Obserwacja w czasie rzeczywistym reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51
13 lutego 2019
Opracowano systemy obserwacji w czasie rzeczywistym oparte na transferze energii rezonansu fluorescencji reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51. Korzystając z przedstawionych tutaj protokołów, jesteśmy w stanie wykryć powstawanie produktów pośrednich reakcji i ich przekształcanie w produkty, jednocześnie analizując kinetykę enzymatyczną reakcji.
Metoda ta może pomóc w rozszyfrowaniu etapów wymiany nici DNA i ujawnić role molekuł różnych białek biorących udział w połączeniu podczas naprawy. Dzięki tej technice możemy monitorować wymianę nici DNA w czasie rzeczywistym bez żadnych zakłóceń reakcji i wykorzystać salę operacyjną do określenia kinetyki każdego etapu reakcji. Z niewielkimi poprawkami technika ta może być stosowana do badania aktywności oczyszczonych białek rekombinacyjnych pochodzących od innych gatunków, takich jak ssaki i rośliny.
Procedurę zademonstruje Kentaro Ito, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Na początek należy przygotować bufor reakcyjny A zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie dodaj 36-nanomolowy oligonukleotyd 16FA do buforu do testu parowania DNA.
Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Do mieszaniny dodać białko RAD-51 o końcowym stężeniu 1,5 mikromola i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodać do mieszaniny białko SWI5-SFR1 o końcowym stężeniu 0,15 mikromoli i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe pięć minut.
Przenieś 1,5 mililitra mieszaniny do kuwety kwarcowej o wymiarach 1,0 na 1,0 cm zawierającej mieszadło magnetyczne. Włóż kuwetę do spektrofluorometru i przystąp do regulacji regulatora temperatury i mieszadła magnetycznego. Rejestruj zmianę emisji fluorescencji FAM przy 525 nanometrach po wzbudzeniu przy 493 nanometrach w odstępach jednosekundowych przez 100 sekund.
Na koniec, za pomocą strzykawki, wstrzyknij do kuwety dwuniciowe DNA znakowane ROX o końcowym stężeniu 36 nanomole. Rejestruj zmianę emisji fluorescencji w odstępach jednosekundowych przez 30 minut. Aby porównać widma fluorescencji między substratami a produktami końcowymi, włóż każdą kuwetę zawierającą 16 oligonukleotydów FA z RAD-51 lub bez RAD-51 do spektrofluorometru i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Następnie zapisz emisję fluorescencji FAM na głębokości od 500 do 600 nanometrów po wzbudzeniu na 493 nanometrach. Aby przetestować wpływ RAD-51 na widma fluorescencji, dodaj RAD-51 w końcowym stężeniu 1,5 mikromola. I inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Na koniec zapisz widma fluorescencji od 500 do 600 nanometrów po wzbudzeniu na 493 nanometrach. Maksymalną wydajność FRET uzyskuje się poprzez pomiar maksymalnego zmniejszenia intensywności fluorescencji, gdy cały substrat jednoniciowego DNA jest przekształcany w dwuniciowy DNA w teście parowania. Lub mierząc maksymalny wzrost intensywności, gdy cały dwuniciowy substrat DNA jest przekształcany w jednoniciowy DNA w teście przemieszczenia.
W obu testach dodatek białka RAD-51 nie wpłynął na emisję fluorescencji FAM, ani na jego skuteczność wygaszania przez skały. Efekty spontanicznych reakcji między DNA substratu a późniejszym fotobieleniem są niewielkie. O czym świadczą znikome zmiany w emisji FAM bez RAD-51, w porównaniu do istotnych zmian obserwowanych przez RAD-51.
Dodanie kompleksu SWI5-SFR1 silnie stymuluje aktywność parowania RAD-51. Reakcja parowania jest symulowana przy użyciu trzyetapowego modelu, składającego się z utworzenia pierwszego trzyniciowego produktu pośredniego, przejścia do drugiego produktu pośredniego oraz uwolnienia jednoniciowego DNA i utworzenia hetero dupleksu. Porównanie modelu trzyetapowego z modelem dwuetapowym wskazuje, że model trzyetapowy lepiej nadaje się do symulacji parowania DNA, bez lub z kompleksem SWI5-SFR1.
Obliczona stała równowagi każdego etapu reakcji, z SWI5-SFR1 lub bez niego, pokazuje, że kompleks SWI5-SFR1 nie stymuluje tworzenia pierwszego trójniciowego produktu pośredniego, ale silnie stymuluje przejście między dwoma trójniciowymi produktami pośrednimi i uwalnianie SS DNA. Konieczne jest sprawdzenie, czy każda partia oczyszczonego białka jest wolna od zanieczyszczenia nukleazą i helikazą.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę obserwacji w czasie rzeczywistym reakcji wymiany nici DNA katalizowanej przez Rad51 z wykorzystaniem fluorescencyjnego przeniesienia energii. Technika ta umożliwia detekcję produktów pośrednich reakcji oraz analizę kinetyki enzymatycznej bez zakłócania przebiegu procesu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia molekularna
- Genetyka
Wstęp
- Wymiana nici DNA jest kluczowym procesem w naprawie DNA.
- Białko Rad51 odgrywa istotną rolę w rekombinacji homologicznej.
- Zrozumienie kinetyki tej reakcji może dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów naprawy DNA.
- Techniki monitorowania w czasie rzeczywistym usprawniają badanie tych złożonych procesów biochemicznych.
Cel badania
- Opracowanie systemu do obserwacji wymiany nici DNA w czasie rzeczywistym.
- Analiza roli różnych białek w tej reakcji.
- Wyznaczenie kinetyki każdego etapu procesu wymiany nici DNA.
