Name: Drożdże jako podwozie do opracowywania testów funkcjonalnych do badania ludzkiego p53 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: Poznaj protokoły badania transaktywacji ludzkiego białka p53 w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Metoda umożliwia ocenę mutacji związanych z rakiem i interakcji z kofaktorami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Unii Europejskiej (fundusze FEDER POCI/01/0145/FEDER/007728 poprzez Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) oraz Funduszom Narodowym (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia i Ministério da Educação e Ciência) na mocy Umowy Partnerstwa PT2020 UID/QUI/50006/2019 oraz projektom (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. Stypendia FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Prace te były wspierane przez Compagnia S. Paolo z Turynu we Włoszech (projekt 2017.0526) oraz Ministerstwo Zdrowia (projekt 5x1000, 2015 i 2016; bieżące badania z 2016 r.). Serdecznie dziękujemy dr Teresie López-Arias Montenegro (Uniwersytet w Trydencie, laboratoria dydaktyczne nauk eksperymentalnych) za pomoc w nagrywaniu filmów.

1. Budowa szczepów drożdży reporterowych ADE2 lub LUC1 zawierających specyficzny RE (yAFM-RE lub yLFM-RE)
<ol>
	<li>Smuga szczepu yAFM-ICORE lub yLFM-ICORE <klasa sup="xref">12,14 (ICORE = I, endonukleaza ISce-I pod promotorem GAL1; CO = licznik wybierany URA3; RE = reporter KanMX4 nadający oporność na kanamycynę; Tabela 1) z 15% glicerolu przechowywanego w temperaturze -80 °C na płytce z agarem YPDA (Tabela 2). Pozwól mu rosnąć przez 2-3 dni w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Wziąć jedną kolonię drożdży ze świeżej płytki (nie starszej niż 3 tygodnie) i umieścić ją w małej kolbie zawierającej 5 ml YPDA (Tabela 2). Inkubować w temperaturze 30 °C przez noc, wstrząsając z prędkością 150-200 obr./min.</li>
	<li>Następnego dnia, aby usunąć wszelkie ślady dekstrozy, należy granulować komórki przez 2 minuty w temperaturze 3000 x g i wyrzucić supernatant przez odwrócenie probówki. 
	UWAGA: Wszystkie wirowania zgodnie z tym protokołem należy wykonywać w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 30-50 ml wstępnie podgrzanego CM (kompletnego podłoża) zawierającego galaktozę (Tabela 2) i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 150-200 obr./min (niezbędne do indukcji I-SceI).</li>
	<li>Odwirować komórki przez 2 minuty przy 3 000 x g i odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 30-50 ml sterylnej wody. Powtórz krok 1.5.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 10 ml sterylnej wody. Powtórz krok 1.5.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 5 ml sterylnego LiAcTE (Tabela 3), roztworu jonowego, który sprzyja wychwytowi DNA. Powtórz krok 1.5.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 250 μl sterylnego LiAcTE i przenieść komórki do probówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz krok 1,5 i ponownie zawieś osad komórek w 300-500 μl sterylnego LiAcTE.</li>
	<li>Podczas płukania denaturować roztwór 10 mg/ml nośnika DNA plemników łososia przez 10 minut w temperaturze 100 °C i natychmiast schłodzić na lodzie, aby utrzymać go jako jednoniciowy DNA.</li>
	<li>W osobnej probówce o pojemności 1,5 ml dodaj 500 pikomoli pożądanego oligonukleotydu (Tabela 3), 5 μl DNA nośnika nasienia łososia gotowanego, 300 μl sterylnego LiAcTE PEG (Tabela 3) i 50 μl zawiesiny komórek drożdży (z kroku 1.9).</li>
	<li>Wirować probówki przez 10 sekund, aby wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 150-200 obr./min. Umieść probówki o pojemności 1,5 ml z boku, aby ułatwić potrząsanie.</li>
	<li>Szok termiczny komórek drożdży przez 15 minut w temperaturze 42 °C w bloku grzewczym, a następnie odwirowywanie komórek przez 20 s przy 10 000 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml sterylnej wody.</li>
	<li>Rozprowadzić 100 μl zawiesiny komórkowej na płytce agarowej YPDA i inkubować (do góry nogami) przez 1 dzień w temperaturze 30 °C. Aby zapewnić uzyskanie dobrze oddzielonych kolonii, należy również rozprowadzić 100 μl rozcieńczenia 1:10.</li>
	<li>Następnego dnia replikować płytkę przy użyciu sterylnych aksamitów na płytce agarowej CM zawierającej dekstrozę i 5-FOA (Tabela 2). Rozważ drugą replikę płytki na nowej płytce, jeśli przeniesiono wiele komórek (tj. pewien wzrost komórek URA3).</li>
	<li>Trzy dni później replika płytki na nieselektywnych płytkach agarowych YPDA i YPDA zawierających G418 (antybiotyk aminoglikozydowy podobny do kanamycyny) (Tabela 2), oznaczając każdą płytkę w celu ułatwienia ich późniejszego porównania. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Następnego dnia zidentyfikuj kandydujące szczepy reporterowe z kolonii, które są wrażliwe na G418, ale rosną na płytkach YPDA (np. kolonie yLFM- lub yAFM-RE). Umieść zidentyfikowane kolonie (3-6 kolonii) na nowej płytce YPDA, aby uzyskać pojedyncze izolaty kolonii i pozwól im rosnąć przez 2 dni w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Umieść pojedyncze kolonie drożdży na płytce YPDA, aby wyizolować kolonie do dalszych analiz. Po 24 godzinach w temperaturze 30 °C należy je przetestować, replikując posiew na płytce agarowej YPGA (tabela 2), która zapobiega rozwojowi drobnych mutantów (tj. mutantów z niedoborem układu oddechowego). W tym samym czasie replika płytki na nowej płytce agarowej YPDA.</li>
	<li>Przetestuj odpowiednie plastry (tj. wzrost na płytkach agarowych YPDA i YPGA; 1-3 kolonie) z kroku 1.18 pod kątem obecności prawidłowej integracji oligonukleotydów metodą PCR kolonii. Zebrać mieszaninę reakcyjną, dodając 5 μl 10x buforu PCR (1,5 mM MgCl2), 2 μl 10 pikoboli/μl starterów (Tabela 3), 4 μl 2,5 mM dNTP, 0,25 μL 5 U/μL polimerazy Taq i wodę do końcowej objętości 50 μL. Pomnóż mieszaninę reakcyjną przez liczbę kolonii drożdży, które należy przesiać, i podwielokrotność 50 μL do każdej probówki PCR. Za pomocą pipety dodaj bardzo małą ilość komórek drożdży z płytki agarowej YPDA do pojedynczej mieszaniny reakcyjnej PCR.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję PCR w następującym programie: 94 °C przez 8 minut, następnie 35 cykli denaturacji przez 1 minutę w temperaturze 94 °C, wyżarzanie starterów przez 1 minutę w temperaturze 55 °C i przedłużenie przez 2 minuty w temperaturze 72 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu reakcji załaduj porcję reakcji PCR (około jednej dziesiątej objętości) na żel agarozowy, aby sprawdzić prawidłowy rozmiar (~500 pz) .</li>
	<li>Sekwencjonować produkt PCR po oczyszczeniu za pomocą zestawu komercyjnego, aby potwierdzić integrację pożądanej sekwencji RE przy użyciu tych samych starterów co w kroku 1.19.</li>
	<li>Po walidacji prawidłowej sekwencji należy przygotować 15% zapas glicerolu z kultury szczepu yAFM-RE lub yLFM-RE (w YPDA) i przechowywać go w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Ocena zdolności transaktywacji białka P53 przy użyciu jakościowego testu drożdży ADE2 opartego na kolorze
