Name: Identyfikacja nowych substratów kinazy CK2 przy użyciu wszechstronnego podejścia biochemicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji substratów kinazy CK2 z próbek biologicznych przy użyciu etykietowania tiotrifosforanowego i immunoprecypitacji. Technika ta umożliwia badanie funkcji CK2 w różnych typach komórek i tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez grant Commonwealth Universal Research Enhancement z Departamentu Zdrowia Pensylwanii dla T.I.S.

UWAGA: Upewnij się, że wymagane materiały są dostępne i odpowiednio przygotowane (patrz Tabela materiałów).
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Mechanicznie lizować próbkę tkanki (1-2 mg tkanki w 100 μl buforu do lizy, tabela 1) lub hodowane komórki (10 cm płytka, która w 80-90% zlewa się w 350 μl buforu do lizy), w celu zebrania łącznie 900 μl próbki do eksperymentu. Zauważ, że ta objętość jest nieznacznie większa niż wymagana do eksperymentu opisanego poniżej.</li>
	<li>Odwirować próbki przez odwirowanie w temperaturze 17 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu przenieść 270 μl supernatantu do każdej z trzech nowych probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Pozostanie około 90 μL. Usunąć 40 μl, które mają być użyte jako "kontrola wejściowa" i umieścić w nowej probówce. Umieść wszystkie próbki na lodzie.</li>
</ol>
2. Test kinazy: tiofosforylacja i alkilacja
<ol>
	<li>Oznaczyć trzy probówki zawierające 270 μl każda w następujący sposób: "kinaza rxn", "tylko GTPγS" i "tylko PNBM (p-nitrobezyl mezylan)". Przygotuj reakcje kinazy.
	<ol>
		<li>Do probówki "kinaza rxn" dodaj 2,7 μl (co odpowiada 1,350 U) CK2, a następnie dodaj 2,7 μl 2,5 mM GTPγS.</li>
		<li>Do probówki "Tylko GTPγS" dodaj 2,7 μl z 2,5 mM GTPγS, a następnie dodaj 2,7 μl buforu do lizy.</li>
		<li>Do probówki "Tylko PNBM" dodać 5,4 μl buforu do lizy. Przesuń wszystkie probówki, aby się wymieszać, a następnie natychmiast umieść na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować wszystkie trzy probówki przez 1 minutę w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C. Po inkubacji dodać 13,5 μl 12 mg/ml PNBM do wszystkich trzech probówek. Odwróć, aby wymieszać próbki. Próbki te należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po rozpoczęciu inkubacji w kroku 2.2 należy jak najszybciej przygotować kolumny odsalające, ponieważ proces ten trwa około 45 minut.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kolumn odsalających
<ol>
	<li>Początkowo przygotuj kolumny (3 w tym przykładowym eksperymencie), odwracając każdą kolumnę kilka razy, aby ponownie zawiesić żywicę Sephadex G-25 w buforze pamięci. Pozwól, aby żywica osiadła, mocując każdą kolumnę do clamp stand i pozwól jej siedzieć w spokoju przez około 5 minut.</li>
	<li>Po osadzeniu się żywicy Sephadex G-25 należy zdjąć zaślepki zarówno z góry, jak i z dołu kolumny, aby umożliwić grawitacyjne opróżnienie bufora magazynowego i umieścić rurkę poniżej dolnego otworu, aby zebrać przepływ w celu wyrzucenia.</li>
	<li>Po wyczerpaniu buforu do przechowywania dodać około 2,7 ml buforu do lizy w celu zrównoważenia kolumn. Zebrać przepływ i wyrzucić. Powtórz 3 razy. Po końcowej równoważności kolumny są gotowe do kroku 4.1.</li>
</ol>
4. Usunięcie PNBM
<ol>
	<li>Po zakończeniu 1 godzinnej inkubacji (etap 2.2) i przygotowania kolumny (etap 3) należy nałożyć próbki do kolumn. Oznacz każdą kolumnę w następujący sposób: "kinaza rxn", "tylko GTPγS" i "tylko PNBM". Załaduj całą każdą próbkę do odpowiedniej kolumny. Zbierz i wyrzuć przepływ.</li>
	<li>Przepłukać próbki, dodając 420 μl buforu do lizy do każdej kolumny. Pozwolić, aby bufor do lizy przefiltrował się przez kolumnę i zebrał przepływ w celu odrzucenia. Po tym etapie mycia umieść probówki w odpowiednim miejscu do pobrania próbek.</li>
	<li>Eluować próbki, dodając 500 μl buforu do lizy do każdej kolumny. Zbierz przepływ, który teraz zawiera tiofosforylowane i alkilowane substraty CK2.</li>
</ol>
5. Immunoprecypitacja: Część I
<ol>
	<li>Przygotować próbki do immunoprecypitacji, usuwając najpierw 80 μl próbki "kontrolnej wejścia elucji" z każdej z odpowiednich elucji ("kinaza rxn", "tylko GTPγS" i "tylko PNBM") zebranych w kroku 4.3. Po usunięciu 80 μl z każdej próbki, pozostanie około 420 μl na próbkę.
	<ol>
		<li>Podzielić każdą próbkę na 2 probówki zawierające 200 μl każda. Oznacz każdą odpowiednią probówkę: "ester antytiofosforanowy kinazy rxn", "kinaza rxn IgG", "ester antytiofosforanowy GTPγS", "GTPγS IgG", "ester antytiofosforanowy PNBM" i "PNBM IgG".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 2,8 μg przeciwciała antytiofosforanowego estru do każdej z probówek znakowanych estrami antytiofosforanowymi i 2,8 μg przeciwciała kontrolnego izotypu do każdej z probówek znakowanych IgG. Umieścić probówki na rotatorze w temperaturze 4 °C na 2 godziny.</li>
	<li>Przygotowanie kulki białkowej A/G należy rozpocząć w ciągu ostatnich 15 minut 2-godzinnej inkubacji w kroku 5.2.</li>
</ol>
6. Białko A/G preparat kulek agarozy
<ol>
	Krótko przekręć <li>rurkę do przechowywania, aby upewnić się, że koraliki są całkowicie ponownie zawieszone. Odetnij koniec końcówki pipety P200 za pomocą czystej żyletki, aby zwiększyć rozmiar miernika. Odpipetować 100 μl zawiesiny perełkowej na immunoprecypitację do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. W tym przykładzie potrzebnych jest łącznie 6 rurek.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 17 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i wyrzucić. Ponownie zawiesić kulki w 200 μl buforu do lizy i krótko zawirować. Powtórz kroki wirowania i prania 3 razy.</li>
	<li>Po ostatnim umyciu umieść koraliki na lodzie, aż inkubacja w kroku 5.2 zostanie zakończona.</li>
</ol>
7. Immunoprecypitacja: Część II
<ol>
