Name: Zastosowanie zaawansowanej technologii hodowli in vitro do badania mikrobioty jelitowej człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Poznaj metodę hodowli mikrobioty jelitowej in vitro w bioreaktorach symulujących warunki przewodu pokarmowego. Technika umożliwia badanie dynamiki mikroorganizmów w kontrolowanym środowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pani Audrey Thomas-Gahring jest doceniana za swoją pracę w GC/MS. Chcielibyśmy również podziękować Massimo Marzorati za redakcję manuskryptu.

<ol><li>Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+mucus+layers+of+colon+are+organized+by+the+MUC2+mucin%2C+whereas+the+outer+layer+is+a+legislator+of+host-microbial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).</li>
<li>Xu, J., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honor+thy+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Honor thy symbionts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).</li>
<li>Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+normal+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of the normal gut microbiota.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).</li>
<li>Macfarlane, G., Macfarlane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+intestinal+fermentation%3A+association+between+food+components%2C+delivery+systems%2C+bioavailability+and+functional+interactions+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut.</a> Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).</li>
<li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulating+distal+gut+mucosal+and+luminal+communities+using+packed-column+biofilm+reactors+and+an+in+vitro+chemostat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).</li>
<li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabinoxylans%2C+inulin+and+Lactobacillus+reuteri+1063+repress+the+adherent-invasive+Escherichia+coli+from+mucus+in+a+mucosa-comprising+gut+model%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+and+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016(2016).</li>
<li>Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+selects+mucosal+and+luminal+associations+of+coevolved+gut+microorganisms%3A+a+novel+concept%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).</li>
<li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+a+mucosal+environment+in+a+dynamic+gut+model+results+in+a+more+representative+colonization+by+lactobacilli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli.</a> Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).</li>
<li>Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome-host+interactions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome-host interactions in health and disease.</a> Genome Medicine. 3 (3), 14(2011).</li>
<li>Wissenbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+metabolomics+of+defined+in+vitro+gut+microbial+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems.</a> International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).</li>
<li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microbial+community+reproducibility%2C+stability+and+composition+in+a+human+distal+gut+chemostat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).</li>
<li>Venema, K., van den Abbeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+and+Research.+Clinical+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Experimental models of the gut microbiome.</a> Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).</li>
<li>Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+functions+of+gut+microbiota+metabolism+impacting+host+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).</li>
<li>Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anxiety%2C+Depression%2C+and+the+Microbiome%3A+A+Role+for+Gut+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides.</a> Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).</li>
<li>Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Axenic+Larvae+Colonization+with+Human+Intestinal+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota.</a> Zebrafish. 00 (00), (2017).</li>
<li>Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaped+fecal+gut+microbiota+composition+by+the+intake+of+high+molecular+weight+persimmon+tannin+in+normal+and+high-cholesterol+diet-fed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Function%22%5BJournal%5D)">Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats.</a> Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).</li>
<li>Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li>
<li>Hale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+Versus+Phylogeny%3A+a+Comparison+of+Gut+Microbiota+in+Captive+Colobine+Monkey+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species.</a> Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).</li>
<li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+contributes+to+longitudinal+diversity+of+fecal+microbiota+in+swine+selected+for+lean+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth.</a> Microbiome. 6 (1), 4(2018).</li>
<li>Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+perspectives+in+in+vitro+human+gut+fermentation+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling.</a> Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).</li>
<li>Muegge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+drives+convergence+in+gut+microbiome+functions+across+mammalian+phylogeny+and+within+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans.</a> Science. 332 (6032), 970-974 (2011).</li>
<li>Santiago-Rodriguez, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemostat+culture+systems+support+diverse+bacteriophage+communities+from+human+feces%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces.</a> Microbiome. 9 (3), 58(2015).</li>
<li>Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gastrointestinal+microbiota+as+a+site+for+the+biotransformation+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).</li>
<li>Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combined+LC-MS+Metabolomics-+and+16S+rRNA+Sequencing+Platform+to+Assess+Interactions+between+Herbal+Medicinal+Products+and+Human+Gut+Bacteria+in+Vitro%3A+a+Pilot+Study+on+Willow+Bark+Extract%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract.</a> Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).</li>
<li>Cueva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fermentation+of+grape+seed+flavan-3-ol+fractions+by+human+faecal+microbiota%3A+changes+in+microbial+groups+and+phenolic+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites.</a> FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).</li>
<li>Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+5-step+multi-chamber+reactor+as+a+simulation+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apigenin+Impacts+the+Growth+of+the+Gut+Microbiota+and+Alters+the+Gene+Expression+of+Enterococcus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus.</a> Molecules. 22 (8), (2017).</li>
<li>Caporaso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li>
<li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search+and+clustering+orders+of+magnitude+faster+than+BLAST%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.</a> Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).</li>
<li>Cole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+Database+Project%3A+data+and+tools+for+high+throughput+rRNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).</li>
<li>Liu, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+mucosal+gut+microbial+community+in+vitro+using+an+artificial+simulator%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator.</a> PLoS ONE. 13 (7), e0197692(2018).</li>
<li>Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+de+Wiele%2C+T+%22The+Impact+of+Food+Bio-Actives+on+Gut+Health%22">The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health</a>. Verhoeckx, K., et al. , Springer Link. (2015).</li>
<li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate-producing+Clostridium+cluster+XIVa+species+specifically+colonize+mucins+in+an+in+vitro+gut+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model.</a> The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).</li>
<li>Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-DGGE-based+quantification+of+stability+of+the+microbial+community+in+a+simulator+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem.</a> FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).</li>
<li>Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+short-chain+fatty+acids+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of short-chain fatty acids in health and disease.</a> Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).</li>
<li>Yang, J., Kweon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota%3A+a+key+regulator+of+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases.</a> BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).</li>
<li>Sonnenburg, J., Bäckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-microbiota+interactions+as+moderators+of+human+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism.</a> Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.

