Identyfikacja nowych substratów kinazy CK2 przy użyciu wszechstronnego podejścia biochemicznego
February 21st, 2019
Celem tego protokołu jest etykietowanie, wzbogacanie i identyfikowanie substratów kinazy białkowej CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub homogenat tkankowy. W tym celu metoda ta wykorzystuje unikalne aspekty biologii CK2
.Protokół ten pozwala na specyficzne znakowanie, a następnie wzbogacanie i identyfikację endogennych substratów CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub tkankowy. Metodę tę można zastosować do dowolnego typu komórki lub tkanki. Ułatwiając w ten sposób badanie CK2 w różnych kontekstach biologicznych.
Procedurę zademonstruje Jan Chojnowski, doktorant z mojego laboratorium. Na początek należy mechanicznie poddać lizie próbkę tkanki lub hodowane komórki, jak opisano w protokole tekstowym, aby zebrać łącznie 900 mikrolitrów próbki. Wirować przy 17, 500 razy grawitacji i w czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty.
Następnie przenieś 270 mikrolitrów supernatantu do każdej z trzech nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,7 mililitra. Usunąć 40 mikrolitrów pozostałego supernatantu, który ma być użyty jako kontrola wejściowa, i przenieść go do nowej probówki. Umieść wszystkie próbki na lodzie.
Najpierw oznacz każdą z trzech probówek z próbkami, jak pokazano tutaj. Do probówki reakcyjnej kinazy dodaj 2,7 mikrolitra CK2 i 2,7 mikrolitra 2,5 milimolowego GTPgammaS. Przesuń rurkę, aby wymieszać i natychmiast umieść ją na lodzie.
Do samej probówki GTPgammaS dodaj 2,7 mikrolitra 2,5 milimolowego GTPgammaS i 2,7 mikrolitra buforu do lizy. Przesuń tę rurkę, aby wymieszać i natychmiast umieść ją na lodzie. Do probówki PNBM Only dodaj 5,4 mikrolitra buforu do lizy.
Przesuń rurkę, aby wymieszać i natychmiast umieść ją na lodzie. Inkubować wszystkie trzy probówki w łaźni wodnej w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Następnie dodaj 13,5 mikrolitra PNBM w ilości 12 miligramów na mililitr do każdej probówki.
Odwrócić probówki, aby wymieszać próbki, i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Podczas inkubacji próbek oznacz każdą z kolumn dla próbki, która ma zostać załadowana, jak pokazano poniżej. Przygotuj kolumny, kilkakrotnie odwracając każdą kolumnę, aby ponownie zawiesić żywicę Sephadex G-25 w buforze magazynowym.
Przymocuj każdą kolumnę do stojaka zaciskowego i pozostaw ją w spokoju przez około pięć minut, aby żywica mogła się osadzić. Następnie umieść rurkę poniżej dolnego otworu każdej kolumny. Zdejmij zaślepki zarówno z góry, jak i z dołu każdej kolumny, aby bufor magazynujący mógł spływać do rur pod wpływem grawitacji.
Po wyczerpaniu bufora magazynowego dodaj około 2,7 mililitra buforu do lizy do każdej kolumny, aby je zrównoważyć, upewniając się, że przepływ przepływa i jest odrzucany. Powtórz ten proces dodawania buforu do lizy i odrzucania przepływu trzy razy. Aby rozpocząć, załaduj każdą próbkę do odpowiedniej kolumny.
Zbierz i wyrzuć przepływ. Dodaj 420 mikrolitrów buforu do lizy do każdej kolumny, aby przepłukać próbki. Pozwól, aby bufor do lizy przefiltrował się przez kolumnę, a następnie zebrał i odrzucił przepływ.
Następnie umieść probówki pod każdą kolumną w celu pobrania próbki. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy do każdej kolumny, aby wymyć próbki. Zbierz przepływ, który zawiera teraz wzbogaconą populację tiofosforylowanych i alkilowanych substratów CK2 w reakcji kinazy.
Tylko reakcja GTPgammaS będzie zawierać substraty tiofosforylowane i alkilowane przez dowolny obecny endogenny CK2. Reakcja tylko PNMB będzie zawierała alkilowane białka tła. Usunąć 80 mikrolitrów z każdej elucji jako próbkę kontrolną wejścia elucji.
Następnie podziel każdą próbkę na dwie probówki, z których każda zawiera 200 mikrolitrów. Oznacz każdą z probówek jako ester antytiofosforanowy lub immunoglobulinę G, jak pokazano tutaj. Dodać 2,8 mikrograma przeciwciała antytiofosforanowego estru do każdej z probówek estru antytiofosforanowego.
