Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell
2 lutego 2019
Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.
Ruchliwość komórek nowotworowych ma kluczowe znaczenie dla zainicjowania przerzutów. Dlatego badanie ruchu komórek i zdolności inwazyjnych komórek nowotworowych jest bardzo interesujące. Ta zintegrowana metoda badania migracji i inwazji komórek nowotworowych, na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewnia łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania ruchliwości i patologii komórek.
Ta metoda może zapewnić wgląd w inwazję komórek rakowych przez macierz zewnątrzkomórkową i może być stosowana do innych typów komórek. Aby uzyskać optymalny czas zarysowywania, upewnij się, że gęstość wysiewu została zoptymalizowana i nie przedłużaj okresu inkubacji, gdy monowarstwa komórkowa osiągnie 100-procentową konfluencję. Aby określić optymalną liczbę wysiewanych komórek do testu migracji, umieść komórki w trzech częściach o różnych gęstościach na płytce o 96 ściankach.
Umieść płytkę w imagerze Live Cell i wybierz opcję Zaplanuj skanowanie z listy zadań w oprogramowaniu imagera. W okienku ustawień szuflady określ pozycje blachy i kliknij dodaj naczynie, aby wybrać typ blachy. W okienku ustawień skanowania wybierz lub edytuj wzorzec skanowania zgodnie z konfiguracją płytki eksperymentalnej i ustaw typ skanowania jako standardowy.
Kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu i wybierz ustaw interwały. Następnie ustaw dodawanie skanów co dwie godziny na 24 godziny i kliknij Zastosuj. Po 24 godzinach otwórz ustawienia szuflady, aby umożliwić wybór płytki eksperymentalnej, a następnie kliknij usuń naczynie.
Wybierz od trzech do sześciu reprezentatywnych obrazów i umieść je w nowej kolekcji obrazów. Aby określić prawidłową definicję przetwarzania, użyj korekty segmentacji, czyszczenia i filtrów, aby zastosować odpowiednią maskę konfluencji, a następnie użyj podglądu bieżącego wszystkiego, aby wyświetlić dokładność masek. Uruchom zadanie analizy i określ zoptymalizowaną gęstość komórek, zgodnie z przybliżoną 100-procentową konfluencją w czasie, w ciągu sześciu do osiemnastu godzin, w zależności od tego, kiedy rozpoczyna się test migracji.
Następnie zastosuj narzędzie do analizy przetwarzania konfluencji do obrazów kontrastu fazowego o wysokiej rozdzielczości, które są automatycznie zbierane w celu wygenerowania krzywej proliferacji komórek w czasie. Przed rozpoczęciem testu pokryj płytkę do testu inwazji 50 mikrolitrami żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej, rozcieńczonego w lodowatej pożywce do hodowli komórkowych, do stężenia 100 mikrogramów na mililitr. Następnie umieść na noc płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.
Następnego popołudnia delikatnie odessać nadmiar pożywki i poszczepić komórki w zoptymalizowanej gęstości, w trzech powtórzeniach, do odpowiednich dołków płytki pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową oraz do dodatkowej niepowlekanej płytki 96-dołkowej. Następnie umieść płytki na noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego ranka umieść niepowlekaną płytkę do badania migracji w uchwycie płyty podstawy narzędzia do drapania i użyj kołków prowadzących, aby ostrożnie umieścić górną część uchwytu na podstawie.
Naciśnij i przytrzymaj czarną dźwignię, jednocześnie ostrożnie podnosząc blok sworznia, aby zrobić zadrapania. Rysy w każdym dołku powinny być widoczne gołym okiem, a także pod mikroskopem. Następnie umyj płytkę raz lub dwa razy podgrzaną pożywką hodowlaną, aby usunąć wszelkie oderwane komórki lub arkusze komórek.
W przypadku testu inwazji należy zarysować pokrytą płytkę, jak właśnie pokazano. Po usunięciu wszelkich oderwanych komórek i arkuszy, użyj wstępnie schłodzonego pojemnika chłodzącego, aby wyrównać płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie ostrożnie zasysaj zimne podłoże. Następnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonego żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej do odpowiednich studzienek i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzydzieści minut.
Bąbelki są powszechne podczas pracy z żelem do macierzy zewnątrzkomórkowej, ale można je wyeliminować, odsysając 70 procent etanolu. Następnie dodać 100 mikrolitrów świeżej, ciepłej pożywki, z badanym związkiem lub bez, do odpowiednich dołków płytki do oznaczania migracji lub inwazji i umieścić płytkę na platformie do obrazowania żywych komórek. Aby wyczyścić narzędzie do drapania, umieść górny blok kołków w indywidualnych 45-mililitrowych łodziach myjących, zawierających 5 procent detergentu jeden, jeden procent detergentu dwa, sterylną wodę destylowaną lub 70 procent etanolu przez pięć minut na mycie przed umieszczeniem narzędzia do drapania z powrotem na płycie podstawy, w celu przechowywania w środowisku wolnym od kurzu.