Systemy hodowli in vitro zostały opracowane w celu badania mikrobioty jelitowej jelita grubego. Używają aparatury zaprojektowanej do symulacji warunków fizjologicznych przewodu pokarmowego, promując wzrost dojrzałej społeczności drobnoustrojów jelitowych dla każdego regionu okrężnicy33. Chociaż koncepcja ta jest logiczna i zrozumiała, samo prowadzenie systemów hodowli in vitro w celu badania mikrobioty jelitowej wymaga precyzji i zrozumienia, co jest wymagane i oczekiwane, aby uzyskać wiarygodne w...

Mikrobiota jelitowa to społeczność mikroorganizmów rezydujących w ludzkim przewodzie pokarmowym (GIT). Społeczność ta osiąga maksymalne stężenie w okrężnicy, która według szacunków zawiera 1013-10 14 bakterii, z 500-1000 gatunków, które żyją w symbiozie ze środowiskiem okrężnicy1,2. Skład i funkcjonalność mikrobioty jelitowej zmieniają się przestrzennie wzdłuż przewodu pokarmowego, tworząc społeczności specyficzne dla regionu, przy czym największą różnorodność stwierdzono dystalnie2,3,4,5. Dla każdego regionu anatomicznego w świetle i na błonie śluzowej znajdują się odrębne zbiorowiska drobnoustrojów6. Społeczność lumenów ma bardziej bezpośredni dostęp do składników odżywczych, ponieważ substraty przemieszczają się przez przedział luminalny7. Mimo to niektóre bakterie znajdują się preferencyjnie w warstwie śluzu, wykorzystując mucynę wytwarzaną przez komórki jelita grubego jako źródło energii1,5,8. Różnica w mikrośrodowiskach między fazą światła i błony śluzowej powoduje dywergencję i rozwój zbiorowisk specyficznych dla fazy. Razem społeczności te zapewniają funkcje metaboliczne, takie jak metabolizm składników odżywczych i produkcja witamin, oraz funkcje immunologiczne, takie jak zapobieganie kolonizacji ludzkich patogenów1,3,9. Mikrobiota jelitowa działa również funkcjonalnie w połączeniu z ludzkimi komórkami jelita grubego3.
Jako ważna część ludzkiego przewodu pokarmowego, nie jest zaskakujące, że mikrobiota jelitowa jest znana z tego, że przyczynia się zarówno do zdrowia gospodarza, jak i statusu choroby3,9,10,11,12. Zmiana w populacji drobnoustrojów jelitowych wiąże się z wieloma chorobami u ludzi, w tym zaburzeniami przewodu pokarmowego, takimi jak choroba jelit (IBD) i zespół jelit (IBS), ale także z innymi chorobami, takimi jak otyłość, choroby krążenia i autyzm3,9,10,11,12. Metabolity wytwarzane przez mikrobiotę jelitową mają działanie globalne, docierając do miejsc oddalonych od jelita12,13. Na przykład oś jelitowo-mózgowa jest związana z zaburzeniami psychicznymi, takimi jak lęk i depresja14. Dlatego badanie mikrobioty jelitowej jest ważne dla wielu dziedzin badań i ma zastosowanie w przypadku wielu chorób, nawet tych, które często nie są związane z przewodem pokarmowym.
Chociaż powszechnie uznaje się, że badanie mikrobioty jelitowej jest ważne, jest to skomplikowane przedsięwzięcie. Dostępnych jest wiele modeli zwierzęcych, od małych zwierząt, takich jak danio pręgowany, szczury i myszy, po większe, takie jak małpy i świniew wieku 15-19 lat. Jednak zastosowanie tych zwierząt w odniesieniu do ludzkiej mikrobioty jelitowej nie jest proste, ponieważ zwierzęta te mają unikalną społeczność bakteryjną, która wyewoluowała w oparciu o środowisko i dietę, i anatomicznie różnią się od ludzi20,21. Wykorzystanie ludzi usuwa pytanie o istotność, ale wprowadza kolejny zestaw wyzwań. Badania na ludziach są kosztowne, czasochłonne i etycznie ograniczone11. Co więcej, czynniki zakłócające wpływają na mikrobiotę jelitową w badaniach na ludziach, w tym wiek lub etap rozwoju, środowisko, dieta, leki i czynniki genetyczne2,4,22. Istnieją również ograniczenia dotyczące tego, co można badać na ludziach i jaki rodzaj próbek można pobierać w jakim czasie4. 
