Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Nasza metoda pomaga badać kinetykę powstawania kompleksu białkowego. Opisuje, jak ciasny jest kompleks białkowy i czy tworzenie kompleksu białkowego jest zakłócane przez inne białka. Technika ta umożliwia badanie interakcji białko-białko w sposób ilościowy przy użyciu fluorescencji jako reportera, nasz test może monitorować asocjację i dysocjację kompleksu białkowego w czasie rzeczywistym.

Aby rozpocząć, zaprojektuj test FRET, zaczynając od danych dla kompleksu COL1 CAND1 z bazy danych białek. Załaduj strukturę do PyMOL, a następnie przejdź do menu kreatora i użyj funkcji pomiaru, aby oszacować odległość między pierwszym aminokwasem CAND1 a ostatnim aminokwasem COL1. Następnie załaduj przeglądarkę widm online i wyświetl widma wzbudzenia i emisji 7-amino-4-metylokoumaryny i FlASH jednocześnie.

AMC jest dawcą FRET, a FlASH jest akceptorem FRET. Przygotuj komórki z białkiem dawcy FRET, postępując zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym. Następnie oczyść kompleks sortazy RBX1 COL1, dodając najpierw 50 mililitrów buforu do lizy do osadu komórek E.Coli wyrażających kompleks RBX1 sortazy COL1.

Zamrozić komórki na lodzie za pomocą sonikacji o amplitudzie 50%. Zmieniaj zasilanie na trzy minuty, tak aby było włączone na jedną sekundę, a następnie wyłączone na jedną sekundę, aby zapobiec przegrzaniu próbki. Przenieś powstały lizat komórkowy do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i usuń resztki komórek przez odwirowanie 25 000 razy g przez 45 minut.

Następnie dodaj supernatant do pięciu mililitrów kulek glutationu i inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć lizat komórkowy. Po inkubacji odwirować mieszaninę lizatu kulkowego w ilości 1 500 g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usunąć supernatant.

Następnie umyj kulki 5 mililitrami buforu do lizy bez inhibitora proteazy. Po odwirowaniu roztworu usunąć supernatant. Teraz dodaj trzy mililitry buforu do lizy do umytych kulek i przenieś zawiesinę kulek do pustej kolumny.

Do nowej kolumny dodaj również pięć mililitrów buforu elucyjnego, a następnie inkubuj kolumnę przez 10 minut i zbierz eluat. Następnie dodaj 200 mikrolitrów trombiny w ilości pięciu miligramów na mililitr do eluatu z kulek glutationu. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza rozcieńczyć próbkę białka trzykrotnie buforem A. Załadować próbkę białka do buforu Kolumna chromatografii kationowej z wymianą kationową w punkcie zerowym pięć mililitrów na minutę.

Następnie dodaj gradient od zera do 50% buforu B w buforze A, aby eluować białko z natężeniem przepływu 1 mililitra na minutę. Następnie połącz frakcje eluatu zawierające białko donorowe FRET i zagęść je do dwóch przecinków i pięciu mililitrów za pomocą membrany ultrafiltracyjnej z odcięciem 30 kilodaltonów. Teraz dodaj 7-amino-4-metylokoumarynę do c-końca COL1 poprzez transpeptydację za pośrednictwem sortazy, najpierw zmieniając bufor w próbce białka donorowego FRET na bufor sortazy za pomocą kolumny odsalającej.

Aby to osiągnąć, najpierw zrównoważ kolumnę odsalającą z 25 mililitrami buforu sortazy. Następnie załaduj dwa przecinki i pięć mililitrów roztworu białka dawcy FRET do kolumny i odrzuć przepływ. Następnie wymyj próbkę za pomocą trzech kropek pięciomililitrowych buforu sortazy i zbierz przepływ.

W 900 mikrolitrach eluatu dodać 100 mikrolitrów 600 mikromolowego oczyszczonego roztworu sortazy A i 10 mikrolitrów 25-milimolowego peptydu GGGG-AMC. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 30 stopni Celsjusza w ciemności przez noc, aby wytworzyć COL1-AMC-RBX1. Teraz załaduj całą próbkę do kolumny chromatograficznej wykluczającej rozmiar i wymyj ją jednym punktem pięciokrotnie większym od objętości kolumny buforu.

Na koniec połącz frakcje eluacyjne zawierające COL1-AMC-RBX1. Postępuj zgodnie z protokołem tekstowym, aby przygotować białko akceptorowe FRET. Wiele kroków jest podobnych do preparatu białka dawcy FRET.

Po zakończeniu przygotuj roztwór FlASH CAND1. Najpierw dodaj jeden mikrolitr roztworu FlASH do 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu tetra-cys-CAND1. Dobrze wymieszaj połączone roztwory i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej w ciemności przez jedną do dwóch godzin, aby utworzyć roztwór FlASH CAND1.

W 300 mikrolitrach buforu FRET dodać COL1-AMC-RBX1 do końcowego stężenia 70 nanomolowych i przenieść roztwór do kuwety. Umieścić kuwetę w uchwycie na sample fluoriometru. Wzbudz próbkę światłem wzbudzającym o długości 350 nanometrów i skanuj sygnały emisyjne od 400 do 600 nanometrów z dokładnością do jednego nanometra.

