Name: Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Poznaj metodę FRET do badania kinetyki tworzenia się kompleksów białkowych w czasie rzeczywistym. Technika ta pozwala ilościowo analizować interakcje białkowe i oceniać ich dynamikę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) za wnikliwą dyskusję na temat rozwoju testu FRET. M.G., Y.Z. i X.L. zostały sfinansowane z funduszy startowych z Purdue University dla Y.Z. i X.L. Praca ta była częściowo wspierana przez grant zalążkowy z Purdue University Center for Plant Biology.

<ol><li>Stumpf, M. P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li>
<li>Kuzmanov, U., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+networks%3A+probing+disease+mechanisms+using+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems.</a> Genome Medicine. 5 (4), 37(2013).</li>
<li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+cellular+protein-protein+interactions%3A+Technological+strategies+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).</li>
<li>Lapetina, S., Gil-Henn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+simple%2C+direct%2C+and+quantitative+in+vitro+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays.</a> Journal of Biological Methods. 4 (1), 62(2017).</li>
<li>Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+kinetic+studies+of+biological+interactions%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).</li>
<li>Pierce, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cand1+promotes+assembly+of+new+SCF+complexes+through+dynamic+exchange+of+F+box+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins.</a> Cell. 153 (1), 206-215 (2013).</li>
<li>Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cand1-Mediated+Adaptive+Exchange+Mechanism+Enables+Variation+in+F-Box+Protein+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression.</a> Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).</li>
<li>Zheng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Cul1-Rbx1-Skp1-F+boxSkp2+SCF+ubiquitin+ligase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex.</a> Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).</li>
<li>Kleiger, G., Deshaies, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tag+Team+Ubiquitin+Ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tag Team Ubiquitin Ligases.</a> Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAND1+binds+to+unneddylated+CUL1+and+regulates+the+formation+of+SCF+ubiquitin+E3+ligase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex.</a> Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).</li>
<li>Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP120A+associates+with+unneddylated+cullin+1+and+regulates+its+neddylation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation.</a> FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).</li>
<li>Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP120A+associates+with+cullins+and+modulates+ubiquitin+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).</li>
<li>Goldenberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Cand1-Cul1-Roc1+complex+reveals+regulatory+mechanisms+for+the+assembly+of+the+multisubunit+cullin-dependent+ubiquitin+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases.</a> Cell. 119 (4), 517-528 (2004).</li>
<li>Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+ETA2%2C+an+apparent+ortholog+of+the+human+cullin-interacting+protein+CAND1%2C+is+required+for+auxin+responses+mediated+by+the+SCF%28TIR1%29+ubiquitin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase.</a> Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+CAND1%2C+an+Unmodified+CUL1-Interacting+Protein%2C+Is+Involved+in+Multiple+Developmental+Pathways+Controlled+by+Ubiquitin%2FProteasome-Mediated+Protein+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22the+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation.</a> the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).</li>
<li>Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtCAND1%2C+a+HEAT-repeat+protein+that+participates+in+auxin+signaling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).</li>
<li>Lo, S. -C., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAND1-Mediated+Substrate+Adaptor+Recycling+Is+Required+for+Efficient+Repression+of+Nrf2+by+Keap1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).</li>
<li>Okamoto, K., Sako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+FRET+for+the+study+of+protein+interactions+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics.</a> Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).</li>
<li>Hussain, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv+preprint%22%5BJournal%5D)">An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET).</a> arXiv preprint. , (2009).</li>
<li>Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression+and+purification+of+recombinant+SCF+ubiquitin+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases.</a> Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).</li>
<li>Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortagging%3A+A+versatile+method+for+protein+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sortagging: A versatile method for protein labeling.</a> Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).</li>
