Name: Monitorowanie przeżycia neuronów za pomocą podłużnej mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj metodę podłużnej mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania przeżycia pojedynczych neuronów kory mózgowej. Technika ta umożliwia identyfikację czynników predykcyjnych śmierci komórkowej i ma zastosowanie w badaniach neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Steve'owi Finkbeinerowi i członkom laboratorium Finkbeinera za pionierską mikroskopię robotyczną. Dziękujemy również Danowi Peisachowi za stworzenie wstępnego oprogramowania niezbędnego do przetwarzania obrazów i automatycznej analizy przeżycia. Praca ta została sfinansowana przez National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R01-NS097542, University of Michigan Protein Folding Disease Initiative oraz Ann Arbor Active Against ALS.

Wszystkie prace nad kręgowcami zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Michigan (protokół # PRO00007096). Eksperymenty są starannie zaplanowane, aby zminimalizować liczbę uśmiercanych zwierząt. Ciężarne samice szczurów Long Evans (WT), nietransgenicznych (Rattus norvegicus) są trzymane pojedynczo w komorach wyposażonych we wzbogacanie środowiska i pod opieką Jednostki Medycyny Zwierząt Laboratoryjnych (ULAM) na Uniwersytecie Michigan, zgodnie z wspieranym przez NIH Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie szczury były trzymane w rutynowych pomieszczeniach tak krótko, jak to możliwe przed eutanazją, zgodnie z zaleceniami Wytycznych dotyczących eutanazji Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych i Wytycznych Uniwersytetu Michigan dotyczących metod eutanazji według gatunków.
1. Przygotowanie materiału
<ol>
	<li>Wypreparuj neurony korowe od embrionalnych dni 19–20 szczeniąt szczurów i hoduj neurony korowe szczurów w 0,5 x 106 komórek na mililitr na płytkach pokrytych poli-D-lizyną przez 4 dni in vitro, jak opisano wcześniej13,14,15,16,17,18,19.</li>
	<li>Przygotuj interesujące Cię plazmidowe DNA, postępując zgodnie z krokami opisanymi przez zestaw do izolacji plazmidowego DNA bez endotoksyn (patrz Tabela materiałów). Określić ilościowo otrzymany DNA za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>W 4. dniu in vitro (DIV4) podwielokrotnie, przesączyć, sterylizować i inkubować następujące pożywki w temperaturze 37 °C: 6 ml zredukowanej pożywki surowicy (RSM; np. OptiMEM), 25 ml neuronalnej pożywki podstawowej (NBM), 40 ml NBKY (NBM + 1 mM kwas kynureninowy + 10 mM MgCl2, dostosowany do pH 7,4), 10 ml NBC (NBM + 1x suplement do hodowli komórek neuronalnych + 1x suplement L-glutaminy + 1x Pen Strep). 
	nuta: Podane objętości są wystarczające do transfekcji jednej płytki 96-dołkowej. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi odczynnikami.</li>
</ol>
2. Transfekcja neuronów kory mózgowej szczura
<ol>
	<li>Zmodyfikuj dostarczony przykładowy arkusz transfekcji (patrz plik uzupełniający 1), dostosowując typ płytki, mapę płyty, liczbę DNA, stężenie DNA i liczbę dołków (zielone pola). 
	nuta: Całkowite DNA sumuje się do 0,2 μg na studzienkę, niezależnie od tego, czy do każdego dołka dodaje się jeden (np. DNA A) lub wiele (np. DNA B i C) konstruktów DNA.</li>
	<li>Pracując z arkusza kalkulacyjnego, połącz odpowiednią ilość RSM i DNA w jednej probówce. Połączyć odpowiednią ilość RSM i odczynnika do transfekcji (np. Lipofektaminy) w osobnej probówce.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.</li>
	<li>Połączyć mieszaniny DNA i odczynnika do transfekcji RSM i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Podczas tego etapu inkubacji należy użyć pipety wielokanałowej i sterylnych plastikowych koryt, aby przemyć komórki 2x po 100 μl na studzienkę NBM. Zachowaj kondycjonowaną pożywkę (CM) i przechowuj w temperaturze 37 °C. W tym i następnych krokach należy zadbać o to, aby zminimalizować czas, w którym neurony są wystawione na działanie powietrza.</li>
	<li>Usuń pożywkę NBM i zastąp ją 100 μl na studzienkę NBKY.</li>