<ol>
	<li>Powtórz kroki 1.1 i 1.2 przy użyciu szczepu yAFM-RE (Tabela 1).</li>
	<li>Następnego dnia rozcieńczyć kulturę komórkową (1:10) w 30-50 ml wstępnie podgrzanego YPDA i kontynuować inkubację w temperaturze 30 °C przez wstrząsanie, aż OD600 nm osiągnie 0,8-1,0 (~ 2 h).</li>
	<li>Powtórz kroki 1.5-1.10.</li>
	<li>W oddzielnej probówce o pojemności 1,5 ml dodaj 300-500 ng wektora ekspresyjnego drożdży P53 (lub kontrolnego) (Tabela 4), 5 μl nośnika DNA ugotowanego nasienia łososia, 300 μl sterylnego LiAcTE PEG i 50 μl zawiesiny komórek drożdży.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.12 i 1.13, ale ponownie zawieś osad komórek w 300 μl sterylnej wody.</li>
	<li>Rozprowadzić 100 μl zawiesiny komórkowej na syntetycznych selektywnych (dla ekspresji P53 lub wektora kontrolnego) płytkach zawierających dekstrozę jako źródło węgla i dużą ilość adeniny (Tabela 2), a następnie inkubować (do góry nogami) w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni.</li>
	<li>Umieść pojedyncze kolonie transformantów drożdży (2-6 smug na płytkę) na nowej selektywnej płytce i pozwól im rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Dzień później, przy użyciu sterylnych aksamitnych replik płytki na nowych selektywnych płytkach, które pozwalają na ocenę fenotypu barwy (tj. Płytki zawierające dekstrozę jako źródło węgla, ale ograniczające ilość adeniny; Tabela 2). Inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 3 dni. Opcjonalnie, aby ocenić wrażliwość termiczną białka P53, inkubować w trzech różnych temperaturach przez 3 dni: 24 °C, 30 °C i 37 °C. 
	UWAGA: Ta sama seria może być wielokrotnie platerowana powłoką.</li>
	<li>Aby ocenić zdolność transaktywacji białka P53, sprawdź fenotyp oparty na kolorze kolonii drożdży i porównaj fenotyp białka P53 w odniesieniu do fenotypów P53 typu dzikiego i pustych wektorów.</li>
</ol>
3. Ocena zdolności transaktywacji białka P53 przy użyciu ilościowego testu drożdży LUC1 opartego na luminescencji
<ol>
	<li>Przekształć komórki drożdży za pomocą wektorów ekspresyjnych P53 (lub kontrolnych) (Tabela 4) przy użyciu metody opartej na LiAc opisanej w protokole 2. Użyj szczepu yLFM-RE (Tabela 1).</li>
	<li>Na nową, selektywną płytkę należy umieścić pojedyncze transformanty z dużą ilością adeniny zawierającej glukozę jako źródłem węgla i pozostawić je do wzrostu w temperaturze 30 °C przez noc. Dla każdego typu transformacji wykonaj 5-7 różnych łatek.</li>
	<li>Po nocnym wzroście ponownie zawiesić niewielką ilość komórek drożdży za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety z płytki w syntetycznym selektywnym podłożu zawierającym dekstrozę lub rafinozę jako źródło węgla (200 μl końcowej objętości na przezroczystej 96-dołkowej płytce, z okrągłym lub płaskim dnem). Jeśli eksperyment wymaga indukowalnej ekspresji P53, dodaj galaktozę do pożywki rafinozowej, aby modulować poziom indukcji (Tabela 2). 
	UWAGA: Te zawiesiny komórek powinny mieć OD600 nm około 0,4 i nie więcej niż 1.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy średnicy zewnętrznej600 nm po indukowanym ekspresji P53 (4-8 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem 150-200 obr./min) za pomocą czytnika płytek z wieloma etykietami. Upewnij się, że zawiesiny komórek są jednorodne, mieszając każdą studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Przenieść 10-20 μl zawiesiny komórek z przezroczystej płytki 96-dołkowej do białej płytki 384 (lub 96) dołkowej i wymieszać z równą objętością (10-20 μl) buforu do lizy. Inkubować przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce (150-200 obr./min), aby uzyskać przepuszczalność komórki do substratu lucyferazy.</li>
	<li>Dodać 10-20 μl substratu lucyferazy świetlika i zmierzyć jednostki świetlne (LU) za pomocą czytnika płytek z wieloma etykietami.</li>
	<li>Aby określić zdolność transaktywacji białka P53, znormalizuj jednostki LU każdej studzienki do odpowiadającego im OD600 nm (względna jednostka światła, RLU). Oblicz średnią RLU i odchylenie standardowe z 3-4 płatów kolonii transformatorów drożdży.</li>
	<li>Porównaj dane dotyczące transaktywacji białka P53 w odniesieniu do wektora dzikiego i pustego typu P53, odejmując wartości uzyskane za pomocą pustego wektora lub dzieląc przez wartości uzyskane za pomocą pustego wektora (tj. obliczeniowego zagięcia indukcji). 
	UWAGA: Aktywność transaktywacji P53 można również ocenić przy użyciu tego samego zestawu eksperymentalnego w obecności białek oddziałujących z P53 (tj. MDM2 i MDMX) i/lub z uwzględnieniem leczenia farmakologicznego.</li>
</ol>
4. Ocena zahamowania wzrostu białka P53 za pomocą testu fenotypowego drożdży
<ol>
	<li>Przekształć komórki drożdży za pomocą wektorów ekspresyjnych P53 / MDM2 / MDMX (lub kontrolnych) (Tabela 4) przy użyciu metody opartej na LiAc opisanej w sekcji 2. Użyj szczepu CG379 (Tabela 1) i rozprowadź transformanty drożdżowe na minimalnie selektywnych płytkach (Tabela 2).</li>
	<li>Hoduj przekształcone komórki w minimalnym selektywnym pożywce (Tabela 2) do około 1 OD600 nm.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki drożdży do 0,05 OD600 nm w selektywnej pożywce indukcyjnej (Tabela 2) i opcjonalnie dodać wybraną małą cząsteczkę do odpowiedniego stężenia (lub tylko rozpuszczalnika), aby przetestować jej skuteczność w reaktywacji zmutowanego P53 lub w hamowaniu interakcji MDM2-/MDMX-P53.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 30 °C pod ciągłym wytrząsaniem orbitalnym (200 obr./min) przez około 42 godziny (czas wymagany przez drożdże kontroli ujemnej, aby osiągnąć fazę mid-log, około 0,45 OD600 nm).</li>
	<li>Umieścić 100 μl podwielokrotności kultur komórkowych drożdży na minimalnie selektywnych płytkach (Tabela 2).</li>
	<li>Inkubować przez 2 dni w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Zmierz wzrost drożdży, licząc liczbę kolonii uzyskanych w 100 μl kropli kulturowych (jednostka tworząca kolonię, liczba CFU). Na przykład oblicz efekt reaktywacji zmutowanych związków, biorąc pod uwagę wzrost drożdży wykazujących ekspresję P53 typu dzikiego jako maksymalny możliwy efekt (ustawiony na 100%), podczas gdy wzrost komórek wykazujących ekspresję zmutowanego P53 (ale wystawionych na kontrolę rozpuszczalnika) reprezentuje zerowy poziom reaktywacji.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Testy na bazie drożdży okazały się przydatne do badania różnych aspektów funkcji białka P53. Testy te są szczególnie czułe do oceny potencjału transaktywacji P53 w stosunku do wariantów miejsc docelowych RE, w tym do oceny funkcjonalnych polimorfizmów. Zastosowanie kolorowych reporterów, a także miniaturyzacja testu lucyferazy skutkują opłacalnymi i stosunkowo skalowalnymi testami. Ponadto test zahamowania wzrostu może być potencjalnie stosowany w badaniach przesiewowych bibliotek chemicznych, automatyzując kwantyfikację...

