Drożdże jako podwozie do opracowywania testów funkcjonalnych do badania ludzkiego p53

Cześć, nazywam się Bartolomeo Bosco i jestem doktorantem w Laboratorium Sieci Transkrypcyjnej w Centrum Biologii Integracyjnej Uniwersytetu w Trydencie we Włoszech. Jak wiadomo, transkrypcja jest niezwykle złożonym procesem obejmującym przestrzenną i czasową organizację czynnika transkrypcyjnego i kofaktora. Większość z nich, w tym ludzki P53, rozpoznaje specyficzne elementy cis-działające, zwane elementami odpowiedzi, a wiązanie się z tym sekwencjonowaniem DNA jest wymagane do modulacji transkrypcji docelowych genów.

W tej pracy chcielibyśmy pokazać Państwu protokół badania sekwencji P53 specyficznej dla funkcji transaktywacji przy użyciu drożdży jako systemu modelowego jako białka w genie reporterowym koloru lub lucyferazy lub na podstawie kwantyfikacji wzrostu komórek, aby podkreślić główne etapy eksperymentalne i wszechstronność tych podejść. Protokół pierwszy, budowa szczepów drożdży reporterowych, które zawierają specyficzny element odpowiedzi P53 przed genem adeniny-2 lub lucyferazy świetlika. Aby skonstruować szczep reporterowy, najpierw wykonaj kroki od 1.1 do 1.15, aby przekształcić komórki drożdży z oligonukleotydami ukierunkowanymi na pożądany region promotora.

Transformacja opiera się na standardowym protokole opartym na octanie litu. Gdy transformanty pojawią się na płytkach 5-FOA, zwykle po trzech dniach inkubacji w temperaturze 30 stopni, należy je replikować na nieselektywnych płytkach YPDA, a także na płytkach YPDA zawierających G418, oznaczając każdą płytkę, aby ułatwić ich późniejsze porównanie. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 30 stopni.

Następnego dnia zidentyfikuj kandydujące szczepy reporterowe z kolonii, które są wrażliwe na G418, ale rosły na płytkach YPDA. Umieść zidentyfikowane kolonie na nowej płytce YPDA, aby uzyskać pojedyncze izolaty kolonii i pozwól im rosnąć przez dwa dni w temperaturze 30 stopni. Sprawdź poprawność integracji żądanego elementu odpowiedzi P53, wykonując reakcję PCR z warunkami wymienionymi w kroku 1.20.

Załaduj porcję produktu PCR na żel agarozowy, aby sprawdzić prawidłową długość amplikonu przed sekwencjonowaniem Sangera. W protokole drugim przedstawiamy przykład, jak ocenić zdolność transaktywacji białka P53 za pomocą jakościowego testu drożdżowego adeniny-2 na bazie barwnika. Przekształć komórki drożdży z wektorami ekspresyjnymi P53 zgodnie z tym samym protokołem opartym na octanie litu, który opisano w sekcji pierwszej.

Umieść pojedyncze kolonie transformujące drożdże, do sześciu na płytkę, na nowej selektywnej płytce i pozwól im rosnąć przez noc w temperaturze 30 stopni. Następnego dnia, przy użyciu sterylnych aksamitów, replikuj smugi na nowych selektywnych płytkach, które pozwalają na ocenę fenotypu barwnego, tj. selektywnych płytkach zawierających ograniczoną ilość adeniny.

Inkubować w 30 stopniach przez trzy dni. Te same smugi mogą być replikowane wielokrotnie. Protokół trzeci, przedstawiamy teraz przykład oceny zdolności transaktywacji białka P53 przy użyciu ilościowego testu drożdży LUC1 opartego na luminescencji.

Najpierw przekształć komórki drożdży z wektorami ekspresyjnymi P53 zgodnie z protokołem opartym na octanie litu opisanym w sekcji drugiej. Umieść pojedyncze transformanty na nowych selektywnych płytkach zawierających glukozę jako źródło węgla i pozwól im rosnąć w temperaturze 30 stopni przez noc. Dla każdego typu transformacji utwórz od pięciu do siedmiu różnych łatek.

Po nocnym wzroście ponownie zawieś niewielką ilość komórek za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety w syntetycznym selektywnym podłożu zawierającym rafinozę jako źródło węgla. Te zawiesiny komórek powinny mieć gęstość optyczną na poziomie 600 nanometrów około 0,4, a następnie można je podzielić na wiele 96-dołkowych płytek w celu inkubacji w różnych temperaturach, zabiegów lub wystawienia komórek na różną ilość galaktozy w celu aktywacji ekspresji P53. Aby zmierzyć aktywność reporterową świetlika, przenieś od 10 do 20 mikrolitrów zawiesiny komórek z przezroczystej płytki 96-dołkowej na białą płytkę 384-dołkową i wymieszaj komórki z równą objętością buforu do lizy, inkubując przez 10, 15 minut w temperaturze pokojowej na shakerze.

Dodaj 10, 20 mikrolitrów substratu lucyferazy świetlika. Mierz jednostki świetlne za pomocą czytnika płytek z wieloma etykietami. Zmierz również gęstość optyczną kultur na płytce 96-dołkowej.