	<li>Po upływie 20 minut dodać kroplami 50 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji/DNA do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować komórki z odczynnikiem do transfekcji/kompleksami DNA przez 20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przepłukać 2x NBKY i zastąpić 100 μl CM i 100 μL NBC na studzienkę.</li>
	<li>Pomyślnie transfekowane komórki powinny być widoczne pod mikroskopią fluorescencyjną w ciągu 16–24 godzin od transfekcji. Aby ocenić skuteczność, użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby sprawdzić transfekcję po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 °C. 
	nuta: Ta technika daje ogólną skuteczność transfekcji od 5 do 10%.</li>
</ol>
3. Obrazowanie
<ol>
	<li>Umieść płytkę na mikroskopie fluorescencyjnym z zmotoryzowanym stolikiem i ustal powiernik (np. znak na spodzie płytki), który pozwoli użytkownikowi wyrównać płytkę za każdym razem, gdy jest ona obrazowana. Zapisz obraz tego powiernika w celach informacyjnych.</li>
	<li>Przejdź do interesującego Cię pola i zanotuj współrzędne x-y względem powiernika.</li>
	<li>Skoncentruj się na transfekowanych komórkach wykazujących ekspresję znacznika fluorescencyjnego.</li>
	<li>Wykonaj obrazy fluorescencyjne w odpowiednim kanale lub kanałach (np. białko czerwonej fluorescencji [RFP], białko zielonej fluorescencji [GFP], 4′,6-diamidino-2-fenyloindol [DAPI]), ręcznie lub w sposób zautomatyzowany. Wykonując kilka zdjęć w regularnych odstępach czasu, można zmontować montaż studzienki podczas przetwarzania obrazu (patrz krok 4). 
	nuta: Odstępy zależą od kilku czynników, w tym powiększenia, optyki mikroskopu i wielkości detektora. Ogólnie rzecz biorąc, odstępy optyczne między sąsiednimi obrazami będą wynosić od 90 do 95% rozmiaru każdego pojedynczego obrazu, aby umożliwić niewielki stopień nakładania się obrazu i wyrównania cech.</li>
	<li>Powtarzaj ten proces tak często, jak to konieczne, za każdym razem dostosowując się do pierwotnego powiernika. W celu analizy przeżycia obrazowanie odbywa się co 6–24 godziny, w zależności od typu komórki i celu eksperymentu.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie obrazu
UWAGA: Po akwizycji obrazu, przed analizą obrazu wymagana jest seria etapów przetwarzania. Należą do nich między innymi zszywanie, układanie w stosy i odejmowanie tła (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Celem tych kroków jest utworzenie stosu obrazów lub szeregów czasowych, w których komórki są wyraźnie odróżnialne od tła i łatwe do śledzenia w wielu punktach czasowych. Dedykowane makro FIJI (Image_Processing.ijm, patrz Plik uzupełniający 2) wykonuje podstawowe zszywanie, układanie w stosy i odejmowanie tła. Wyjaśnienie każdego kroku i parametrów, które należy wziąć pod uwagę podczas przetwarzania obrazu, znajduje się w sekcji dyskusji.
<ol>
	<li>Dostosuj nieprzetworzone dane lub katalog wejściowy, aby pasowały do formatowania pokazanego w Rysunek 2.</li>
	<li>Jeśli punkty czasowe nie są ciągłe (np. T1, T2, T3), zmień nazwy tych folderów tak, aby były. Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby upewnić się, że makro Image_Processing nie ulega awarii podczas układania w stos.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie ikonę Fidżi, aby otworzyć program, a następnie kliknij i przeciągnij makro Image_Processing na pasek Fidżi. Spowoduje to otwarcie makra na Fidżi.</li>
	<li>Dostosuj wiersze 2-7 makra Image_Processing, aby określić katalog wejściowy zawierający obrazy, żądany katalog wyjściowy dla obrazów zszytych i ułożonych w stos, liczbę punktów czasowych obrazowania, liczbę kanałów fluorescencyjnych i format płyty.</li>
	<li>Określ kolejność, w jakiej obrazy zostały pobrane. Aby to przetestować, ręcznie zszyj montaż obrazów na FIDŻI, manewrując do menu rozwijanego Wtyczki | Szwy | Szwy siatkowe/kolekcjonerskie. Dostosuj ustawienia w menu rozwijanych Typ i Kolejność, aż zostanie utworzony dokładnie zszyty obraz.</li>
	<li>Dostosuj zmienne GRID_TYPE i STITCH_ORDER w wierszach 8 i 9 makra Image_Processing, aby dopasować je do tych wyborów.</li>
	<li>Określ liczbę obrazów na studzienkę, dostosowując linię 10 w Image_Processing macro. 
