Name: Bardzo czuły pomiar przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy z izotiocyjanianem fluoresceiny i polisarozą 70 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę pomiaru przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy z użyciem fluorescencyjnego znacznika FITC-polisaroza 70. Technika umożliwia wykrywanie małych, przejściowych zmian w nefrologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Christinie Schwandt, Blanki Duvnjak i Nicoli Kuhr za wyjątkową pomoc techniczną oraz dr Dennisowi Sohnowi za pomoc przy skanowaniu fluorescencyjnym. Badania te zostały wsparte grantem Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 dla L.C.R. i L.S. Grantodawca nie odgrywał żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zawartymi w Przewodniku do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (publikacja US National Institutes of Health nr 85-23, poprawiona w 1996 roku). Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi zezwoleniami instytucjonalnymi (rząd krajowy Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] numer referencyjny 84-02.04.2012.A397).
1. Przygotowanie instrumentów, roztworów i sprzętu
<ol>
	<li>Rozpuścić FITC-polisacharozę 70 w 0,9% sterylnym chlorku sodu (NaCl) do końcowego stężenia 10 mg/ml (tj. 100 mg w 10 ml NaCl).</li>
	<li>Dializować roztwór polisacharozy FITC-70 w celu usunięcia wolnych cząsteczek FITC przez noc w temperaturze 4 °C (odcięcie masy cząsteczkowej [MWCO] przy 10 000). Użyć 1 l 0,9% sterylnego NaCl na 10 ml polisacharozy FITC 70 pod ciągłym mieszaniem. Chronić przed światłem. Podwielokrotnić dializowaną polisacharozę FITC 70 i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>W przypadku polisacharozy FITC-70 bolusa dodać 4 μl 10 mg/ml roztworu polisacharozy FITC 70 do 996 μl 0,9% NaCl (końcowe stężenie polisacharozy FITC 70: 40 μg/ml).</li>
	<li>W celu uzyskania równoważącego roztworu infuzyjnego dodać 20 μl roztworu polisacharozy 70 o stężeniu 10 mg/ml do 9,98 ml 0,9% sterylnego NaCl, uzyskując końcowe stężenie 20 μg/ml.</li>
	<li>W przypadku roztworu doświadczalnego dodać leki lub substancje do roztworu do infuzji (np. dla angiotensyny II [Ang II] [100 ng/kg/min] dla myszy 25 g dodać 3 μl Ang II z 1 mM roztworu).</li>
	<li>Do operacji przygotuj jedną golarkę, dwa zaciski chirurgiczne, jedną parę nożyczek chirurgicznych, dwie pęsety, dwie cienkie pęsety, jedną parę cienkich nożyczek i waciki. Przygotuj dwie 10 cm nici jedwabne (4-0 do 6-0) do zabiegów podwiązania.</li>
	<li>Do założenia cewnika do żyły centralnej należy przygotować strzykawkę o pojemności 10 ml z igłą 21 G. Umieść końcówkę igły w cewniku o długości 30 cm (o średnicy wewnętrznej [ID] 0,58 mm). Podłącz cewnik 0,58 mm do cewnika 10 cm (o średnicy wewnętrznej 0,28 mm). Przetnij końcówkę mniejszego cewnika skośnie, aby utworzyć ostrą końcówkę, która jest wprowadzana do żyły szyjnej.</li>
	<li>Przygotuj znieczulenie (tj. znieczulenie dootrzewnowe ketamina 100 mg/kg masy ciała i ksylazyna 5 mg/kg masy ciała).</li>
	<li>Przygotuj angiocewnik o masie 22 G, odrzucając igłę i oznaczając cewnik w odległości 1 cm od końcówki. Rozgrzej poduszkę grzewczą do 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj urządzenie do pomiaru ciśnienia krwi i w razie potrzeby wymień membranę do pomiaru ciśnienia krwi.</li>
</ol>
2. Faza przygotowawcza
<ol>
	<li>Cewnik moczowy 
	UWAGA: Sekcja 2.1 jest zgodna z protokołem opisanym przez Reisa i wsp.7. <silna klasa="xfig">Rysunek 1 i Rysunek uzupełniający 1 pokazują umiejscowienie cewnika moczowego u samic myszy.
	<ol>
		<li>Znieczulić mysz ketaminą/ksylazyną (patrz krok 1.8). Użyj testu szczypania palców u stóp, aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie. Aby utrzymać znieczulenie, należy powtórzyć znieczulenie (np. z połową dawki) po 60 minutach. Prawidłowe znieczulenie potwierdza się, jeśli próba uszczypnięcia palca u nogi nie spowoduje wycofania odruchu. 
		UWAGA: W tym protokole używane są samice myszy FVB.</li>
		<li>Ustaw mysz w pozycji leżącej grzbietowej na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C. Zaciśnij dolną część brzucha i znajdź ujście cewki moczowej (np. pod mikroskopem).</li>
		<li>Użyj plastikowej części cewnika angiocewnika 22 G i nasmaruj go żelem ksylocainowym. Wprowadź go ostrożnie 3 mm do ujścia cewki moczowej, równolegle do dystalnej osi cewki moczowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Obróć górną część angiocewnika o 180°, trzymając końcówkę w ujściu cewki moczowej i utrzymując oś cewki moczowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Wprowadzić cewnik o 7 mm głębiej do organizmu myszy, tak aby został umieszczony w pęcherzu moczowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Nie wciskaj cewnika na siłę poza opór. Skoryguj położenie cewnika od początku, jeśli wyczuwalny jest opór. Należy pamiętać, że jeśli pozycja cewnika moczowego jest prawidłowa, mocz może już pojawić się w cewniku.</li>
		<li>Umieść brązową rurkę o pojemności 1,5 ml na górze cewnika naczyniowego, aby zebrać mocz. Zastosuj podskórnie 1 ml 0,9% NaCl, aby zwiększyć produkcję moczu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cewnik do żyły centralnej 
	<ol>
		<li>Ogol szyję myszy i umieść ją w pozycji leżącej z głową skierowaną w stronę chirurga. Hyperstretch głowę myszy za pomocą taśmy.</li>
		<li>Zdezynfekuj szyję 70% izopropanolem. Wykonaj małe nacięcie skóry (5 mm) poniżej linii żuchwy za pomocą pęsety i nożyczek. Przeciąć skórę około 1 cm w kierunku mostka, aż do osiągnięcia środka mostka.</li>
		<li>Ostrożnie wypreparuj skórę po prawej stronie szyi za pomocą nożyczek. Wykonaj prostokątne nacięcie skóry po prawej stronie myszy, aby odsłonić tkankę miękką szyi. Użyj nożyczek i pęsety. Zamocuj płaty skóry za pomocą dwóch zacisków. 
		UWAGA: Żyła szyjna biegnie wzdłuż lewej strony tarczycy lub jest lekko pokryta prawym płatem tarczycy. Po tym kroku użyj mikroskopu do operacji.</li>
		<li>Ostrożnie odsłoń żyłę szyjną preparatem, używając końcówki cienkiej pęsety. Unikaj uszkodzeń gałęzi żył. 
		UWAGA: Może być konieczne usunięcie tkanki cienkimi nożyczkami. Zachowaj ostrożność podczas używania nożyczek do usuwania tkanki, ponieważ zwiększa to ryzyko krwawienia.</li>
		<li>Umieść i zamknij ligaturę jedwabną nicią (4-0 do 6-0) w dystalnej części widocznej żyły szyjnej (w kierunku głowy myszy). Napręż ligaturę, mocując jedwabną nić taśmą, aby zapewnić lekkie napięcie żyły szyjnej. Przygotuj ligaturę wokół bliższej części żyły szyjnej.</li>