<li>Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Protein+Labeling+via+Sortase-Mediated+Transpeptidation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-PAGE+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">SDS-PAGE of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+E2-E3+Assembly+and+Disassembly+Enable+Processive+Ubiquitylation+of+Cullin-RING+Ubiquitin+Ligase+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates.</a> Cell. 139 (5), 957-968 (2009).</li>
<li>Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Stopped-flow+Kinetics+Methods+to+Investigate+the+Mechanism+of+Action+of+a+DNA+Repair+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).</li>
<li>Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Stopped-Flow+Fluorescence+and+Labeled+Nucleotides+to+Analyze+the+ATP+Turnover+Cycle+of+Kinesins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).</li>
<li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+fluorescent+protein+FRET+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">A guide to fluorescent protein FRET pairs.</a> Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).</li>
<li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li>
<li>Lin, C. T., Rorabacher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+approach+for+stopped-flow+kinetics+of+fast+second-order+reactions+involving+inhomogeneity+in+the+reaction+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell.</a> Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).</li>
<li>Toseland, C. P., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Reaction+Kinetic+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Fluorescent+Methods+for+Molecular+Motors%22%5BJournal%5D)">Rapid Reaction Kinetic Techniques.</a> Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).</li>
<li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+Synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li>
<li>Lin, C. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transglutaminase-catalyzed+site-specific+conjugation+of+small-molecule+probes+to+proteins+in+vitro+and+on+the+surface+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+short+peptide+tag+for+versatile+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).</li>
<li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDiaspro%2C+A+%22Handbook+Of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook Of Biological Confocal Microscopy</a>. , 690-702 (2006).</li>
<li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo%3A+Basis+of+biosensor+construction%2C+live+imaging%2C+and+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Development, Growth & Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).</li>
<li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+GTPase+movement+on+an+RNA+scaffold+drives+co-translational+protein+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting.</a> Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).</li>
<li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

FRET jest zjawiskiem fizycznym, które jest bardzo interesujące dla badania i zrozumienia systemów biologicznych19. W tym miejscu przedstawiamy protokół testowania i wykorzystania FRET do badania kinetyki wiązania dwóch oddziałujących ze sobą białek. Projektując FRET, wzięliśmy pod uwagę trzy główne czynniki: nakładanie się widma między emisją donorową a wzbudzeniem akceptorowym, odległość między dwoma fluoroforami oraz orientację dipolową fluoroforów28. Aby wybrać fluorofor...

Aktywność biologiczna jest ostatecznie przeprowadzana przez białka, z których większość oddziałuje z innymi dla prawidłowych funkcji biologicznych. Korzystając z podejścia obliczeniowego, całkowita ilość interakcji białko-białko u człowieka jest szacowana na ~650 0001, a zakłócenie tych interakcji często prowadzi do chorób2. Ze względu na ich istotną rolę w kontrolowaniu procesów komórkowych i organizmowych, opracowano liczne metody badania interakcji białko-białko, takich jak drożdże-dwie hybrydy, dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji, komplementacja rozszczepionej lucyferazy i test koimmunoprecypitacji3. Chociaż metody te są dobre w odkrywaniu i potwierdzaniu interakcji białko-białko, są one zwykle nieilościowe, a zatem dostarczają ograniczonych informacji na temat powinowactwa między oddziałującymi partnerami białkowymi. Ilościowe pull-downy mogą być używane do pomiaru powinowactwa wiązania (np. stałej dysocjacji Kd), ale nie mierzą kinetyki wiązania, ani nie mogą być stosowane, gdy Kd jest bardzo niskie z powodu nieodpowiedniego stosunku sygnału do szumu4. Spektroskopia powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) określa ilościowo kinetykę wiązania, ale wymaga określonej powierzchni i unieruchomienia jednego reagenta na powierzchni, co może potencjalnie zmienić właściwości wiązania reagenta5. Co więcej, SPR ma trudności z pomiarem szybkości asocjacji i dysocjacji5, a także nie jest właściwe używanie SPR do charakteryzowania zdarzenia wymiany podjednostek białkowych w kompleksie białkowym. W tym miejscu opisujemy metodę, która umożliwia pomiar szybkości składania i rozkładu kompleksu białkowego w milisekundowej skali czasowej. Metoda ta była niezbędna do określenia roli białka 1 isasocjowanego przez Cullin-a, N edd8-d (Cand1) jako czynnika wymiany białka F-box6,7.
