Obserwacja w czasie rzeczywistym reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51
February 13th, 2019
Opracowano systemy obserwacji w czasie rzeczywistym oparte na transferze energii rezonansu fluorescencji reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51. Korzystając z przedstawionych tutaj protokołów, jesteśmy w stanie wykryć powstawanie produktów pośrednich reakcji i ich przekształcanie w produkty, jednocześnie analizując kinetykę enzymatyczną reakcji.
Metoda ta może pomóc w rozszyfrowaniu etapów wymiany nici DNA i ujawnić role molekuł różnych białek biorących udział w połączeniu podczas naprawy. Dzięki tej technice możemy monitorować wymianę nici DNA w czasie rzeczywistym bez żadnych zakłóceń reakcji i wykorzystać salę operacyjną do określenia kinetyki każdego etapu reakcji. Z niewielkimi poprawkami technika ta może być stosowana do badania aktywności oczyszczonych białek rekombinacyjnych pochodzących od innych gatunków, takich jak ssaki i rośliny.
Procedurę zademonstruje Kentaro Ito, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Na początek należy przygotować bufor reakcyjny A zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie dodaj 36-nanomolowy oligonukleotyd 16FA do buforu do testu parowania DNA.
Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Do mieszaniny dodać białko RAD-51 o końcowym stężeniu 1,5 mikromola i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodać do mieszaniny białko SWI5-SFR1 o końcowym stężeniu 0,15 mikromoli i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe pięć minut.
Przenieś 1,5 mililitra mieszaniny do kuwety kwarcowej o wymiarach 1,0 na 1,0 cm zawierającej mieszadło magnetyczne. Włóż kuwetę do spektrofluorometru i przystąp do regulacji regulatora temperatury i mieszadła magnetycznego. Rejestruj zmianę emisji fluorescencji FAM przy 525 nanometrach po wzbudzeniu przy 493 nanometrach w odstępach jednosekundowych przez 100 sekund.
Na koniec, za pomocą strzykawki, wstrzyknij do kuwety dwuniciowe DNA znakowane ROX o końcowym stężeniu 36 nanomole. Rejestruj zmianę emisji fluorescencji w odstępach jednosekundowych przez 30 minut. Aby porównać widma fluorescencji między substratami a produktami końcowymi, włóż każdą kuwetę zawierającą 16 oligonukleotydów FA z RAD-51 lub bez RAD-51 do spektrofluorometru i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Następnie zapisz emisję fluorescencji FAM na głębokości od 500 do 600 nanometrów po wzbudzeniu na 493 nanometrach. Aby przetestować wpływ RAD-51 na widma fluorescencji, dodaj RAD-51 w końcowym stężeniu 1,5 mikromola. I inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Na koniec zapisz widma fluorescencji od 500 do 600 nanometrów po wzbudzeniu na 493 nanometrach. Maksymalną wydajność FRET uzyskuje się poprzez pomiar maksymalnego zmniejszenia intensywności fluorescencji, gdy cały substrat jednoniciowego DNA jest przekształcany w dwuniciowy DNA w teście parowania. Lub mierząc maksymalny wzrost intensywności, gdy cały dwuniciowy substrat DNA jest przekształcany w jednoniciowy DNA w teście przemieszczenia.
W obu testach dodatek białka RAD-51 nie wpłynął na emisję fluorescencji FAM, ani na jego skuteczność wygaszania przez skały. Efekty spontanicznych reakcji między DNA substratu a późniejszym fotobieleniem są niewielkie. O czym świadczą znikome zmiany w emisji FAM bez RAD-51, w porównaniu do istotnych zmian obserwowanych przez RAD-51.
Dodanie kompleksu SWI5-SFR1 silnie stymuluje aktywność parowania RAD-51. Reakcja parowania jest symulowana przy użyciu trzyetapowego modelu, składającego się z utworzenia pierwszego trzyniciowego produktu pośredniego, przejścia do drugiego produktu pośredniego oraz uwolnienia jednoniciowego DNA i utworzenia hetero dupleksu. Porównanie modelu trzyetapowego z modelem dwuetapowym wskazuje, że model trzyetapowy lepiej nadaje się do symulacji parowania DNA, bez lub z kompleksem SWI5-SFR1.
Obliczona stała równowagi każdego etapu reakcji, z SWI5-SFR1 lub bez niego, pokazuje, że kompleks SWI5-SFR1 nie stymuluje tworzenia pierwszego trójniciowego produktu pośredniego, ale silnie stymuluje przejście między dwoma trójniciowymi produktami pośrednimi i uwalnianie SS DNA. Konieczne jest sprawdzenie, czy każda partia oczyszczonego białka jest wolna od zanieczyszczenia nukleazą i helikazą.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę do obserwacji w czasie rzeczywistym reakcji wymiany nici DNA pośredniczyć przez Rad51 z wykorzystaniem rezonansu energii przeniesienia fluorescencji. Technika ta umożliwia wykrywanie pośrednich produktów reakcji i analizę kinetyki enzymatycznej bez zakłócania reakcji.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biochemia
- Biologia molekularna
- Genetyka
Tło
- Wymiana nici DNA jest kluczowym procesem w naprawie DNA.