	<li>Po 2 godzinach inkubacji od etapu 5.2 odwirowywać próbki w temperaturze 17 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu dodać 200 μl z każdej próbki do probówek z przemytymi kulkami. Umieścić probówki na rotatorze w temperaturze 4 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Po 1 godzinnej inkubacji odwirować probówki o stężeniu 17 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Następnie usuń 40 μl supernatantu z każdej próbki i zachowaj jako "kontrolę zubożenia" (łącznie 6 probówek). Usunąć pozostałą część supernatantu i wyrzucić. Uważaj, aby nie naruszyć koralików.</li>
	<li>Przemyć próbki, dodając 200 μl buforu do lizy i krótko wirując. Następnie odwirować przy 17 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i wyrzucić. Powtórz kroki prania i wirowania 3 razy. Uważaj, aby nie przeszkadzać koralikom podczas tych czynności.</li>
	<li>Po zakończeniu etapów płukania dodać 50 μl 2x buforu do każdej próbki zawierającej kulki. Dla wszystkich innych próbek dodać 8 μl 6-krotnego buforu próbki: "kontrola wejściowa", "kontrola wejścia elucji" i "kontrola zubożenia".</li>
	<li>Po dodaniu buforu do probówek, pipetować w górę i w dół, aby wymieszać, a następnie podgrzewać wszystkie próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut przed przystąpieniem do SDS-PAGE.</li>
</ol>
8. Analiza/Walidacja wyników
<ol>
	<li>Walidacja udanej tiofosforylacji i alkilacji zależnej od CK2.
	<ol>
		<li>Aby określić skuteczność tiofosforylacji za pośrednictwem CK2 w kroku 2.2, należy przeprowadzić SDS-PAGE i Western blot, uruchamiając 15-20 μl "kontrolnych danych wejściowych elucji" zebranych w kroku 5.1 na 12,5% żelu poliakrylamidowym.</li>
		<li>Membrany sondy z następującymi przeciwciałami: ester antytiofosforanowy, anty-CK2α i anty-GAPDH (lub inna odpowiednia kontrola obciążenia). Jeśli ten krok się powiódł, wzmocniony sygnał estru antytiofosforanowego powinien być widoczny na torze "kinazy rxn" w porównaniu z pozostałymi dwoma pasami (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja wzbogaconych przypuszczalnych substratów CK2 i określenie tożsamości białka.
	<ol>
		<li>Aby ocenić, czy etapy immunoprecypitacji zakończyły się sukcesem, należy przeprowadzić 25-30 μl próbek eluowanych z kulek w kroku 7.4 na oddzielnym 12,5% żelu poliakrylowym. Upewnij się, że cały sprzęt jest czysty i przez cały czas noś rękawice, aby zminimalizować zanieczyszczenie.</li>
		<li>Zabarwić żel kolorem Coomassie na niebiesko, aby uwidocznić wzbogacone białka z różnych etapów protokołu eksperymentalnego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Używając nowych żyletek, ostrożnie wyciąć unikalne prążki obecne na pasie "kinazy rxn anty-tiofosforan ester IP", zwracając uwagę na ich przybliżoną masę cząsteczkową.</li>
		<li>Prześlij te pasma do identyfikacji białek za pomocą chromatografii cieczowej/tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS) (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Jeśli dostępne są przeciwciała skierowane przeciwko zidentyfikowanym białkom, potwierdź wyniki spektrometrii mas za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu frakcji wejściowych, zubożonych i IP pobranych w trakcie trwania protokołu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+CK2%3A+structure%2C+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li>
<li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joining+the+cell+survival+squad%3A+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li>
<li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li>
<li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2%3A+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li>
<li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li>
<li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li>
<li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li>
<li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li>
<li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CK2+in+Cancer%3A+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li>
<li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li>
<li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Casein+Kinase+II%3A+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li>
<li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX-4945%2C+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2%2C+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li>
<li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+casein+kinase+2+inhibitor%2C+CX-4945%2C+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70(2015).</li>
<li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIGB-300%2C+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li>
<li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858(2014).</li>
<li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li>
<li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li>
<li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li>
<li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival%3A+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li>
<li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biologyl%22%5BJournal%5D)">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97(2017).</li>
<li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460(2013).</li>
<li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li>
<li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy%3A+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy stosunkowo prostą metodę biochemiczną identyfikacji substratów kinazy białkowej CK2 ze złożonej próbki biologicznej. Krytyczne etapy tego protokołu opierają się na niezwykłych właściwościach enzymatycznych CK2 i obejmują zależną od CK2 tiofosforylację specyficznych białek substratowych przy użyciu GTPγS oraz ich późniejszą immunoprecypitację i identyfikację. Dzięki tym wynikom wykazaliśmy użyteczność i wszechstronność tego podejścia, ponieważ teraz zastosowaliśmy tę strategię zarówno w lu...

