Zastosowanie zaawansowanej technologii hodowli in vitro do badania mikrobioty jelitowej człowieka

Celem tego protokołu jest hodowla mikrobioty jelitowej in vitro. Pozwoli to na badanie dynamiki mikrobioty bez konieczności uwzględniania udziału nowoczesnego komponentu. Korzystając z tego wieloetapowego systemu in vitro, liczymy, że społeczność mikrobioty rozwija się jednocześnie w świetle i na błonie śluzowej w wielu regionach jelita grubego.

Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna ze względu na złożoność tego systemu in vitro. Zacznij od wypełnienia okrężnicy wstępującej 500 mililitrami zdefiniowanego podłoża, okrężnicy poprzecznej 800 mililitrami zdefiniowanego pożywki, a dwukropka opadającego 600 mililitrami zdefiniowanego podłoża. Dodać mucynę agricarriers do okolic okrężnicy w ilości proporcjonalnej do objętości reaktora i użyć probówki z próbką i strzykawki, aby usunąć nadmiar zdefiniowanego podłoża z każdego reaktora.

Użyj sond pH, aby wyregulować pH w każdym reaktorze. I włącz spłukiwanie azotem na 20 minut. Następnie rozmrozić homogenat kału zgodnie z wytycznymi producenta przed załadowaniem 60-mililitrowej strzykawki próbką homogenatu kału.

Następnie zaszczepić każdy reaktor okrężnicy przez port próbki ilością homogenatu równą 5% objętości każdego reaktora w celu hodowli nocnej z kontrolą pH. Następnego ranka wyczyść kłódkę luer w porcie próbki każdego bioreaktora alkoholem. Po wyschnięciu portów podłącz 30-mililitrową strzykawkę, oczyszczoną z całego powietrza, do jednego z portów próbki.

Wycofać tłok trzy do pięciu razy, aby zapewnić dokładne wymieszanie składników naczynia przed zasysaniem 15 mililitrów supernatu kultury z bioreaktora. Następnie przenieś próbkę światła do sterylnej probówki Falcon i umieść na lodzie. Do analizy DNA zbierz od jednego do trzech mililitrów płynu świetlnego za pomocą pięciomililitrowej strzykawki.

W ten sam sposób należy zebrać supernat z innych bioreaktorów. Aby odłożyć materiał próbki do analizy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, odwiruj 15 mililitrów interesującej nas próbki światła i strzykawką przefiltruj supernat przez filtr porowy o średnicy 0,2 mikrometra do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby odłożyć materiał próbki do analizy DNA, odwiruj jeden mililitr płynu świetlnego i przechowuj osad w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

W celu pobrania próbki błony śluzowej należy usunąć przygotowane nośniki mucyny z magazynu w czterech stopniach Celsjusza i włączyć płukanie azotem. Szybko otwórz pokrywę reaktora i wymień 50% nośników w każdym reaktorze na nowe. Po wymianie wszystkich nośników szybko ponownie zamknij pokrywę i utrzymuj płukanie azotem przez kolejne 20 minut.

Następnie podamulować od 0,25 do 0,5 grama agaru nośnika mucyny do pojedynczych dwumililitrowych probówek do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do ekstrakcji DNA. Trzy razy dziennie system automatycznie przełącza się na cykle. Rozpoczyna się to od przeniesienia 140 mililitrów zdefiniowanej pożywki do bioreaktora żołądkowego, a następnie godzinnej inkubacji z kontrolą pH.

Pod koniec inkubacji zawartość żołądka przenosi się do jelita cienkiego wraz z 60 mililitrami soku trzustkowego. W bioreaktorze jelita cienkiego pH jest automatycznie dostosowywane do 6,7 do 6,9, a zawartość inkubuje się przez 90 minut. Podczas tej inkubacji płukanie azotem dla każdego systemu jest włączane na łącznie 10 minut.

Pod koniec tej inkubacji zawartość jelita cienkiego jest przenoszona do okrężnicy wstępującej, z okrężnicy wstępującej do okrężnicy poprzecznej, z okrężnicy poprzecznej do okrężnicy zstępującej i z okrężnicy zstępującej do odpadów. W tej reprezentatywnej analizie współrzędnych głównych społeczność zmieniła się w sposób amortyzujący między pierwszym a siódmym dniem. Jednak od 11 dnia po inokulacji do końca eksperymentu próbki zajmowały niewielki obszar głównej przestrzeni analizy współrzędnych zarówno dla wyników odległości między próbkami, w oparciu o operacyjną jednostkę taksonomiczną, obecność do braku i liczebność.

Pomiar trzech głównych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych ujawnia, że kwas propionowy, kwas butanowy i kwas octowy zmieniają się od początku eksperymentu do 15 dnia po inokulacji. Po 15 dniu ilości tych kwasów wytwarzanych w każdym regionie okrężnicy pozostały stałe z minimalnymi zmianami do końca eksperymentu. Analiza stabilnego zbiorowiska dla fazy świetlnej i śluzówkowej każdego regionu jelita grubego pokazuje, że zbiorowiska, które rozwijają się w poszczególnych regionach okrężnicy systemu in vitro, są podobne do składu inokulum kałowego.

Porównanie różnorodności alfa w systemie in vitro ujawnia podobny poziom różnorodności jak w inokulum dla wszystkich regionów, z wyjątkiem próbek światła z obszaru wstępującego. Wykazanie, że system hodowli in vitro jest w stanie wytworzyć społeczność porównywalną do inokulum kałowego, zarówno pod względem składu, jak i różnorodności. Aby wytworzyć stabilną społeczność mikrobioty jelitowej przy użyciu tego protokołu, kluczowe znaczenie ma zapewnienie dokładnego przygotowania roztworów oraz utrzymanie warunków beztlenowych i parametrów pH przez cały czas trwania eksperymentu.

Zgodnie z tą procedurą, próbki mogą być analizowane pod kątem składu społeczności przy użyciu sekwencjonowania DNA nowej generacji, a następnie analizy bioinformatycznej oraz pod kątem funkcjonalności przy użyciu metabolomiki.