Jedną z krytycznych wad korzystania z systemu in vivo do badania mikrobioty jelitowej jest obecność składników pochodzących od ssaków. Mikrobiota jelitowa i komórki ludzkie oddziałują na siebie, a w warunkach in vivo niemożliwe jest ich rozróżnienie. Metabolity wytwarzane przez mikrobiotę jelitową są wychwytywane przez komórki jelita grubego, więc pomiary nie mogą być obliczone z precyzją. W związku z tym wszelkie badania mechanistyczne muszą być ograniczone do pomiarów punktu końcowego11. Inną poważną wadą badań in vivo jest brak możliwości pobrania próbek z różnych regionów przewodu pokarmowego longitudinally23. Nie pozwala to na ocenę zmian, które mogą wystąpić w mikrośrodowisku jelita grubego w czasie12. Wiele badań in vivo, w tym badania na ludziach, opiera się na analizie próbek kału w celu wykrycia zmian w mikrobiocie jelitowej12. Chociaż jest to pouczające, nie dostarcza danych na temat mikrobioty jelitowej w całym przewodzie pokarmowym i nie rozróżnia społeczności luminalnych i śluzówkowych5,6,7,8.
Dla mikrobioty jelitowej wymagane jest zastosowanie metody in vitro do badania dynamiki społeczności bakteryjnej, bez ingerencji ze strony składników ssaków. Zastosowanie metody in vitro pozwala na ścisłą kontrolę warunków środowiskowych10, testowanie wielu parametrów jednocześnie oraz możliwość pobierania próbek wzdłużnie i w dużych ilościach11. Ponieważ metoda in vitro wykorzystuje urządzenie mechaniczne, a nie gospodarza, nie trzeba brać pod uwagę wieku, środowiska, diety ani tła genetycznego. Systemy te mogą być wykorzystywane do badania całej społeczności mikrobioty jelitowej, tylko wybranych organizmów, a nawet pojedynczych szczepów. Co ważne, wyniki in vitro są powtarzalne, a jednocześnie zachowują poziom różnorodności porównywalny z badaniami in vivo11,22.
W zależności od hipotezy, o której mowa, iin vitro, badania in vitro mogą być prowadzone na wiele sposobów. Mogą wykorzystywać systemy jednonaczyniowe i proste metody, takie jak inkubacja próbek z homogenatem kału24 lub przeprowadzanie hodowli pojedynczej partii w ciągu 24-48 h25. Można je również osiągnąć za pomocą systemów jednonaczyniowych i bardziej złożonych metod, takich jak użycie systemu chemostatu do wytworzenia stabilnej społeczności mikroorganizmów jelitowych11. Jednak użycie pojedynczego reaktora może nadmiernie uprościć mikrobiotę12, ponieważ reprezentuje on tylko jedną część jelita grubego, mimo że okrężnica składa się z obszarów wstępujących, poprzecznych i zstępujących.
W celu zbadania społeczności mikrobioty jelitowej, która rozwija się w różnych regionach jelita grubego (regiony wstępujące, poprzeczne i zstępujące), można zastosować złożony, wieloetapowy system. W tych systemach wiele naczyń jest ustawionych tak, aby naśladować różne regiony okrężnicy, więc mikrobiota jelitowa regionów wstępujących, poprzecznych i zstępujących jest hodowana niezależnie. Naczynia te są połączone za pomocą pomp do sekwencyjnego przemieszczania substratów z obszarów wstępujących do poprzecznych i zstępujących, naśladując przepływ składników odżywczych przez przewód pokarmowy.
Celem tego badania było pokazanie, w jaki sposób 5-etapowy system hodowli in vitro (patrz Tabela materiałów) może być wykorzystany do hodowli społeczności mikrobioty jelitowej, oraz zademonstrowanie dynamiki społeczności pod względem stabilności i składu. W tym systemie jedno naczynie reprezentuje żołądek, a drugie jelito cienkie. Dwukropek jest podzielony na trzy regiony (rosnący, poprzeczny, malejący), z jednym naczyniem reprezentującym każdy region26. W tej eksperymentalnej konfiguracji dwa kompletne systemy prowadzono równolegle, przy czym jednostka 1 zawierała nośniki mucyny reprezentujące powierzchnię błony śluzowej, a jednostka 2 nie zawierała nośników mucyny. Społeczności, które rozwinęły się w fazie świetlnej i śluzówkowej każdego regionu, porównano ze sobą i z inokulum kałowym w czasie za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i analizy SCFA. Przedstawione wyniki pokazują rodzaj zbiorowiska, zarówno pod względem składu, jak i funkcjonalności, które można wytworzyć z tego typu systemu in vitro.