Kinazy białkowe są kluczowymi składnikami kaskad transdukcji sygnału. Fosforylacja białek substratowych przez te enzymy wywołuje reakcje biologiczne, które regulują krytyczne zdarzenia kontrolujące między innymi podział, metabolizm i różnicowanie komórek. CK2 to wszechobecna, kwasofilna kinaza serynowo-treoninowa, która jest konserwowana od drożdży do ludzi i która odgrywa ważną rolę w wielu procesach komórkowych, od regulacji transkrypcji po progresję cyklu komórkowego do apoptozy1,2,3. Enzym jest heterotetramerem złożonym z dwóch katalitycznych podjednostek α (lub α') i dwóch podjednostek regulatorowych β4. Oprócz tego, że jest wysoce plejotropowy, CK2 wykazuje dwie inne niezwykłe cechy, które komplikują jego analizę, a mianowicie aktywność konstytutywną5 i specyficzność podwójnego kosubstratu6. Ta ostatnia właściwość nadaje CK2 zdolność do wykorzystywania GTP, a także ATP do fosforylacji białek substratowych.
Genetyczna delecja podjednostek katalitycznych lub regulatorowych CK2 u myszy powoduje śmiertelność embrionalną, co wskazuje, że odgrywa ona kluczową rolę podczas rozwoju i organogenezy7,8. CK2 ulega również nadekspresji w kilku typach raka, a zatem stanowi obiecujący cel terapeutyczny9,10,11. Rzeczywiście, specyficzne inhibitory, które celują w aktywność kinazy CK2, są obecnie badane w tym celu12,13,14. Chociaż hamowanie CK2 jest realną opcją, biorąc pod uwagę jego plejotropowy charakter, alternatywnym i być może bardziej racjonalnym podejściem byłoby celowanie w krytyczne substraty CK2, które leżą u podstaw progresji niektórych nowotworów. W związku z tym kompleksowa identyfikacja i charakterystyka białek substratowych CK2 byłaby istotna dla wyjaśnienia specyficznych funkcji tej kinazy w określonej tkance lub typie nowotworu.
Tutaj opisujemy wszechstronną metodę biochemiczną do identyfikacji substratów CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub tkankowy. Protokół ten wykorzystuje swoistość CK2 dla podwójnego kosubstratu przy użyciu analogu GTP GTPγS (5'-[γ-tio]trifosforanu guanozyny), którego inne kinazy endogenne nie mogą wykorzystać. To skutecznie pozwala kinazie "oznaczyć" swoje substraty w tej próbce w celu późniejszej izolacji i identyfikacji.