		<li>Napełnić cewnik roztworem do infuzji równowagowej (patrz krok 1.4) i przymocować cewnik taśmą tak, aby cewnik wyrównywał żyłę szyjną. Kontroluj pęcherzyki, aby uniknąć zatoru powietrznego.</li>
		<li>Podnieś żyłę szyjną za pomocą cienkiej pęsety w miejscu wkłucia (miejsce wkłucia znajduje się 1–2 mm proksymalnie ligatury). Wyrównaj rurkę równolegle do żyły szyjnej. Nakłuć żyłę szyjną, kierując się w stronę światła, i włożyć na około 2–4 mm, równolegle do osi żyły szyjnej. Unikaj energicznych ruchów.</li>
		<li>Zamknij ligaturę, aby zamocować cewnik. Kontroluj szczelność ligatury poprzez dokładne oglądanie przez mikroskop. Umieść wilgotny wacik na miejscu operacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar ciśnienia krwi
	<ol>
		<li>Umieść mankiet ogonowy na dole ogona myszy, podczas gdy mysz leży w pozycji leżącej grzbietowej. Rozpocznij pomiary i powtórz je 10 razy na punkt czasowy. Zbuduj średnią z pomiarów.</li>
		<li>Dostosuj położenie mankietu tylnego, jeśli pomiary ciśnienia krwi nie wydają się prawidłowe i generowane są fałszywe dane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Faza równowagi
<ol>
	<li>Wymień rurkę do zbierania moczu przed rozpoczęciem fazy równowagi i umieść ją na lodzie.</li>
	<li>Wprowadzić strzykawkę o pojemności 10 ml wypełnioną roztworem fazy równoważącej FITC (patrz krok 1.4) z igłą 21 G i większym cewnikiem (o średnicy wewnętrznej 0,58 mm) i umieścić ją w pompie strzykawkowej.</li>
	<li>Złóż wacik i umieść go wokół cewnika do małych naczyń (o średnicy wewnętrznej 0,28 mm), który wprowadza się do żyły szyjnej. Umieść cewnik w waciku. Umieść zacisk na waciku, aby znieść wsteczny przepływ krwi lub zator powietrzny. Podłączyć igłę 27 G ze strzykawką o pojemności 1 ml wypełnioną bolusem FITC do końca cewnika do małych naczyń.</li>
	<li>Otwórz zacisk i nałóż bolus FITC (100 μl). Ponownie zamknij zacisk i połącz większy cewnik z mniejszym cewnikiem. Uruchomić pompę strzykawkową od 0,008 ml/min (0,480 ml/h). Kontynuować infuzję przez 60 minut.</li>
</ol>
4. Faza eksperymentalna
UWAGA: W tej fazie można badać wpływ leków na permselektywność kłębuszkową.
<ol>
	<li>Zmień rurkę moczową (punkt czasowy 0 min) na inną brązową rurkę o pojemności 1,5 ml. Umieść wacik wokół cewnika do małych naczyń i zamknij zacisk, jak wskazano w kroku 3.3.</li>
	<li>Odłączyć duży cewnik od cewnika do małych naczyń. Zmienić strzykawki na roztwory fazy doświadczalnej (patrz krok 1.5). Pozwól pompie infuzyjnej pracować tak, aby duży cewnik został wypełniony roztworem równoważącym.</li>
	<li>Ponownie podłącz cewniki, unikając zatoru powietrznego i ponownie otwórz zacisk. Uruchomić pompę strzykawkową przy 0,008 ml/min.</li>
	<li>Kontynuować pracę pompy strzykawkowej przez 60 minut, a następnie zebrać mocz do rurki moczowej (mocz 60 minut). Umieść rurkę moczu na lodzie.</li>
	<li>Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy podczas znieczulenia. Przed wyrzuceniem mysz jest obserwowana przez 5 minut, aby upewnić się, że jest martwa.</li>
</ol>
5. Analiza moczu
<ol>
	<li>Pomiar fluorescencji
	<ol>
		<li>Rozmrozić kałużę moczową i rozcieńczyć ją w stosunku 1:10 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). 
		UWAGA: Basen moczowy to kałuża moczu, która została zebrana od zdrowych myszy w 12-24 godzinnym zbieraniu moczu w klatce metabolicznej.</li>
		<li>Przygotuj wzorce do pomiaru fluorescencji. Weź 10 brązowych probówek o pojemności 1,5 ml i oznacz je jako ślepe (kałuża moczu rozcieńczona w stosunku 1:10) i następujące stężenia polisacharozy FITC 70 (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 i 160 μg/ml).</li>
		<li>Odmierzyć pipetę 246 μl rozcieńczonego moczu do brązowej probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 4 μl podstawowego stężenia FITC-polisacharozy 70 (patrz krok 1.1), aby uzyskać końcowe stężenie 160 μg/ml FITC-polisacharozy 70. Odpipetować 100 μl rozcieńczonego kałuży moczu do wszystkich pozostałych probówek.</li>
		<li>Rozcieńczyć w stosunku 1:2 przez pipetowanie 100 μl probówki 160 μg/ml polisacharozy 70 do probówki o stężeniu 80 μg/ml i kontynuować z innymi stężeniami. Upewnić się, że rozcieńczone stężenia są odpowiednio wymieszane (np. poprzez wirowanie probówki przed kontynuowaniem).</li>
		<li>Rozcieńczyć próbki moczu myszy (0 min, 60 min) w stosunku 1:10 rozcieńczonym zbiornikiem moczowym.</li>
		<li>Odmierzyć pipetą 5 μl każdego wzorcowego stężenia polisacharozy 70 FITC, a próbki moczu myszy w trzech egzemplarzach umieścić na czarnej płytce 384-dołkowej. Odwirować płytkę o masie 1 000 x g przez 15 sekund, aby uniknąć pęcherzyków.</li>
		<li>Przeanalizować płytkę 384-dołkową w czytniku płytek. Wykonać wzbudzenie przy 496 nm i zmierzyć fluorescencję przy 525 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar kreatyniny
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, przygotuj wzorce kreatyniny, rozcieńczając 10 μl 100 mM roztworu wzorca kreatyniny z 990 μl buforu do oznaczania kreatyniny, aby przygotować 1 mM roztwór wzorcowy.</li>
		<li>Dodaj 0, 2, 4, 6, 8 i 10 μl roztworu wzorcowego kreatyniny 1 mM do 96-dołkowej płytki, aby wygenerować odpowiednio 0, 2, 4, 6, 8 i 10 nmol/dołek. Dodać bufor do oznaczania kreatyniny do każdej studzienki, aby zwiększyć objętość do 50 μl.</li>
		<li>Przygotuj mieszaniny reakcyjne, dodając 42–44 μl buforu do oznaczania kreatyniny, 2 μl kreatynazy, 2 μl kreatyninazy, 2 μl mieszanki enzymów kreatyninowych i 2 μl sondy kreatyniny. Do ślepej próby użyj 44 μl buforu do oznaczania kreatyniny, 2 μl kreatynazy, 2 μl mieszanki enzymów kreatyninowych i 1–2 μl sondy kreatyniny.</li>
		<li>Dodać 50 μl odpowiedniej mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka na płytce 96-dołkowej i inkubować przez 60 minut na wytrząsarce poziomej w temperaturze 37 °C. Chronić płytkę przed światłem podczas inkubacji. Zmierzyć absorbancję przy 570 nm na czytniku płytkowym.</li>
		<li>Oblicz stężenie kreatyniny, odejmując wartość ślepej próby od wszystkich odczytów. Wynik będzie miał jednostkę nanomoli / mikrolitr. Pomnóż stężenie kreatyniny przez masę cząsteczkową kreatyniny (113,12 ng / nmol), aby otrzymać jednostkę nanogramów / mikrolitr.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Obliczyć stężenie polisacharozy FITC-70 w moczu na podstawie krzywej wzorcowej.</li>
	<li>Odnieś stężenia polisacharozy FITC-70 w moczu do stężeń kreatyniny w reprezentatywnej próbce moczu.</li>
	<li>Odnieś próbki moczu z 60 minut do próbek moczu 0 min kontrolnych i leczonych myszy.</li>
</ol>