Transkrypcja to niezwykle złożony proces obejmujący dynamiczną, przestrzenną i czasową organizację czynników transkrypcyjnych (TF) i kofaktorów do rekrutacji i modulacji polimeraz RNA na regionach chromatyny w odpowiedzi na określone bodźce1. Większość TF, w tym ludzki supresor guza P53, rozpoznaje specyficzne elementy działające na cis w postaci sekwencji DNA zwanych elementami odpowiedzi (RE), które składają się z pojedynczych (lub wielu) unikalnych motywów o długości ~ 6-10 nukleotydów. W obrębie tych motywów poszczególne pozycje mogą wykazywać różne stopnie zmienności2, zwykle podsumowane za pomocą matryc wag pozycji (PWM) lub logos3,4.
Drożdże S. cerevisiae to odpowiedni system modelowy do badania różnych aspektów ludzkich białek poprzez testy komplementacji, ekspresji ektopowej i testów funkcjonalnych, nawet gdy nie występuje ortologicznego genu drożdży5,6,7. Ze względu na ewolucyjną konserwację podstawowych składników systemu transkrypcyjnego8, wiele ludzkich TF (gdy ektopowo eksprymowane w komórkach drożdży) może modulować ekspresję genu reporterowego, działając poprzez promotory zaprojektowane tak, aby zawierały odpowiednie RE. Przedstawiony tutaj system modelu transkrypcji dla ludzkiego P53 charakteryzuje się trzema głównymi zmiennymi, których efekty można modulować: 1) modalność ekspresji i typ P53, 2) sekwencja RE kontrolująca transkrypcję zależną od P53 oraz 3) typ genu reporterowego (Figura 1A).
Jeśli chodzi o modalność wyrażenia P53, S. cerevisiae pozwala na wybór indukowalnych, represyjnych lub konstytutywnych promotorów9,10,11. W szczególności indukowalny promotor GAL1 umożliwia podstawową (przy użyciu rafinozy jako źródła węgla) lub zmienną (poprzez zmianę ilości galaktozy w pożywce) ekspresję TF w drożdżach. W rzeczywistości precyzyjnie przestrajalne wyrażenie stanowi kluczowe osiągnięcie w badaniu nie tylko samego P53, ale także innych białek rodziny P5312,13.
Jeśli chodzi o rodzaj RE kontrolujących ekspresję zależną od P53, S. cerevisiae pozwala na konstruowanie różnych szczepów reporterowych posiadających unikalne różnice w interesującym RE na tle izogenicznym. Cel ten został osiągnięty dzięki adaptacji szczególnie wszechstronnego podejścia do edycji genomu opracowanego u S. cerevisiae, zwanego delitto perfetto12,14,15,16.
Ponadto, różne geny reporterowe (tj. URA3, HIS3 i ADE2) mogą być używane do jakościowej i ilościowej oceny aktywności transkrypcyjnej ludzkich TF u S. cerevisiae, z których każdy ma specyficzne cechy, które można dostosować do potrzeb eksperymentalnych17,18,19,20,21. Ekspresja tych genów reporterowych nadaje odpowiednio prototrofię uracylu, histydyny i adeniny. Reporter URA3 nie pozwala również na wzrost komórek w obecności 5-FOA, a zatem może być kontrselekcjonowany. System reporterowy ADE2 ma tę zaletę, że oprócz selekcji żywieniowej umożliwia identyfikację komórek drożdży, które wyrażają P53 typu dzikiego (tj. funkcjonalnego na ADE2) lub zmutowanego (tj. niefunkcjonalnego na ADE2) P53 z koloru kolonii.
Na przykład, komórki drożdży wyrażające gen ADE2 generują białe kolonie normalnej wielkości na płytkach zawierających ograniczające ilości adeniny (2,5-5,0 mg/L), podczas gdy te, które słabo lub nie transkrybują jej, pojawiają się na tej samej płytce co mniejsze czerwone (lub różowe) kolonie. Wynika to z akumulacji produktu pośredniego w szlaku biosyntezy adeniny (tj. P-rybozyloamino-imidazolu, który wcześniej nazywano rybotydem amino-imidazolu lub AIR), który jest przekształcany w czerwony pigment. Jakościowy gen reporterowy ADE2 oparty na kolorze został od tego czasu zastąpiony ilościowym Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22. Niedawno reporter ADE2 został połączony z reporterem lacZ w łatwym do oceny, półilościowym, podwójnym teście reporterowym, który można wykorzystać do podklasyfikacji mutantów P53 zgodnie z ich resztkowym poziomem funkcjonalności23.
Fluorescencyjne reportery, takie jak EGFP (wzmocnione białko zielonej fluorescencji) lub DsRed (czerwone białko fluorescencyjne Discosoma sp.) zostały również użyte do ilościowej oceny aktywności transaktywacji związanej ze wszystkimi możliwymi mutacjami typu missense w sekwencji kodującej TP5324. Wreszcie, szansa na połączenie przestrajalnych promotorów ekspresji allelu P53 z izogenicznymi szczepami drożdży różniącymi się genem RE i/lub reporterowym doprowadziła do opracowania matrycy danych, która generuje wyrafinowaną klasyfikację alleli P53 związanych z rakiem i zmutowanych w linii zarodkowej25,26,27.
Opisane powyżej podejścia są używane do pomiaru aktywności transkrypcyjnej białka P53. Jednak ekspresja P53 typu dzikiego u drożdży S. cerevisiae28 i Schizosaccharomyces pombe29 może powodować opóźnienie wzrostu, które jest związane z zatrzymaniem cyklu komórkowego28,30 lub śmierć komórki31. W obu przypadkach zahamowanie wzrostu drożdży jest wywoływane przez wysoką ekspresję P53 i jest skorelowane z potencjalną modulacją transkrypcji endogennych genów drożdży zaangażowanych we wzrost komórek. Potwierdzając tę hipotezę, mutant P53 R273H nie zakłócał wzrostu komórek drożdży, gdy był wyrażany na podobnych poziomach jak P5332. I odwrotnie, ekspresja w drożdżach toksycznego mutanta P53 V122A (znanego z wyższej aktywności transkrypcyjnej w porównaniu z P53 typu dzikiego) spowodowała silniejszy efekt hamujący wzrost niż typ dziki P5332.
Dodatkowo, wykazano, że ludzki MDM2 był w stanie hamować ludzką aktywność transkrypcyjną P53 u drożdży, sprzyjając ich ubikwitynacji i późniejszej degradacji33. W związku z tym wykazano zdolność ludzkich MDM2 i MDMX do hamowania indukowanego przez P53 wzrostu drożdży32,34. W dodatkowym badaniu ustalono korelację między aktywnością transkrypcyjną P53 a poziomem ekspresji aktyny, z identyfikacją przypuszczalnego RE P53 przed genem ACT1 w drożdżach32. Konsekwentnie, ekspresja aktyny była zwiększana przez P53 typu dzikiego, a jeszcze bardziej przez P53 V122A, ale nie przez zmutowany P53 R273H. I odwrotnie, ekspresja aktyny przez P53 zmniejszyła się przy jednoczesnej obecności inhibitorów P53 MDM2, MDMX lub pifitryny-α (małocząsteczkowego inhibitora aktywności transkrypcyjnej P53), zgodnie z wynikami opartymi na teście wzrostu drożdży. Co ważne, wyniki te ustaliły korelację między indukowanym przez P53 hamowaniem wzrostu a stopniem jego aktywności u drożdży, co zostało również wykorzystane do identyfikacji i badania małych cząsteczek modulujących funkcje P5328,34,35.

