Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell
February 2nd, 2019
Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.
Ruchliwość komórek nowotworowych ma kluczowe znaczenie dla zainicjowania przerzutów. Dlatego badanie ruchu komórek i zdolności inwazyjnych komórek nowotworowych jest bardzo interesujące. Ta zintegrowana metoda badania migracji i inwazji komórek nowotworowych, na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewnia łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania ruchliwości i patologii komórek.
Ta metoda może zapewnić wgląd w inwazję komórek rakowych przez macierz zewnątrzkomórkową i może być stosowana do innych typów komórek. Aby uzyskać optymalny czas zarysowywania, upewnij się, że gęstość wysiewu została zoptymalizowana i nie przedłużaj okresu inkubacji, gdy monowarstwa komórkowa osiągnie 100-procentową konfluencję. Aby określić optymalną liczbę wysiewanych komórek do testu migracji, umieść komórki w trzech częściach o różnych gęstościach na płytce o 96 ściankach.
Umieść płytkę w imagerze Live Cell i wybierz opcję Zaplanuj skanowanie z listy zadań w oprogramowaniu imagera. W okienku ustawień szuflady określ pozycje blachy i kliknij dodaj naczynie, aby wybrać typ blachy. W okienku ustawień skanowania wybierz lub edytuj wzorzec skanowania zgodnie z konfiguracją płytki eksperymentalnej i ustaw typ skanowania jako standardowy.
Kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu i wybierz ustaw interwały. Następnie ustaw dodawanie skanów co dwie godziny na 24 godziny i kliknij Zastosuj. Po 24 godzinach otwórz ustawienia szuflady, aby umożliwić wybór płytki eksperymentalnej, a następnie kliknij usuń naczynie.
Wybierz od trzech do sześciu reprezentatywnych obrazów i umieść je w nowej kolekcji obrazów. Aby określić prawidłową definicję przetwarzania, użyj korekty segmentacji, czyszczenia i filtrów, aby zastosować odpowiednią maskę konfluencji, a następnie użyj podglądu bieżącego wszystkiego, aby wyświetlić dokładność masek. Uruchom zadanie analizy i określ zoptymalizowaną gęstość komórek, zgodnie z przybliżoną 100-procentową konfluencją w czasie, w ciągu sześciu do osiemnastu godzin, w zależności od tego, kiedy rozpoczyna się test migracji.
Następnie zastosuj narzędzie do analizy przetwarzania konfluencji do obrazów kontrastu fazowego o wysokiej rozdzielczości, które są automatycznie zbierane w celu wygenerowania krzywej proliferacji komórek w czasie. Przed rozpoczęciem testu pokryj płytkę do testu inwazji 50 mikrolitrami żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej, rozcieńczonego w lodowatej pożywce do hodowli komórkowych, do stężenia 100 mikrogramów na mililitr. Następnie umieść na noc płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.
Następnego popołudnia delikatnie odessać nadmiar pożywki i poszczepić komórki w zoptymalizowanej gęstości, w trzech powtórzeniach, do odpowiednich dołków płytki pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową oraz do dodatkowej niepowlekanej płytki 96-dołkowej. Następnie umieść płytki na noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego ranka umieść niepowlekaną płytkę do badania migracji w uchwycie płyty podstawy narzędzia do drapania i użyj kołków prowadzących, aby ostrożnie umieścić górną część uchwytu na podstawie.
Naciśnij i przytrzymaj czarną dźwignię, jednocześnie ostrożnie podnosząc blok sworznia, aby zrobić zadrapania. Rysy w każdym dołku powinny być widoczne gołym okiem, a także pod mikroskopem. Następnie umyj płytkę raz lub dwa razy podgrzaną pożywką hodowlaną, aby usunąć wszelkie oderwane komórki lub arkusze komórek.
W przypadku testu inwazji należy zarysować pokrytą płytkę, jak właśnie pokazano. Po usunięciu wszelkich oderwanych komórek i arkuszy, użyj wstępnie schłodzonego pojemnika chłodzącego, aby wyrównać płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie ostrożnie zasysaj zimne podłoże. Następnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonego żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej do odpowiednich studzienek i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzydzieści minut.