<ol><li>Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts%3A+a+collaborative+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li>
<li>Mori, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+Total+Nephron+Albumin+Filtration+and+Reabsorption+in+Diabetic+Nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).</li>
<li>Amsellem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubilin+is+essential+for+albumin+reabsorption+in+the+renal+proximal+tubule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).</li>
<li>Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+dynamic+changes+in+glomerular+permeability+to+macromolecules+during+systemic+angiotensin+II+%28ANG+II%29+infusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).</li>
<li>Grande, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unaltered+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+caveolin-1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).</li>
<li>Jeansson, M., Haraldsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+size+and+charge+selectivity+in+the+mouse+after+exposure+to+glucosaminoglycan-degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).</li>
<li>Reis, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+features+of+the+urethra+and+urinary+bladder+catheterization+in+female+mice+and+rats.+An+essential+translational+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cirurgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).</li>
<li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513(2016).</li>
<li>Venturoli, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ficoll+and+dextran+vs.+globular+proteins+as+probes+for+testing+glomerular+permselectivity%3A+effects+of+molecular+size%2C+shape%2C+charge%2C+and+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).</li>
<li>Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+molecular+configuration+on+the+passage+of+macromolecules+across+the+glomerular+capillary+wall%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall.</a> The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).</li>
<li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction%3A+Effects+of+Tempol%2C+NOS-%2C+RhoA-+and+Rac-1-inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).</li>
<li>Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+inhibition+causes+acute+increases+in+glomerular+permeability+in+vivo%2C+dependent+upon+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).</li>
<li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+reactive+oxygen+species+%28ROS%29-dependent+effects+of+IL-1beta%2C+TNF-alpha%2C+and+IL-6+on+the+glomerular+filtration+barrier+%28GFB%29+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).</li>
<li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+size-selective+effects+of+protamine+sulfate+and+hyaluronidase+on+the+rat+glomerular+filtration+barrier+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).</li>
<li>Sverrisson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+fetal+hemoglobin+induces+increases+in+glomerular+permeability%3A+inhibition+with+alpha1-microglobulin+and+tempol%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).</li>
<li>Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats+following+laparotomy+and+muscle+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).</li>
<li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+sustained+increases+in+glomerular+permeability+following+ANP+infusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).</li>
<li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+hyperglycemia+induces+rapid%2C+reversible+increases+in+glomerular+permeability+in+nondiabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).</li>
<li>Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+early+endotoxemia+and+dextran-induced+anaphylaxis+on+the+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).</li>
<li>Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+renal+ischemia-reperfusion+reduces+charge+and+size+selectivity+of+the+glomerular+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).</li>
<li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction%3A+effects+of+Tempol%2C+NOS%2C+RhoA%2C+and+Rac-1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).</li>
<li>Rosengren, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+protein+transport+in+mice+lacking+endothelial+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).</li>
<li>Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+simultaneous+measurement+of+mouse+systolic+arterial+blood+pressure+by+radiotelemetry+and+tail-cuff+methods%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).</li>
<li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona metoda umożliwia badaczowi bardzo czułe badanie przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy za pomocą znacznika. Dzięki tej metodzie krótkotrwałe zwiększenie przepuszczalności kłębuszków nerkowych można zdiagnozować przy użyciu tylko niewielkich ilości moczu. Najważniejszymi krokami do pomyślnego opanowania tej techniki są: 1) rozwijanie wiedzy manualnej w chirurgii na myszach, zwłaszcza w kaniulacji żyły centralnej, 2) umieszczanie cewnika moczowego bez uszkadzania błony śluzowej oraz 3) ręczna wiedza s...

