ekspozycji oraz dobór długości fali.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:06
Transfection of Rat Cortical Neurons
2:22
Imaging
3:09
Image Processing and Scoring Cell Death
4:35
Performing Cox Proportional Hazards Analysis and Visualizing Results
5:19
Results: Assessing Neuronal Survival on a Single-cell Basis
6:16
Conclusion