Cand1 reguluje dynamikę ligaz E3 Skp1•Cul1•F-box protein (SCF), które należą do dużej rodziny ligaz ubikwityny Cullin-RING. SCF składają się z culliny Cul1, która wiąże białko domeny RING Rbx1, oraz wymiennego białka F-box, które rekrutuje substraty i wiąże Cul1 przez białko adaptorowe Skp18. Jako ligaza E3, SCF katalizuje koniugację ubikwityny z jej substratem i jest aktywowany, gdy substrat jest rekrutowany przez białko F-box i gdy Cul1 jest modyfikowany przez białko podobne do ubikwityny Nedd89. Cand1 wiąże niezmodyfikowany Cul1, a po związaniu zakłóca zarówno asocjację białka Skp1•F-box z Cul1, jak i koniugację Nedd8 z Cul110,11,12,13. W rezultacie, Cand1 wydawał się być inhibitorem aktywności SCF in vitro, ale niedobór Cand1 w organizmach powodował defekty, co sugeruje pozytywną rolę Cand1 w regulacji aktywności SCF in vivo14,15,16,17. Ten paradoks został ostatecznie wyjaśniony przez badanie ilościowe, które ujawniło dynamiczne interakcje między białkiem Cul1, Cand1 i Skp1•F-box. Korzystając z testów transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET), które wykrywają tworzenie się kompleksów SCF i Cul1•Cand1, stałe szybkości asocjacji i dysocjacji (odpowiednio kon i koff) mierzono indywidualnie. Pomiary wykazały, że zarówno białko Cand1, jak i Skp1•F-box tworzą niezwykle ścisły kompleks z Cul1, ale koff SCF jest dramatycznie zwiększone przez Cand1, a koff Cul1•Cand1 jest dramatycznie zwiększone przez Skp1•F-box protein6,7. Wyniki te stanowią wstępne i krytyczne wsparcie dla zdefiniowania roli Cand1 jako czynnika wymiany białek, który katalizuje tworzenie nowych kompleksów SCF poprzez recykling Cul1 ze starych kompleksów SCF.
Tutaj przedstawiamy procedurę opracowywania i używania testu FRET do badania dynamiki kompleksu Cul1•Cand1 class<sup="xref">7, a ta sama zasada może być zastosowana do badania dynamiki różnych biomolekuł. FRET występuje, gdy donor jest wzbudzany odpowiednią długością fali, a akceptor o widmie wzbudzenia nakładającym się na widmo emisji donorowej jest obecny w odległości 10-100 A. Stan wzbudzony jest przenoszony do akceptora, zmniejszając w ten sposób intensywność donora i zwiększając intensywność akceptora18. Skuteczność FRET (E) zależy zarówno od promienia Förstera (R0), jak i odległości między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi (r) i jest określona wzorem: E = R06/(R06 + r6). Promień Förstera (R0) zależy od kilku czynników, w tym od orientacji kątowej dipola, nakładania się widmowego pary donor-akceptor oraz zastosowanego roztworu19. Aby zastosować test FRET na fluorymetrze z zatrzymanym przepływem, który monitoruje zmianę emisji donora w czasie rzeczywistym i umożliwia pomiary szybkiego włączania i wyłączania k, konieczne jest ustalenie wydajnego FRET, który skutkuje znacznym zmniejszeniem emisji donora. Dlatego ważne jest zaprojektowanie wydajnego FRET poprzez wybór odpowiedniej pary barwników fluorescencyjnych i miejsc na białkach docelowych do przyłączenia barwników, co zostanie omówione w tym protokole.

