Bardzo czuły pomiar przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy z izotiocyjanianem fluoresceiny i polisarozą 70
9 sierpnia 2019
Tutaj prezentujemy protokół do badania przepuszczalności kłębuszków nerkowych u myszy za pomocą bardzo czułego, nieradioaktywnego znacznika. Metoda ta pozwala na powtarzalne analizy moczu przy małych objętościach moczu.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nefrologii dotyczące roli przepuszczalności kłębuszków nerkowych w chorobach nerek. Główną zaletą tej techniki jest to, że niewielkie i przejściowe wzrosty przepuszczalności kłębuszków nerkowych są wykrywane za pomocą znacznika znakowanego ołowiem fluorescencyjnym. Po znieczuleniu umieść cewnik moczowy u samicy myszy.
Ustaw mysz w pozycji leżącej grzbietowej. Zaciśnij dolną część brzucha i znajdź ujście cewki moczowej. Zaopatrzyć się w plastikową część cewnika angiocewnika 22 G i nasmarować go żelem ksylocainowym.
Użyj lewego palca wskazującego, aby ostrożnie napiąć dolną część brzucha i wprowadzić cewnik trzy milimetry do ujścia cewki moczowej, jednocześnie równolegle do dalszej osi cewki moczowej. Obróć górną część angiocewnika o 180 stopni, trzymając końcówkę w ujściu cewki moczowej i utrzymując oś cewki moczowej. Następnie wprowadź cewnik siedem milimetrów głębiej do myszy, tak aby został umieszczony w pęcherzu.
Umieść brązową rurkę o pojemności 1,5 mililitra na górze angiocewnika, aby zebrać mocz. Zastosuj podskórnie jeden mililitr 0,9% chlorku sodu, aby zwiększyć produkcję moczu. Ogol szyję myszy i umieść ją w pozycji leżącej z głową skierowaną w stronę chirurga.
Hyper przedłuż głowę myszki za pomocą taśmy. Zdezynfekuj szyję 70% izopropanolem. Za pomocą pęsety i nożyczek wykonaj pięciomilimetrowe nacięcie skóry poniżej linii szczęki.
Przeciąć skórę około jednego centymetra w kierunku mostka, aż do osiągnięcia środka mostka. Użyj nożyczek. Ostrożnie rozetnij skórę po prawej stronie szyi.
Wykonaj prostokątne nacięcie skóry po prawej stronie, aby odsłonić tkankę miękką szyi. Uważaj, aby nie uszkodzić żyły szyjnej. Użyj nożyczek i pęsety, aby przymocować płaty skóry za pomocą dwóch zacisków.
Za pomocą końcówki cienkiej pęsety ostrożnie odsłoń żyłę szyjną preparatem. W razie potrzeby usuń tkankę cienkimi nożyczkami. Unikaj obrażeń gałęzi żył.
Umieść i zamknij ligaturę jedwabną nicią w dystalnej części widocznej żyły szyjnej, która jest skierowana w stronę głowy myszy. Przymocuj jedwabną nić taśmą, aby naprężyć ligaturę. Zapewnia to lekkie napięcie żyły szyjnej.
Przygotuj ligaturę wokół bliższej części żyły szyjnej. Następnie napełnij cewnik roztworem równoważącym i fuzyjnym. Zamocuj cewnik taśmą tak, aby cewnik wyrównywał żyłę szyjną.
Kontroluj pęcherzyki, aby uniknąć zatoru powietrznego. Podnieś żyłę szyjną za pomocą cienkiej pęsety w miejscu wprowadzenia. Ustaw rurkę równolegle do żyły szyjnej i nakłuj żyłę szyjną, kierując się w stronę światła.
Włóż na około dwa do czterech milimetrów równolegle do osi żyły szyjnej. Unikaj energicznych ruchów. Zamknij ligaturę, aby zamocować cewnik.
Kontroluj szczelność ligatury poprzez dokładne oglądanie przez mikroskop. Umieść wilgotny wacik na miejscu operacji. Umieść mankiet ogonowy na dole ogona myszy, podczas gdy mysz leży w pozycji leżącej grzbietowej.
Rozpocznij pomiary i powtórz je dziesięć razy na punkt czasowy. Jeśli pomiary ciśnienia krwi nie wydają się prawidłowe i generowane są fałszywe dane, dostosuj położenie mankietu ogonowego. Przed fazą równowagi zmień rurkę do zbierania moczu i umieść ją na lodzie.