Zastosowane metody
- Przygotowanie buforu reakcyjnego i oligonukleotydów do testów parowania DNA.
- Inkubacja białek RAD-51 i SWI5-SFR1 z substratami DNA.
- Wykorzystanie spektrofluorometru do monitorowania zmian fluorescencji.
- Analiza produktów i produktów pośrednich reakcji poprzez pomiary emisji fluorescencji.
Główne wyniki
- Dodatek SWI5-SFR1 znacząco stymuluje aktywność parowania RAD-51.
- Model trzystopniowy lepiej pasuje do symulacji parowania DNA w porównaniu z modelem dwustopniowym.
- Badanie dostarcza danych ilościowych na temat kinetyki wymiany nici DNA.
- Pomiary fluorescencji wykazały minimalny wpływ reakcji spontanicznych.
Wnioski
- Opracowana metoda umożliwia szczegółową analizę kinetyczną wymiany nici DNA.
- SWI5-SFR1 zwiększa wydajność RAD-51 w parowaniu DNA.
- Technikę tę można dostosować do badania białek rekombinacyjnych z różnych gatunków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Obserwacja w czasie rzeczywistym wymiany nici DNA pośredniczonej przez białko Rad51 zapewnia ilościowe ramy do oceny funkcji białek rekombinacyjnych, wspierając walidację celów w szlakach naprawy DNA. Test oparty na metodzie FRET umożliwia kinetyczną weryfikację hipotez mechanistycznych poprzez rozdzielenie przejściowych produktów pośrednich, co pozwala na identyfikację wiodących związków wśród modulatorów rekombinacji homologicznej. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków, łącząc aktywność białka z funkcjonalnymi efektami naprawy DNA.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wymiany nici pośredniczonej przez Rad51 w celu walidacji celów terapeutycznych w szlakach naprawy DNA.
- Wartość operacyjna: Pozwala na rozróżnienie procesów tworzenia i dojrzewania trójniciowych produktów pośrednich DNA, wyjaśniając mechanizm działania białek pomocniczych, takich jak Swi5-Sfr1.
- Wartość prognostyczna: Wspiera trzystopniowe modelowanie kinetyczne, co zwiększa pewność w zakresie przewidywań dotyczących angażowania celu i modulacji szlaków.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych odczytów fluorescencji w celu pomiaru kinetyki wymiany nici w różnych warunkach białkowych.
- Wartość operacyjna: Ustanawia jednorodny, roztworowy format testu, kompatybilny ze spektrofluorometryczną detekcją w celu przesiewania związków.
- Gotowość testu: Umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym bez zakłócania reakcji, co wspiera analizy zależności dawka-odpowiedź oraz analizy przebiegu czasowego w celu walidacji trafień.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Ułatwia porównywanie aktywności białek rekombinacyjnych między gatunkami, wspierając ekstrapolację wyników z systemów modelowych na homologi ludzkie.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala odróżnić wpływ białek akcesoryjnych na konkretne etapy reakcji, redukując niejednoznaczność w dopasowaniu biomarkerów opartych na mechanizmach.
- Ciągłość przedkliniczna: Zapewnia znormalizowaną metodę oceny konserwacji funkcjonalnej regulatorów Rad51 między gatunkami, co wspomaga wybór celów terapeutycznych.
Integracja rurociągów i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację wiodących związków, w którym profilowanie kinetyczne białek naprawy DNA dostarcza informacji niezbędnych do podjęcia decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac przed etapem inwestycji przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ilościowe określenie, w jaki sposób kompleks Swi5-Sfr1 stymuluje dojrzewanie kompleksów pośrednich oraz uwalnianie ssDNA w procesie wymiany nici zależnej od Rad51.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne sygnały FRET w czasie rzeczywistym, co umożliwia porównanie wpływu inhibitorów lub aktywatorów na kinetykę reakcji.
- Analityka: Dostarcza rozdzielone etapowo stałe szybkości i stałe równowagi, które pozwalają na ilościowe porównanie wariantów białek lub warunków reakcji.
- Badania translacyjne: Umożliwia ocenę konserwacji ewolucyjnej poprzez zastosowanie testu do białek rekombinacyjnych ssaków i roślin.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do charakteryzacji aktywności rekombinaz, ograniczając redundancję w opracowywaniu testów w ramach różnych projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez rozdzielenie przejściowych produktów pośrednich i zdefiniowanie etapów limitujących szybkość reakcji.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne dane kinetyczne dzięki monitorowaniu fluorescencji w czasie rzeczywistym w formacie z użyciem kuwet.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ilościowe określenie, w jaki sposób białka akcesoryjne modulują konkretne etapy wymiany nici, co zmniejsza niepewność mechanistyczną.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów naprawy DNA z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe profile kinetyczne oraz dane o konserwacji ewolucyjnej.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie oczyszczania białek, spektroskopii fluorescencyjnej oraz analizy danych kinetycznych.
- Metoda zależy od dostępu do spektrofluorometru z kontrolą temperatury, mieszaniem magnetycznym oraz możliwością wstrzykiwania próbek za pomocą strzykawki.
- Konieczne jest ustandaryzowane przygotowanie białek w celu wyeliminowania zanieczyszczeń nukleazami i helikazami, które mogłyby zakłócić interpretację reakcji.
- Wymagana jest optymalizacja znakowania i stężenia oligonukleotydów dla każdego gatunku docelowego, aby zapewnić wykrywalne sygnały FRET.
- Metoda ograniczona do układów in vitro; nie uwzględnia efektów kontekstu chromatynowego lub jądrowego występujących in vivo.