Funkcjonalne lub strukturalne defekty w obrębie kłębuszkowej bariery filtracyjnej zwiększają przepuszczalność kłębuszków nerkowych dla albuminy, co skutkuje wykryciem albuminy w moczu (albuminuria). Albuminuria przewiduje wynik sercowo-naczyniowy i jest ważnym markerem uszkodzenia kłębuszków nerkowych1. Nawet niski poziom albuminurii, leżący w normalnym zakresie, wiąże się ze zwiększonym ryzykiem sercowo-naczyniowym1.
W warunkach fizjologicznych albumina jest filtrowana przez kłębuszki nerkowy i jest prawie całkowicie ponownie wchłaniana w układzie rurkowym2,3. U myszy wykrywanie albuminy w moczu jest zwykle wykonywane za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) po 24 godzinach zbierania moczu. W przypadku użycia moczu z 24-godzinnego zbierania moczu lub moczu punktowego, niewielkie różnice w stężeniach albumin mogą zostać pominięte z powodu problemów z czułością testu. Większość badaczy używa zatem modeli zwierzęcych, w których albuminuria jest wywoływana przez silne uszkodzenie nerek spowodowane toksynami, lekami i chirurgią nerek.
Dlatego znalezienie czułej metody wykrywania małych i przejściowych zmian w przepuszczalności kłębuszków nerkowych jest bardzo ważne dla tej dziedziny. Rippe i wsp. przedstawili model szczurzy do testowania przepuszczalności kłębuszków nerkowych poprzez zastosowanie znakowanego fluorescencyjnie znacznika, a mianowicie FITC-polisacharozy 70 (tj. FITC-Ficoll 70), o wielkości albuminy4. Aplikacja znacznikowa umożliwia testowanie krótkoterminowych zmian przepuszczalności kłębuszków nerkowych (w ciągu kilku minut) i jest bardzo czuła4. W dwóch badaniach wykorzystano metodę śledzenia na myszach5,6. Pomimo swoich zalet ta metoda ma niestety wady: jest technicznie bardzo złożona, radioaktywna i inwazyjna. Dalsza analiza moczu jest wykonywana tylko przy użyciu filtracji żelowej lub wykluczenia rozmiaru HPLC5,6.
W tym artykule przedstawiamy alternatywną, czułą, nieradioaktywną i szybką metodę pomiaru przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanej polisacharozy FITC 70. Dzięki wprowadzeniu cewnika przezcewkowego, zbieranie moczu jest mniej inwazyjne niż nakłucie pęcherza moczowego, uretrotomia i założenie cewnika nadłonowego i umożliwia pobieranie moczu co najmniej co 30 minut. Analiza moczu jest wykonywana z małych ilości (5 μL) za pomocą czytnika fluorescencyjnego. Stężenia znaczników w moczu są normalizowane do stężeń kreatyniny w moczu za pomocą enzymatycznego testu kreatyniny.
Dlatego ta nowatorska metoda oferuje czułe narzędzie do badania wczesnego uszkodzenia kłębuszków nerkowych ze zwiększoną przepuszczalnością kłębuszków nerkowych.