<table><tbody><tr><td>12 mg/ml PNBM</td><td>Abcam</td><td>ab138910</td><td>40,5 &mikro; L</td></tr><tr><td>2,5 mM GTP&gamma; S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8634-1MG</td><td>5.4 i mikro; L</td></tr><tr><td>Anty-CK2 i alfa; (E-7) mysie przeciwciało monoklonalne</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-373894</td><td>1:1000 dla</td></tr><tr><td>mysiego przeciwciała monoklonalnego Western blotting Anti-GAPDH (6C5)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32233</td><td>1:1000 dla Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne królika antynukleoliny</td><td>Abcam</td><td>ab22758</td><td>1:1000 dla Western blotting</td></tr><tr><td>Ester antytiofosforanowy [51-8] Przeciwciało</td> <td>monoklonalne królikaAbcam</td><td>ab92570</td><td>Zmienia się (stężenie końcowe 2,8 &mikro; g dla każdej próbki)</td></tr> <tr><td>Wirówka wstępnie ustawiona na 4&ordm; C</td><td>ThermoScientific</td><td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini Inhibitor Proteazy Wolny od EDTA</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy</td><td>Zobacz przepis poniżej</td><td>Zobacz przepis poniżej 30</td><td>ml</td></tr><tr><td>Normalne królicze przeciwciało IgG (kontrola izotypu)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>2729S&nbsp;</td><td>Waha się (stężenie końcowe 2,8 &mikro; g dla każdej próbki)</td></tr><tr><td>PD MiniTrap Kolumna</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-10</td><td>3 kolumny</td></tr><tr><td>Białko A/G Plus Koraliki agarozowe</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td>600 &micro; L</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki holoenzym CK2</td><td>New England Biolabs</td><td>P6010S</td><td>2,7 i mikro; L</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Labnet: Mini Labroller</td><td>Mini Labroller SKU# H5500</td><td></td></tr><tr><td>T98G ludzkie komórki glejaka</td><td>ATCC</td><td>CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna wstępnie ustawiona na 30&ordm; C</td><td>Shel Lab</td><td>H20 Seria wanien Model# SWB15</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja nowych substratów kinazy ck2 przy użyciu wszechstronnego podejścia biochemicznego

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Badanie relacji kinaza-substrat jest niezbędne do pełnego zrozumienia funkcji tych enzymów i ich dalszych celów zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych. CK2 jest ewolucyjnie konserwatywną kinazą serynowo-treoninową z rosnącą listą setek substratów zaangażowanych w wiele procesów komórkowych. Ze względu na jego właściwości plejotropowe, identyfikacja i scharakteryzowanie kompleksowego zestawu substratów CK2 było szczególnie trudne i pozostaje przeszkodą w badaniach nad tym ważnym enzymem. Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowaliśmy wszechstronną strategię eksperymentalną, która umożliwia ukierunkowane wzbogacenie i identyfikację przypuszczalnych substratów CK2. Protokół ten wykorzystuje unikalną specyficzność CK2 dla podwójnego kosubstratu, co pozwala na specyficzną tiofosforylację jego substratów w lizacie komórkowym lub tkankowym. Te białka substratowe są następnie alkilowane, immunoprecypitowane i identyfikowane za pomocą chromatografii cieczowej/tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS). Wcześniej stosowaliśmy to podejście, aby z powodzeniem zidentyfikować substraty CK2 z jajników Drosophila, a tutaj rozszerzamy zastosowanie tego protokołu do ludzkich komórek glejaka, ilustrując zdolność adaptacyjną tej metody do badania biologicznych ról tej kinazy w różnych organizmach modelowych i systemach eksperymentalnych.

