Name: Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę badania migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym przy użyciu imagera Live Cell. Protokół zapewnia powtarzalne i efektywne podejście do analizy ruchliwości komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować za nasze wsparcie finansowe ze strony Fundacji Bloomfield Group za pośrednictwem Hunter Medical Research Institute (HMRI 13-02). X.Z jest wspierany przez stypendium APA za pośrednictwem Uniwersytetu w Newcastle oraz stypendium doktoranckie HCRA Biomarkers Flag.

UWAGA: Dwie linie komórkowe powinny być obsługiwane oddzielnie. Poniższe procedury należy zastosować do jednej pojedynczej linii komórkowej, jeśli nie zostały określone.
1. Zoptymalizuj gęstość komórek przed zranieniem
<ol>
	<li>Hodowla komórek adherentnych w kolbach do hodowli tkankowych T75 cm2 do około 80% konfluencji w wolnym od czerwieni fenolowej zmodyfikowanym podłożu Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 200 mM L-glutaminą i 2 μg/ml insuliny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 (standardowe warunki inkubacji dla większości linii komórek rakowych, preparaty hodowlane są zależne od linii komórkowej).</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną, pipetując ją do pojemnika na odpady. Odpipetować 2 ml wstępnie podgrzanej 0,1% trypsyny-EDTA, aby krótko spłukać monowarstwę komórek i odpipetować. Dodać kolejne 2 ml 0,1% trypsyny-EDTA i umieścić kolbę w standardowych warunkach inkubacji w temperaturze 37 °C na 5 minut.</li>
	<li>Delikatnie postukać w kolbę, aby zapewnić oderwanie komórek, a następnie dodać 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej, aby zatrzymać reakcję proteolityczną.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Ostrożnie usunąć supernatant bez mieszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić z kolejnymi 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.</li>
</ol>
2. Zliczanie numerów komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (lub dowolnych metod liczenia)
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 200 μl zawieszonej zawiesiny komórek 800 μl 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przymocuj czujnik liczby komórek 60 μm do licznika komórek, przytrzymaj przełącznik i połącz końcówkę z zawiesiną komórki. Powoli zwalniaj przełącznik, aż zawiesina ogniw zostanie pomyślnie wciągnięta do czujnika. Stężenie komórek jest wyświetlane w komórkach/ml.</li>
	<li>Obliczyć liczbę komórek w zawiesinie komórek o objętości 10 ml.</li>
</ol>
3. Poszycie komórek
<ol>
	<li>Płytki komórek o różnej gęstości komórek (40 000-90 000 komórek/dołek) w trzech egzemplarzach na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Umieść płytkę w imagerze live-cell i zaplanuj skanowanie co 2 godziny przez 24 godziny.
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu kliknij opcję Zaplanuj skanowanie na liście zadań. W okienku ustawień szuflady określ położenie blachy, kliknij przycisk Dodaj naczynie i wybierz typ blachy. W panelu Scan Setup (Ustawienia skanowania) wybierz lub edytuj wzór skanowania zgodnie z ustawieniami płytki eksperymentalnej, a następnie ustaw Typ skanowania jako Standardowy.</li>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu i wybierz Ustaw interwały. Ustaw opcję Dodaj skany co do 2 godzin zgodnie z harmonogramem 24-godzinnym. Kliknij przycisk Zastosuj.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Określ optymalną gęstość wysiewu komórek dla testu migracji
<ol>
	<li>Po24 godzinach zastosuj narzędzie do analizy przetwarzania konfluencji do automatycznie zebranych obrazów kontrastu fazowego HD i wygeneruj krzywą proliferacji komórek w czasie.
	<ol>
		<li>Określ od 3 do 6 reprezentatywnych obrazów i umieść je w nowej kolekcji obrazów.</li>
		<li>Określ właściwą maskę jako definicję przetwarzania.</li>
		<li>Uruchom zadanie analizy.</li>
		<li>Określ zoptymalizowaną gęstość komórek zgodnie z konfluencją w czasie (około 100% konfluencji w ciągu 6 -18 godzin, w zależności od tego, kiedy rozpoczyna się test migracji). 
		nuta: Czas potrzebny do wyhodowania komórek do zbiegu różni się w zależności od rozcieńczenia wysiewu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Dzień 1 i 2: Przygotowanie do testów migracji i inwazji
<ol>
	<li>W dniu 1 pokryj płytkę do testu inwazji. 
	UWAGA: Żel ECM należy zawsze dotykać na lodzie i z końcówkami, które zostały umieszczone w lodówce na noc.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć żel ECM lodowatą pożywką hodowlaną do 100 μg/ml i dodać 50 μl rozcieńczonego żelu/pożywki ECM do wyznaczonych studzienek.</li>