<table><tbody><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>SIGMA</td><td>11189</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>L-fenyloalanina</td><td>SIGMA</td><td>78019</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>BD Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże ex+A2:C26tract</td><td>BD Bacto</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże Difco Zasada azotu bez aminokwasów i siarczanu amonu</td><td>BDTM</td><td>233520</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrat octanu litu</td><td>SIGMA</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>Agar bakteriologiczny typu A</td><td>Biokar Diagnostics</td><td>A1010 HA</td><td></td></tr><tr><td>G418 Sól dwusiarczanowa</td><td>SIGMA</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>SIGMA</td><td>A2939</td><td></td></tr><tr><td>Monochlorowodorek L-argininy</td><td>SIGMA</td><td>A5131</td><td></td></tr><tr><td>Sól hemissiarczanu adeniny</td><td>SIGMA</td><td>A9126</td><td></td></tr><tr><td>Pasywny bufor do lizy 5x</td><td>PROMEGA</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>System oznaczania lucyferazy Bright-Glo&nbsp;</td><td>PROMEGA</td><td>E2620</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>Zymo Research</td><td>F9001</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-galaktoza</td><td>SIGMA</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy</td><td>SIGMA</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>L-histydyna</td><td>SIGMA</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>L-Izoleucyna</td><td>SIGMA</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Lizyna</td><td>SIGMA</td><td>L1262</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucyna</td><td>SIGMA</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>SIGMA</td><td>M2893</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>SIGMA</td><td>P3640</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-rafinoza Pentahydrat</td><td>SIGMA</td><td>R0250</td><td></td></tr><tr><td>L-seryna</td><td>SIGMA</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptofan</td><td>SIGMA</td><td>T0271</td><td></td></tr><tr><td>L-Treonina</td><td>SIGMA</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>Uracyl</td><td>SIGMA</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Walina</td><td>SIGMA</td><td>V0500</td><td></td></tr></tbody></table>