Aby zobrazować testy rany, po pozostawieniu płytki do równowagi przez pięć minut, wybierz typ naczynia jako płaszczyznę logarytmu obrazu i ustaw typ skanowania jako ranę zadrapania. Wybierz lub edytuj wzór skanowania, zgodnie z konfiguracją płytki eksperymentalnej, i zaplanuj 24 godziny powtarzania skanowania co jedną do dwóch godzin przez 72 godziny lub do momentu, gdy rany się zagoją, jak pokazano. Gdy wszystkie rany się zagoją, przerwij skanowanie i wybierz od trzech do sześciu reprezentatywnych obrazów, obejmujących zakres procentów dźwięku, w tym obrazy zaraz po wykonaniu rany i zamknięcie rany o 10 i 50 procent.
Aby określić prawidłową definicję przetwarzania, zastosuj odpowiednią maskę rany na zadrapania i maskę zbiegu, jak pokazano, a następnie użyj podglądu bieżącego wszystkiego, aby wyświetlić dokładność masek. Następnie uruchom zadanie analizy. W teście migracji szerokość rany to średnia odległość między arkuszami komórek obok rany.
Zbieg rany to zbieg w obrębie zranionego obszaru. Idealna początkowa zbieżność rany powinna być bliska zeru procent. Względna gęstość rany i zbieg rany sugerują szybkość komórek zajmujących obszar rany zadrapania.
Dane te prawie pokrywają się w obu tych reprezentatywnych liniach komórkowych. Różne linie komórkowe wykazują bardzo różne zdolności gojenia się ran, co wskazuje na zróżnicowane zdolności migracyjne między liniami komórkowymi. Na przykład lamellipodia obserwuje się w tej linii komórkowej gruczolakoraka piersi na froncie migracji na początku migracji, podczas gdy ta linia komórkowa raka piersi wytwarzająca mucynę 1 nie wykazywała żadnych oznak migracji komórek w tym samym punkcie czasowym.
Co więcej, względna gęstość ran linii gruczolakoraka piersi była nasycona po 50 godzinach, podczas gdy względna gęstość rany linii komórkowej raka piersi wytwarzającej mucynę 1 nie zmieniała się w czasie, co podkreśla wysoce inwazyjny fenotyp komórek gruczolakoraka i nieinwazyjność komórek raka piersi wytwarzających mucynę 1. Komórki gruczolakoraka zachowywały się również inaczej podczas inwazji przez żel macierzy zewnątrzkomórkowej, wykazując wydłużoną morfologię z wiodącymi wypukłościami, a w testach migracji uwidoczniono pęcherzyk na froncie migracji. Podczas powlekania pamiętaj, że jeśli wysianych zostanie zbyt mało komórek, rysa nie utworzy się prawidłowo, a jeśli zostanie wysianych zbyt wiele komórek, nastąpi przepełnienie.
Po tej procedurze można dodać zabiegi na ścieżce, co pozwala na dostosowanie tej metody do wysokoprzepustowych badań przesiewowych ścieżek. Metoda ta pozwala naukowcom wykonywać te testy na jednej platformie, która jest wysoce przepustowa i pozwala naukowcom monitorować swoje komórki w czasie rzeczywistym, a nie w eksperymentalnym punkcie końcowym. Środki dezynfekujące używane do sterylizacji narzędzia do drapania mogą być niebezpieczne.
Upewnij się, że zbierasz i utylizujesz roztwory zgodnie z odpowiednią kartą charakterystyki i regularnymi liniami wyzwalającymi w Twoim zakładzie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym. Oferuje on powtarzalne i efektywne podejście do analizy mobilności oraz morfologii komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Badania nad rakiem
- Migracja komórek
Wprowadzenie
- Mobilność komórek nowotworowych jest niezbędna do powstawania przerzutów.
- Zrozumienie przemieszczania się komórek guza jest kluczowe dla opracowywania terapii.
- Metodę tę można zastosować do różnych typów komórek.
- Przedstawiono informacje na temat inwazji komórek nowotworowych przez macierz pozakomórkową.
Cel badania
- Badanie migracji i inwazji komórek nowotworowych.
- Zapewnienie efektywnej czasowo metody badania mobilności komórek.