<table><tbody><tr><td>Kolumna chromatografii anionowymiennej</td><td>GE Healthcare</td><td>17505301</td><td>Kolumna chromatografii anionowej HiTrap Q FF</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>2231000511</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Kompetentne komórki</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C600003</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>C78-500</td><td></td></tr><tr><td>Wymiana kationowa Kolumna chromatograficzna</td><td>GE Healthcare</td><td>17505401</td><td>HiTrap SP Sepharose FF</td></tr><tr><td>Kolumna odsalająca</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka podłogowa (wysoka prędkość)</td><td>Beckman Coulter</td><td>J2-MC</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka podłogowa (wolna prędkość)</td><td>Beckman Coulter</td><td>J6-MI</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence SpectraViewer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td></tr><tr><td>FluoroMax FluoroMax</td><td>HORIBA</td><td>FluoroMax-3</td><td></td></tr><tr><td>FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>peptyd GGGGAMC</td> Nowa <td>Anglia Peptyd</td><td>niestandardowa synteza</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki glutationu</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td>17075605</tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-100</td><td></td></tr><tr><td>Izopropylo-&beta;-D-tiogalaktozyd (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-529-019</td><td></td></tr><tr><td>Bulion LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MiliporeSigma</td><td>A2512</td><td></td></tr><tr><td>wektor pGEX-4T-2</td><td>GE Healthcare</td><td>28954550</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>MilliporeSigma</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Zredukowany glutation</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP25211</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka chłodnicza</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0004</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta Kompetentne komórki</td><td>MilliporeSigma</td><td>70953-3</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna chromatograficzna wykluczająca rozmiar</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>Kolumna Superdex 200 10/300 GL</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Fluorymetr z zatrzymanym przepływem</td><td>Hi-Tech Scientific</td><td>SF-61 DX2</td><td></td></tr><tr><td>TCEP&middot; HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI20490</td><td></td></tr><tr><td>Trombin</td><td>MilliporeSigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Membrana ultrafiltracyjna</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC903008</td><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15, Ultra-15, 30 000 NMWL</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Białka są głównymi operatorami systemów biologicznych i zazwyczaj oddziałują z innymi makro- lub małymi cząsteczkami, aby realizować swoje biologiczne funkcje. Takie interakcje mogą być bardzo dynamiczne, co oznacza, że oddziałujące podjednostki są stale powiązane i dysocjowane w określonym tempie. Podczas gdy pomiar powinowactwa wiązania za pomocą technik takich jak ilościowe ściąganie ujawnia siłę oddziaływania, badanie kinetyki wiązania dostarcza informacji na temat tego, jak szybko zachodzi interakcja i jak długo może istnieć każdy kompleks. Co więcej, pomiar kinetyki interakcji w obecności dodatkowego czynnika, takiego jak czynnik wymiany białka lub lek, pomaga ujawnić mechanizm, za pomocą którego interakcja jest regulowana przez drugi czynnik, dostarczając ważnej wiedzy dla postępu badań biologicznych i medycznych. W tym miejscu opisujemy protokół pomiaru kinetyki wiązania kompleksu białkowego, który ma wysoki współczynnik asocjacji wewnętrznej i może być szybko dysocjowany przez inne białko. Metoda wykorzystuje transfer energii rezonansu fluorescencyjnego do raportowania powstawania kompleksu białkowego in vitro i umożliwia monitorowanie szybkiej asocjacji i dysocjacji kompleksu w czasie rzeczywistym na fluorymetrze z zatrzymanym przepływem. Za pomocą tego testu określa się ilościowo stałe szybkości asocjacji i dysocjacji kompleksu białkowego.

Aby przetestować FRET między Cul1AMC a FlAsHCand1, najpierw określono intensywność emisji odpowiednio 70 nM Cul1AMC (donora) oraz 70 nM FlAsHCand1 (akceptora) (Rysunek 3A-C, niebieskie linie). W każdej analizie obecny był tylko jeden pik emisji, a emisja FlAsHCand1 (akceptora) była niska. Po zmieszaniu 70 nM Cul1AMC i 70 nM FlAsHCand1 w celu wywołania FRET, w widmach...