Złóż wacik i umieść go wokół małego cewnika naczyniowego, który jest wprowadzany do żyły szyjnej. Umieść zacisk na waciku, aby znieść wsteczny przepływ krwi lub zator powietrzny. Podłączyć igłę 27 G z jednomililitrową strzykawką wypełnioną bolusem FITC do końca cewnika do małego naczynia.
Otwórz zacisk i nałóż bolus FITC o pojemności 100 mikrolitrów. Ponownie zamknij zacisk i połącz większy cewnik z mniejszym cewnikiem. Ponownie otwórz zacisk i uruchom pompę strzykawkową o natężeniu przepływu 0,008 mililitra na minutę.
Kontynuuj napar przez 60 minut. W tej fazie badane są skuteczne leki na selektywność krębuszkowej trwałej ondulacji. Zmień rurkę moczową z punktu czasowego zero minuty na inną 1,5 mililitra brązowej rurki.
Umieść wacik wokół cewnika do małych naczyń i odłącz duży cewnik od cewnika do małych naczyń. Napełnić strzykawkę roztworem fazy doświadczalnej. Umieścić go w pompie strzykawkowej i pozwolić pompie infuzyjnej pracować tak, aby duży cewnik został wypełniony roztworem fazy eksperymentalnej.
Ponownie podłącz cewniki, unikając zatoru powietrznego i ponownie otwórz zacisk. Uruchomić pompę strzykawkową przy natężeniu przepływu 0,008 mililitra na minutę. Kontynuuj pracę pompy strzykawkowej przez 60 minut, a następnie zbieraj mocz do rurki moczowej.
Umieść rurkę moczu na lodzie. W tym badaniu skan fluorescencyjny rodzimego moczu myszy wykazuje szczyt przy 395 nanometrach. Polisacharoza FITC 70 w stężeniu 40 mikrogramów na mililitr w moczu myszy wykazuje maksimum fluorescencji przy 525 nanometrach.
Mocz myszy nie zaburza pomiaru fluorescencji polisacharozy FITC 70. Przy wejściu 525 nanometrów rosnące stężenie polisacharozy FITC 70 wykazuje zwiększoną intensywność fluorescencji. Ta metoda jest również w stanie wykryć różnice w przepuszczalności kłębuszków nerkowych.
Białe kolumny reprezentują poziomy polisacharozy FITC 70 przed rozpoczęciem stymulacji angiotensyny II w fazie eksperymentalnej. Po dawkowaniu przez 60 minut przepuszczalność kłębuszków nerkowych wzrosła w porównaniu z grupą kontrolną. angiotensyna II wypłukuje zmniejszoną przepuszczalność kłębuszków nerkowych.
Poziom polisacharozy FITC 70 zmniejszył się po dodatkowych 60 minutach stymulacji angiotensyną II lub 60 minutach wymywania angiotensyny II. Zwiększenie przepuszczalności kłębuszków nerkowych spowodowane angiotensyną II może być blokowane przez bloker receptora angiotensyny II. Ciśnienie krwi monitorowane metodą mankietu ogonowego nie wykazało istotnych różnic między grupą kontrolną a grupą leczoną angiotensyną II.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby unikać zatoru powietrznego podczas zmiany roztworów infuzyjnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół badania przepuszczalności kłębków nerkowych u myszy z wykorzystaniem czułego znacznika nieradiacyjnego. Metoda ta umożliwia wielokrotne analizy moczu przy zastosowaniu minimalnych objętości próbki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nefrologia
- Badania nad chorobami nerek
- Ocena funkcji kłębuszkowej
Wstęp
- Zrozumienie przepuszczalności kłębuszków ma kluczowe znaczenie w chorobach nerek.
- Obecne metody mogą nie wykrywać niewielkich zmian w przepuszczalności.
- Niniejszy protokół ma na celu zwiększenie czułości detekcji.
- Tracery fluorescencyjne stanowią niepromienną alternatywę dla prowadzonych badań.
Cel badania
- Ocena przepuszczalności kłębuszków w modelu mysim.
- Ocena wpływu niewielkich zwiększeń przepuszczalności na funkcję nerek.
- Zapewnienie niezawodnej metody dla badań nefrologicznych.
Zastosowane metody
- Zastosowanie znacznika z fluoresceinyjnym związkiem ołowiu w celu detekcji.
- Podanie znieczulenia myszom.
- Wprowadzenie cewnika do pęcherza moczowego u samic myszy.
- Ułożenie myszy na plecach w celu wykonania procedury.
Główne wyniki
- Można wykryć niewielkie i przejściowe wzrosty przepuszczalności kłębuszków nerkowych.
