Metoda przebijania mikroelektrod w celu zarejestrowania potencjału błony z kaniulowanej tętnicy środkowej mózgu
July 2nd, 2019
Głównym celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowych informacji na temat sposobu rejestrowania potencjału błonowego (Vm) z tętnicy środkowej mózgu za pomocą metody nabijania mikroelektrod. Kaniulowana tętnica środkowa mózgu jest równoważona w celu uzyskania tonu miogennego, a ściana naczynia jest przebijana za pomocą mikroelektrod o wysokiej rezystancji.
Protokół ten może być stosowany do pomiaru potencjału błonowego normalnych i chorych naczyń krwionośnych oraz do oceny środków farmakologicznych, które modulują potencjał błony, napięcie naczyniowe i przepływ krwi. Potencjały błonowe generowane przez tę technikę są bliskie zakresowi fizjologicznemu, ponieważ mięśnie gładkie naczyń krwionośnych w naczyniu znajdują się w syncytium. Przed rozpoczęciem procedury należy umieścić dwukanałowy wzmacniacz elektrometru różnicowego w pobliżu komory naczynia w żądanym miejscu.
Użyj BNC-BNC, aby podłączyć wyjście amplifier kanał A lub B do wejścia kanału digitizera. Zamontuj sondę w mikromanipulatorze i obróć mikromanipulator w kierunku mikroskopu i miografu na stole bez wibracji. Umieść pokrętła i przełączniki z przodu amplifier w odpowiednich pozycjach do eksperymentu, zgodnie z opisem w instrukcji.
Następnie podłącz uziemienie wanny do uziemienia obwodu amplifier za pomocą odpowiedniej elektrody i upewnij się, że klatka jest uziemiona do obudowy amplifier. Aby przygotować mikroelektrody ze szkła borokrzemianowego, użyj standardowego ściągacza, aby uzyskać krótki, stopniowy, ośmio- do 10-milimetrowy stożek o średnicy mniejszej niż jeden mikrometr, zapętlając się dwukrotnie w celu uzyskania wyższych oporów i mniejszych końcówek. Za pomocą strzykawki z mikrofibry napełnić mikroelektrodę trójmolowym chlorkiem potasu, powoli cofając tłok podczas wstrzykiwania, aby zrobić miejsce na wypełnienie płynu i zapobiec tworzeniu się pęcherzyków wewnątrz mikroelektrody.
Umieść w pełni załadowaną mikroelektrodę na uchwycie mikroelektrody i ostrożnie, ale stanowczo wepchnij trzpień elektrody do uchwytu przez wywiercony otwór. Usuń nadmiar płynu chusteczką laboratoryjną i podłącz zespół uchwytu elektrody do ampsonda lifier. Przeprowadź test elektrody, aby zmierzyć rezystancję elektrody.
Następnie otwórz oprogramowanie do nagrywania, przypisz nazwę do pliku i zapisz plik do przyszłej analizy. Następnie kilkakrotnie przepłucz komorę miografu wodą destylowaną przed załadowaniem jej pięcioma mililitrami normalnego roztworu soli fizjologicznej lub PSS. Za pomocą pięcio- lub 10-mililitrowej strzykawki napełnij zarówno szklane kaniule, jak i dołączoną rurkę przefiltrowanym normalnym PSS bez wprowadzania pęcherzyków powietrza i użyj kleszczyków, aby zrobić pół węzła w dwóch monofilamentowych nylonowych szwach 10-0.
Następnie, za pomocą kleszczy preparacyjnych pod mikroskopem preparacyjnym, umieść częściowo zamknięte węzły szwów na obu kaniulach nieco z dala od końcówek. W celu izolacji tętnicy środkowej mózgu użyj sprężynowych nożyczek i kleszczy, aby zidentyfikować i wypreparować nierozgałęziony odcinek środkowej tętnicy mózgowej o wewnętrznej średnicy od 100 do 200 mikrometrów mózgu szczura. Użyj cienkich kleszczyków, aby zamontować środkową tętnicę mózgową na szklanych kaniulach i zaciśnij szwy, aby przymocować tętnicę do kaniuli.
Zamknij dystalną kaniulę tak, aby nie było przepływu w tętnicy, a następnie podłącz pipetę dopływową do zbiornika PSS. Wizualizacja kaniulowanej tętnicy środkowej mózgu za pomocą kamery ze sprzężeniem ładunku zamontowanej na odwróconym mikroskopie i oprogramowaniu do obrazowania. Ustaw długość osiową MCA na przybliżoną długość, tak aby nie wydawała się ani sztywna, ani wiotka.
Zrównoważyć roztwór kąpieli z 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zanurz masę wzmacniacza w PSS miografu. Oświetl komorę naczynia i uwidocznij końcówkę mikroelektrody w roztworze kąpieli przez mikroskop.
Za pomocą mikromanipulatora przesuń końcówkę mikroelektrody blisko zewnętrznej ścianki naczynia krwionośnego i rozpocznij zapis. Powoli przesuwaj końcówkę mikroelektrody w kierunku naczynia, kierując się w stronę środka naczynia. Gdy końcówka znajdzie się w bliskiej odległości od naczynia, przesuń elektrodę do przodu jednym szybkim ruchem, aby przebić błonę mięśnia.
Po przeniknięciu przez membranę można zaobserwować zmiany w potencjale błony. Nie dotykaj mikromanipulatora po przebiciu membrany. Po zarejestrowaniu zmian potencjału membrany należy użyć manipulatora, aby jednym szybkim ruchem usunąć mikroelektrodę i zatrzymać zapis przed zapisaniem plików danych.
