Montaż molekularnych wahadłowców zasilanych przez odwracalnie przyłączone kinezyny
26 stycznia 2019
Prezentujemy protokół budowy molekularnych wahadłowców, gdzie przylegające do powierzchni białka motoryczne kinezyny napędzają mikrotubule znakowane barwnikiem. Słabe oddziaływania kinezyn z powierzchnią umożliwiają ich odwracalne przywiązanie do niej. W ten sposób powstaje system w nanoskali, który wykazuje dynamiczny montaż i demontaż swoich elementów przy zachowaniu swojej funkcjonalności.
Protokół ten jest istotny, ponieważ otwiera drzwi do dalszych badań nad projektowaniem nanoskalowych systemów biologicznych, które znajdują się w równowadze dynamicznej. Technika ta wypełnia część luki między strukturami inżynieryjnymi a naturalnymi, ponieważ umożliwia badanie tego, co możemy nazwać samoleczeniem, czyli dynamiczną wymianą składników molekularnych. Najważniejszą radą dotyczącą wypróbowania tej techniki po raz pierwszy jest upewnienie się, że eksperymentator przestrzega wszystkich protokołów bezpieczeństwa.
Najpierw przygotuj roztwory podstawowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Odpipetować 21,8 mikrolitra buforu BRB80 do małej probówki wirówkowej. Dodać 1 mikrolitr roztworu podstawowego chlorku magnezu, 1 mikrolitr roztworu podstawowego GTP i 1,2 mikrolitra roztworu podstawowego DMSO, aby zakończyć przygotowywanie buforu wzrostu mikrotubul.
Aby rozpocząć polimeryzację mikrotubul, dodaj 6,25 mikrolitra buforu wzrostu mikrotubul bezpośrednio do 20 mikrogramów podwielokrotności liofilizowanej tubuliny; Oznaczone jako wzbudzone na 647 nanometrów. Wir z prędkością 40 pocisków na sekundę trwa 5 sek. Schłodzić porcję na lodzie przez 5 minut.
Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Aby rozpocząć stabilizację mikrotubul, dodać 5 mikrolitrów roztworu poddanego na porcję paklitakselu do 490 mikrolitrów buforu BRB80. Wiruj roztwór z prędkością 30 RPS przez 10 sekund.
Po upływie 45 minut inkubacji mikrotubul dodaj 5 mikrolitrów tego roztworu do mieszaniny BRB80 i paklitakselu, aby uzyskać roztwór MT100. Najpierw dodaj 9,0 mikrolitrów roztworu kazeiny do 291 mikrolitrów buforu BRB80. Odpipetować 83 mikrolitry roztworu kazeiny BRB80 do nowej 6-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.
Dodaj 1 mikrolitr D-glukozy, oksydazy glukozowej, katalazy, DTT, fosforanu kreatyny i fosfokinazy. Następnie dodaj 1 mikrolitr podstawowego roztworu ATP do roztworu ruchliwości. Trzepocznij lub zwiruj podwielokrotność, aby równomiernie rozprowadzić chemikalia.
Następnie dodaj 1 mikrolitr przygotowanego roztworu kinezyny do roztworu ruchliwości, tak aby końcowe stężenie wynosiło 20 nanomolowców. Dodaj 10 mikrolitrów roztworu MT100 do roztworu ruchliwości. W przypadku komórek przepływowych należy użyć zarówno dużego szkiełka nakrywkowego, jak i małego szkiełka nakrywkowego.
Opłucz wszystkie szkiełka nakrywkowe dwukrotnie etanolem i dwukrotnie ultraczystą wodą. Umyte szkiełka nakrywkowe należy sonikować w ultraczystej wodzie przez 5 minut. Następnie wysusz szkiełka nakrywkowe w piekarniku w temperaturze od 50 do 75 stopni Celsjusza.
Użyj środka czyszczącego UV-ozone, aby leczyć jedną stronę każdego szkiełka nakrywkowego przez 15 minut w temperaturze pokojowej i w normalnych warunkach atmosferycznych. Za pomocą pęsety odwróć każde szkiełko nakrywkowe i użyj ozonu UV, aby potraktować również nieleczoną stronę. Sonikować poddane działaniu szkiełek nakrywkowych w ultraczystej wodzie przez 5 minut.
Następnie wysusz je w piekarniku w temperaturze od 50 do 75 stopni Celsjusza. Następnie załóż odzież ochronną zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zanurz każde szkiełko nakrywkowe w roztworze soli fizjologicznej na 15 sekund.