drożdże jako podwozie do opracowywania testów funkcjonalnych do badania ludzkiego p53

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Odkrycie, że dobrze znane białko P53 ssaków może działać jako czynnik transkrypcyjny (TF) u drożdży S. cerevisiae, pozwoliło na opracowanie różnych testów funkcjonalnych w celu zbadania wpływu 1) wariantów sekwencji miejsca wiązania [tj. elementu odpowiedzi (RE)] na specyficzność transaktywacji P53 lub 2) TP53 mutacje, kofaktory ulegające koekspresji lub małe cząsteczki o aktywności transaktywacyjnej P53. Opracowano różne podstawowe i translacyjne aplikacje badawcze. Eksperymentalnie podejścia te wykorzystują dwie główne zalety modelu drożdży. Z jednej strony łatwość edycji genomu umożliwia szybką budowę jakościowych lub ilościowych systemów reporterowych poprzez wykorzystanie szczepów izogenicznych, które różnią się tylko na poziomie określonego P53-RE, w celu zbadania swoistości sekwencyjnej transaktywacji zależnej od P53. Z drugiej strony, dostępność regulowanych systemów do ektopowej ekspresji P53 pozwala na ocenę transaktywacji w szerokim zakresie ekspresji białek. W niniejszym raporcie omówiono szeroko stosowane systemy oparte na genach reporterowych kolorów, lucyferazie i wzroście drożdży, aby zilustrować ich główne kroki metodologiczne i krytycznie ocenić ich moc predykcyjną. Co więcej, ekstremalna wszechstronność tych podejść może być łatwo wykorzystana do badania różnych TF, w tym P63 i P73, które są innymi członkami rodziny genów TP53.

Konstrukcja ADE2 lub LUC1 szczepy drożdży reporterowych
Podejście delitto perfetto12,14,15,16 zostało zaadaptowane w celu umożliwienia konstrukcji szczepów drożdży z reporterem P53 (<strong c...

Przedstawione są tutaj cztery protokoły do konstruowania i wykorzystywania szczepów reporterowych drożdży Saccharomyces cerevisiae do badania potencjału transaktywacji ludzkiego P53, wpływu różnych mutacji związanych z rakiem, współekspresji białek oddziałujących oraz efektów określonych małych cząsteczek.

