Badania probiotyczne na nowonarodzonych myszach z użyciem zgłębnika

Badania probiotyczne u nowonarodzonych myszy przy użyciu zgłębnika. Wprowadzenie, ten protokół wideo szczegółowo omówi konfigurację i procedurę podawania probiotyków noworodkowi myszy w drugim dniu jej życia. Sterylne pobieranie jelit do analizy mikrobiomu jelitowego jest również szczegółowo opisane w tym protokole.

Niektóre reprezentatywne wyniki są również zawarte w tym protokole, aby wprowadzić niektóre rodzaje danych, które można uzyskać w wyniku zastosowania tej procedury. Zgłębnik wewnątrzprzełykowy noworodka myszy, dzień życia dwa. Umieść klatkę zapory w tym samym okapie, w którym eksperymentalne klatki są umieszczone na poduszce grzewczej, poduszka grzewcza jest ustawiona na średni poziom, który wynosi około 38 stopni Celsjusza.

Usuń trochę ziemi zagnieżdżonej z klatki domowej, przetrzyj gniazdo rękami w rękawiczkach, aby przenieść zapachy materiału gniazdowego na rękawicę. Zmniejsza to przenoszenie obcych zapachów na szczenię podczas obchodzenia się z nim. To z kolei zmniejsza ryzyko porzucenia lub kanibalizacji przez zaporę z powodu obcych zapachów.

Kiedy szczenięta wracają do klatki domowej, po zabiegu. Stwórz stożkowe gniazdo trzymające i umieść je w nowej i sterylnej klatce eksperymentalnej, która została wstępnie ogrzana. Przenieś wszystkie szczenięta z klatki domowej do klatki eksperymentalnej.

Przenieś młode do stożkowego gniazda, w klatce doświadczalnej. Zdejmij klatkę zapory i umieść ją z dala od obszaru gavagingu. Zmniejsza to stresujące warunki dla matki, uniemożliwiając matce słyszenie szczeniąt podczas wykonywania zabiegu.

Otwórz opakowanie strzykawki, aby mieć do niej łatwy dostęp. Wyjąć igłębnik z automatyczną osłoną ciała w sterylny sposób i przymocować ją do główki strzykawki. Igła jest myta 70% etanolem i wodą przed autoklawowaniem.

Różne zestawy igieł do karmienia są używane między grupą badaną i kontrolną, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Wciągnąć roztwór barwnika probiotycznego do strzykawki, odwrócić i przesunąć palcem, aby usunąć pęcherzyki i pustą przestrzeń w objętości wewnątrz strzykawki. Cofnąć tłok, aby usunąć płyn z martwej przestrzeni igieł, a następnie wcisnąć tłok, aby usunąć powietrze i pęcherzyki powietrza, ważne jest, aby upewnić się, że żadne pęcherzyki powietrza nie są wnikające, do zwierzęcia.

Dostosuj żądaną objętość w strzykawce, na dzień życia dwie myszy nie należy spożywać więcej niż 30 mikrolitrów. Czarne oznaczenie, które widzisz na igle, wskazuje maksymalną długość, że igłę można włożyć do myszy. Długość tę uzyskuje się poprzez zewnętrzny pomiar długości między pyskiem a wyrostkiem mieczykowatym.

Umieścić strzykawkę na sterylnej powierzchni, wyjąć szczenię do pobrania z klatki doświadczalnej i obserwować oznaki zdrowia. Te oznaki zdrowotne obejmują regularny oddech i różowe zabarwienie skóry. Umieść szczeniaka na sterylnym arkuszu obserwacyjnym, na poduszce grzewczej.

Nasmaruj zewnętrzną powierzchnię igły do karmienia, używając rozpuszczalnika używanego do rozpuszczenia probiotyku. Tutaj jest to woda dekstroza, która ułatwia płynne wejście igły do przełyku zwierzęcia. Chrupnij szczeniaka za skórę na szyi, używając kciuka i palca wskazującego.

Chwycić strzykawkę w dominującą rękę, w pozycji umożliwiającej włożenie igły, i wcisnąć tłok bez regulowania palców. Włóż gruszkę igły do karmienia pod kątem 45 stopni, aż dotrze do tylnej części jamy ustnej. Odchyl rękę z igłą od siebie, trzymając gruszkę igły na miejscu, gdy igła będzie gładka z tułowiem, zacznie się ślizgać.

Upewnij się, że strzykawka nie jest wywierana dodatkowo w celu pobudzenia ruchu. Proces połykania będzie powolny, a cierpliwość jest kluczowa. Wraz z wiekiem szczenię połykanie igły stanie się szybsze i łatwiejsze.

Igła do karmienia została wstępnie oznaczona, aby zapobiec przedostawaniu się bańki do żołądka. Gdy oznakowanie zbliży się do pyska, zatrzymaj ruch igły i powoli podawaj roztwór probiotyczny. Po zakończeniu porodu należy powoli wyjmować igłę.

Umieść mysz na poduszce grzewczej i obserwuj, czy się regeneruje. Odruch sapania ustępuje, a tętno wzrasta, ponownie pojawia się zdrowe różowe zabarwienie, a nierozwiązany odruch sapania po 45 sekundach wskazuje na nieudane zgłębnik i mysz musi zostać poddana eutanazji. Barwnik zgłębnika powinien być widoczny przez bladą skórę, barwnik powinien być widoczny tylko w obszarze, w którym zwykle znajduje się plamka mleczna.