<table><tbody><tr><td>Motic SMZ168 BL</td><td>Mikroskop Motic</td><td>SMZ168BL</td><td>do chirurgii myszy</td></tr><tr><td>KL1500LCD</td><td>Mikroskopia pulchowa i Lorenza</td><td>150500</td><td>światło do chirurgii myszy</td></tr><tr><td>Microfederschere</td><td>Braun, Aesculap</td><td>FD100R</td><td>cienkie nożyczki</td></tr><tr><td>Durotip Feine Scheren</td><td>Braun, Aesculap</td><td>BC210R</td><td>do cięcia szyi</td></tr><tr><td>Anatomische Pinzette</td><td>Braun, Aesculap</td><td>BD215R</td><td>do zabiegów chirurgicznych&nbsp;</td></tr><tr><td>Pr&auml; parierklemme</td><td>Aesculap</td><td>BJ008R</td><td>do zabiegów chirurgicznych&nbsp;</td></tr><tr><td>Seraflex</td><td>Serag Wiessner</td><td>IC108000</td><td>nić jedwabna</td></tr><tr><td>Ketamina 10%</td> <td>znieczulenie</td> <td>Medistar</td><td></td></tr><tr><td>Rompun (Xylazin) 2%</td> <td>znieczulenie</td> <td>Bayera</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa o drobnym otworze ID 0,28 mm OD 0,61 mm</td><td>Portex</td><td>800/100/100</td><td>Cewnik</td></tr> z <tr><td>polietylenu o drobnym otworze ID 0,58 mm OD 0,96 mm</td><td>Cewnik</td> <td>Portex</td><td>800/100/200</td></tr><tr><td>Aparat Harvard 11 Plus</td><td>Aparat Harvard</td><td>70-2209</td><td>pompa strzykawkowa</td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381823</td><td>&nbsp; cewnik moczowy</td></tr><tr><td>Detektor wielomodowy DTX 880</td><td>Czytnik płytek</td><td>Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka mikromiareczkowa</td><td>Nunc</td><td>262260</td><td>384 dołkowa płytka</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania kreatyniny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK080</td><td>do pomiaru stężenia kreatyniny</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Nunc</td><td>260836</td><td>do oznaczania kreatyniny&nbsp;</td></tr><tr><td>Polisacharoza z oznaczeniem FITC 70</td><td>TBD Consulting</td><td>FP70</td><td>FITC-ficoll</td></tr><tr><td>Angiotensyna II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525</td><td>służy do badania przepuszczalności kłębuszków nerkowych</td></tr><tr><td>BP-98A</td><td>Softron</td><td></td><td>do pomiaru ciśnienia krwi</td></tr><tr><td>OTS 40.3040</td> Płyta grzewcza <td>Medite</td><td>01-4005-00</td><td>do chirurgii myszy</td></tr><tr><td>Instillagel 6mL</td><td>Farco-Pharma GmbH</td><td></td><td>do cewnika moczowego</td></tr><tr><td>Golarka Exacta</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td></td></tr></tbody></table>