	nuta: W przypadku montażu obrazów 2 x 2 ten wiersz będzie brzmiał DIM = 2.</li>
	<li>Jeśli wymagane jest odejmowanie tła, dostosuj wiersz 14 w makrze Image_Processing do BGSUB = true.</li>
	<li>Ustaw promień toczącej się kulki, dostosowując linię 15 w makro Image_Processing. 
	nuta: Aby uzyskać optymalne wyniki, ustaw promień na co najmniej średnicę największego obiektu pierwszego planu na obrazie.</li>
	<li>Kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić makro Image_Processing. Po uruchomieniu Image_Processing automatycznie przejdzie przez zszywanie, układanie w stosy i odejmowanie tła.</li>
</ol>
5. Punktacja śmierci komórki
UWAGA: Zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji na temat oceny śmierci komórki i cenzurowania danych.
<ol>
	<li>Zlokalizuj stosy obrazów utworzone przez skrypt Image_Processing. Otwórz je na FIDŻI.</li>
	<li>Użyj narzędzia punktowego w FIDŻI, aby indywidualnie oznaczyć każdą komórkę liczbą. Naciśnięcie t po każdym punkcie spowoduje dodanie identyfikatora komórki do Menedżera ROI (regionu zainteresowania). 
	nuta: Identyfikatory można wizualizować, klikając etykiety i wyświetlając wszystkie pola wyboru w Menedżerze ROI.</li>
	<li>Przejdź przez punkty czasowe w każdym stosie obrazów i zapisz punkt czasowy, w którym każda komórka albo umiera, albo musi zostać ocenzurowana w pliku Survival_spreadsheet.csv (patrz Plik uzupełniający 3).
	<ol>
		<li>Każda komórka zajmuje pojedynczy wiersz w arkuszu kalkulacyjnym, w którym unikalny identyfikator (ID) dla każdej komórki składa się z odpowiadającego jej źródła i liczby zwrotu z inwestycji w tym źródle. tp_death jest ostatnim punktem czasowym, w którym zaobserwowano, że komórka jest żywa, podczas gdy time_death reprezentuje rzeczywisty czas śmierci w godzinach. Dla każdej komórki wprowadź te dane. Bardzo ważne jest utrzymanie tej struktury do późniejszej analizy z wykorzystaniem przeżycia. R (patrz plik uzupełniający 4). 
		UWAGA: Kryteria określania śmierci komórki są kluczowe i mogą się różnić w zależności od typu komórki. Trzy główne kryteria są używane do identyfikacji martwych neuronów11,20 (Rysunek 3): utrata intensywności fluorescencji (np. Neuron 1 po 69 godzinach), zaokrąglenie ciała komórki (np. Neuron 2 po 188 godzinach) oraz utrata integralności neurytów lub pęcherzyki (np. Neuron 2 po 188 godzinach).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz status cenzury komórki w ostatniej kolumnie. 
	nuta: Tutaj, ze względu na specyficzny sposób, w jaki cenzura jest obsługiwana przez R, ocenzurowane komórki są oznaczone przez 0, podczas gdy nieocenzurowane komórki są oznaczone przez 1. Należy pamiętać, że wszystkie komórki, które żyją do ostatniego punktu czasu, są cenzurowane i dlatego są oznaczone jako 0.</li>
</ol>
6. Przeprowadzanie analizy proporcjonalnych zagrożeń Coxa i wizualizacja wyników
<ol>
	<li>W razie potrzeby pobierz program R studio pod adresem https://cran.r-project.org/mirrors.html.</li>
	<li>Otwórz R studio i kliknij dwukrotnie ikonę przetrwania. Skrypt języka R.</li>
	<li>Umieść kursor w wierszu 2 przetrwania. R i kliknij przycisk uruchamiania w głównym oknie R studio, aby załadować bibliotekę przetrwania.</li>
	<li>Zmień linię 5 przetrwania. Skrypt języka R pasujący do lokalizacji pliku Survival_spreadsheet.csv. Kliknij uruchom, aby załadować dane dotyczące przeżycia jako ramkę danych.</li>
	<li>Podświetl wiersze 8 i 9, a następnie kliknij przycisk uruchamiania w oknie konsoli programu R Studio, aby przeprowadzić analizę proporcjonalnych zagrożeń Coxa. Wyniki i statystyki wyjściowe są wyświetlane w oknie konsoli programu R Studio.</li>
	<li>Podkreśl linie 12-16 przetrwania. R i naciśnij przycisk uruchom, aby wygenerować skumulowane ryzyko śmierci, wykres, który pojawi się w zakładce wykresy w R studio. Plik ten można zapisać, klikając przycisk eksportu nad działką.</li>
	<li>Jeśli pożądane jest wykreślenie danych dotyczących przeżycia jako krzywej Kaplana-Meiera, zaznacz linie 19-24 przeżycia. R i naciśnij przycisk uruchamiania.</li>
</ol>