Szkiełka nakrywkowe umyć dwa razy w toluenie i trzy razy w metanolu. Do wysuszenia szkiełek nakrywkowych należy użyć azotu pod ciśnieniem. Po wyschnięciu szkiełek nakrywkowych wytnij kawałek taśmy dwustronnej o wymiarach 2 centymetry na 2,5 centymetra.
Przetnij ten kawałek na pół pionowo na dwa paski o wymiarach 1 centymetr na 2,5 centymetra. Połóż duże szkiełko nakrywkowe na delikatnej wycieraczce roboczej i przyklej do niej paski taśmy wzdłuż krawędzi, aby utworzyć obszar o wymiarach 1 centymetr na 2,5 centymetra między kawałkami taśmy. Przyklej małe szkiełko nakrywkowe na paskach taśmy, aby zakończyć montaż komory przepływowej.
Najpierw przelej około 20 mikrolitrów roztworu PEG-PPG-PEG do zmontowanej komory przepływowej. Pozwól roztworowi wchłonąć się na powierzchni przez 5 minut, a następnie wymień ten roztwór na 20 mikrolitrów buforu BRB80 trzykrotnie, wlewając bufor. Wlać 20 mikrolitrów roztworu ruchliwości do komory przepływowej.
Następnie uszczelnij krawędzie komory przepływowej smarem, aby zapobiec parowaniu, jeśli planowany eksperyment jest dłuższy niż godzina. Wykonaj obrazowanie za pomocą obiektywnej mikroskopii całkowitego wewnętrznego kwiatostanu. Umieść kroplę olejku immersyjnego na obiektywie.
Następnie umieść komórkę przepływową na platformie mikroskopu. I podnieś obiektyw do góry, aż dojdzie do kontaktu między olejem na obiektywie a komorą przepływową. Użyj systemu osłon blokujących mikroskopu, aby zablokować ucieczkę całego światła laserowego.
Następnie włącz laser i skup się na dolnej powierzchni komórki przepływowej za pomocą lasera o długości 642 nanometrów do obrazowania mikrotubul i lasera o długości 488 nanometrów do obrazowania silników kinezynowych GFP. Nagraj interesujące obrazy lub filmy. Obrazy mogą być rejestrowane tak długo, jak długo istnieje ruchliwość w komórce przepływowej.
W niniejszej pracy przedstawiono aktywny system w nanoskali, który samoorganizuje słabo wiążące bloki budulcowe w celu skonstruowania własnego toru. Za pomocą mikroskopii tirf ślizgające się mikrotubule są obrazowane oddzielnie od silników kinezynowych. Mikrotubule są widoczne po wzbudzeniu laserem o długości 647 nanometrów.
A kinezyny GFP są widoczne po wzbudzeniu laserem o długości 488 nanometrów. Czas między wzbudzeniem a światłem czerwonym i zielonym wynosił mniej niż jedną sekundę. Jak widać, ślizgające się mikrotubule gromadzą silniki kinezynowe z roztworu i osadzają je na powierzchni.
Silniki kinezynowe pozostają w śladzie za mikrotubulami przez krótki okres czasu, zanim powrócą do roztworu. Bardzo ważne jest, aby mieć odpowiednie stężenie odczynników w roztworze zapobiegającym blaknięciu ruchliwości, w przeciwnym razie wybielanie fotograficzne spowodowałoby niepowodzenie eksperymentu. Technika ta toruje drogę do bardziej efektywnego wykorzystania silników białkowych w nanoskalowych systemach inżynieryjnych.
Umożliwiając w ten sposób projektowanie i badanie bardziej złożonych nanostruktur.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół konstrukcji cząsteczkowych promów z wykorzystaniem białek motorowych kinezyn do przesuwania znakowanych barwnikiem mikrotubul. System ten umożliwia dynamiczną montaż i demontaż przy zachowaniu pełnej funkcjonalności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biofizyka
- Nanotechnologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Wahadła molekularne są niezbędne do zrozumienia biologicznych systemów w nanoskali.
- Motory kinezynowe ułatwiają ruch mikrotubul w procesach komórkowych.
- Równowaga dynamiczna w systemach w nanoskali może prowadzić do właściwości samonaprawczych.
- Protokoły bezpieczeństwa są kluczowe podczas przeprowadzania eksperymentów z wykorzystaniem tych komponentów.
Cel badania
- Opracowanie metody badania systemów w nanoskali w dynamicznej równowadze.