W protokole czwartym, przedstawiamy teraz przykład, jak wykorzystać hamowanie wzrostu drożdży indukowanego przez P53. Przekształć komórki drożdży z wektorami ekspresyjnymi P53 lub przekształć je za pomocą wektorów ekspresyjnych w celu koekspresji P53 i jednego z jego kofaktorów, takich jak MDM2, zgodnie z protokołem opartym na octanie litu opisanym w sekcji pierwszej. Hoduj komórki transformacyjne w selektywnym podłożu do około jednej gęstości optycznej.

I rozcieńczyć je do 0,05, a następnie dodać wybraną cząsteczkę do odpowiedniego stężenia. Inkubować komórki w temperaturze 30 stopni na wytrząsarce przez 42 godziny. Następnie wysiewaj 100 mikrolitrów hodowli komórek drożdży na minimalnie selektywnych płytkach pożywki.

Inkubować przez dwa dni w temperaturze 30 stopni. Prawidłową integrację RE w miejscu kasety ICORE można sprawdzić za pomocą PCR kolonii, zaczynając od niewielkiej liczby komórek z potencjalnych klonów drożdży i używając starterów opisanych w tabeli trzeciej w celu amplifikacji docelowego locus. Produkty PCR, pasmo około 500 nukleotydów, można następnie sprawdzić za pomocą sekwencjonowania Sangera w celu potwierdzenia sekwencji edytowanej lokalizacji genomu pod kątem obecności prawidłowej sekwencji elementu odpowiedzi P53.

Szczep reporterowy jest gotowy do użycia w testach funkcjonalnych. Aby ocenić zdolność transaktywacji białka P53, sprawdź kolor kolonii drożdży. Na przykład przedstawiamy porównanie P53 typu dzikiego z mutantami R175H i R282W przy użyciu dwóch różnych reporterów, P21-5-prime i PUMA, oraz dwóch różnych temperatur, 30 stopni i 37 stopni.

Co ciekawe, podczas gdy R175H jest allelem P53 powodującym utratę funkcji, czerwone kolonie w każdych warunkach, R282W wykazuje wrażliwość na temperaturę z resztkową aktywnością transaktywacyjną przy 30 stopniach, co skutkuje białymi koloniami, ale utratą aktywności przy 37 stopniach, co skutkuje czerwonymi lub różowymi koloniami. Rozszerzony zestaw danych przedstawiono na rysunku drugim: P53 typu dzikiego w czterech zmutowanych allelach przetestowano pod kątem transaktywacji przy użyciu 10 różnych szczepów reporterowych elementu odpowiedzi P53, trzech temperatur i konstytutywnych poziomów ekspresji. Wyniki są podsumowane kodem kolorystycznym, który przypomina fenotyp koloru kolonii drożdży.

Zmutowany allel P53 K139E zachowuje częściową aktywność i jest wrażliwy na zimno. Na przykład kolonie są czerwone w szczepie reporterowym GADD45 pod kątem 24 i 30 stopni, ale są białe pod kątem 37 stopni. W niniejszej pracy przedstawiono przykładowe wyniki uzyskane tą metodą, porównujące swoistość transaktywacji drożdży ludzkich i drożdży C.elegans P53.

Wyniki na wykresie słupkowym są wyrażone jako średnie względne jednostki światła z błędem standardowym wynoszącym cztery powtórzenia. Porównano pięć różnych elementów odpowiedzi P53. Przetestowano trzy różne poziomy ekspresji białka P53 poprzez różnicowanie stężenia galaktozy w pożywce.

Dwa ortologi P53 wykazują wyraźnie różną specyficzność transaktywacji. Ilustrują to wyniki z elementami odpowiedzi ced13 i V1, które mają tę samą sekwencję, z wyjątkiem obecności lub braku dystansu 28-nukleotydowego. Ludzki P53 wykazuje znacznie wyższą transaktywację z miejscem wiązania V1, podczas gdy C.elegans P53 wykazuje odwrotną tendencję.

Wyniki są niezależne od poziomu ekspresji P53 pod promotorem indukowanym galaktozą. Zmierz wzrost drożdży, licząc liczbę kolonii uzyskanych w kroplach kultury o pojemności 100 mikrolitrów. Oblicz efekt reaktywacji zmutowanych związków, biorąc pod uwagę wzrost drożdży eksprymujących P53 typu dzikiego jako maksymalny możliwy efekt, ustawiony na 100%, podczas gdy wzrost komórek wykazujących ekspresję zmutowanego P53 reprezentuje zerowy poziom reaktywacji.

W tym przykładzie Nutlin-3a łagodzi hamowanie P53 typu dzikiego spowodowane koekspresją MDM2, podczas gdy PhiKan083 częściowo reaktywuje mutanta Y220C P53. W obu przypadkach powoduje to zależne od P53 zmniejszenie wzrostu drożdży. Komórki podstawne drożdży okazały się przydatne do badania wartości i aspektów funkcji białka P53.

Protokół opisany w tej pracy jest szczególnie czuły w ocenie potencjału transaktywacji mutanta P53 typu dzikiego lub związanego z rakiem do wariantów miejsc docelowych. Co więcej, podejście to może być wykorzystane do identyfikacji małych cząsteczek wpływających na funkcje P53 oraz do badania interakcji P53 z kofaktorem. Zastosowanie kolorowych reporterów, miniaturyzacja lucyferazy, a także test zahamowania wzrostu skutkują opłacalnymi i skalowalnymi testami, które potencjalnie można poddać badaniom przesiewowym w bibliotece chemicznej.

Wreszcie, system opisany w tej pracy może być łatwo zaadaptowany do badania innych czynników transkrypcyjnych specyficznych dla sekwencji.