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Nasza metoda pomaga badać kinetykę powstawania kompleksu białkowego. Opisuje, jak ciasny jest kompleks białkowy i czy tworzenie kompleksu białkowego jest zakłócane przez inne białka. Technika ta umożliwia badanie interakcji białko-białko w sposób ilościowy przy użyciu fluorescencji jako reportera, nasz test może monitorować asocjację i dysocjację kompleksu białkowego w czasie rzeczywistym.Aby rozpocząć, zaprojektuj test FRET, zaczynając od danych dla kompleksu COL1 CAND1 z bazy danych białek. Załaduj strukturę do PyMOL, a następnie przejdź do menu kreatora i użyj funkcji pomiaru, aby oszacować odległość między pierwszym aminokwasem CAND1 a ostatnim aminokwasem COL1. Następnie załaduj przeglądarkę widm online i wyświetl widma wzbudzenia i emisji 7-amino-4-metylokoumaryny i FlASH jednocześnie.AMC jest dawcą FRET, a FlASH jest akceptorem FRET. Przygotuj komórki z białkiem dawcy FRET, postępując zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym. Następnie oczyść kompleks sortazy RBX1 COL1, dodając najpierw 50 mililitrów buforu do lizy do osadu komórek E.Coli wyrażających kompleks RBX1 sortazy COL1.Zamrozić komórki na lodzie za pomocą sonikacji o amplitudzie 50%. Zmieniaj zasilanie na trzy minuty, tak aby było włączone na jedną sekundę, a następnie wyłączone na jedną sekundę, aby zapobiec przegrzaniu próbki. Przenieś powstały lizat komórkowy do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i usuń resztki komórek przez odwirowanie 25 000 razy g przez 45 minut.Następnie dodaj supernatant do pięciu mililitrów kulek glutationu i inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć lizat komórkowy. Po inkubacji odwirować mieszaninę lizatu kulkowego w ilości 1 500 g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usunąć supernatant.Następnie umyj kulki 5 mililitrami buforu do lizy bez inhibitora proteazy. Po odwirowaniu roztworu usunąć supernatant. Teraz dodaj trzy mililitry buforu do lizy do umytych kulek i przenieś zawiesinę kulek do pustej kolumny.Do nowej kolumny dodaj również pięć mililitrów buforu elucyjnego, a następnie inkubuj kolumnę przez 10 minut i zbierz eluat. Następnie dodaj 200 mikrolitrów trombiny w ilości pięciu miligramów na mililitr do eluatu z kulek glutationu. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza rozcieńczyć próbkę białka trzykrotnie buforem A. Załadować próbkę białka do buforu Kolumna chromatografii kationowej z wymianą kationową w punkcie zerowym pięć mililitrów na minutę.Następnie dodaj gradient od zera do 50% buforu B w buforze A, aby eluować białko z natężeniem przepływu 1 mililitra na minutę. Następnie połącz frakcje eluatu zawierające białko donorowe FRET i zagęść je do dwóch przecinków i pięciu mililitrów za pomocą membrany ultrafiltracyjnej z odcięciem 30 kilodaltonów. Teraz dodaj 7-amino-4-metylokoumarynę do c-końca COL1 poprzez transpeptydację za pośrednictwem sortazy, najpierw zmieniając bufor w próbce białka donorowego FRET na bufor sortazy za pomocą kolumny odsalającej.Aby to osiągnąć, najpierw zrównoważ kolumnę odsalającą z 25 mililitrami buforu sortazy. Następnie załaduj dwa przecinki i pięć mililitrów roztworu białka dawcy FRET do kolumny i odrzuć przepływ. Następnie wymyj próbkę za pomocą trzech kropek pięciomililitrowych buforu sortazy i zbierz przepływ.W 900 mikrolitrach eluatu dodać 100 mikrolitrów 600 mikromolowego oczyszczonego roztworu sortazy A i 10 mikrolitrów 25-milimolowego peptydu GGGG-AMC. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 30 stopni Celsjusza w ciemności przez noc, aby wytworzyć COL1-AMC-RBX1. Teraz załaduj całą próbkę do kolumny chromatograficznej wykluczającej rozmiar i wymyj ją jednym punktem pięciokrotnie większym od objętości kolumny buforu.Na koniec połącz frakcje eluacyjne zawierające COL1-AMC-RBX1. Postępuj zgodnie z protokołem tekstowym, aby przygotować białko akceptorowe FRET. Wiele kroków jest podobnych do preparatu białka dawcy FRET.Po zakończeniu przygotuj roztwór FlASH CAND1. Najpierw dodaj jeden mikrolitr roztworu FlASH do 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu tetra-cys-CAND1. Dobrze wymieszaj połączone roztwory i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej w ciemności przez jedną do dwóch godzin, aby utworzyć roztwór FlASH CAND1.W 300 mikrolitrach buforu FRET dodać COL1-AMC-RBX1 do końcowego stężenia 70 nanomolowych i przenieść roztwór do kuwety. Umieścić kuwetę w uchwycie na sample fluoriometru. Wzbudz próbkę światłem wzbudzającym o długości 350 nanometrów i skanuj sygnały emisyjne od 400 do 600 nanometrów z dokładnością do jednego nanometra.Następnie w 300 mikrolitrach buforu FRET dodać zarówno COL1-AMC-RBX1, jak i FlASH-CAND1 do końcowego stężenia 70 nanomolowców. Wzbudz próbkę światłem wzbudzającym o długości 350 nanometrów i skanuj sygnały emisyjne z 400-600 nanometrów z dokładnością do jednego nanometra. Ustaw światło wzbudzenia na 350 nanometrów i użyj filtra pasmowo-przepustowego, który przepuszcza światło emisyjne o długości 450 nanometrów i blokuje światło emisyjne o długości od 500 do 650 nanometrów.Z zaworami próbki w pozycji napełniania podłączyć trzymililitrową strzykawkę wypełnioną wodą. Następnie umyj dwie strzykawki z próbkami wodą, przesuwając kilkakrotnie napęd strzykawki z próbką w górę i w dół, wylewając wodę po zakończeniu. Następnie podłącz trzymililitrową strzykawkę wypełnioną buforem FRET.Umyć dwie strzykawki z próbkami buforem FRET, kilkakrotnie przesuwając napęd strzykawki z próbką w górę i w dół, wylewając wodę po zakończeniu. Teraz podłącz trzymililitrową strzykawkę i załaduj pierwszą strzykawkę z próbką, strzykawkę A, ze 100 nanomolowymi COL1-AMC-RBX1 do bufora FRET. Następnie przekręć zawór próbki do pozycji napędu Podłącz również trzymililitrową strzykawkę do strzykawki B i załaduj strzykawkę B 100 nanomolami FlAsh CAND1 do bufora FRET i przekręć jej zawór do pozycji napędu.Otwórz panel sterowania w obszarze pobierania w oprogramowaniu i zarejestruj emisję COL1-AMC w ciągu 60 sekund. Następnie zrób jedno ujęcie. Dopasuj spadek i sygnały fluorescencyjne mierzone w czasie od każdego strzału do pojedynczej krzywej wykładniczej.Umyj system, jak pokazano wcześniej, a następnie dodaj roztwór 100 nanomolowych COL1-AMC-RBX1 i 100 nanomolowych FlASH CAND1 w buforze FRET do strzykawki A. Podłącz go do systemu, gdy jest w pozycji napełnienia Załaduj strzykawkę A, a następnie przekręć zawór próbki do pozycji napędu. Następnie załadować roztwór Skp1-Skp2 do strzykawki B. Podłączyć ją do systemu, gdy znajduje się w pozycji napełnienia. Załadować strzykawkę B, a następnie obrócić próbkę do pozycji napędu.W oprogramowaniu przejdź do pobierz i otwórz panel sterowania. Skonfiguruj program tak, aby rejestrował emisję COL1-AMC przez 30 sekund. Następnie zrób pojedynczy strzał.Sygnały fluorescencyjne zwiększają się w czasie po zmieszaniu roztworów ze strzykawki A i strzykawki B. Gdy po 70 nanomoli COL1-AMC i FlASH CAND1 