- Rad51 odgrywa znaczącą rolę w rekombinacji homologicznej.
- Zrozumienie kinetyki tej reakcji może dostarczyć wglądu w mechanizmy naprawy DNA.
- Techniki monitorowania w czasie rzeczywistym poprawiają badania tych złożonych procesów biochemicznych.
Cel badania
- Opracowanie systemu do obserwacji wymiany nici DNA w czasie rzeczywistym.
- Analiza ról różnych białek w reakcji.
- Wyznaczenie kinetyki każdego kroku w procesie wymiany nici DNA.
Zastosowane metody
- Przygotowanie buforu reakcji i oligonukleotydów do badań parowania DNA.
- Inkubacja białek RAD-51 i SWI5-SFR1 z substratami DNA.
- Wykorzystanie spektrofluorometru do monitorowania zmian fluorescencji.
- Analiza pośrednich produktów reakcji i produktów końcowych poprzez pomiary emisji fluorescencji.
Główne wyniki
- Dodanie SWI5-SFR1 znacznie stymuluje aktywność parowania RAD-51.
- Model trzystopniowy lepiej pasuje do symulacji parowania DNA niż model dwustopniowy.
- Badanie dostarcza ilościowych danych na temat kinetyki wymiany nici DNA.
- Pomiar fluorescencji wskazał minimalne efekty od spontanicznych reakcji.
Wnioski
- Opracowany metoda umożliwia szczegółową analizę kinetyki wymiany nici DNA.
- SWI5-SFR1 zwiększa efektywność RAD-51 w parowaniu DNA.
- Ta technika może być dostosowana do badania białek rekombinacyjnych z różnych gatunków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Real-time observation of DNA strand exchange mediated by Rad51 provides a quantitative framework for evaluating recombination protein function, supporting target validation in DNA repair pathways. The FRET-based assay enables kinetic de-risking of mechanistic hypotheses by resolving transient intermediates, informing lead identification for modulators of homologous recombination. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking protein activity to functional DNA repair outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Rad51-mediated strand exchange to validate therapeutic targets in DNA repair pathways.
- Operational Value: Resolves formation and maturation of three-strand DNA intermediates, clarifying mechanism of action for accessory proteins like Swi5-Sfr1.
- Predictive Value: Supports three-step kinetic modeling that improves confidence in target engagement and pathway modulation predictions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts to measure strand exchange kinetics under varying protein conditions.
- Operational Value: Establishes a homogeneous, solution-based assay format compatible with spectrofluorometric detection for compound screening.
- Assay Readiness: Enables real-time monitoring without reaction disruption, supporting dose-response and time-course analyses for hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Facilitates cross-species comparison of recombination protein activity, supporting extrapolation from model systems to human homologs.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes effects of accessory proteins on specific reaction steps, reducing ambiguity in mechanism-based biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Provides a standardized method to assess functional conservation of Rad51 regulators across species, informing target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where kinetic profiling of DNA repair proteins informs go/no-go decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how Swi5-Sfr1 stimulates intermediate maturation and ssDNA release in Rad51-mediated strand exchange.
- Screening: Delivers reproducible, real-time FRET signals that enable comparison of inhibitor or activator effects on reaction kinetics.
- Analytics: Provides step-resolved rate constants and equilibrium constants that allow quantitative comparison of protein variants or conditions.
- Translational Research: Enables assessment of evolutionary conservation by applying the assay to recombination proteins from mammals and plants.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing recombinase activity, reducing redundant assay development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving transient intermediates and defining rate-limiting steps.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible kinetic data through real-time fluorescence monitoring in a cuvette-based format.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying how accessory proteins modulate specific steps of strand exchange, reducing mechanistic uncertainty.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA repair targets based on quantitative kinetic profiles and evolutionary conservation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, fluorescence spectroscopy, and kinetic data analysis.
- Dependent on access to a temperature-controlled spectrofluorometer with magnetic stirring and syringe injection capability.
- Necessitates standardized protein preparation to exclude nuclease and helicase contaminants that could confound reaction interpretation.
- Requires optimization of oligonucleotide labeling and concentration for each target species to ensure detectable FRET signals.
- Limited to in vitro systems; does not capture chromatin or nuclear context effects present in vivo.