Drożdże jako podwozie do opracowywania testów funkcjonalnych do badania ludzkiego p53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Cześć, nazywam się Bartolomeo Bosco i jestem doktorantem w Laboratorium Sieci Transkrypcyjnej w Centrum Biologii Integracyjnej Uniwersytetu w Trydencie we Włoszech. Jak wiadomo, transkrypcja jest niezwykle złożonym procesem obejmującym przestrzenną i czasową organizację czynnika transkrypcyjnego i kofaktora. Większość z nich, w tym ludzki P53, rozpoznaje specyficzne elementy cis-działające, zwane elementami odpowiedzi, a wiązanie się z tym sekwencjonowaniem DNA jest wymagane do modulacji transkrypcji docelowych genów.W tej pracy chcielibyśmy pokazać Państwu protokół badania sekwencji P53 specyficznej dla funkcji transaktywacji przy użyciu drożdży jako systemu modelowego jako białka w genie reporterowym koloru lub lucyferazy lub na podstawie kwantyfikacji wzrostu komórek, aby podkreślić główne etapy eksperymentalne i wszechstronność tych podejść. Protokół pierwszy, budowa szczepów drożdży reporterowych, które zawierają specyficzny element odpowiedzi P53 przed genem adeniny-2 lub lucyferazy świetlika. Aby skonstruować szczep reporterowy, najpierw wykonaj kroki od 1.1 do 1.15, aby przekształcić komórki drożdży z oligonukleotydami ukierunkowanymi na pożądany region promotora.Transformacja opiera się na standardowym protokole opartym na octanie litu. Gdy transformanty pojawią się na płytkach 5-FOA, zwykle po trzech dniach inkubacji w temperaturze 30 stopni, należy je replikować na nieselektywnych płytkach YPDA, a także na płytkach YPDA zawierających G418, oznaczając każdą płytkę, aby ułatwić ich późniejsze porównanie. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 30 stopni.Następnego dnia zidentyfikuj kandydujące szczepy reporterowe z kolonii, które są wrażliwe na G418, ale rosły na płytkach YPDA. Umieść zidentyfikowane kolonie na nowej płytce YPDA, aby uzyskać pojedyncze izolaty kolonii i pozwól im rosnąć przez dwa dni w temperaturze 30 stopni. Sprawdź poprawność integracji żądanego elementu odpowiedzi P53, wykonując reakcję PCR z warunkami wymienionymi w kroku 1.20.Załaduj porcję produktu PCR na żel agarozowy, aby sprawdzić prawidłową długość amplikonu przed sekwencjonowaniem Sangera. W protokole drugim przedstawiamy przykład, jak ocenić zdolność transaktywacji białka P53 za pomocą jakościowego testu drożdżowego adeniny-2 na bazie barwnika. Przekształć komórki drożdży z wektorami ekspresyjnymi P53 zgodnie z tym samym protokołem opartym na octanie litu, który opisano w sekcji pierwszej.Umieść pojedyncze kolonie transformujące drożdże, do sześciu na płytkę, na nowej selektywnej płytce i pozwól im rosnąć przez noc w temperaturze 30 stopni. Następnego dnia, przy użyciu sterylnych aksamitów, replikuj smugi na nowych selektywnych płytkach, które pozwalają na ocenę fenotypu barwnego, tj. selektywnych płytkach zawierających ograniczoną ilość adeniny.Inkubować w 30 stopniach przez trzy dni. Te same smugi mogą być replikowane wielokrotnie. Protokół trzeci, przedstawiamy teraz przykład oceny zdolności transaktywacji białka P53 przy użyciu ilościowego testu drożdży LUC1 opartego na luminescencji.Najpierw przekształć komórki drożdży z wektorami ekspresyjnymi P53 zgodnie z protokołem opartym na octanie litu opisanym w sekcji drugiej. Umieść pojedyncze transformanty na nowych selektywnych płytkach zawierających glukozę jako źródło węgla i pozwól im rosnąć w temperaturze 30 stopni przez noc. Dla każdego typu transformacji utwórz od pięciu do siedmiu różnych łatek.Po nocnym wzroście ponownie zawieś niewielką ilość komórek za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety w syntetycznym selektywnym podłożu zawierającym rafinozę jako źródło węgla. Te zawiesiny komórek powinny mieć gęstość optyczną na poziomie 600 nanometrów około 0,4, a następnie można je podzielić na wiele 96-dołkowych płytek w celu inkubacji w różnych temperaturach, zabiegów lub wystawienia komórek na różną ilość galaktozy w celu aktywacji ekspresji P53. Aby zmierzyć aktywność reporterową świetlika, przenieś od 10 do 20 mikrolitrów zawiesiny komórek z przezroczystej płytki 96-dołkowej na białą płytkę 384-dołkową i wymieszaj komórki z równą objętością buforu do lizy, inkubując przez 10, 15 minut w temperaturze pokojowej na shakerze.Dodaj 10, 20 mikrolitrów substratu lucyferazy świetlika. Mierz jednostki świetlne za pomocą czytnika płytek z wieloma etykietami. Zmierz również gęstość optyczną kultur na płytce 96-dołkowej.W protokole czwartym, przedstawiamy teraz przykład, jak wykorzystać hamowanie wzrostu drożdży indukowanego przez P53. Przekształć