- Metoda ta pozwala na wielokrotne pomiary przy minimalnej objętości moczu.
- Tracery fluorescencyjne zwiększają czułość analizy.
- Protokół jest prosty i powtarzalny.
Wnioski
- Metoda ta stanowi wartościowe narzędzie w badaniach nefrologicznych.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie funkcji kłębków nerkowych w stanie zdrowia i choroby.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę w celu pogłębienia wiedzy na temat patologii nerek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza metoda umożliwia wykrywanie niewielkich, przejściowych wzrostów przepuszczalności kłębuszków nerkowych przy użyciu nieradiacyjnego znacznika fluorescencyjnego, co pozwala wypełnić istotną lukę w odkrywaniu wczesnych biomarkerów chorób nerek. Dzięki możliwości wielokrotnej analizy moczu przy minimalnej objętości próbki, metoda ta wspiera monitorowanie podłużne w modelach przedklinicznych, zwiększając pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w opracowywaniu leków na schorzenia nerek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie zmian w permselektywności kłębuszkowej w odpowiedzi na modulatory farmakologiczne.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośredni pomiar strumienia znacznika, co zmniejsza zależność od pośrednich punktów końcowych w postaci albuminurii.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez wykrywanie wczesnych zmian przepuszczalności, które mogą przewidywać późniejsze skutki patologiczne.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszego przesiewu związków poprzez ustalenie podstawowych parametrów przepuszczalności.
- Wynik ilościowy: Generuje odczyty oparte na fluorescencji znormalizowane do poziomu kreatyniny, co umożliwia standaryzowane i powtarzalne pomiary w różnych badaniach.
- Skalowalność: Umożliwia częste pobieranie próbek przy niskim zapotrzebowaniu na objętość moczu, co wspiera podłużne projekty analiz.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje ludzką dysfunkcję kłębków nerkowych poprzez rejestrację zmian przepuszczalności wywołanych przez angiotensynę II, znany mediator patofizjologiczny.
- Ciągłość translacyjna: Łączy fazę odkryć z fazą przedkliniczną, zapewniając spójny odczyt przepuszczalności w fazach interwencji i wypłukiwania.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Wpływa na kryteria go/no-go poprzez wykazanie odwracalności zmian przepuszczalności po blokadzie receptorów, co wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrywania leku do badań przedklinicznych, umożliwiając opartą na hipotezach ocenę funkcji kłębuszków przed optymalizacją wiodących związków oraz wspierając decyzje o dalszym rozwoju oparte na danych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie mechanizmów szlaków wpływających na integralność bariery kłębuszkowej, takich jak modulacja RAAS.
- Przesiewanie: Dostarcza systemy gotowe do analizy ze zestandaryzowanymi protokołami postępowania z znacznikami i detekcji fluorescencji.
- Analityka: Zapewnia ilościowe, znormalizowane pomiary intensywności fluorescencji, które pozwalają na porównanie stanów przepuszczalności w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne zmiany przepuszczalności z walidacją przedkliniczną poprzez śledzenie odpowiedzi na angiotensynę II i jej blokadę.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do testowania przepuszczalności, którą można zastosować w wielu modelach chorób nerek i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność w odniesieniu do celu poprzez wykrywanie subtelnych, wczesnych zmian przepuszczalności, które są pomijane przez konwencjonalne biomarkery.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji procedur kaniulacji, infuzji oraz pomiarów fluorescencji.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego wykrycia nieskutecznych związków, co redukuje ryzyko niepowodzenia na późniejszych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację związków modulujących permselektywność kłębkową z jasnością mechanistyczną.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach dostępu naczyniowego oraz cewnikowania pęcherza u myszy.
- Zależność od aparatury w postaci czytnika płytek fluorescencyjnych z możliwością wzbudzenia/emisji przy 490/525 nm do detekcji FITC.
- Konieczność standaryzacji procedur zbierania, obchodzenia się z próbkami moczu oraz normalizacji kreatyniny pomiędzy zespołami.
- Wymaga rozważenia adaptacji protokołów przy zastosowaniu różnych szczepów, płci lub modeli chorobowych.
- Ograniczone koniecznością starannego zapobiegania zatorowości powietrznej podczas wymiany roztworu infuzyjnego, zgodnie z kontrolą procedury.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Preparation Phase Urinary Catheter
1:43
Preparation Phase - Central Venous Catheter
4:16
Blood Pressure Measurement and Equilibration Phase
5:51
Experimental Phase
7:10
Results: Fluorescence Scan, Glomerular Permeability and Blood Pressure
9:00
Conclusion