bardzo czuły pomiar przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy z izotiocyjanianem fluoresceiny i polisarozą 70

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

Utrata albuminy w moczu (albuminuria) przewiduje wynik sercowo-naczyniowy. W warunkach fizjologicznych niewielkie ilości albuminy są filtrowane przez kłębuszki nerkowe i ponownie wchłaniane w układzie kanalikowym aż do osiągnięcia granicy wchłaniania. Wczesne wzrosty patologicznej filtracji albuminowej mogą zatem zostać pominięte podczas analizy albuminurii. W związku z tym korzystne wydaje się stosowanie znaczników do badania permselektywności kłębuszków nerkowych. Znakowany fluorescencyjnie znacznik izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-polisacharozy (tj. FITC-Ficoll) może być stosowany do badania permselektywności kłębuszków nerkowych. Cząsteczki polisacharozy FITC są swobodnie filtrowane przez kłębuszki nerkowe, ale nie są ponownie wchłaniane w układzie kanalikowym. U myszy i szczurów polisacharoza FITC była badana w modelach przepuszczalności kłębuszków nerkowych przy użyciu technicznie złożonych procedur (tj. pomiary radioaktywne, wysokosprawna chromatografia cieczowa [HPLC], filtracja żelowa). Zmodyfikowaliśmy i ułatwiliśmy protokół oparty na znaczniku polisacharozy FITC, aby przetestować wczesne i niewielkie wzrosty przepuszczalności kłębuszków nerkowych do polisacharozy FITC 70 (wielkość albuminy) u myszy. Metoda ta pozwala na powtarzalne analizy moczu przy małych objętościach moczu (5 μl). Protokół ten zawiera informacje o tym, w jaki sposób znacznik FITC-polisacharoza 70 jest podawany dożylnie, a mocz jest zbierany za pomocą prostego cewnika moczowego. Mocz jest analizowany za pomocą czytnika fluorescencyjnego i normalizowany do markera stężenia moczu (kreatyniny), co pozwala uniknąć skomplikowanych technicznie procedur.

Jak przedstawiono na Rysunku 2, metoda badania przepuszczalności kłębuszkowej u myszy składa się z trzech faz. Pierwsza faza to faza przygotowawcza, podczas której umieszcza się cewnik moczowy oraz cewnik żylny centralny. Druga faza to faza równoważenia, która rozpoczyna się od dożylnego wstrzyknięcia bolusa FITC-polisacharydu 70, a następnie kontynuowana jest ciągłą infuzją FITC-polisacharydu 70 przez 60 min. Ostatnia faza to faza eksperymentalna. W tej fazi...

Tutaj prezentujemy protokół do badania przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy za pomocą bardzo czułego, nieradioaktywnego znacznika. Metoda ta pozwala na powtarzalne analizy moczu przy małych objętościach moczu.