zmieszano w celu wytworzenia FRET, w widmach emisyjnych występowały dwa piki emisji. Szczyt COL1-AMC stał się niższy, a szczyt FlASH CAND1 stał się wyższy. Gdy do FRET użyto pełnej długości CAND1, pik dawcy wykazał 10% zmniejszenie intensywności.Jednakże, gdy zastosowano CAND1 z obciętą pierwszą helisą, zmniejszenie intensywności piku donora zostało zwiększone do 30%, co sugeruje wyższą wydajność FRET Aby potwierdzić, że zmiany sygnału wynikały z FRET między COL1-AMC a FlASH CAND1, FRET dawcy zmieszano z nadmiarem nieznakowanego CAND1 znanego jako Chase w akceptorze. W rezultacie pik dawcy został w pełni przywrócony, a pik akceptora uległ zmniejszeniu. Pokazano tutaj wykres średniej obserwowanej wartości K ze stężeniem CAND1 po analizie regresji liniowej.Aby zmierzyć stałą on-on kompleksu, użyto 50 nanomolowych COL1-AMC w serii obserwowanych stałych szybkości dysocjacji, które mierzono przez zmieszanie 50 nanomolowych COL1-AMC z rosnącymi stężeniami FlAsh CAND1. Podobnie jak w przypadku pomiaru stałej włączenia, obserwowaną stałą dysocjacji COL1 i CAND1 stwierdzono poprzez monitorowanie przywrócenia sygnału dawcy w czasie na fluorometrze o zatrzymanym przepływie. W tym przypadku sygnał dawcy szybko się zwiększył i ujawnił obserwowaną wartość K wynoszącą zero punktów cztery na sekundę.W przeciwieństwie do tego, gdy bufor został dodany do wstępnie zmontowanego kompleksu, nie zaobserwowano wzrostu sygnału sugerującego, że szybka dysocjacja COL1 CAND1 została wyzwolona przez Skp1 Skp2. Upewnij się, że zminimalizujesz ilość światła, na które wystawione są białka donorowe i akceptorowe. Staraj się trzymać fluorofory w ciemności tak bardzo, jak to możliwe.

using-vitro-fluorescence-resonance-energy-transfer-to-study-dynamics

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Kluczowe etapy funkcjonowania białka, w szczególności zmiany konformacyjne szkieletu i reakcje transferu protonów, często odbywają się w skali od mikrosekund do milisekund. Te dynamiczne procesy można badać za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowo-rozdzielczym, w szczególności w przypadku białek, których funkcja jest wyzwalana przez światło.

Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) pomiędzy dwiema cząsteczkami fluoroforu może być wykorzystany do badania interakcji białek w żywej komórce. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru FRET w żywych komórkach poprzez wykrywanie uczulonej emisji akceptora i wygaszanie cząsteczki donorowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Transfer energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki to metoda, która śledzi dynamikę tRNA podczas syntezy białek rybosomalnych. Śledząc poszczególne rybosomy, identyfikuje się niejednorodne populacje, które rzucają światło na mechanizmy. Metoda ta może być wykorzystana do śledzenia biologicznych zmian konformacyjnych w ogóle, aby ujawnić zależności dynamiczno-funkcyjne w wielu innych złożonych biosystemach. W metodach jednocząsteczkowych można zaobserwować etapy nieograniczające szybkości i...

Badanie transferu energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki w syntezie białek rybosomów

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Poznaj metodę FRET do badania kinetyki tworzenia się kompleksów białkowych w czasie rzeczywistym. Technika ta pozwala ilościowo analizować interakcje białkowe i oceniać ich dynamikę.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Przeglądaj więcej filmów