<ol><li>Lockshin, R. A., Zakeri, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell death in health and disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).</li>
<li>Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+assays+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cell death assays for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).</li>
<li>Lemasters, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+in+cell+death%3A+a+common+mechanism+in+necrosis%2C+apoptosis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy.</a> Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+phospholipid+degradation+and+associated+membrane+dysfunction+in+irreversible%2C+ischemic+liver+cell+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury.</a> Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).</li>
<li>Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+exposure+of+phosphatidylserine+in+pathological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).</li>
<li>Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytotoxicity+in+cultured+cells+by+enzyme+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).</li>
<li>Moran, J. H., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+beta-NADH-linked+fluorescence+assay+for+lactate+dehydrogenase+in+cellular+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).</li>
<li>Mossman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival%3A+Application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li>
<li>Guerzoni, L. P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Modulation+of+TrkB+Receptor+Signaling+upon+Sequential+Delivery+of+Curcumin-DHA+Loaded+Carriers+Towards+Promoting+Neuronal+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival.</a> Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).</li>
<li>Arrasate, M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+microscope+system+for+determining+factors+that+predict+neuronal+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).</li>
<li>Christensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+survival+analysis+using+Cox%E2%80%99s+regression+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multivariate survival analysis using Cox’s regression model.</a> Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).</li>
<li>Malik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrin+3-dependent+neurotoxicity+is+modified+by+nucleic+acid+binding+and+nucleocytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Archbold, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP43+nuclear+export+and+neurodegeneration+in+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Scientific Reports. 8, 4606(2018).</li>
<li>Green, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005(2017).</li>
<li>Park, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+essential+Sis1+chaperone+reduces+TDP-43+effects+on+toxicity+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis.</a> PLOS Genetics. 13, e1006805(2017).</li>
<li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Proline%2FArginine+Dipeptide+from+Hexanucleotide+Repeat+Expanded+C9ORF72+Inhibits+the+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome.</a> eNeuro. 4, (2017).</li>
<li>Angelov, B., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+clustering+of+the+neurotrophin+receptor+TrkB+revealed+by+super-resolution+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy.</a> Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule przedstawiono metodologię bezpośredniego monitorowania przeżywalności neuronów w pojedynczej komórce. W przeciwieństwie do tradycyjnych testów śmierci komórki, które są ograniczone do dyskretnych punktów czasowych i całych populacji komórek, metoda ta pozwala na ciągłą ocenę różnych czynników, takich jak morfologia komórki, ekspresja białka lub lokalizacja, i może określić, w jaki sposób każdy czynnik wpływa na przeżycie komórki w sposób prospektywny.
Metodologia ta może być modyfik...