Bardzo czuły pomiar przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy z izotiocyjanianem fluoresceiny i polisarozą 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nefrologii dotyczące roli przepuszczalności kłębuszków nerkowych w chorobach nerek. Główną zaletą tej techniki jest to, że niewielkie i przejściowe wzrosty przepuszczalności kłębuszków nerkowych są wykrywane za pomocą znacznika znakowanego ołowiem fluorescencyjnym. Po znieczuleniu umieść cewnik moczowy u samicy myszy.Ustaw mysz w pozycji leżącej grzbietowej. Zaciśnij dolną część brzucha i znajdź ujście cewki moczowej. Zaopatrzyć się w plastikową część cewnika angiocewnika 22 G i nasmarować go żelem ksylocainowym.Użyj lewego palca wskazującego, aby ostrożnie napiąć dolną część brzucha i wprowadzić cewnik trzy milimetry do ujścia cewki moczowej, jednocześnie równolegle do dalszej osi cewki moczowej. Obróć górną część angiocewnika o 180 stopni, trzymając końcówkę w ujściu cewki moczowej i utrzymując oś cewki moczowej. Następnie wprowadź cewnik siedem milimetrów głębiej do myszy, tak aby został umieszczony w pęcherzu.Umieść brązową rurkę o pojemności 1,5 mililitra na górze angiocewnika, aby zebrać mocz. Zastosuj podskórnie jeden mililitr 0,9% chlorku sodu, aby zwiększyć produkcję moczu. Ogol szyję myszy i umieść ją w pozycji leżącej z głową skierowaną w stronę chirurga.Hyper przedłuż głowę myszki za pomocą taśmy. Zdezynfekuj szyję 70% izopropanolem. Za pomocą pęsety i nożyczek wykonaj pięciomilimetrowe nacięcie skóry poniżej linii szczęki.Przeciąć skórę około jednego centymetra w kierunku mostka, aż do osiągnięcia środka mostka. Użyj nożyczek. Ostrożnie rozetnij skórę po prawej stronie szyi.Wykonaj prostokątne nacięcie skóry po prawej stronie, aby odsłonić tkankę miękką szyi. Uważaj, aby nie uszkodzić żyły szyjnej. Użyj nożyczek i pęsety, aby przymocować płaty skóry za pomocą dwóch zacisków.Za pomocą końcówki cienkiej pęsety ostrożnie odsłoń żyłę szyjną preparatem. W razie potrzeby usuń tkankę cienkimi nożyczkami. Unikaj obrażeń gałęzi żył.Umieść i zamknij ligaturę jedwabną nicią w dystalnej części widocznej żyły szyjnej, która jest skierowana w stronę głowy myszy. Przymocuj jedwabną nić taśmą, aby naprężyć ligaturę. Zapewnia to lekkie napięcie żyły szyjnej.Przygotuj ligaturę wokół bliższej części żyły szyjnej. Następnie napełnij cewnik roztworem równoważącym i fuzyjnym. Zamocuj cewnik taśmą tak, aby cewnik wyrównywał żyłę szyjną.Kontroluj pęcherzyki, aby uniknąć zatoru powietrznego. Podnieś żyłę szyjną za pomocą cienkiej pęsety w miejscu wprowadzenia. Ustaw rurkę równolegle do żyły szyjnej i nakłuj żyłę szyjną, kierując się w stronę światła.Włóż na około dwa do czterech milimetrów równolegle do osi żyły szyjnej. Unikaj energicznych ruchów. Zamknij ligaturę, aby zamocować cewnik.Kontroluj szczelność ligatury poprzez dokładne oglądanie przez mikroskop. Umieść wilgotny wacik na miejscu operacji. Umieść mankiet ogonowy na dole ogona myszy, podczas gdy mysz leży w pozycji leżącej grzbietowej.Rozpocznij pomiary i powtórz je dziesięć razy na punkt czasowy. Jeśli pomiary ciśnienia krwi nie wydają się prawidłowe i generowane są fałszywe dane, dostosuj położenie mankietu ogonowego. Przed fazą równowagi zmień rurkę do zbierania moczu i umieść ją na lodzie.Złóż wacik i umieść go wokół małego cewnika naczyniowego, który jest wprowadzany do żyły szyjnej. Umieść zacisk na waciku, aby znieść wsteczny przepływ krwi lub zator powietrzny. Podłączyć igłę 27 G z jednomililitrową strzykawką wypełnioną bolusem FITC do końca cewnika do małego naczynia.Otwórz zacisk i nałóż bolus FITC o pojemności 100 mikrolitrów. Ponownie zamknij zacisk i połącz większy cewnik z mniejszym cewnikiem. Ponownie otwórz zacisk i uruchom pompę strzykawkową o natężeniu przepływu 0,008 mililitra na minutę.Kontynuuj napar przez 60 minut. W tej fazie badane są skuteczne leki na selektywność krębuszkowej trwałej ondulacji. Zmień rurkę moczową z punktu czasowego zero minuty na inną 1,5 mililitra brązowej rurki.Umieść wacik wokół cewnika do małych naczyń i odłącz duży cewnik od cewnika do małych naczyń. Napełnić strzykawkę roztworem fazy doświadczalnej. Umieścić go w pompie strzykawkowej i pozwolić pompie infuzyjnej pracować tak, aby duży cewnik został wypełniony roztworem fazy eksperymentalnej.Ponownie podłącz cewniki, unikając zatoru powietrznego i ponownie otwórz zacisk. Uruchomić pompę strzykawkową przy natężeniu przepływu 0,008 mililitra na minutę. Kontynuuj pracę pompy strzykawkowej przez 60 minut, a następnie zbieraj mocz do rurki moczowej.Umieść rurkę moczu na lodzie. W tym badaniu skan fluorescencyjny rodzimego moczu myszy wykazuje szczyt przy 395 nanometrach. Polisacharoza FITC 70 w stężeniu 40 mikrogramów na mililitr w moczu myszy wykazuje maksimum fluorescencji przy 525 nanometrach.Mocz myszy nie zaburza pomiaru fluorescencji polisacharozy FITC 70. Przy wejściu 525 nanometrów rosnące stężenie polisacharozy FITC 70 wykazuje zwiększoną intensywność fluorescencji. Ta metoda jest również w stanie wykryć różnice w przepuszczalności kłębuszków nerkowych.Białe kolumny reprezentują poziomy polisacharozy FITC 70 przed rozpoczęciem stymulacji angiotensyny II w fazie eksperymentalnej. Po dawkowaniu przez 60 minut przepuszczalność kłębuszków nerkowych wzrosła w porównaniu z grupą kontrolną. angiotensyna II wypłukuje zmniejszoną przepuszczalność kłębuszków nerkowych.Poziom polisacharozy FITC 70 zmniejszył się po dodatkowych 60 minutach stymulacji angiotensyną II lub 60 minutach wymywania angiotensyny II. Zwiększenie przepuszczalności kłębuszków nerkowych spowodowane angiotensyną II może być blokowane przez bloker receptora angiotensyny II. Ciśnienie krwi monitorowane metodą mankietu ogonowego nie wykazało istotnych różnic między grupą kontrolną a grupą leczoną angiotensyną II.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby unikać zatoru powietrznego podczas zmiany roztworów infuzyjnych.