<table><tbody><tr><td>TWINSHIME</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zdefiniowane podłoże (dorosły M-SHIME pożywka wzrostowa ze skrobią)</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Rurki Masterflex</td><td>cole Parmer</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Worek drenażowy moczu</td><td>Bard</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Labsorb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Próbka kału</td><td>Openbiome</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>Becton Dickson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zdefiniowane podłoże</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Oxgall Bile</td><td>Becton Dickson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pancreatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Wyroby szklane</td><td>Ace Glass</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mucyna</td> wieprzowa <td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Agor bakteriologiczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Woreczki do sterylizacji</td><td>VWR</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>BeadBug</td><td>Benchmark Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Potrójnie czysty cyrkon wysokoudarowy 0,1 mm Rurka do ubijania koralików</td><td>Benchmark Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bez RNAza, bez DNA, sterylna woda</td><td>Roche</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS</td><td>Shimadzu</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Stabilwax-DA, 30 m, średnica wewnętrzna 0,25 mm, 0,25 &mikro; m</td><td>Restek</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>plastikowe nośniki mucyny</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie zaawansowanej technologii hodowli in vitro do badania mikrobioty jelitowej człowieka

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Mikrobiota jelitowa człowieka odgrywa istotną rolę zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Badanie mikrobioty jelitowej przy użyciu modelu in vivo jest trudne ze względu na jej złożony charakter i różnorodne powiązania z komponentami ssaków. Celem tego protokołu jest hodowla mikrobioty jelitowej in vitro, co pozwala na badanie dynamiki mikrobioty jelitowej bez konieczności uwzględniania wkładu środowiska ssaków. Korzystając z technologii hodowli in vitro, symulowane są warunki fizjologiczne przewodu pokarmowego, w tym parametry takie jak pH, temperatura, anaerobioza i czas pasażu. Powierzchnia jelita grubego jest symulowana przez dodanie nośników pokrytych mucyną, utworzenie fazy śluzówkowej i dodanie dalszego wymiaru. Mikrobiota jelitowa jest wprowadzana poprzez inokulację ludzkim materiałem kałowym. Po zaszczepieniu tą złożoną mieszaniną bakterii, określone drobnoustroje są wzbogacane w różnych podłużnych (wstępujących, poprzecznych i zstępujących okrężnicach) i poprzecznych (luminalnych i śluzówkowych) środowiskach modelu in vitro. Kluczowe znaczenie ma umożliwienie systemowi osiągnięcia stanu stacjonarnego, w którym społeczność i wytwarzane metabolity pozostają stabilne. Wyniki eksperymentalne zawarte w tym manuskrypcie pokazują, w jaki sposób zaszczepiona społeczność mikrobioty jelitowej przekształca się z czasem w stabilną społeczność. Po osiągnięciu stanu ustalonego system może być wykorzystywany do analizy interakcji bakterii i funkcji społeczności lub do testowania wpływu wszelkich dodatków na mikrobiotę jelitową, takich jak żywność, składniki żywności lub farmaceutyki.

Powyższy protokół opisuje przygotowanie, inokulację i prowadzenie 5-stopniowego systemu in vitro do badania mikrobioty jelita grubego. W celu uzyskania przedstawionych poniżej danych, po ekstrakcji DNA przeprowadzono sekwencjonowanie DNA markerowego genu 16S rRNA w regionie V1V2 z wykorzystaniem sekwencjonowania wysokoprzepustowego (np., platforma MiSeq Illumina) w Microbiome Center w Children’s Hospital of Philadelphia27. Do przetwarzania danych sekwencyj...

Tutaj prezentujemy protokół hodowli mikrobioty jelitowej jelita grubego in vitro, przy użyciu szeregu bioreaktorów, które symulują warunki fizjologiczne przewodu pokarmowego.

Zastosowanie zaawansowanej technologii hodowli in vitro do badania mikrobioty jelitowej człowieka