Nieprawidłowa śmierć komórek jest czynnikiem napędzającym wiele chorób, w tym raka, neurodegenerację i udar mózgu1. Solidne i czułe testy śmierci komórki są niezbędne do scharakteryzowania tych zaburzeń, a także do opracowania strategii terapeutycznych w celu wydłużenia lub zmniejszenia przeżycia komórek. Obecnie istnieją dziesiątki technik pomiaru śmierci komórki, zarówno bezpośrednio, jak i za pomocą markerów zastępczych2. Na przykład śmierć komórki można ocenić wizualnie za pomocą ważnych barwników, które selektywnie barwią martwe lub żywe komórki3, lub monitorując pojawienie się określonych fosfolipidów na błonie komórkowej4,5,6. Pomiary składników wewnątrzkomórkowych lub metabolitów komórkowych uwalnianych do pożywki po rozpuszczeniu komórkowym mogą być również używane jako wskaźniki zastępcze dla śmierci komórki7,8. Alternatywnie, żywotność komórek można przybliżyć, oceniając aktywność metaboliczną9,10. Chociaż metody te zapewniają szybkie sposoby oceny przeżywalności komórek, nie są pozbawione zastrzeżeń. Każda technika polega na obserwacji kultury jako pojedynczej populacji, co uniemożliwia rozróżnienie poszczególnych komórek i ich unikalnych wskaźników przeżycia. Co więcej, takie testy populacyjne nie są w stanie zmierzyć czynników, które mogą być ważne dla śmierci komórki, w tym morfologii komórki, ekspresji białka lub lokalizacji. W wielu przypadkach testy te są ograniczone do dyskretnych punktów czasowych i nie pozwalają na ciągłą obserwację komórek w czasie.
 W przeciwieństwie do tego, podłużna mikroskopia fluorescencyjna jest wysoce elastyczną metodologią, która bezpośrednio i stale monitoruje ryzyko zgonu na podstawie pojedynczej komórki11. Krótko mówiąc, podłużna mikroskopia fluorescencyjna umożliwia śledzenie tysięcy pojedynczych komórek w regularnych odstępach czasu przez dłuższy czas, umożliwiając precyzyjne określenie śmierci komórki i czynników, które zwiększają lub hamują śmierć komórki. U podstaw metody leży przejściowa transfekcja lub transdukcja komórek z wektorami kodującymi białka fluorescencyjne. Następnie ustalany jest unikalny powiernik, a pozycja każdej transfekowanej komórki w stosunku do tego punktu orientacyjnego pozwala użytkownikowi na obrazowanie i śledzenie poszczególnych komórek w ciągu godzin, dni lub tygodni. Gdy obrazy te są oglądane sekwencyjnie, śmierć komórki jest naznaczona charakterystycznymi zmianami we fluorescencji, morfologii i fragmentacji ciała komórki, co umożliwia przypisanie czasu śmierci każdej komórce. Obliczony współczynnik zgonów, określony przez funkcję hazardu, może być następnie ilościowo porównany między warunkami lub powiązany z wybranymi cechami komórkowymi za pomocą jednowymiarowej lub wielowymiarowej analizy proporcjonalnego hazardu Coxa12. Razem podejścia te umożliwiają dokładne i obiektywne rozróżnianie wskaźników śmierci komórek w populacjach komórkowych oraz identyfikację zmiennych, które w istotny sposób przewidują śmierć komórki i/lub przeżycie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
Chociaż ta metoda może być używana do monitorowania przeżywalności w dowolnym typie komórek post-mitotycznych w różnych formatach posiewu, ten protokół będzie opisywał warunki transfekcji i obrazowania neuronów korowych szczurów hodowanych na 96-dołkowej płytce.