Przebijanie uważa się za udane, gdy następuje szybkie odchylenie do wartości ujemnych, potencjał membrany jest stabilny przez co najmniej 30 sekund, a napięcie gwałtownie powraca do zera miliwoltów po wyjęciu elektrody. Po udanym przebiciu i ustabilizowaniu potencjału błonowego, interesujące leki mogą być perfundowane do kąpieli i można zarejestrować zmiany w potencjale błonowym. W tym reprezentatywnym eksperfuzji z chlorkiem potasu zdepolaryzowała błonę o około sześć miliwoltów, podczas gdy perfuzja z zależnym od wapnia aktywatorem kanałów potasowych aktywowanych wapniem o dużej przewodności hiperpolaryzowała błonę o prawie cztery miliwolty.
Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest wyciąganie wysoce wytrzymałych mikroelektrod, które mają krótki, stopniowy stożek o średnicy mniejszej niż jeden mikrometr.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół rejestracji potencjału błonowego (V m) z tętnicy środkowej mózgu przy użyciu metody przekłucia mikrookludów. Technika ta umożliwia pomiar potencjałów błonowych zarówno w normalnych, jak i chorobowych naczyniach krwionośnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Elektrofizjologia
- Biologia naczyń
- Farmakologia
Tło
- Tętnica środkowa mózgu jest kluczowa dla przepływu krwi w mózgu.
- Zrozumienie potencjału błonowego jest niezbędne do oceny napięcia naczyniowego.
- Ta metoda może oceniać działanie substancji farmakologicznych na przepływ krwi.
- Potencjały błonowe są zbliżone do zakresów fizjologicznych ze względu na synchroniczne mięśnie gładkie naczyń krwionośnych.
Cel badania
- Dostarczenie szczegółowego protokołu pomiaru potencjału błonowego.
- Ocena wpływu środków farmakologicznych na napięcie naczyniowe.
- Zgłębienie zrozumienia regulacji przepływu krwi w zdrowiu i chorobie.
Stosowane metody
- Zastosowanie dwukanałowego różnicowego wzmacniacza elektrometru.
- Połączenie wzmacniacza z cyfrownikiem za pomocą kabla BNC-BNC.
- Montaż sondy w mikromanipulatorze dla precyzyjnego pozycjonowania.
- Dostosowanie ustawień wzmacniacza zgodnie z podręcznikiem eksperymentalnym.
Główne wyniki
- Pomyślne pomiary potencjału błonowego w tętnicy środkowej mózgu.
- Wykazanie zastosowania techniki zarówno do normalnych, jak i chorobowych naczyń.
- Walidacja fizjologicznej istotności rejestrowanych potencjałów błonowych.
- Wgląd w modulacje napięcia naczyniowego przez środki farmakologiczne.
Wnioski
- Metoda przekłucia mikrookludów jest skuteczna w badaniach fizjologii naczyniowej.
- Ten protokół może pomóc w ocenie środków terapeutycznych ukierunkowanych na stany naczyniowe.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zrozumienie wpływu potencjału błonowego na zdrowie naczyniowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of vascular smooth muscle membrane potential enables mechanistic de-risking of ion channel modulators in preclinical cardiovascular and cerebrovascular programs. This method supports target validation by linking electrophysiological readouts to vascular tone and blood flow regulation, providing predictive confidence for lead optimization. It bridges discovery biology with translational assessment of pharmacological agents affecting cerebral perfusion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on ion channel and electrogenic pump function in vascular smooth muscle.
- Operational Value: Enables functional target validation by correlating membrane potential changes with vascular tone modulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that depolarize or hyperpolarize membrane potential in resistance arteries.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (cannulated middle cerebral artery) for compound screening with stable membrane potential baselines.
- Quantitative Output: Generates reproducible membrane potential measurements in millivolts, enabling dose-response analysis of pharmacological agents.
- Screening Reproducibility: Standardizes impalement technique across vessels to ensure consistent electrophysiological readouts for hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to diseased vessel models to assess ion channel dysfunction in hypertension, stroke, or vascular inflammation.
- Translational Continuity: Connects electrophysiological mechanism to functional outcomes like cerebral blood flow regulation.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on membrane potential shifts induced by test compounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to functional validation in resistance arteries, supporting lead identification and preclinical efficacy assessment.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses about ion channel contribution to resting membrane potential in vascular smooth muscle.
- Screening: Delivers assay-ready preparations with stable impalement recordings for compound library screening.
- Analytics: Provides quantitative membrane potential readouts (mV) that enable comparison of compound effects on vascular excitability.
- Translational Research: Links electrophysiological modulation to downstream functional assays of vascular tone and perfusion.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform for multiple vascular beds and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in vascular pharmacology by directly measuring electrophysiological consequences of target modulation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible membrane potential data across laboratories and vascular preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying off-target electrophysiological effects early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of compounds with favorable vascular safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microelectrode preparation, vascular dissection, and electrophysiology recording.
- Depends on low-noise electrometers, digitizers, micromanipulators, and vibration-free imaging setups.
- Necessitates standardization of impalement success criteria (e.g., 30-second stability, return to zero) across users.
- Adaptation to other resistance arteries (e.g., mesenteric, coronary) may require vessel-specific cannulation and tone equilibration.
- Limited by technical success rate of impalement and susceptibility to movement artifacts during recording.