komórki drożdży z wektorami ekspresyjnymi P53 lub przekształć je za pomocą wektorów ekspresyjnych w celu koekspresji P53 i jednego z jego kofaktorów, takich jak MDM2, zgodnie z protokołem opartym na octanie litu opisanym w sekcji pierwszej. Hoduj komórki transformacyjne w selektywnym podłożu do około jednej gęstości optycznej.I rozcieńczyć je do 0,05, a następnie dodać wybraną cząsteczkę do odpowiedniego stężenia. Inkubować komórki w temperaturze 30 stopni na wytrząsarce przez 42 godziny. Następnie wysiewaj 100 mikrolitrów hodowli komórek drożdży na minimalnie selektywnych płytkach pożywki.Inkubować przez dwa dni w temperaturze 30 stopni. Prawidłową integrację RE w miejscu kasety ICORE można sprawdzić za pomocą PCR kolonii, zaczynając od niewielkiej liczby komórek z potencjalnych klonów drożdży i używając starterów opisanych w tabeli trzeciej w celu amplifikacji docelowego locus. Produkty PCR, pasmo około 500 nukleotydów, można następnie sprawdzić za pomocą sekwencjonowania Sangera w celu potwierdzenia sekwencji edytowanej lokalizacji genomu pod kątem obecności prawidłowej sekwencji elementu odpowiedzi P53.Szczep reporterowy jest gotowy do użycia w testach funkcjonalnych. Aby ocenić zdolność transaktywacji białka P53, sprawdź kolor kolonii drożdży. Na przykład przedstawiamy porównanie P53 typu dzikiego z mutantami R175H i R282W przy użyciu dwóch różnych reporterów, P21-5-prime i PUMA, oraz dwóch różnych temperatur, 30 stopni i 37 stopni.Co ciekawe, podczas gdy R175H jest allelem P53 powodującym utratę funkcji, czerwone kolonie w każdych warunkach, R282W wykazuje wrażliwość na temperaturę z resztkową aktywnością transaktywacyjną przy 30 stopniach, co skutkuje białymi koloniami, ale utratą aktywności przy 37 stopniach, co skutkuje czerwonymi lub różowymi koloniami. Rozszerzony zestaw danych przedstawiono na rysunku drugim: P53 typu dzikiego w czterech zmutowanych allelach przetestowano pod kątem transaktywacji przy użyciu 10 różnych szczepów reporterowych elementu odpowiedzi P53, trzech temperatur i konstytutywnych poziomów ekspresji. Wyniki są podsumowane kodem kolorystycznym, który przypomina fenotyp koloru kolonii drożdży.Zmutowany allel P53 K139E zachowuje częściową aktywność i jest wrażliwy na zimno. Na przykład kolonie są czerwone w szczepie reporterowym GADD45 pod kątem 24 i 30 stopni, ale są białe pod kątem 37 stopni. W niniejszej pracy przedstawiono przykładowe wyniki uzyskane tą metodą, porównujące swoistość transaktywacji drożdży ludzkich i drożdży C.elegans P53.Wyniki na wykresie słupkowym są wyrażone jako średnie względne jednostki światła z błędem standardowym wynoszącym cztery powtórzenia. Porównano pięć różnych elementów odpowiedzi P53. Przetestowano trzy różne poziomy ekspresji białka P53 poprzez różnicowanie stężenia galaktozy w pożywce.Dwa ortologi P53 wykazują wyraźnie różną specyficzność transaktywacji. Ilustrują to wyniki z elementami odpowiedzi ced13 i V1, które mają tę samą sekwencję, z wyjątkiem obecności lub braku dystansu 28-nukleotydowego. Ludzki P53 wykazuje znacznie wyższą transaktywację z miejscem wiązania V1, podczas gdy C.elegans P53 wykazuje odwrotną tendencję.Wyniki są niezależne od poziomu ekspresji P53 pod promotorem indukowanym galaktozą. Zmierz wzrost drożdży, licząc liczbę kolonii uzyskanych w kroplach kultury o pojemności 100 mikrolitrów. Oblicz efekt reaktywacji zmutowanych związków, biorąc pod uwagę wzrost drożdży eksprymujących P53 typu dzikiego jako maksymalny możliwy efekt, ustawiony na 100%, podczas gdy wzrost komórek wykazujących ekspresję zmutowanego P53 reprezentuje zerowy poziom reaktywacji.W tym przykładzie Nutlin-3a łagodzi hamowanie P53 typu dzikiego spowodowane koekspresją MDM2, podczas gdy PhiKan083 częściowo reaktywuje mutanta Y220C P53. W obu przypadkach powoduje to zależne od P53 zmniejszenie wzrostu drożdży. Komórki podstawne drożdży okazały się przydatne do badania wartości i aspektów funkcji białka P53.Protokół opisany w tej pracy jest szczególnie czuły w ocenie potencjału transaktywacji mutanta P53 typu dzikiego lub związanego z rakiem do wariantów miejsc docelowych. Co więcej, podejście to może być wykorzystane do identyfikacji małych cząsteczek wpływających na funkcje P53 oraz do badania interakcji P53 z kofaktorem. Zastosowanie kolorowych reporterów, miniaturyzacja lucyferazy, a także test zahamowania wzrostu skutkują opłacalnymi i skalowalnymi testami, które potencjalnie można poddać badaniom przesiewowym w bibliotece chemicznej.Wreszcie, system opisany w tej pracy może być łatwo zaadaptowany do badania innych czynników transkrypcyjnych specyficznych dla sekwencji.