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Celem tego protokołu jest hodowla mikrobioty jelitowej in vitro. Pozwoli to na badanie dynamiki mikrobioty bez konieczności uwzględniania udziału nowoczesnego komponentu. Korzystając z tego wieloetapowego systemu in vitro, liczymy, że społeczność mikrobioty rozwija się jednocześnie w świetle i na błonie śluzowej w wielu regionach jelita grubego.Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna ze względu na złożoność tego systemu in vitro. Zacznij od wypełnienia okrężnicy wstępującej 500 mililitrami zdefiniowanego podłoża, okrężnicy poprzecznej 800 mililitrami zdefiniowanego pożywki, a dwukropka opadającego 600 mililitrami zdefiniowanego podłoża. Dodać mucynę agricarriers do okolic okrężnicy w ilości proporcjonalnej do objętości reaktora i użyć probówki z próbką i strzykawki, aby usunąć nadmiar zdefiniowanego podłoża z każdego reaktora.Użyj sond pH, aby wyregulować pH w każdym reaktorze. I włącz spłukiwanie azotem na 20 minut. Następnie rozmrozić homogenat kału zgodnie z wytycznymi producenta przed załadowaniem 60-mililitrowej strzykawki próbką homogenatu kału.Następnie zaszczepić każdy reaktor okrężnicy przez port próbki ilością homogenatu równą 5% objętości każdego reaktora w celu hodowli nocnej z kontrolą pH. Następnego ranka wyczyść kłódkę luer w porcie próbki każdego bioreaktora alkoholem. Po wyschnięciu portów podłącz 30-mililitrową strzykawkę, oczyszczoną z całego powietrza, do jednego z portów próbki.Wycofać tłok trzy do pięciu razy, aby zapewnić dokładne wymieszanie składników naczynia przed zasysaniem 15 mililitrów supernatu kultury z bioreaktora. Następnie przenieś próbkę światła do sterylnej probówki Falcon i umieść na lodzie. Do analizy DNA zbierz od jednego do trzech mililitrów płynu świetlnego za pomocą pięciomililitrowej strzykawki.W ten sam sposób należy zebrać supernat z innych bioreaktorów. Aby odłożyć materiał próbki do analizy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, odwiruj 15 mililitrów interesującej nas próbki światła i strzykawką przefiltruj supernat przez filtr porowy o średnicy 0,2 mikrometra do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby odłożyć materiał próbki do analizy DNA, odwiruj jeden mililitr płynu świetlnego i przechowuj osad w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.W celu pobrania próbki błony śluzowej należy usunąć przygotowane nośniki mucyny z magazynu w czterech stopniach Celsjusza i włączyć płukanie azotem. Szybko otwórz pokrywę reaktora i wymień 50% nośników w każdym reaktorze na nowe. Po wymianie wszystkich nośników szybko ponownie zamknij pokrywę i utrzymuj płukanie azotem przez kolejne 20 minut.Następnie podamulować