Dodać 2,8 mikrograma przeciwciała Isotype Control do każdej z probówek IGG. Następnie umieść rurki na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na dwie godziny. W ciągu ostatnich 15 minut inkubacji próbki użyj czystej żyletki, aby odciąć koniec końcówki pipety P200, aby zwiększyć rozmiar miernika.
Bezpośrednio przed użyciem należy krótko wymieszać rurkę do przechowywania zawierającą kulki agarozy. Za pomocą wyciętej końcówki pipety przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny kulek na immunoprecypitację do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 mililitra. Ważne jest, aby przed każdym transferem wirować koraliki, aby zapobiec osiadaniu koralików.
Odwiruj probówki pod ciśnieniem 17 500 razy większym niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Ponownie zawiesić kulki, dodając 200 mikrolitrów buforu do lizy i krótko wirując, aby wymieszać.
Powtórz ten proces wirowania i mycia koralików trzy razy. Po ostatnim umyciu umieść koraliki na lodzie, aż będą gotowe do kontynuowania. Gdy próbki zakończą inkubację, odwiruj je pod ciśnieniem 17 500 razy większym niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty.
Następnie przenieś 200 mikrolitrów każdej próbki do probówek zawierających umyte kulki. Umieść rurki na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na godzinę. Następnie odwiruj probówki pod ciśnieniem 17 500 razy większym niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę.
Usuń 40 mikrolitrów z każdego supernatantu, aby zapisać jako kontrolę wyczerpania. Usunąć i wyrzucić pozostałą część supernatantu, uważając, aby nie naruszyć kulek. Umyj próbki, dodając do każdej z nich 200 mikrolitrów buforu do lizy i krótko wirując.
Wirować przy 17, 500 razy grawitacji i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę, odrzucając supernatant. Powtórz ten proces mycia i wirowania trzy razy, uważając, aby nie naruszyć kulek. Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu 2X próbki do każdej próbki zawierającej kulki.
Dla wszystkich innych próbek, które obejmują kontrolę wejściową, kontrolę wejścia elucji i kontrolę zubożenia, dodaj 8 mikrolitrów buforu próbki 6X. Odpipetować każdą probówkę w górę i w dół, aby wymieszać z wyjątkiem probówek zawierających kulki, i podgrzać wszystkie próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut przed przystąpieniem do SDS-PAGE. Aby ocenić, czy immunoprecypitacja się powiodła, należy przepuścić od 25 do 30 mikrolitrów każdej próbki, która wydostała się z kulek, na oddzielnym 12,5% żelu poliakrylamidowym.
Wybarwić każdy żel kolorem Coomassie Blue, aby uwidocznić wzbogacone białka z różnych etapów protokołu eksperymentalnego. Używając nowych, czystych żyletek, ostrożnie wytnij wszelkie unikalne prążki obecne w reakcji kinazy antytiofosforanowego estru IP Lane, zwracając uwagę na ich przybliżoną masę cząsteczkową. Do każdej unikalnej opaski należy użyć nowej żyletki.
Podstawą tej techniki jest to, że technika ta jest niezwykłą zdolnością CK2 do wykorzystania GTP do przenoszenia grup fosforylowych. Dodanie egzogennego holoenzymu CK2 wraz z analogiem GTP, GTPgammaS, do lizatu komórkowego powoduje tiofosforylację endogennych substratów CK2. Późniejsze traktowanie lizatu odczynnikiem alkilującym mesylan p-nitrobenzylu generuje ugrupowanie estru tiofosforanowego na tych specyficznych białkach substratowych, które można następnie immunoprecypitować za pomocą przeciwciała anty-tiofosforanowego estru i ostatecznie zidentyfikować za pomocą spektrometrii mas.
W reprezentatywnych pozytywnych wynikach pokazanych tutaj, zależnych od CK2, tiofosforylacja i późniejsza alkilacja zakończyły się sukcesem. Zgodnie z oczekiwaniami, wzmocniony sygnał estru antytiofosforanowego przez Western blot obserwuje się tylko na torze zawierającym kompletną reakcję kinazy, a nie tylko w próbkach traktowanych tylko GTPgammaS i PNMB. Żel barwiony na niebiesko Coomassie z immunoprecypitowanymi i nawiązanymi białkami również wykazuje pozytywny wynik.