		<li>Umieścić płytkę w standardowych warunkach inkubacji na noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 2 delikatnie odessaj nadmiar pożywki. Komórki płytkowe o zoptymalizowanej gęstości komórek na 2 96-dołkowych płytkach przeznaczonych do testu migracji (niepowlekane) i testu inwazji (powlekane) w trzech egzemplarzach zgodnie z sekcjami 1-3 późnym popołudniem (w obecnym protokole zoptymalizowane gęstości wysiewu dla ZR75-1 i MDA-MB-231 wynosiły odpowiednio 90 000/dołek i 50 000/dołek).</li>
	<li>Umieść płytki w standardowych warunkach inkubacji na noc.</li>
</ol>
6. Dzień 3: Zadrapanie rany
<ol>
	<li>Spryskaj i wytrzyj narzędzie do drapania i 2 łódeczki myjące 70% etanolem przed umieszczeniem ich w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Napełnij łódź myjącą 1 i 2 dokładnie 45 ml sterylnej (autoklawowanej) wody destylowanej i 70% etanolu.</li>
	<li>W celu sterylizacji umieść blok kołków do drapania (u góry) na łodzi myjącej 1 i 2 na 5 minut każdy.</li>
	<li>Zacznij od płytki do oznaczania migracji.
	<ol>
		<li>Przesunąć płytkę zawierającą komórki z inkubatora i upewnić się, że żadna studzienka nie jest sucha, aby uniknąć uszkodzenia narzędzia do drapania. Zdejmij pokrywę płyty i włóż ją do uchwytu płyty podstawy narzędzia do drapania i ostrożnie umieść górną część na części podstawy, prowadząc kołki. Naciśnij i przytrzymaj czarną dźwignię, a w międzyczasie ostrożnie podnieś blok sworznia. Szczeliny w każdej studzience są zwykle widoczne gołym okiem i pod mikroskopem.</li>
		<li>Szybko namocz szpilki w wodzie; to wystarczy, aby wyczyścić narzędzie do zarysowania przed zarysowaniem płytki do badania inwazji, jeśli konfiguracja płytki jest identyczna. W przeciwnym razie powtórz etapy sterylizacji sterylną wodą destylowaną, a następnie 70% etanolem przez 5 minut każdy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj płytkę 1 lub 2 razy wstępnie podgrzaną pożywką hodowlaną, aby uniknąć ponownego przyczepienia się oderwanych komórek lub arkuszy komórek do studzienki.</li>
	<li>Dodać 100 μl świeżej, ciepłej pożywki do wyznaczonych studzienek z zabiegami lub bez.</li>
	<li>Dodatkowe kroki do testu inwazji.
	<ol>
		<li>Umieścić płytkę do oznaczania inwazji w temperaturze 4 °C na 5 minut w celu zrównoważenia i ostrożnie zassać zimną pożywkę.</li>
		<li>Rozcieńczyć żel ECM lodowatą pożywką hodowlaną do 5 mg/ml, dodać 50 μl rozcieńczonego żelu ECM do wyznaczonych studzienek i umieścić w standardowej inkubacji na 30 minut.</li>
		<li>Dodać 100 μl podgrzanej pożywki ze związkami testowymi lub bez.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść płytkę w imagerze live-cell i pozwól jej się zrównoważyć przez 5 minut. Wybierz Vessel Type (Typ naczynia) jako płytkę imagelock. Ustaw Typ skanowania jako Rana zadrapań, wybierz lub edytuj Wzór skanowania zgodnie z konfiguracją płytki eksperymentalnej (1 obraz/studzienka i tryb szerokokątny) i zaplanuj 24-godzinne powtarzanie skanowania co 1-2 godziny przez 72 godziny, aż rany się zagoją.</li>
	<li>Aby wyczyścić drapak, umieść górną blokadę kołków w każdym z następujących roztworów (45 ml w łódkach do mycia) na 5 minut: 0,5% detergentu 1 (patrz Tabela materiałów), 1% detergentu 2 (patrz Tabela materiałów), sterylnej wody destylowanej i 70% etanolu. Umieść narzędzie do drapania z powrotem na płycie podstawy i przechowuj w środowisku wolnym od kurzu.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Przestań skanować wyznaczoną płytkę po zagojeniu się wszystkich ran, wybierając eksperymentalną płytkę w ustawieniach szuflady i klikając Usuń naczynie.</li>
	<li>Zbierz 3-6 reprezentatywnych obrazów obejmujących różne wartości procentowe dźwięku, w tym obrazy bezpośrednio po wykonaniu rany, zamknięciu rany o 10% i 50%.</li>
	<li>Aby określić prawidłową definicję przetwarzania, użyj narzędzi Korekta segmentacji, Oczyszczanie i Filtry, aby zastosować odpowiednią maskę zadrapań i maskę konfluencji. Użyj opcji Podgląd bieżącej/wszystkich, aby wyświetlić dokładność masek.</li>
	<li>Uruchom zadanie analizy.</li>
	<li>Dane mogą być analizowane w oprogramowaniu lub eksportowane w celu dalszej analizy. Do oceny obrazów w fazie HD można wykorzystać trzy wskaźniki dostarczane przez oprogramowanie: szerokość rany (μm), zbieżność rany (%) i względną gęstość rany (%). Porównania zostaną omówione w następnej sekcji.</li>
</ol>