od 0,25 do 0,5 grama agaru nośnika mucyny do pojedynczych dwumililitrowych probówek do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do ekstrakcji DNA. Trzy razy dziennie system automatycznie przełącza się na cykle. Rozpoczyna się to od przeniesienia 140 mililitrów zdefiniowanej pożywki do bioreaktora żołądkowego, a następnie godzinnej inkubacji z kontrolą pH.Pod koniec inkubacji zawartość żołądka przenosi się do jelita cienkiego wraz z 60 mililitrami soku trzustkowego. W bioreaktorze jelita cienkiego pH jest automatycznie dostosowywane do 6,7 do 6,9, a zawartość inkubuje się przez 90 minut. Podczas tej inkubacji płukanie azotem dla każdego systemu jest włączane na łącznie 10 minut.Pod koniec tej inkubacji zawartość jelita cienkiego jest przenoszona do okrężnicy wstępującej, z okrężnicy wstępującej do okrężnicy poprzecznej, z okrężnicy poprzecznej do okrężnicy zstępującej i z okrężnicy zstępującej do odpadów. W tej reprezentatywnej analizie współrzędnych głównych społeczność zmieniła się w sposób amortyzujący między pierwszym a siódmym dniem. Jednak od 11 dnia po inokulacji do końca eksperymentu próbki zajmowały niewielki obszar głównej przestrzeni analizy współrzędnych zarówno dla wyników odległości między próbkami, w oparciu o operacyjną jednostkę taksonomiczną, obecność do braku i liczebność.Pomiar trzech głównych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych ujawnia, że kwas propionowy, kwas butanowy i kwas octowy zmieniają się od początku eksperymentu do 15 dnia po inokulacji. Po 15 dniu ilości tych kwasów wytwarzanych w każdym regionie okrężnicy pozostały stałe z minimalnymi zmianami do końca eksperymentu. Analiza stabilnego zbiorowiska dla fazy świetlnej i śluzówkowej każdego regionu jelita grubego pokazuje, że zbiorowiska, które rozwijają się w poszczególnych regionach okrężnicy systemu in vitro, są podobne do składu inokulum kałowego.Porównanie różnorodności alfa w systemie in vitro ujawnia podobny poziom różnorodności jak w inokulum dla wszystkich regionów, z wyjątkiem próbek światła z obszaru wstępującego. Wykazanie, że system hodowli in vitro jest w stanie wytworzyć społeczność porównywalną do inokulum kałowego, zarówno pod względem składu, jak i różnorodności. Aby wytworzyć stabilną społeczność mikrobioty jelitowej przy użyciu tego protokołu, kluczowe znaczenie ma zapewnienie dokładnego przygotowania roztworów oraz utrzymanie warunków beztlenowych i parametrów pH przez cały czas trwania eksperymentu.Zgodnie z tą procedurą, próbki mogą być analizowane pod kątem składu społeczności przy użyciu sekwencjonowania DNA nowej generacji, a następnie analizy bioinformatycznej oraz pod kątem funkcjonalności przy użyciu metabolomiki.