Schemat procedury eksperymentalnej przedstawiono na Rysunku 1. Podstawą tej techniki jest nietypowa zdolność CK2 do wykorzystywania GTP w transferze grupy fosforanowej. Dodanie egzogennego holoenzymu CK2 wraz z analogiem GTP, GTPγS, do lizatu komórkowego prowadzi do tiofosforylacji endogennych substratów CK2. Następnie traktowanie lizatu odczynnikiem alkilującym p-nitrobenzylo-mesylanem (PNBM) generuje fragment estru tiofosforanowego w tych specyficz...

Celem tego protokołu jest etykietowanie, wzbogacanie i identyfikowanie substratów kinazy białkowej CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub homogenat tkankowy. W tym celu metoda ta wykorzystuje unikalne aspekty biologii CK2.

Identyfikacja nowych substratów kinazy CK2 przy użyciu wszechstronnego podejścia biochemicznego

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Protokół ten pozwala na specyficzne znakowanie, a następnie wzbogacanie i identyfikację endogennych substratów CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub tkankowy. Metodę tę można zastosować do dowolnego typu komórki lub tkanki. Ułatwiając w ten sposób badanie CK2 w różnych kontekstach biologicznych.Procedurę zademonstruje Jan Chojnowski, doktorant z mojego laboratorium. Na początek należy mechanicznie poddać lizie próbkę tkanki lub hodowane komórki, jak opisano w protokole tekstowym, aby zebrać łącznie 900 mikrolitrów próbki. Wirować przy 17, 500 razy grawitacji i w czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty.Następnie przenieś 270 mikrolitrów supernatantu do każdej z trzech nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,7 mililitra. Usunąć 40 mikrolitrów pozostałego supernatantu, który ma być użyty jako kontrola wejściowa, i przenieść go do nowej probówki. Umieść wszystkie próbki na lodzie.Najpierw oznacz każdą z trzech probówek z próbkami, jak pokazano tutaj. Do probówki reakcyjnej kinazy dodaj 2,7 mikrolitra CK2 i 2,7 mikrolitra 2,5 milimolowego GTPgammaS. Przesuń rurkę, aby wymieszać i natychmiast umieść ją na lodzie.Do samej probówki GTPgammaS dodaj 2,7 mikrolitra 2,5 milimolowego GTPgammaS i 2,7 mikrolitra buforu do lizy. Przesuń tę rurkę, aby wymieszać i natychmiast umieść ją na lodzie. Do probówki PNBM Only dodaj 5,4 mikrolitra buforu do lizy.Przesuń rurkę, aby wymieszać i natychmiast umieść ją na lodzie. Inkubować wszystkie trzy probówki w łaźni wodnej w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Następnie dodaj 13,5 mikrolitra PNBM w ilości 12 miligramów na mililitr do każdej probówki.Odwrócić probówki, aby wymieszać próbki, i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Podczas inkubacji próbek oznacz każdą z kolumn dla próbki, która ma zostać załadowana, jak pokazano poniżej. Przygotuj kolumny, kilkakrotnie odwracając każdą kolumnę, aby ponownie zawiesić żywicę Sephadex G-25 w buforze magazynowym.Przymocuj każdą kolumnę do stojaka zaciskowego i pozostaw ją w spokoju przez około pięć minut, aby żywica mogła się osadzić. Następnie umieść rurkę poniżej dolnego otworu każdej kolumny. Zdejmij zaślepki zarówno z góry, jak i z dołu każdej kolumny, aby bufor magazynujący mógł spływać do rur pod wpływem grawitacji.Po wyczerpaniu bufora magazynowego dodaj około 2,7 mililitra buforu do lizy do każdej kolumny, aby je zrównoważyć, upewniając się, że przepływ przepływa i jest odrzucany. Powtórz ten proces dodawania buforu do lizy i odrzucania przepływu trzy razy. Aby rozpocząć, załaduj każdą próbkę do odpowiedniej kolumny.Zbierz i wyrzuć przepływ. Dodaj 420 mikrolitrów buforu do lizy do każdej kolumny, aby przepłukać próbki. Pozwól, aby bufor do lizy przefiltrował się przez kolumnę, a następnie zebrał i odrzucił przepływ.Następnie umieść probówki pod każdą kolumną w celu pobrania próbki. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy do każdej kolumny, aby wymyć próbki. Zbierz przepływ, który zawiera teraz wzbogaconą populację tiofosforylowanych i alkilowanych substratów CK2 w reakcji kinazy.Tylko reakcja GTPgammaS będzie zawierać substraty tiofosforylowane i alkilowane przez dowolny obecny endogenny CK2. Reakcja tylko PNMB będzie zawierała alkilowane białka tła. Usunąć 80 mikrolitrów z każdej elucji jako próbkę kontrolną wejścia elucji.Następnie podziel każdą próbkę na dwie probówki, z których każda zawiera 200 mikrolitrów. Oznacz każdą z probówek jako ester antytiofosforanowy lub immunoglobulinę G, jak pokazano tutaj. Dodać 2,8 mikrograma przeciwciała antytiofosforanowego estru do każdej z probówek estru antytiofosforanowego.Dodać 