yeast-as-a-chassis-for-developing-functional-assays-to-study-human-p53

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Badania genetyczne na drożdżach mogą być wykorzystywane do badania funkcji molekularnych i komórkowych ludzkich genów w komórkowym metabolizmie DNA. Opisano metody genetycznej charakterystyki produktu ludzkiego genu WRN, którego defekt występuje w zespole Wernera – chorobie objawiającej się przedwczesnym starzeniem się, w funkcjonalnie konserwowanych szlakach, wykorzystując drożdże jako przystępny system modelowy.

Badania genetyczne białek naprawy DNA u ludzi z wykorzystaniem drożdży jako systemu modelowego

Niniejszy manuskrypt opisuje trzy komplementarne protokoły służące do oceny toksyczności białek z ekspansją poliglutaminy (polyQ) w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Protokoły te można łatwo zmodyfikować w celu monitorowania toksyczności innych błędnie sfałdowanych białek w drożdżach.

Testy wzrostu do oceny toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Modele proteinopatii drożdży są cennymi narzędziami do oceny toksyczności i agregacji białek związanych z chorobą. W tym miejscu przedstawiamy metody badań przesiewowych bibliotek wariantów Hsp104 pod kątem supresorów toksyczności. Protokół ten można dostosować do badań przesiewowych dowolnej biblioteki białek pod kątem supresorów toksyczności dowolnego białka, które jest toksyczne w drożdżach.

Izolowanie wzmocnionych wariantów Hsp104 przy użyciu modeli proteinopatii drożdżowej

Białka oddziałują na siebie nawzajem i te interakcje determinują w dużej mierze ich funkcje. Partnerzy interakcji białkowych można zidentyfikować przy wysokiej przepustowości in vivo za pomocą testu sprawności drożdży opartego na teście komplementacji fragmentów białka reduktazy dihydrofolianu (DHFR-PCA).

Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach

Prezentowany tutaj jest ujednolicony opis technik, które mogą być użyte do rozwoju, transformacji, podawania i testowania ekspresji heterologicznego białka probiotycznych drożdży Saccharomyces boulardii.

Przemiana drożdży probiotycznych i ich odzyskiwanie z tkanek odpornościowych przewodu pokarmowego po zgłębniku doustnym u myszy

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Ten artykuł przedstawia metodę opartą na kojarzeniu, która ułatwia badanie przesiewowe nadekspresji u pączkujących drożdży przy użyciu biblioteki plazmidów z tablicą.

Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Ten protokół przedstawia procedury eksperymentalne do charakteryzowania zmian w całym genomie w poziomach modyfikacji potranslacyjnych histonów (PTM) występujących w związku z nadekspresją białek związanych z ALS i chorobą Parkinsona w modelach Saccharomyces cerevisiae. Po oddzieleniu SDS-PAGE poszczególne poziomy PTM histonów są wykrywane za pomocą przeciwciał specyficznych dla modyfikacji za pomocą Western blot.

Charakterystyka zmian modyfikacji potranslacyjnej histonów w modelach neurodegeneracyjnej proteinopatii drożdży

Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

Poznaj protokoły badania transaktywacji ludzkiego białka p53 w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Metoda umożliwia ocenę mutacji związanych z rakiem i interakcji z kofaktorami.

Drożdże jako podwozie do opracowywania testów funkcjonalnych do badania ludzkiego p53

Przeglądaj więcej filmów