highly-sensitive-measurement-glomerular-permeability-mice-with

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Technika wykorzystująca mikroskopię 2-fotonową intavital o wysokiej rozdzielczości do bezpośredniej wizualizacji i ilościowego określenia filtracji gloemrarnej w kłębuszkach nerkowych na powierzchni. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie charakterystyk przepuszczalności makrocząsteczek zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym.

Kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Pomiar współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) jest złotym standardem oceny funkcji nerek. Tutaj opisujemy metodę wysokoprzepustową, która umożliwia określenie GFR u przytomnych myszy za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia bolusa, oznaczenie izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-inuliny w osoczu i obliczenie GFR za pomocą dwufazowego modelu rozpadu wykładniczego.

Wysokoprzepustowa metoda pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej u świadomych myszy

Określenie współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) jest złotym standardem do oceny ogólnej funkcji nerek. Jednak tradycyjne procedury pomiaru tego parametru są kłopotliwe i wymagają dużej inwestycji czasu. W tym miejscu opisujemy szybszą i minimalnie inwazyjną metodę przezskórnego oznaczania GFR.

Przezskórna ocena czynności nerek u świadomych gryzoni

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Tutaj opisujemy protokół pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) u świadomych, swobodnie poruszających się myszy za pomocą transdermalnego monitora GFR.

Transdermalny pomiar szybkości filtracji kłębuszkowej u myszy

Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem mikroskopii 2-fotonowej u szczurów z Monachium Wistar Fromter z powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi w celu ilościowego określenia wpływu przedłużonej niedrożności moczowodu na dynamikę i funkcję kłębuszków nerkowych.

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

Współczynnik filtracji kłębuszkowej (GFR) jest idealnym markerem do oceny funkcji nerek. Jednak standardowa metoda pomiaru polegająca na wstrzykiwaniu inuliny z seryjną analizą krwi i moczu jest niepraktyczna. W artykule przedstawiono praktyczną metodę transdermalnego pomiaru GFR u prosiąt.

Transdermalny pomiar szybkości filtracji kłębuszkowej u prosiąt wentylowanych mechanicznie

W obecnym badaniu, dekstran znakowany fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) jest podawany myszom przez zgłębnik doustny w celu oceny przepuszczalności jelit zarówno in vivo, jak i w próbkach osocza i kału. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest zaburzona w wielu procesach chorobowych, ten bezpośredni i ilościowy test może być stosowany w różnych obszarach badawczych.

Ocena integralności bariery jelitowej u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny

To badanie przedstawia łatwy w użyciu, kompletny i prosty zestaw metod do oznaczania i analizowania kłębuszków nerkowych z mysich nerek oczyszczonych metodą CUBIC. Dane, takie jak liczba i objętość kłębuszków nerkowych, można łatwo i niezawodnie uzyskać za pomocą dekstranu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-Dextran, mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (LSFM) lub popularnej mikroskopii konfokalnej i oprogramowania, takiego jak Imaris.

Wydajna i szybka metoda etykietowania i analizy kłębuszków mysich

Poznaj metodę pomiaru przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy z użyciem fluorescencyjnego znacznika FITC-polisaroza 70. Technika umożliwia wykrywanie małych, przejściowych zmian w nefrologii.

Bardzo czuły pomiar przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy z izotiocyjanianem fluoresceiny i polisarozą 70

Przeglądaj więcej filmów