2,8 mikrograma przeciwciała Isotype Control do każdej z probówek IGG. Następnie umieść rurki na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na dwie godziny. W ciągu ostatnich 15 minut inkubacji próbki użyj czystej żyletki, aby odciąć koniec końcówki pipety P200, aby zwiększyć rozmiar miernika.Bezpośrednio przed użyciem należy krótko wymieszać rurkę do przechowywania zawierającą kulki agarozy. Za pomocą wyciętej końcówki pipety przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny kulek na immunoprecypitację do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 mililitra. Ważne jest, aby przed każdym transferem wirować koraliki, aby zapobiec osiadaniu koralików.Odwiruj probówki pod ciśnieniem 17 500 razy większym niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Ponownie zawiesić kulki, dodając 200 mikrolitrów buforu do lizy i krótko wirując, aby wymieszać.Powtórz ten proces wirowania i mycia koralików trzy razy. Po ostatnim umyciu umieść koraliki na lodzie, aż będą gotowe do kontynuowania. Gdy próbki zakończą inkubację, odwiruj je pod ciśnieniem 17 500 razy większym niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty.Następnie przenieś 200 mikrolitrów każdej próbki do probówek zawierających umyte kulki. Umieść rurki na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na godzinę. Następnie odwiruj probówki pod ciśnieniem 17 500 razy większym niż grawitacja i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę.Usuń 40 mikrolitrów z każdego supernatantu, aby zapisać jako kontrolę wyczerpania. Usunąć i wyrzucić pozostałą część supernatantu, uważając, aby nie naruszyć kulek. Umyj próbki, dodając do każdej z nich 200 mikrolitrów buforu do lizy i krótko wirując.Wirować przy 17, 500 razy grawitacji i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę, odrzucając supernatant. Powtórz ten proces mycia i wirowania trzy razy, uważając, aby nie naruszyć kulek. Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu 2X próbki do każdej próbki zawierającej kulki.Dla wszystkich innych próbek, które obejmują kontrolę wejściową, kontrolę wejścia elucji i kontrolę zubożenia, dodaj 8 mikrolitrów buforu próbki 6X. Odpipetować każdą probówkę w górę i w dół, aby wymieszać z wyjątkiem probówek zawierających kulki, i podgrzać wszystkie próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut przed przystąpieniem do SDS-PAGE. Aby ocenić, czy immunoprecypitacja się powiodła, należy przepuścić od 25 do 30 mikrolitrów każdej próbki, która wydostała się z kulek, na oddzielnym 12,5% żelu poliakrylamidowym.Wybarwić każdy żel kolorem Coomassie Blue, aby uwidocznić wzbogacone białka z różnych etapów protokołu eksperymentalnego. Używając nowych, czystych żyletek, ostrożnie wytnij wszelkie unikalne prążki obecne w reakcji kinazy antytiofosforanowego estru IP Lane, zwracając uwagę na ich przybliżoną masę cząsteczkową. Do każdej unikalnej opaski należy użyć nowej żyletki.Podstawą tej techniki jest to, że technika ta jest niezwykłą zdolnością CK2 do wykorzystania GTP do przenoszenia grup fosforylowych. Dodanie egzogennego holoenzymu CK2 wraz z analogiem GTP, GTPgammaS, do lizatu komórkowego powoduje tiofosforylację endogennych substratów CK2. Późniejsze traktowanie lizatu odczynnikiem alkilującym mesylan p-nitrobenzylu generuje ugrupowanie estru tiofosforanowego na tych specyficznych białkach substratowych, które można następnie immunoprecypitować za pomocą przeciwciała anty-tiofosforanowego estru i ostatecznie zidentyfikować za pomocą spektrometrii mas.W reprezentatywnych pozytywnych wynikach pokazanych tutaj, zależnych od CK2, tiofosforylacja i późniejsza alkilacja zakończyły się sukcesem. Zgodnie z oczekiwaniami, wzmocniony sygnał estru antytiofosforanowego przez Western blot obserwuje się tylko na torze zawierającym kompletną reakcję kinazy, a nie tylko w próbkach traktowanych tylko GTPgammaS i PNMB. Żel barwiony na niebiesko Coomassie z immunoprecypitowanymi i nawiązanymi białkami również wykazuje pozytywny wynik.Ponieważ wiele unikalnych prążków jest widocznych tylko w estrze antytiofosforanowym IP Lane, w którym lizat inkubowano z egzogennymi CK2 i GTPgammaS. Oznaczone prążki są następnie wycinane z żelu i przekazywane do identyfikacji białka za pomocą spektrometrii mas. Zgodnie z tą procedurą, przypuszczalne substraty CK2 zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas muszą zostać zwalidowane przy użyciu dodatkowego podejścia, takiego jak fosforylacja zależna od CK2 w standardowym teście kinazy in vitro.