<ol><li>Graham, C. H., Lala, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+placental+invasion+of+the+uterus+and+their+control%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control.</a> Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).</li>
<li>Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+remodelling+through+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue remodelling through branching morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).</li>
<li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10, 683-690 (2014).</li>
<li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis%3A+markers+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).</li>
<li>Breast Cancer: Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. GLOBOCAN. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx">http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx</a> (2012).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis.</a> Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).</li>
<li>Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+cell+line+for+breast+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Choosing the right cell line for breast cancer research.</a> Breast Cancer Research. 13, 215(2011).</li>
<li>Clark, A. G., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+cancer+cell+invasion+and+the+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Migracja i inwazja są ważnymi parametrami oceny mobilności komórek nowotworowych. Dzięki zastosowaniu 96-pinowego narzędzia do drapania możliwe jest jednoczesne przeprowadzanie testów gojenia się ran w 2D i 3D. Oprócz ułatwienia automatycznego skanowania, zapewniając stabilne środowisko hodowli komórkowej przy minimalnych zakłóceniach, test zarysowania przeprowadzony przy użyciu 96-pinowego narzędzia do zarysowania zapewnia spójne rany po zadrapaniach, umożliwiając eksperymenty, które są bardziej niezawodne i powtarzalne...

Migracja i inwazja komórek to ważne procesy biologiczne, które umożliwiają normalne funkcjonowanie w ludzkim ciele, takie jak zamykanie ran, inwazja łożyska do macicy i morfogeneza gruczołu sutkowego1,2,3. Ciało ludzkie ma precyzyjną i ścisłą kontrolę nad tymi zdarzeniami biologicznymi; Istnieją jednak pewne wyjątki. Na przykład nowotwory złośliwe są w stanie uciec przed tym zabezpieczeniem, wykazywać nieprawidłową proliferację i atakować sąsiednie tkanki, co nazywa się przerzutami. Przerzuty są główną przyczyną śmiertelności związanej z rakiem4.
Rak piersi jest najczęściej diagnozowanym nowotworem u kobiet i jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem wśród kobiet w krajach rozwiniętych na całym świecie5. Rak piersi wywodzi się z przewodów lub zrazików, które składają się z jednej lub więcej warstw komórek nabłonkowych. W prawidłowej piersi komórki nabłonkowe przylegają do siebie i do błony podstawnej poprzez białka błonowe, takie jak E-kadheryna i integryny6. Jednak inwazyjne komórki raka piersi utraciły swoją polaryzację i adhezję komórka-komórka i klasycznie przechodzą mezenchymalne przejście nabłonkowe (EMT) i zyskują zdolność poruszania się. Po wynaczynieniu komórki te przemieszczają się przez macierz zewnątrzkomórkową (ECM) i dostają się do naczynia krwionośnego lub układu limfatycznego, po czym następuje wynaczynienie i wzrost przerzutowy7. Zrozumienie mechanizmów, za pomocą których to zachodzi, ma ogromne znaczenie, ponieważ przerzuty są najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem i są ściśle związane z migracją/inwazją komórek rakowych. Aby zobrazować ruch komórek nowotworowych, testy migracji i inwazji są idealnymi modelami do badania odpowiednio ruchu komórek 2D i 3D. Migracja bezpośrednio ocenia ruch komórek, podczas gdy inwazja wiąże się z interakcją z mikrośrodowiskiem i zdolnością do degradacji barier biologicznych. Te dwa procesy nie są w pełni od siebie niezależne, ponieważ migracja jest warunkiem inwazji.
Opracowano kilka metod do badania migracji i inwazji. Jak dokonali przeglądy Kramer i wsp., testy migracji, takie jak gojenie się ran, testy ogrodzenia i mikronośników, generują obszar wolny od komórek, aby umożliwić komórkom przemieszczanie się, oceniając zmianę obszaru; Natomiast testy transwell i kapilarne opierają się na liczbie komórek, które poruszają się w kierunku atraktantu<klasa SUP = "xref">8. W przypadku testów inwazji należy skonfigurować środowisko ECM, na przykład z żelem lub kolagenem ECM, a ruch 3D można ocenić, monitorując obszar inwazji, odległość i liczbę komórek (np. test transwell, test dziobaka)8. Innym rodzajem testu inwazji jest połączenie komórek inwazyjnych z komórkami nieinwazyjnymi i ocena zachowania komórek inwazyjnych (np. testy sferoidalne). Powyższe metody mają swoje wady i zalety, a sposób, który jest łatwy do podejścia, łatwy do powtórzenia i łączenia testu migracji i testu inwazji w podobnym przepływie pracy, jest preferowany w projektowaniu eksperymentalnym.
Ten protokół opisuje pomiar migracji i inwazji komórek za pomocą imagera żywych komórek. Jest to system monitorowania komórek w czasie rzeczywistym zainstalowany w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych. Wykonuje obrazy w wysokiej rozdzielczości zgodnie z ustalonymi interwałami skanowania i pomiarami, nakładając odpowiednie maski na komórki lub cele fluorescencyjne. Moduł testu migracji/inwazji obejmuje użycie 96-pinowego narzędzia do rysowania, które nadaje się do wykonywania jednorodnych ran zadrapań na monowarstwie komórki na 96-dołkowej płytce. Mechanizm opiera się na testach gojenia się ran in vitro, monitorujących ruch komórek 2D na powierzchni z tworzywa sztucznego lub powlekanej. Można również ocenić inwazję lub ruch 3D przez dodatkowy ECM w obrębie rany po zadrapaniu. Krótki przepływ pracy jest zilustrowany w Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>0,5% roztwór trypsyny-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td>Rozcieńczyć do 2x w DPBS</td></tr><tr><td>Countess II FL Automatyczny licznik komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Automatyczny licznik komórek</td></tr><tr><td>Detergent 1 (Alconox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985</td><td>0,5% stężenie robocze</td></tr><tr><td>Detergent 2 (Virkon S)</td><td>VetProduct DIRECT</td><td></td><td>1% pracy koncentracja</td></tr><tr><td>Dulbecco" s Zmodyfikowana pożywka Eagle, bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>Dostarczana z 10% FBS, 200 mM L-glutaminą, 2 &mu; g / ml insuliny</td></tr><tr><td>Żel ECM (matrigel)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6909</td><td>Obniżony czynnik wzrostu, bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Essen ImageLock 96-dołkowa płytka, płaskie dno</td><td>Essen</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>EVE Szkiełka liczące</td><td>BioTools</td><td>EVS-50</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 96-dołkowa inwazja komórek rany drapanej akcesoria</td><td>Essen</td><td>4444</td><td>W tym CoolBox, 2x CoolSink</td></tr><tr><td>IncuCyte Zestaw do migracji komórek</td><td>Essen</td><td>4493</td><td>W zestawie 96-dołkowy blok pinów, 2x myjki i oprogramowanie</td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen</td><td></td><td>System analizy żywych komórek</td></tr><tr><td>Roztwór insuliny ludzkiej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>roztwór L-glutaminy (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-091</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych, powierzchnia wzrostu 75 cm2</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr></tbody></table>

prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera live cell

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Mobilność komórek rakowych jest kluczowa dla inicjacji przerzutów. Dlatego badanie ruchu komórek i zdolności inwazyjnych ma ogromne znaczenie. Testy migracji zapewniają podstawowy wgląd w ruch komórek na poziomie 2D, podczas gdy testy inwazji są bardziej istotne fizjologicznie, naśladując przemieszczanie się komórek rakowych in vivo z pierwotnego miejsca i inwazję przez macierz zewnątrzkomórkową. Obecny protokół zapewnia pojedynczy przepływ pracy dla testów migracji i inwazji. Wraz ze zintegrowaną, zautomatyzowaną kamerą mikroskopową do przetwarzania obrazów HD w czasie rzeczywistym i wbudowanym modułem analitycznym, daje to naukowcom efektywną czasowo, prostą i powtarzalną opcję eksperymentalną. Protokół ten obejmuje również zamienniki materiałów eksploatacyjnych i alternatywne metody analizy do wyboru przez użytkowników.

Niniejszy test migracji/inwazji opiera się na teście gojenia ran, który ocenia szybkość przemieszczania się komórek do obszaru wolnego od komórek, utworzonego za pomocą 96-pinowego narzędzia do drapania. Różnica między testami migracji i inwazji polega na tym, że testy migracji mierzą przemieszczanie się komórek po powierzchni plastiku traktowanej do hodowli tkanek, natomiast testy inwazji mierzą przemieszczanie się komórek przez żel ECM.
<p class="jove_content" fo:keep-together.withi...