- Zniwelowanie różnic między strukturami biologicznymi zaprojektowanymi a naturalnymi.
- Zbadanie samoorganizacji i ruchliwości mikrotubul napędzanych przez motory kinezynowe.
Zastosowane metody
- Przygotowanie buforu do wzrostu mikrotubul oraz roztworów stabilizujących.
- Montaż komór przepływowych z użyciem podkładków szkiełek przedmiotowych po obróbce.
- Obrazowanie z wykorzystaniem mikroskopii TIRF (całkownego wewnętrznego odbicia fluorescencyjnego).
- Rejestracja ruchliwości mikrotubul i białek motorycznych kinezyn.
Główne wyniki
- Mikrotubule zostały pomyślnie zobrazowane i wykazano, że gromadzą one motory kinesynowe.
- System wykazał dynamiczny montaż i demontaż komponentów.
- Właściwe stężenia odczynników były kluczowe dla zapobiegania fotowyblakaniu.
- Technika ta umożliwia projektowanie bardziej złożonych nanostruktur.
Wnioski
- Niniejszy protokół ułatwia badanie systemów nanoskalowych o właściwościach dynamicznych.
- Usprawnia on zrozumienie oddziaływań molekularnych w systemach projektowanych.
- Wyniki te torują drogę do dalszych badań w dziedzinie nanotechnologii i biofizyki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia badanie dynamicznych układów w skali nanometrów, w których komponenty molekularne ulegają samoorganizacji i dysocjacji w stanie równowagi, stanowiąc model do mechanistycznego ograniczania ryzyka we wczesnej fazie walidacji celu. Poprzez naśladowanie transportu biologicznego za pomocą odwracalnie przyłączonych białek motorowych, system ten zwiększa wiarygodność predykcyjną testów przesiewowych wymagających trwałej i powtarzalnej ruchliwości. Układ ten zapewnia platformę istotną w kontekście chorobowym do oceny wpływu związków na dynamikę cytoszkieletu bez konieczności trwałej immobilizacji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji białek motorycznych oraz dynamiki oddziaływań z mikrotubulami w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera odwracalny, odnawialny montaż aktywnych kompleksów do wielokrotnych cykli testowych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia ilościowe odczytywanie poślizgu mikrotubul oraz rekrutacji białek motorowych za pomocą mikroskopii TIRF.
- Wartość operacyjna: Pozwala na detekcję w czasie rzeczywistym, opartą na znakowaniu, zarówno ładunku, jak i białek motorowych w jednym te samej analizie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje mechanizmy transportu cytoszkieletowego istotne dla szlaków chorób neurodegeneracyjnych i proliferacyjnych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ocenę zmian w ruchliwości i kinetyce odłączania motorów indukowanych przez związki chemiczne.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów badawczych, w których priorytetem przed optymalizacją związku wiodącego jest ocena interakcji z celem oraz odczyty funkcjonalne.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących oddziaływań między motorem a ładunkiem oraz modulacji szlaków.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe pomiary motywności niezbędne do walidacji trafień.
- Analityka: Umożliwia korelację czasu przebywania motoru na powierzchni z prędkością ruchu po mikrotubulach i długością przebiegu.
- Badania translacyjne: Łączy funkcjonalne odczyty z modelami przedklinicznymi defektów transportu aksonalnego.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Tworzy modularną platformę do testowania różnorodnych białek motorowych lub związków związanych z mikrotubulami.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez rozdzielenie wiązania motorów od trwałego przytwierdzenia do powierzchni.
- Wartość operacyjna: Zapewnia stabilność testu dzięki ciągłemu uzupełnianiu aktywnych motorów z roztworu.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie dynamicznych danych funkcjonalnych opartych na równowadze.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów zaangażowanych w szlaki transportu wewnątrzkomórkowego z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w oczyszczaniu białek, pracy z mikrotubulami oraz w mikroskopii TIRF.
- Zależne od dostępu do mikroskopów fluorescencyjnych z dwulaserowym wzbudzeniem i kontrolą parametrów środowiskowych.
- Wymaga standaryzacji pasywacji powierzchni oraz montażu komory przepływowej w celu zminimalizowania niespecyficznego wiązania.
- Wiąże się z optymalizacją stężeń motorów i mikrotubul w celu utrzymania równowagi dynamicznej.
- Ograniczone przez ryzyko fotowybielania w przypadku nieprecyzyjnego przygotowania odczynników anty-fade.