identification-novel-ck2-kinase-substrates-using-versatile

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Kinaza 2 z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRK2) jest dużą, wielodomenową kinazą, której mutacje stanowią najczęstszą genetyczną przyczynę choroby Parkinsona. Analiza aktywności kinazowej tego białka okazała się kluczowym narzędziem w zrozumieniu biologii i dysfunkcji tego białka. W niniejszej pracy opisano badanie aktywności kinazowej LRRK2 oraz wybranych jej mutantów in vitro, zapewniając system eksperymentalny do badania fosforylacji domniemanych substratów oraz potencjalnej dysfunkcji...

Oznaczanie aktywności kinazy LRRK2 in vitro

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Fosforylacja białek jest główną cechą tego, jak komórki interpretują i reagują na informacje w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu przedstawiamy wysokoprzepustowy protokół badań przesiewowych wykorzystujący kinazy oczyszczone z komórek ssaków w celu szybkiej identyfikacji kinaz, które fosforylują substrat (substraty) będący przedmiotem zainteresowania.

Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

Wiele przewidywanych (fosfo)lipaz jest słabo scharakteryzowanych pod względem specyficzności substratowej i funkcji fizjologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół optymalizacji aktywności enzymów, poszukiwania naturalnych substratów i proponowania funkcji fizjologicznych tych enzymów.

Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Tutaj prezentujemy ilościowy i skalowalny protokół do przeprowadzania ukierunkowanych badań przesiewowych małych cząsteczek dla regulatorów kinaz naiwnie zaszczepionego przejścia pluripotencjalnego.

Prosta metoda identyfikacji kinaz, które regulują pluripotencję embrionalnych komórek macierzystych za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych inhibitorów

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Przedstawiono szczegółowy protokół generowania samodzielnie składających się mikromacierzy białek ludzkich do badań przesiewowych inhibitorów kinaz.

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich

Tutaj wprowadzamy protokół do używania substratów z powierzchni drożdży do testów modyfikacji enzymatycznej. Platformę zademonstrowano, wykorzystując analizę aktywności defosforylacji fosfatazy tyrozynowej SHP-2 w stosunku do jednego z jej substratów jako reprezentatywny test modyfikacji enzymatycznej.

Modyfikacja enzymatyczna i cytometria przepływowa oceny białek powierzchniowych drożdży

Poznaj metodę identyfikacji substratów kinazy CK2 z próbek biologicznych przy użyciu etykietowania tiotrifosforanowego i immunoprecypitacji. Technika ta umożliwia badanie funkcji CK2 w różnych typach komórek i tkankach.

Identyfikacja nowych substratów kinazy CK2 przy użyciu wszechstronnego podejścia biochemicznego

Przeglądaj więcej filmów