Ograniczenie do barwnika do żołądka wskazuje na udane zgłębnik. Jeśli barwnik zostanie znaleziony w jamie klatki piersiowej lub jakiejkolwiek innej jamie niż żołądek, mysz musi zostać poddana eutanazji, ponieważ wskazuje to na nieudaną głębnik. Minimalny nacisk jest potrzebny, aby zasmucić dzień życia dwie myszy.

Oznaki zbyt twardego chrupania mogą obejmować niezdolność do oddychania, znaczne sapanie i wystawianie języka przez długi czas. Kilka sugestii dotyczących procedury gavagingu, oprzyj grzbiet palca dłoni na dłoni trzymającej strzykawkę, co zapewnia stabilną pozycję szczeniąt, podczas zabiegu, a igła nie jest przesuwana wewnątrz zwierzęcia. Podczas zgłębnika ciężar igły ułatwi przesuwanie, pozwoli na połknięcie igły przez szczeniaka, bez wywierania nacisku zewnętrznego.

Zwróć szczenięta do klatki matki i kontynuuj monitorowanie zgodnie z harmonogramem. Pobieranie próbek jelitowych do analizy kolonizacji. Zwierzę zostało humanitarnie poddane eutanazji metodami zatwierdzonymi w Protokole Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania.

Stół operacyjny wyłożony jest sterylną matą chłonną. Narzędzia zostały wysterylizowane przy użyciu 70-procentowego etanolu i sterylizacji na gorąco w temperaturze 250 stopni Celsjusza. Zewnętrzna służba zwierzęcia jest dezynfekowana 70-procentowym etanolem.

Przetnij zewnętrzną skórę za pomocą kleszczy i nożyczek na cztery ćwiartki, zachowując szczególną ostrożność, aby nie zranić otrzewnej. Podwiń skórę na bok tak, aby otrzewna była dobrze odsłonięta. Użyj innych, nowych sterylnych narzędzi, aby rozciąć otrzewną i zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zranić narządów wewnętrznych w tym procesie.

Zlokalizuj żołądek szczeniaka i zaciśnij na dwunastnicy. Za pomocą dwóch sterylnych kleszczy zlokalizuj żołądek i zlokalizuj dwunastniczy koniec żołądka. Zaciśnij w prawo na skrzyżowaniu żołądka i dwunastnicy.

Użyj dwóch nowych sterylnych kleszczy do uruchomienia jelit, użyj jednego kleszcza, aby przytrzymać dwunastnicę, podczas gdy drugiego użyj do oderwania tkanki łącznej, utrzymując jelita w stanie nienaruszonym. Podczas rozplątywania umieść jelita na sterylnej podkładce chłonnej przykrywającej zwierzę. Jeśli zdarzy Ci się rozerwać jelita, podczas procedury rozplątywania zaznacz obszar, w którym pękły, tak aby orientacja jelita była nienaruszona.

Zacisnąć na końcu odbytu i wykonać nacięcia na obu zaciskach. Umieść nienaruszone jelito na sterylnie oznakowanej folii aluminiowej we właściwej orientacji. Zaznacz wszystkie odcinki jelita, niezbędne do późniejszej analizy.

DNA jest ekstrahowane z tych jelit przy użyciu zoptymalizowanej procedury ekstrakcji, a analiza QPCR jest wykonywana w celu ilościowego określenia probiotyku. DNA jest ekstrahowane ze świeżych jelit lub jelita mogą być przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza za pomocą zamrażarki. Reprezentatywne wyniki, Lactobacillus plantarium, kolonizacja przez zgłębnik codziennie i co drugi dzień.

Wyższy sygnał LP zaobserwowano w jelitach myszy, które zgłębnikowały co drugi dzień, w porównaniu z myszami poddawanymi przez zgłębnik codziennie. W ten sposób budowano kolejne eksperymenty, w których co drugi dzień używano gavlingów. Lactobacillus plantarum zwolczałkowate myszy, trzymane razem z myszami nieukwaszonymi.

Zmienne sygnały LP zaobserwowano u myszy nieleczonych, które były trzymane razem z myszami z zgłębnikami LP. Rozprzestrzenianie się kolonizacji LP jest możliwe w przypadku rodzeństwa z miotu, a tym samym warunki leczenia, zostały oddzielone klatkami dla naszych kolejnych eksperymentów. Wniosek, ta procedura może być stosowana do dostarczania precyzyjnych ilości dowolnego płynu nowonarodzonym myszom.

Pobieranie próbek z jelit można ekstrapolować w celu zbadania zmian w mikrobiomie za pomocą innych metod analizy. Celem tego filmu jest zapewnienie naukowcom platformy do wykorzystania modeli zgłębników u noworodków myszy, aby zrozumieć mechanizmy stojące za zaobserwowanymi efektami przy wczesnym podawaniu probiotyków. Specjalne podziękowania dla zespołu Kollmann Lab, The Animal Care Services of University of British Colombia, za umożliwienie przeprowadzenia tego badania.