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Ruchliwość komórek nowotworowych ma kluczowe znaczenie dla zainicjowania przerzutów. Dlatego badanie ruchu komórek i zdolności inwazyjnych komórek nowotworowych jest bardzo interesujące. Ta zintegrowana metoda badania migracji i inwazji komórek nowotworowych, na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewnia łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania ruchliwości i patologii komórek.Ta metoda może zapewnić wgląd w inwazję komórek rakowych przez macierz zewnątrzkomórkową i może być stosowana do innych typów komórek. Aby uzyskać optymalny czas zarysowywania, upewnij się, że gęstość wysiewu została zoptymalizowana i nie przedłużaj okresu inkubacji, gdy monowarstwa komórkowa osiągnie 100-procentową konfluencję. Aby określić optymalną liczbę wysiewanych komórek do testu migracji, umieść komórki w trzech częściach o różnych gęstościach na płytce o 96 ściankach.Umieść płytkę w imagerze Live Cell i wybierz opcję Zaplanuj skanowanie z listy zadań w oprogramowaniu imagera. W okienku ustawień szuflady określ pozycje blachy i kliknij dodaj naczynie, aby wybrać typ blachy. W okienku ustawień skanowania wybierz lub edytuj wzorzec skanowania zgodnie z konfiguracją płytki eksperymentalnej i ustaw typ skanowania jako standardowy.Kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu i wybierz ustaw interwały. Następnie ustaw dodawanie skanów co dwie godziny na 24 godziny i kliknij Zastosuj. Po 24 godzinach otwórz ustawienia szuflady, aby umożliwić wybór płytki eksperymentalnej, a następnie kliknij usuń naczynie.Wybierz od trzech do sześciu reprezentatywnych obrazów i umieść je w nowej kolekcji obrazów. Aby określić prawidłową definicję przetwarzania, użyj korekty segmentacji, czyszczenia i filtrów, aby zastosować odpowiednią maskę konfluencji, a następnie użyj podglądu bieżącego wszystkiego, aby wyświetlić dokładność masek. Uruchom zadanie analizy i określ zoptymalizowaną gęstość komórek, zgodnie z przybliżoną 100-procentową konfluencją w czasie, w ciągu sześciu do osiemnastu godzin, w zależności od tego, kiedy rozpoczyna się test migracji.Następnie zastosuj narzędzie do analizy przetwarzania konfluencji do obrazów kontrastu fazowego o wysokiej rozdzielczości, które są automatycznie zbierane w celu wygenerowania krzywej proliferacji komórek w czasie. Przed rozpoczęciem testu pokryj płytkę do testu inwazji 50 mikrolitrami żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej, rozcieńczonego w lodowatej pożywce do hodowli komórkowych, do stężenia 100 mikrogramów na mililitr. Następnie umieść na noc płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.Następnego popołudnia delikatnie odessać nadmiar pożywki i poszczepić komórki w zoptymalizowanej gęstości, w trzech powtórzeniach, do odpowiednich dołków płytki pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową oraz do dodatkowej niepowlekanej płytki 96-dołkowej. Następnie umieść płytki na noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego ranka umieść niepowlekaną płytkę do badania migracji w uchwycie płyty podstawy narzędzia do drapania i użyj kołków prowadzących, aby ostrożnie umieścić górną część uchwytu na podstawie.Naciśnij i przytrzymaj czarną dźwignię, jednocześnie ostrożnie podnosząc blok sworznia, aby zrobić zadrapania. Rysy w każdym dołku powinny być widoczne gołym okiem, a także pod mikroskopem. Następnie umyj płytkę raz lub dwa razy podgrzaną pożywką hodowlaną, aby usunąć wszelkie oderwane komórki lub arkusze komórek.W przypadku testu inwazji należy zarysować pokrytą płytkę, jak właśnie pokazano. Po usunięciu wszelkich oderwanych komórek i arkuszy, użyj wstępnie schłodzonego pojemnika chłodzącego, aby wyrównać płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie ostrożnie zasysaj zimne podłoże. Następnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonego żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej do odpowiednich studzienek i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzydzieści minut.Bąbelki są powszechne podczas pracy z żelem do macierzy zewnątrzkomórkowej, ale można je wyeliminować, odsysając 70 procent etanolu. Następnie dodać 100 mikrolitrów świeżej, ciepłej pożywki, z badanym związkiem lub bez, do odpowiednich dołków płytki do oznaczania migracji lub inwazji i umieścić płytkę na platformie do obrazowania żywych komórek. Aby wyczyścić narzędzie do drapania, umieść górny blok kołków w indywidualnych 45-mililitrowych łodziach myjących, zawierających 5 procent detergentu jeden, jeden procent detergentu dwa, sterylną wodę destylowaną lub 70 procent etanolu przez pięć minut na mycie przed umieszczeniem narzędzia do drapania z powrotem na płycie podstawy, w celu przechowywania w środowisku wolnym od kurzu.Aby zobrazować testy rany, po pozostawieniu płytki do równowagi przez pięć minut, wybierz typ naczynia jako płaszczyznę logarytmu obrazu i ustaw typ skanowania jako ranę zadrapania. Wybierz lub edytuj wzór skanowania, zgodnie z konfiguracją płytki eksperymentalnej, i zaplanuj 24 godziny powtarzania skanowania co jedną do dwóch godzin przez 72 godziny lub do momentu, gdy rany się zagoją, jak pokazano. Gdy wszystkie rany się zagoją, przerwij skanowanie i wybierz od trzech do sześciu reprezentatywnych obrazów, obejmujących zakres procentów dźwięku, w tym obrazy zaraz po wykonaniu rany i zamknięcie rany o 10 i 50 procent.Aby określić prawidłową definicję przetwarzania, zastosuj odpowiednią maskę rany na zadrapania i maskę zbiegu, jak pokazano, a następnie użyj podglądu bieżącego wszystkiego, aby wyświetlić dokładność masek. Następnie uruchom zadanie analizy. W teście migracji szerokość rany to średnia odległość między arkuszami komórek obok rany.Zbieg rany to zbieg w obrębie zranionego obszaru. Idealna początkowa zbieżność rany powinna być bliska zeru procent. Względna gęstość rany i zbieg rany sugerują szybkość komórek zajmujących obszar rany zadrapania.Dane te prawie pokrywają się w obu tych reprezentatywnych liniach komórkowych. Różne linie komórkowe wykazują bardzo różne zdolności gojenia się ran, co wskazuje na zróżnicowane zdolności migracyjne między liniami komórkowymi. Na przykład lamellipodia obserwuje się w tej linii komórkowej gruczolakoraka piersi na froncie migracji na początku migracji, podczas gdy ta linia komórkowa raka piersi wytwarzająca mucynę 1 nie wykazywała żadnych oznak migracji komórek w tym samym punkcie czasowym.Co więcej, względna gęstość ran linii gruczolakoraka piersi była nasycona po 50 godzinach, podczas gdy względna gęstość rany linii komórkowej raka piersi wytwarzającej mucynę 1 nie zmieniała się w czasie, co podkreśla wysoce inwazyjny fenotyp komórek gruczolakoraka i nieinwazyjność komórek raka piersi wytwarzających mucynę 1. Komórki gruczolakoraka zachowywały się również inaczej podczas inwazji przez żel macierzy zewnątrzkomórkowej, wykazując wydłużoną morfologię z wiodącymi wypukłościami, a w testach migracji uwidoczniono pęcherzyk na froncie migracji. Podczas powlekania pamiętaj, że jeśli wysianych zostanie zbyt mało komórek, rysa nie utworzy się prawidłowo, a jeśli zostanie wysianych zbyt wiele komórek, nastąpi przepełnienie.Po tej procedurze można dodać zabiegi na ścieżce, co pozwala na dostosowanie tej metody do wysokoprzepustowych badań przesiewowych ścieżek. Metoda ta pozwala naukowcom wykonywać te testy na jednej platformie, która jest wysoce przepustowa i pozwala naukowcom monitorować swoje komórki w czasie rzeczywistym, a nie w eksperymentalnym punkcie końcowym. Środki dezynfekujące używane do sterylizacji narzędzia do drapania mogą być niebezpieczne.Upewnij się, że zbierasz i utylizujesz roztwory zgodnie z odpowiednią kartą charakterystyki i regularnymi liniami wyzwalającymi w Twoim zakładzie.