applying-advanced-vitro-culturing-technology-to-study-human-gut

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Ahmadi, S. i in. Model hodowli partii in vitro do szacowania efektów reżimów interwencyjnych na ludzką mikrobiotę kałową. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje metodę modelowania fermentacji mikroorganizmów jelitowych poprzez inkubację próbek kału z fermentowalnym błonnikiem w warunkach beztlenowych w celu badania produkcji metabolitów przez mikrobiotę jelitową.

In vitro Model hodowli partiowej naśladujący fermentację kolonową przez ludzką mikrobiotę jelita

W tym filmie opisujemy metodologię tworzenia systemu hodowli narządów jelitowych ex vivo w celu zbadania interakcji między fragmentami tkanki jelitowej myszy a specyficznymi bakteriami jelitowymi. Urządzenie składa się z dwóch par portów wejścia-wyjścia, z których pierwszy łączy światło tkanki jelitowej i dostarcza do niej specyficzną zawiesinę bakteryjną, a drugi w sposób ciągły dostarcza pożywkę do studzienek urządzenia w celu utrzymania żywotności tkanek ex vivo.

System hodowli narządów jelitowych ex vivo do badania interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Tutaj opisany jest protokół zbierania, utrzymywania i leczenia organoidów jelita cienkiego myszy z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP) i Listeria monocytogenes, a także nacisk na ekspresję genów i właściwe techniki normalizacji białka.

Hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy

Opisujemy protokół in vitro do wspólnej hodowli mikrobiomu jelitowego i kosmków jelitowych przez dłuższy okres przy użyciu ludzkiego systemu mikrofizjologicznego typu gut-on-a-chip.

Współhodowla żywego mikrobiomu z mikroinżynieryjnymi kosmkami jelitowymi człowieka w urządzeniu mikroprzepływowym typu gut-on-a-chip

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

Interakcje między gospodarzem a mikroorganizmem jelitowym zostały ocenione przy użyciu nowatorskiego podejścia łączącego syntetyczną społeczność doustną, trawienie in vitro przewodu pokarmowego i model nabłonka jelita cienkiego. Przedstawiamy metodę, którą można zaadaptować do oceny inwazji komórek patogenów i biofilmów wielogatunkowych, a nawet do badania przeżywalności preparatów probiotycznych.

Ocena żywotności konsorcjum bakterii syntetycznych na granicy faz gospodarz-mikroorganizm w jelitach in vitro

Ten protokół opisuje system fermentacji in vitro mikroflory kałowej przy użyciu inuliny (dobrze znanego prebiotyku i jednego z najczęściej badanych modulatorów mikrobioty), aby zademonstrować użycie tego systemu do szacowania wpływu konkretnych interwencji na skład mikrobioty kałowej i aktywność metaboliczną.

Model hodowli okresowej in vitro w celu oszacowania wpływu schematów interwencyjnych na mikrobiotę kału ludzkiego

Opisany tutaj jest protokół do badania interakcji między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową za pomocą systemów fermentacji in vitro.

Analiza interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową człowieka przy użyciu systemów fermentacji w kąpieli in vitro

Ten artykuł przedstawia unikalną metodę analizy interakcji gospodarz-mikrobiom przy użyciu nowatorskiego systemu hodowli narządów jelitowych do eksperymentów ex vivo.

System hodowli jelit i narządów do analizy interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Poznaj metodę hodowli mikrobioty jelitowej in vitro w bioreaktorach symulujących warunki przewodu pokarmowego. Technika umożliwia badanie dynamiki mikroorganizmów w kontrolowanym środowisku.

Zastosowanie zaawansowanej technologii hodowli in vitro do badania mikrobioty jelitowej człowieka

Przeglądaj więcej filmów