Ponieważ wiele unikalnych prążków jest widocznych tylko w estrze antytiofosforanowym IP Lane, w którym lizat inkubowano z egzogennymi CK2 i GTPgammaS. Oznaczone prążki są następnie wycinane z żelu i przekazywane do identyfikacji białka za pomocą spektrometrii mas. Zgodnie z tą procedurą, przypuszczalne substraty CK2 zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas muszą zostać zwalidowane przy użyciu dodatkowego podejścia, takiego jak fosforylacja zależna od CK2 w standardowym teście kinazy in vitro.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół pozwala na specyficzne znakowanie i następujące wzbogacanie i identyfikację endogennych substratów CK2 ze złożonych próbek biologicznych, takich jak lizaki komórkowe lub tkankowe. Metoda może być zastosowana do każdego typu komórek lub tkanki, ułatwiając badania nad CK2 w różnych kontekstach biologicznych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia komórki
- Chemia białek
Tło
- CK2 jest kinaza serynową/treoninową zaangażowaną w różne procesy komórkowe.
- Rozumienie substratów CK2 jest kluczowe dla wyjaśnienia jego biologicznych ról.
- Ten protokół zwiększa zdolność badania CK2 w różnych kontekstach biologicznych.
- Endogenne znakowanie zapewnia wgląd w naturalne substraty CK2.
Cel badania
- Znakowanie i wzbogacanie substratów CK2 z próbek biologicznych.
- Identyfikowanie specyficznych substratów CK2 w różnych typach komórek.
- Ułatwienie badań nad rolą CK2 w funkcjach komórkowych.
Zastosowanie metod
- Mechaniczne lizysowanie próbek tkankowych lub hodowanych komórek.
- Centrifugowanie z siłą 17 500 razy większą niż siła grawitacji w 4 stopniach Celsjusza.
- Następujące wzbogacanie substratów CK2 z lizatów.
- Identyfikacja substratów za pomocą technik biochemicznych.
Główne wyniki
- Udane znakowanie substratów CK2 ze złożonych próbek.
- Identyfikacja różnych substratów w różnych typach komórek.
- Wykazanie efektywności protokołu w różnych kontekstach biologicznych.
- Wgląd w funkcjonalne role CK2 w procesach komórkowych.
Konkluzje
- Ten protokół zapewnia niezawodną metodę badania substratów CK2.
- Może być dostosowany do różnych próbek i kontekstów biologicznych.
- Wyniki te zwiększają nasze zrozumienie biologicznego znaczenia CK2.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Identifying kinase substrates is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. This biochemical approach enables specific enrichment and identification of CK2 substrates, supporting hypothesis testing and pathway clarification in disease-relevant systems. The method enhances predictive confidence by providing quantitative, reproducible data on kinase activity across diverse biological contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping CK2 substrate networks in human disease models.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for functional target validation using endogenous labeling from complex lysates.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying substrates linked to oncogenic pathways in glioblastoma and other contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems enriched for thiophosphorylated CK2 substrates, enabling reliable compound screening.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative outputs via LC-MS/MS that support assay reproducibility and scalability.
- Platform Reuse: Adaptable to any cell or tissue type, facilitating cross-project application in target de-risking workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects CK2 activity to disease-relevant substrates in human glioblastoma, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing consistent substrate identification across models.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity in CK2-driven pathways, informing go/no-go decisions in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to lead optimization, particularly for kinases with pleiotropic functions like CK2.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through specific labeling of endogenous CK2 substrates.
- Screening: Enables assay readiness by producing enriched, quantifiable substrate pools for inhibitor profiling.
- Analytics: Generates LC-MS/MS readouts that allow comparison of CK2 activity under varying experimental conditions.
- Translational Research: Links kinase activity to disease substrates in human cancer models, supporting biomarker relevance.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for kinase substrate mapping across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing false positives in kinase-substrate assignments.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized lysis, enrichment, and immunoprecipitation steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of kinase targets before costly lead optimization.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying substrates with strong disease linkage.
Implementation Considerations
- Requires expertise in kinase biochemistry, immunoprecipitation, and mass spectrometry-based proteomics.
- Dependent on access to CK2 enzyme, GTPgammaS, PNBM, anti-thiophosphate ester antibodies, and LC-MS/MS infrastructure.
- Needs cross-team standardization for sample handling, lysis consistency, and data analysis across discovery and translational groups.
- Adaptable to various model systems, but substrate validation via orthogonal kinase assays is recommended for confirmation.
- Practical limitations include the need for sufficient lysate quantity and optimization of incubation times for low-abundance substrates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:35
Preparation of the Tissue Samples
1:20
Kinase Assay: Thiophosphorylation and Alkylation
2:34
Preparation of the Desalting Columns
3:40
Removal of PNBM
4:42
Immunoprecipitation: Part I
5:32
Protein A/G Agarose Bead Preparation
6:39
Immunoprecipitation: Part II
8:19
Analysis/Validation of Results
9:06
Results: Analysis and Identification of Novel CK2 Kinase Substrates
10:48
Conclusion