<table><tbody><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>CompactPrep Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12863</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat kwasu kynureninowego</td><td>TCI</td><td>H0303</td><td></td></tr><tr><td>PoliD-lizyna</td><td>Milipor</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Thermo Fisher</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki</td><td>TPP</td><td>0876</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie przeżycia neuronów za pomocą podłużnej mikroskopii fluorescencyjnej

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Standardowe testy cytotoksyczności, które wymagają pobrania lizatów lub stałych komórek w wielu punktach czasowych, mają ograniczoną czułość i zdolność do oceny czynników wpływających na los neuronów. Testy te wymagają obserwacji oddzielnych populacji komórek w dyskretnych punktach czasowych. W rezultacie, poszczególne komórki nie mogą być śledzone prospektywnie w czasie, co poważnie ogranicza zdolność do rozróżnienia, czy zdarzenia subkomórkowe, takie jak tworzenie się puncta lub błędna lokalizacja białka, są patogennymi czynnikami choroby, odpowiedziami homeostatycznymi, czy tylko przypadkowymi zjawiskami. Mikroskopia podłużna pojedynczych komórek przezwycięża te ograniczenia, pozwalając badaczowi określić różnice w przeżywalności między populacjami i narysować związki przyczynowo-skutkowe ze zwiększoną czułością. Ten przewodnik wideo przedstawi reprezentatywny przebieg eksperymentów mierzących przeżywalność pojedynczych komórek pierwotnych neuronów korowych szczurów wykazujących ekspresję fluorescencyjnego markera białkowego. Widz dowie się, jak osiągać wysokiej wydajności transfekcji, zbierać i przetwarzać obrazy umożliwiające prospektywne śledzenie pojedynczych komórek oraz porównywać względne przeżycie populacji neuronów za pomocą analizy proporcjonalnych zagrożeń Coxa.

Stosując opisaną tutaj procedurę transfekcji, neurony kory szczura w 4. dniu in vitro (DIV4) przetransfekowano plazmidem kodującym białko fluorescencyjne mApple. Począwszy od 24 h po transfekcji, obrazy komórek rejestrowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej co 24 h przez 10 kolejnych dni. Uzyskane obrazy uporządkowano zgodnie z Rysunkiem 2, a następnie zszyto, ułożono w stosy i oceniono pod kątem śmierci komórek (Rysunek 1)....

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania przeżywalności na podstawie pojedynczej komórki i identyfikowania zmiennych, które znacząco przewidują śmierć komórki.

Monitorowanie przeżycia neuronów za pomocą podłużnej mikroskopii fluorescencyjnej