a-simple-migrationinvasion-workflow-using-an-automated-live-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszej pracy opisujemy nieinwazyjną metodę mikroskopii dwufotonowej (2P) służącą do badania homingu leukocytów w poduszce stopy myszy. Omówiamy aspekty techniczne przygotowania tkanki do obrazowania i przeprowadzamy czytelnika przez typowy eksperyment – od początkowej konfiguracji, przez wykonanie, aż po gromadzenie danych.

Nieinwazyjne obrazowanie homingu i migracji leukocytów in vivo

Opisano przedzielone urządzenie mikrofluidyczne do badania migracji komórek macierzystych nowotworu. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co w przyszłości może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych terapii.

Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

Ta metoda pozwala na monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym oraz ilościowe pomiary różnych parametrów migracji komórkowej, takich jak prędkość, przemieszczenie i wektor prędkości. W przeciwieństwie do metod tradycyjnych, to podejście w czasie rzeczywistym nie opiera się na ilościowych pomiarach migracji w punkcie końcowym; zamiast tego umożliwia ciągłe monitorowanie i obliczanie różnych parametrów.

Ilościowa analiza przypadkowej migracji komórek z wykorzystaniem mikroskopii wideo time-lapse

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisany jest solidny protokół do monitorowania populacji neuronów za pomocą wideomikroskopii poklatkowej, a następnie przetwarzania końcowego opartego na oprogramowaniu. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do identyfikacji zdarzeń biologicznych w wybranej populacji podczas eksperymentów obrazowania na żywo.

Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronalnych

Tutaj opisujemy procedurę testowania migracji komórek in vitro za pomocą automatycznego mikroskopu optycznego. Test zarysowania jest szeroko stosowany, w którym zamknięcie rysy następuje przez określony czas. Mikroskop optyczny umożliwia niezawodne i tanie wykrywanie migracji komórek.

Zoptymalizowany test zarysowań do testowania migracji komórek in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej

Komórki strefy brzeżnej B (MZB) reagują na siłę przepływu ścinającego, reorientując swoją ścieżkę migracji w górę przepływu. Protokół ten pokazuje, jak rejestrować i analizować migrację za pomocą jednostki fluidyki, pompy, systemu obrazowania mikroskopowego i bezpłatnego oprogramowania.

Analiza indukowanej przepływem ścinającym migracji mysich komórek brzeżnej strefy B in vitro

To badanie przedstawia protokół immunocytochemii żywych komórek 3D zastosowany do pediatrycznej linii komórkowej rozlanego glejaka pośrodkowego, przydatny do badania w czasie rzeczywistym ekspresji białek na błonie plazmatycznej podczas dynamicznych procesów, takich jak inwazja i migracja komórek 3D.

Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci

Ten protokół zapewnia metodę pierwotnej izolacji mysich limfocytów T i mikroskopii poklatkowej migracji limfocytów T w określonych warunkach środowiskowych z analizą ilościową.

Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

Poznaj zautomatyzowaną metodę badania migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym przy użyciu imagera Live Cell. Protokół zapewnia powtarzalne i efektywne podejście do analizy ruchliwości komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Przeglądaj więcej filmów