Bąbelki są powszechne podczas pracy z żelem do macierzy zewnątrzkomórkowej, ale można je wyeliminować, odsysając 70 procent etanolu. Następnie dodać 100 mikrolitrów świeżej, ciepłej pożywki, z badanym związkiem lub bez, do odpowiednich dołków płytki do oznaczania migracji lub inwazji i umieścić płytkę na platformie do obrazowania żywych komórek. Aby wyczyścić narzędzie do drapania, umieść górny blok kołków w indywidualnych 45-mililitrowych łodziach myjących, zawierających 5 procent detergentu jeden, jeden procent detergentu dwa, sterylną wodę destylowaną lub 70 procent etanolu przez pięć minut na mycie przed umieszczeniem narzędzia do drapania z powrotem na płycie podstawy, w celu przechowywania w środowisku wolnym od kurzu.
Aby zobrazować testy rany, po pozostawieniu płytki do równowagi przez pięć minut, wybierz typ naczynia jako płaszczyznę logarytmu obrazu i ustaw typ skanowania jako ranę zadrapania. Wybierz lub edytuj wzór skanowania, zgodnie z konfiguracją płytki eksperymentalnej, i zaplanuj 24 godziny powtarzania skanowania co jedną do dwóch godzin przez 72 godziny lub do momentu, gdy rany się zagoją, jak pokazano. Gdy wszystkie rany się zagoją, przerwij skanowanie i wybierz od trzech do sześciu reprezentatywnych obrazów, obejmujących zakres procentów dźwięku, w tym obrazy zaraz po wykonaniu rany i zamknięcie rany o 10 i 50 procent.
Aby określić prawidłową definicję przetwarzania, zastosuj odpowiednią maskę rany na zadrapania i maskę zbiegu, jak pokazano, a następnie użyj podglądu bieżącego wszystkiego, aby wyświetlić dokładność masek. Następnie uruchom zadanie analizy. W teście migracji szerokość rany to średnia odległość między arkuszami komórek obok rany.
Zbieg rany to zbieg w obrębie zranionego obszaru. Idealna początkowa zbieżność rany powinna być bliska zeru procent. Względna gęstość rany i zbieg rany sugerują szybkość komórek zajmujących obszar rany zadrapania.
Dane te prawie pokrywają się w obu tych reprezentatywnych liniach komórkowych. Różne linie komórkowe wykazują bardzo różne zdolności gojenia się ran, co wskazuje na zróżnicowane zdolności migracyjne między liniami komórkowymi. Na przykład lamellipodia obserwuje się w tej linii komórkowej gruczolakoraka piersi na froncie migracji na początku migracji, podczas gdy ta linia komórkowa raka piersi wytwarzająca mucynę 1 nie wykazywała żadnych oznak migracji komórek w tym samym punkcie czasowym.
Co więcej, względna gęstość ran linii gruczolakoraka piersi była nasycona po 50 godzinach, podczas gdy względna gęstość rany linii komórkowej raka piersi wytwarzającej mucynę 1 nie zmieniała się w czasie, co podkreśla wysoce inwazyjny fenotyp komórek gruczolakoraka i nieinwazyjność komórek raka piersi wytwarzających mucynę 1. Komórki gruczolakoraka zachowywały się również inaczej podczas inwazji przez żel macierzy zewnątrzkomórkowej, wykazując wydłużoną morfologię z wiodącymi wypukłościami, a w testach migracji uwidoczniono pęcherzyk na froncie migracji. Podczas powlekania pamiętaj, że jeśli wysianych zostanie zbyt mało komórek, rysa nie utworzy się prawidłowo, a jeśli zostanie wysianych zbyt wiele komórek, nastąpi przepełnienie.