Następnie w 300 mikrolitrach buforu FRET dodać zarówno COL1-AMC-RBX1, jak i FlASH-CAND1 do końcowego stężenia 70 nanomolowców. Wzbudz próbkę światłem wzbudzającym o długości 350 nanometrów i skanuj sygnały emisyjne z 400-600 nanometrów z dokładnością do jednego nanometra. Ustaw światło wzbudzenia na 350 nanometrów i użyj filtra pasmowo-przepustowego, który przepuszcza światło emisyjne o długości 450 nanometrów i blokuje światło emisyjne o długości od 500 do 650 nanometrów.

Z zaworami próbki w pozycji napełniania podłączyć trzymililitrową strzykawkę wypełnioną wodą. Następnie umyj dwie strzykawki z próbkami wodą, przesuwając kilkakrotnie napęd strzykawki z próbką w górę i w dół, wylewając wodę po zakończeniu. Następnie podłącz trzymililitrową strzykawkę wypełnioną buforem FRET.

Umyć dwie strzykawki z próbkami buforem FRET, kilkakrotnie przesuwając napęd strzykawki z próbką w górę i w dół, wylewając wodę po zakończeniu. Teraz podłącz trzymililitrową strzykawkę i załaduj pierwszą strzykawkę z próbką, strzykawkę A, ze 100 nanomolowymi COL1-AMC-RBX1 do bufora FRET. Następnie przekręć zawór próbki do pozycji napędu Podłącz również trzymililitrową strzykawkę do strzykawki B i załaduj strzykawkę B 100 nanomolami FlAsh CAND1 do bufora FRET i przekręć jej zawór do pozycji napędu.

Otwórz panel sterowania w obszarze pobierania w oprogramowaniu i zarejestruj emisję COL1-AMC w ciągu 60 sekund. Następnie zrób jedno ujęcie. Dopasuj spadek i sygnały fluorescencyjne mierzone w czasie od każdego strzału do pojedynczej krzywej wykładniczej.

Umyj system, jak pokazano wcześniej, a następnie dodaj roztwór 100 nanomolowych COL1-AMC-RBX1 i 100 nanomolowych FlASH CAND1 w buforze FRET do strzykawki A. Podłącz go do systemu, gdy jest w pozycji napełnienia Załaduj strzykawkę A, a następnie przekręć zawór próbki do pozycji napędu. Następnie załadować roztwór Skp1-Skp2 do strzykawki B. Podłączyć ją do systemu, gdy znajduje się w pozycji napełnienia. Załadować strzykawkę B, a następnie obrócić próbkę do pozycji napędu.

W oprogramowaniu przejdź do pobierz i otwórz panel sterowania. Skonfiguruj program tak, aby rejestrował emisję COL1-AMC przez 30 sekund. Następnie zrób pojedynczy strzał.

Sygnały fluorescencyjne zwiększają się w czasie po zmieszaniu roztworów ze strzykawki A i strzykawki B. Gdy po 70 nanomoli COL1-AMC i FlASH CAND1 zmieszano w celu wytworzenia FRET, w widmach emisyjnych występowały dwa piki emisji. Szczyt COL1-AMC stał się niższy, a szczyt FlASH CAND1 stał się wyższy. Gdy do FRET użyto pełnej długości CAND1, pik dawcy wykazał 10% zmniejszenie intensywności.

Jednakże, gdy zastosowano CAND1 z obciętą pierwszą helisą, zmniejszenie intensywności piku donora zostało zwiększone do 30%, co sugeruje wyższą wydajność FRET Aby potwierdzić, że zmiany sygnału wynikały z FRET między COL1-AMC a FlASH CAND1, FRET dawcy zmieszano z nadmiarem nieznakowanego CAND1 znanego jako Chase w akceptorze. W rezultacie pik dawcy został w pełni przywrócony, a pik akceptora uległ zmniejszeniu. Pokazano tutaj wykres średniej obserwowanej wartości K ze stężeniem CAND1 po analizie regresji liniowej.

Aby zmierzyć stałą on-on kompleksu, użyto 50 nanomolowych COL1-AMC w serii obserwowanych stałych szybkości dysocjacji, które mierzono przez zmieszanie 50 nanomolowych COL1-AMC z rosnącymi stężeniami FlAsh CAND1. Podobnie jak w przypadku pomiaru stałej włączenia, obserwowaną stałą dysocjacji COL1 i CAND1 stwierdzono poprzez monitorowanie przywrócenia sygnału dawcy w czasie na fluorometrze o zatrzymanym przepływie. W tym przypadku sygnał dawcy szybko się zwiększył i ujawnił obserwowaną wartość K wynoszącą zero punktów cztery na sekundę.

W przeciwieństwie do tego, gdy bufor został dodany do wstępnie zmontowanego kompleksu, nie zaobserwowano wzrostu sygnału sugerującego, że szybka dysocjacja COL1 CAND1 została wyzwolona przez Skp1 Skp2. Upewnij się, że zminimalizujesz ilość światła, na które wystawione są białka donorowe i akceptorowe. Staraj się trzymać fluorofory w ciemności tak bardzo, jak to możliwe.