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

Protokół ten umożliwia naukowcom monitorowanie przeżycia na podstawie pojedynczej komórki i identyfikowanie zmiennych, które znacząco przewidują śmierć lub przeżycie komórki. Konwencjonalne testy cytotoksyczności oceniają populacje komórek i nie mają możliwości rozróżnienia pojedynczych komórek. Mikroskopia podłużna pozwala na przypisanie czasu śmierci dla każdej komórki w populacji.Technika ta doskonale nadaje się do oceny nowych terapii chorób neurodegeneracyjnych i innych schorzeń. Metoda ta okazała się nieoceniona w badaniu mechanizmów chorobowych w stanach neurodegeneracyjnych i może być stosowana z równą skutecznością w przypadku innych zaburzeń, w których śmierć komórek jest przedmiotem zainteresowania. Badacze mogą mieć trudności z osiągnięciem odpowiedniej wydajności transfekcji bez nadmiernej toksyczności.Praktyka z pipetą wielokanałową i znajomość protokołu powinny z czasem zmniejszyć te trudności. Mikroskopia jest z natury metodologią wizualną. Dlatego technika ta może być łatwiej zrozumiana, oglądając nie tylko czytanie.Na początek połącz odpowiednią ilość zredukowanej pożywki surowicy i odczynnika do transfekcji w jednej probówce, a zredukowaną pożywkę surowicy i DNA w osobnej probówce. Inkubuj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie połącz zawartość obu probówek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Użyj wielokanałowej pipety i sterylnych plastikowych koryt, aby dwukrotnie przemyć neurony korowe 100 mikrolitrami podstawowych pożywek nerwowych na studzienkę. I przechowuj kondycjonowane media i inne pozostałe media w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zastąp NBM 100 mikrolitrami wcześniej przygotowanego roztworu NBKY na studzienkę.Po 20 minutach wlej kroplami 50 mikrolitrów odczynnika do transfekcji i mieszaniny DNA do każdej studzienki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Przepłucz komórki dwa razy roztworem NBKY.Następnie dodaj 100 mikrolitrów kondycjonowanej pożywki i 100 mikrolitrów roztworu NBC do studzienek. Aby rozpocząć obrazowanie komórek, umieść 96-dołkową płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym. Użyj znaku powierniczego unikalnego dla każdej płyty jako odniesienia dla przyszłego wyrównania i zapisz obraz do wykorzystania w przyszłości.Następnie przejdź do obszarów zainteresowania i zapisz ich współrzędne x i y względem znaku. Użyj znaku powierniczego unikalnego dla każdej płyty jako odniesienia dla przyszłego wyrównania i zapisz obraz do wykorzystania w przyszłości. Na koniec skup się na transfekowanych komórkach wyrażających znacznik fluorescencyjny.Wykonaj wiele zdjęć w regularnych odstępach czasu w odpowiednich kanałach fluorescencyjnych. Aby rozpocząć przetwarzanie obrazu, kliknij dwukrotnie ikonę Fidżi. Następnie kliknij i przeciągnij makro przetwarzania podkreślenia obrazu na pasek Fidżi, aby otworzyć makro na Fidżi.Dostosuj linie od drugiej do siódmej makra przetwarzania podkreślenia obrazu zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie kliknij ściegi, a następnie zszywanie siatki/kolekcji. Dostosuj ustawienia w menu rozwijanych, wpisz i porządkuj, aż zostanie utworzony dokładnie zszyty obraz.Dostosuj typ siatki i zmienne kolejności ściegów w wierszach ósmym i dziewiątym zgodnie z tymi wyborami. Następnie dostosuj linię 10, aby określić liczbę obrazów na studzience i w razie potrzeby ustaw opcję odejmowania tła w wierszu 14 na true. Dostosuj linię 15, aby ustawić promień toczącej się kuli zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie kliknij przycisk Uruchom.Na koniec otwórz stosy obrazów wyjściowych i ręcznie zidentyfikuj martwe neurony zgodnie z protokołem tekstowym. Zapisz dane w pliku arkusza kalkulacyjnego. Aby przeprowadzić analizę statystyczną, kliknij dwukrotnie ikonę przeżycia.Skrypt języka R. Zaznacz drugą linię i kliknij przycisk uruchom, aby załadować bibliotekę przetrwania. Następnie zmień ścieżkę w wierszu piątym, aby wywołać wejściowy arkusz kalkulacyjny, i kliknij przycisk Uruchom.Podświetl linie ósmą i dziewiątą, a następnie kliknij przycisk uruchamiania, aby przeprowadzić analizę proporcjonalnych zagrożeń Coxa. Podświetl linie od 12 do 16 i od 19 do 24. Kliknij przycisk uruchamiania, aby wykreślić łączne ryzyko zgonu i dane dotyczące przeżycia jako krzywą Kaplana-Meiera.W tym badaniu neurony korowe szczura transfekowano cztery dni po posiewie plazmidem kodującym fluorescencyjne białko jabłka M. 24 godziny po transfekcji neurony obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej co 24 godziny przez 10 kolejnych dni. Po uzyskaniu obrazu obrazy zostały przetworzone i zbadane sekwencyjnie, aby oznaczyć śmierć komórki.Czas śmierci każdej komórki był określany przez zmiany we fluorescencji, morfologii i fragmentacji ciała komórki. Analiza proporcjonalnego hazardu Coxa przeprowadzona na danych dotyczących przeżycia zmutowanych neuronów wykazała współczynnik ryzyka wynoszący 2,2. Wynik ten wskazał na szybsze tempo umierania zmutowanych neuronów w porównaniu z populacją typu dzikiego.Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest staranne pipetowanie. Minimalizacja ekspozycji na powietrze i unikanie pęcherzyków powietrza ma kluczowe znaczenie dla udanej transfekcji. Po transfekcji podłużna mikroskopia fluorescencyjna może być stosowana do śledzenia różnych czynników, które mogą przyczyniać się do śmierci komórki, w tym lokalizacji białka, obrotu i poziomu ekspresji, a także przeżycia komórki.W dziedzinie neurodegeneracji dynamiczny charakter mikroskopii podłużnej rzucił światło na to, czy agregacja białek związanych z chorobą stanowi zdarzenie toksyczne czy ochronne. Żaden z tych odczynników ani przyrządów nie jest niebezpieczny.

monitoring-neuronal-survival-via-longitudinal-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy protokół umożliwiający obrazowanie mitochondriów w żywych neuronach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez dłuższy czas. Obrazowanie w wydłużonych przedziałach czasowych osiągnięto dzięki ekspresji białka fluorescencyjnego skierowanego do mitochondriów za pomocą lentiwirusa oraz zastosowaniu niedrogiego inkubatora nakładanego na stolik mikroskopu, który został zaprojektowany i zbudowany w naszym laboratorium.