Po tej procedurze można dodać zabiegi na ścieżce, co pozwala na dostosowanie tej metody do wysokoprzepustowych badań przesiewowych ścieżek. Metoda ta pozwala naukowcom wykonywać te testy na jednej platformie, która jest wysoce przepustowa i pozwala naukowcom monitorować swoje komórki w czasie rzeczywistym, a nie w eksperymentalnym punkcie końcowym. Środki dezynfekujące używane do sterylizacji narzędzia do drapania mogą być niebezpieczne.
Upewnij się, że zbierasz i utylizujesz roztwory zgodnie z odpowiednią kartą charakterystyki i regularnymi liniami wyzwalającymi w Twoim zakładzie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym. Oferuje ono reproduktyjne i wydajne podejście do badania ruchliwości i morfologii komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Badania nad rakiem
- Migracja komórek
Tło
- Ruchliwość komórek rakowych jest niezbędna do wystąpienia przerzutów.
- Zrozumienie ruchu komórek nowotworowych jest kluczowe dla opracowywania terapii.
- Ta metoda może być zastosowana do różnych typów komórek.
- Metoda ta zapewnia wgląd w inwazję komórek rakowych przez matrycę pozakomórkową.
Cel badania
- Badanie migracji i inwazji komórek rakowych.
- Zapewnienie efektywnego czasowo metody badania ruchliwości komórek.
- Optymalizacja warunków do badań migracji.
Zastosowane metody
- Zintegrowana metoda do obserwacji w czasie rzeczywistym.
- Optymalizacja gęstości siewu dla badań po rysowaniu.
- Wykorzystanie 96-dołkowej płyty do badań gęstości komórek.
- Monitorowanie stopnia pokrycia przez komórki w celu określenia optymalnego czasu inkubacji.
Główne wyniki
- Dane w czasie rzeczywistym dotyczące migracji i inwazji komórek rakowych.
- Ustawienie optymalnych warunków dla badań.
- Wgląd w zachowanie komórek nowotworowych w kontrolowanym środowisku.
- Potencjalne zastosowania do innych typów komórek poza komórkami rakowymi.
Wnioski
- Metoda ta jest reproduktyjna i wydajna w badaniu ruchliwości komórek.
- Dostarcza cenny wgląd w zachowanie komórek nowotworowych.
- Dalsze zastosowania mogą poprawić zrozumienie różnych typów komórek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative migration and invasion assays are critical for de-risking oncology targets and evaluating metastatic potential in preclinical models. Automated live-cell imaging platforms enable reproducible, high-throughput assessment of cell motility, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. Integrating real-time analysis streamlines decision-making at key inflection points in oncology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of metastasis-related targets by quantifying cell movement and invasion.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing invasive from non-invasive phenotypes in disease-relevant systems.
- Facilitates portfolio triage by providing comparative data across cell lines and treatment conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible migration and invasion assays for downstream compound screening.
- Standardizes assay conditions and quantitative outputs using automated imaging and analysis modules.
- Enables high-throughput screening readiness and platform scalability for diverse oncology programs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro invasion data with disease-relevant metastatic processes for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by correlating cell behavior with preclinical efficacy endpoints.
- Provides mechanistic insights into compound effects on cell motility and invasion through extracellular matrix.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical validation by delivering standardized, quantitative migration and invasion data. Automated imaging and analysis modules ensure reproducibility and comparability across studies.
- Discovery Biology: Quantifies cell motility and invasion to test metastatic hypotheses and clarify target function.
- Screening: Delivers reproducible, high-content readouts for compound evaluation and assay optimization.
- Analytics: Provides real-time, quantitative metrics such as wound width, confluence, and relative wound density.
- Translational Research: Connects in vitro invasion phenotypes to in vivo metastatic potential when supported by model selection.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, single-platform workflow adaptable to multiple cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in metastasis studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput with automated imaging and analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative comparisons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets based on functional invasion data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, assay setup, and live-cell imaging instrumentation.
- Needs access to automated imaging platforms and compatible analysis software modules.
- Demands cross-team standardization of seeding density, incubation timing, and image analysis parameters.
- Adaptable to various cell lines and matrix compositions with protocol optimization.
- Careful handling and disposal of disinfectants and reagents per facility safety guidelines is necessary.