- Optymalizacja warunków dla testów migracji.
Zastosowane metody
- Zintegrowana metoda obserwacji w czasie rzeczywistym.
- Optymalizacja gęstości siewu dla testów zarysowania (scratch assays).
- Zastosowanie płytki 96-dołkowej do prób gęstości komórek.
- Monitorowanie konfluencji komórek w celu określenia optymalnego czasu inkubacji.
Główne wyniki
- Dane w czasie rzeczywistym dotyczące migracji i inwazji komórek nowotworowych.
- Ustalenie optymalnych warunków przeprowadzania testów.
- Wgląd w zachowanie komórek nowotworowych w kontrolowanym środowisku.
- Potencjalne zastosowania w odniesieniu do innych typów komórek poza komórkami nowotworowymi.
Wnioski
- Metoda ta jest powtarzalna i wydajna w badaniu mobilności komórek.
- Dostarcza ona cennych informacji na temat zachowania komórek nowotworowych.
- Dalsze zastosowania mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia różnych typów komórek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Ilościowe testy migracji i inwazji są kluczowe dla ograniczania ryzyka przy wyborze celów onkologicznych oraz oceny potencjału przerzutowego w modelach przedklinicznych. Zautomatyzowane platformy do obrazowania żywych komórek umożliwiają powtarzalną, wysokoprzepustową ocenę ruchliwości komórek, co zwiększa pewność predykcyjną w wczesnej fazie odkrywania leków oraz w badaniach translacyjnych. Integracja analizy w czasie rzeczywistym usprawnia podejmowanie decyzji w kluczowych punktach zwrotnych w portfelach projektów onkologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną walidację celów związanych z przerzutowaniem poprzez ilościowe określanie ruchu i inwazji komórek.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnianie fenotypów inwazyjnych od nieinwazyjnych w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Ułatwia selekcję projektów w portfelu badawczym poprzez dostarczanie danych porównawczych dla różnych linii komórkowych i warunków terapeutycznych.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Przygotowuje zwalidowane, powtarzalne testy migracji i inwazji do późniejszego przesiewu związków.
- Standaryzuje warunki testów oraz wyniki ilościowe przy użyciu zautomatyzowanych modułów obrazowania i analizy.
- Umożliwia przygotowanie do wysokoprzepustowego przesiewu oraz skalowalność platformy dla różnorodnych programów onkologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane dotyczące inwazji in vitro z procesami przerzutniczymi istotnymi dla przebiegu choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera optymalizację rozwoju z uwzględnieniem ryzyka poprzez korelację zachowania komórek z przedklinicznymi punktami końcowymi skuteczności.
- dostarcza wglądu w mechanizmy wpływu związków na ruchliwość komórek i ich inwazję przez macierz zewnątrzkomórkową.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy schemat postępowania łączy etapy wczesnego odkrywania, identyfikacji wiodących związków oraz walidacji przedklinicznej, dostarczając ustandaryzowanych, ilościowych danych dotyczących migracji i inwazji. Zautomatyzowane moduły obrazowania i analizy zapewniają powtarzalność i porównywalność wyników między badaniami.
- Biologia odkrywcza: Pozwala na ilościowe określenie motylości i inwazyjności komórek w celu testowania hipotez dotyczących przerzutowania oraz wyjaśnienia funkcji celów terapeutycznych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, wysokoprzepustowe wyniki do oceny związków chemicznych i optymalizacji testów.
- Analityka: Zapewnia ilościowe parametry w czasie rzeczywistym, takie jak szerokość rany, konfluencja i względna gęstość rany.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy inwazyjności in vitro z potencjałem przerzutowym in vivo przy odpowiednim doborze modelu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje elastyczny przepływ pracy na jednej platformie, który można dostosować do wielu typów komórek i projektów doświadczalnych.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad przerzutami.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i przepustowość dzięki zautomatyzowanemu obrazowaniu i analizie.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie solidnych, ilościowych porównań.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój zasobów onkologicznych w oparciu o funkcjonalne dane dotyczące inwazji.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli komórkowych, przygotowania testów oraz obsługi aparatury do obrazowania żywych komórek.
- Konieczny jest dostęp do zautomatyzowanych platform obrazowania oraz kompatybilnych modułów oprogramowania analitycznego.
- Wymagana jest standaryzacja gęstości wysiewu, czasu inkubacji oraz parametrów analizy obrazu pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych linii komórkowych i składów macierzy po optymalizacji protokołu.
- Niezbędne jest ostrożne obchodzenie się z dezynfekcjami i odczynnikami oraz ich utylizacja zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa w placówce.