Neuromodulacja i transport mitochondriów: obrazowanie żywych neuronów hipokampa w długich odstępach czasu

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy apoptozy pośredniczonej przez kaspazę-3 w unieśmiertelnionych kulturach komórek oligodendrocytów N19 z wykorzystaniem substratu kaspazy-3 NucView 488. Technika ta znajduje zastosowanie w testach programowanej śmierci komórki w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek i tkanek.

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

Niniejszy raport opisuje zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz technik fotowybielania w celu określenia ekspresji powierzchniowej, szlaków transportu i kinetyki ruchu egzogennych białek znakowanych pH-wrażliwym białkiem GFP w błonie plazmatycznej neuronów.

Dyfuzja boczna i egzocytoza białek błonowych w hodowlach neuronów oceniane za pomocą metody odzyskiwania fluorescencji oraz fotowybielania z utratą fluorescencji

Źródło: Krishnamurthy, K.  i wsp. Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego. J. Vis. Exp. (2021)Ten film demonstruje obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym w celu monitorowania aktywności synaptycznej w neuronach z mutacją ALS wyrażających genetycznie kodowany bioczujnik wapnia. Przedstawiono w nim etapy przygotowania neuronów do obrazowania, stymulowania dynamiki wapnia i rejestrowania fluorescencji w celu pomiaru zmian w...

Obrazowanie fluorescencyjne synaptycznej dynamiki wapnia w modelu in vitro stwardnienia zanikowego bocznego

Wewnątrzkomórkowa przebudowa Ca2+ w procesie starzenia się może przyczyniać się do ekscytotoksyczności i uszkodzenia neuronów, procesów, w których pośredniczy przeciążenie Ca2+. Naszym celem było zbadanie przebudowy Ca2 + w starzejącym się mózgu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i bioluminescencyjnego cytozolowego i mitochondrialnego Ca2 + w długoterminowych hodowlach neuronów hipokampa szczura, modelu starzenia się neuronów.

Obrazowanie fluorescencyjne i bioluminescencyjne subkomórkowego Ca2+ w starzejących się neuronach hipokampa

Opisany jest solidny protokół do monitorowania populacji neuronów za pomocą wideomikroskopii poklatkowej, a następnie przetwarzania końcowego opartego na oprogramowaniu. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do identyfikacji zdarzeń biologicznych w wybranej populacji podczas eksperymentów obrazowania na żywo.

Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronalnych

Prezentowana tutaj jest zmodyfikowana metoda rolkowa do hodowli i przerywanego obrazowania w wysokiej rozdzielczości wycinków mózgu gryzoni przez wiele tygodni z precyzyjną zmianą położenia na fototrawionych szkiełkach nakrywkowych. Żywotność neuronów i morfologia warstw są dobrze zachowane. Zapewnione są zastosowania tego w pełni zamkniętego systemu wykorzystującego wirusy do ekspresji specyficznej dla typu komórki.

Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym

Obrazowanie żywych komórek dostarcza bogactwa informacji o pojedynczych komórkach lub całych populacjach, które są nieosiągalne przez samo obrazowanie komórek stałych. W tym miejscu opisano protokoły obrazowania żywych komórek w celu oceny decyzji dotyczących losu komórek po leczeniu lekiem antymitotycznym paklitakselem.

Długoterminowe obrazowanie żywych komórek w celu oceny losu komórek w odpowiedzi na paklitaksel

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Poznaj metodę podłużnej mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania przeżycia pojedynczych neuronów kory mózgowej. Technika ta umożliwia identyfikację czynników predykcyjnych śmierci komórkowej i ma zastosowanie w badaniach neurodegeneracyjnych.

Monitorowanie przeżycia neuronów za pomocą podłużnej mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów