Protokół przezczaszkowej terapii fotobiomodulacyjnej u myszy

Ogólnym celem poniższego protokołu eksperymentalnego jest przeprowadzenie przezczaszkowej terapii fotobiomodulacyjnej przy użyciu niskiego poziomu czerwonego lasera u myszy. Osiąga się to poprzez bezpośredni kontakt sondy laserowej z głowicą myszy. Pierwszym krokiem, w celu oceny przepuszczalności światła laserowego, jest dokładne wypreparowanie tkanki mózgowej z czaszki.

A następnie zmierz moc światła przepuszczanego przez czaszkę, skórę głowy i jeden milimetrowy wycinek tkanki mózgowej. W sekcji terapii należy przyłożyć końcówkę sondy laserowej bezpośrednio do skóry głowy w punkcie bregma. To przestrzenne uczenie się i funkcje pamięci są oceniane za pomocą zadania labiryntu Barnesa.

Następnie poziomy ATP w hipokampie określa się metodą spektrofotometryczną. Dane z transmisji laserowej pokazują, że około 1% poprzedzającego światła na powierzchni skóry głowy osiągało głębokość jednego milimetra od powierzchni kory mózgowej. Wyniki zadania labiryntu Barnesa pokazują poprawę pamięci przestrzennej u starszych myszy po dwóch tygodniach leczenia przezczaszkowym czerwonym laserem.

Wyniki sugerują również podwyższony poziom ATP w hipokampie u starzejących się myszy leczonych laserem. Fotobiomodulacja przezczaszkowa jest nieinwazyjnym podejściem terapeutycznym stosowanym w leczeniu szerokiego zakresu zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych oraz w celu poprawy prawidłowego funkcjonowania mózgu. Rzeczywiście, uważa się, że terapia fotobiomodulacyjna powoduje fotodysocjację tlenku azotu z oksydazy cytochromu c w mitochondriach.

Te z kolei zwiększają mitochondrialny transport elektronów, co ostatecznie prowadzi do wzrostu produkcji ATP. Metoda ta jest bezpiecznym i opłacalnym podejściem do dostarczania światła, które odbywa się poprzez promieniowanie głowy przy użyciu zewnętrznych źródeł światła, w tym laserów i diod elektroluminescencyjnych. Prawie wszystkie procedury fotobiomodulacji przezczaszkowej są stosowane za pomocą światła czerwonego do bliskiej podczerwieni o długości fali od 600 do 1100 nanometrów, mocy od jednego do 500 miliwatów i fluencji od jednego do 20 dżuli na centymetr kwadratowy.

U głęboko znieczulonej myszy ostrożnie wypreparuj tkankę mózgową z czaszki. Najpierw utrwal nienaruszoną tkankę mózgową na żelu agarozowym i przygotuj wszystkie wymagane materiały, w tym chlorek sodu i klej. Następnie rozprowadź cienką warstwę kleju na powierzchni bloku montażowego wibratomu.

Ostrożnie przymocuj blok agarozy i dostosuj jego położenie. Lekko dopasuj ostrze wibratomu do górnej powierzchni bloku i zapisz wartość licznika. Napełnij zbiornik wibratomu lodowatym roztworem soli fizjologicznej.

Dostosuj prędkość i częstotliwość wibracji wibratomu i zmień licznik na odpowiednią wartość, aby uzyskać grubość warstwy jednego milimetra. Włącz wibratomium i naciśnij przycisk start i pokrój mózg poprzecznie na plasterek o grubości jednego milimetra. Najpierw dodaj kroplę wody na powierzchnię szkła optycznego.

Następnie połóż plasterek mózgu na szklance. Dodaj na niego kroplę wody i ostrożnie umieść drugie szkło optyczne. Należy pamiętać, że kropla wody powinna zostać dodana do granicy próbki i szkła, aby zapobiec wysuszeniu tkanki, a także rozpraszaniu światła od szorstkich powierzchni.

Przenieść próbki do laboratorium optycznego. Skonfiguruj urządzenia optyczne i włącz miernik mocy. Załóż okulary ochronne przed rozpoczęciem pracy z urządzeniem laserowym.

Włącz laser i skoncentruj wiązkę na lustrze, aby skierować wiązkę do aktywnego obszaru fotodiody. Najpierw umieść dwa puste okulary optyczne na powierzchni miernika mocy i odczytaj moc przepuszczanego światła z ekranu wyświetlacza. Zdejmij puste okulary i delikatnie umieść próbkę mózgu na powierzchni miernika mocy, a następnie skup wiązkę na odpowiednim obszarze tkanki i odczytaj przesyłaną moc.

Tym razem umieść puste szkło optyczne na powierzchni miernika mocy i odczytaj moc przepuszczanego światła. Następnie usuń puste szkło i delikatnie umieść szkło optyczne ze świeżą czaszką i oskalpowaną tkanką na powierzchni miernika mocy. Skoncentruj wiązkę na bregmie i odczytaj przesyłaną moc.

Na koniec wyłącz urządzenie laserowe i miernik mocy. Sekcja terapeutyczna obecnego protokołu obejmuje zastosowanie instrumentów laserowych klasy 3B, co wymaga odpowiedniego szkolenia i wytycznych dotyczących bezpieczeństwa. W celu przystosowania się zwierząt do nowego środowiska, należy przynieść myszy z ich domowych klatek do gabinetu terapeutycznego na około 20 minut przed rozpoczęciem zabiegu.

Najpierw włóż wtyczkę urządzenia laserowego do ochraniacza elektrycznego. Przykryj końcówkę sondy laserowej przezroczystą folią nylonową, aby zapobiec zarysowaniu powierzchni sondy. Ostrożnie podłącz sondę laserową do kanału urządzenia.

Załóż okulary ochronne przed rozpoczęciem pracy z urządzeniem laserowym. Włącz urządzenie laserowe i poczekaj kilka sekund na jego rozgrzanie. Po zaobserwowaniu znaku Laser Ready na panelu urządzenia, należy dostosować parametry zabiegu, w tym czas naświetlania i tryb pracy.

Przed rozpoczęciem zabiegu należy określić średnią moc lasera, stykając końcówkę sondy z obszarem aktywnym miernika mocy na urządzeniu. W obecnym protokole sonda laserowa jest umieszczana w strefie bregma, która jest około trzech milimetrów rostralna do linii poprowadzonej między przednią podstawą uszu. Aby uniknąć bezpośredniego promieniowania do oczu zwierzęcia, najpierw umieść końcówkę sondy laserowej na głowie, a następnie włącz laser i stabilnie trzymaj sondę aż do zakończenia napromieniania.

Następnie wyłącz urządzenie laserowe i odłącz sondę od urządzenia. Pod koniec zabiegu wyczyść sondę laserową odpowiednim środkiem do czyszczenia optycznego. Zadanie uczenia się przestrzennego i zapamiętywania jest wykonywane w labiryncie Barnesa.

Najpierw umieść znak "nie wchodź" na zewnętrznej stronie drzwi pokoju zadań. Dołącz wizualne wskazówki przestrzenne do ścian obwodowych. Umieść kamerę wideo nad platformą labiryntu.

Oczyść powierzchnię platformy labiryntu 70% etanolem, aby usunąć niechciane sygnały węchowe. Dodaj niewielką ilość ściółki z domowej klatki zwierzęcia do pudełka ucieczkowego, aby służyła jako wskazówka węchowa. Przed rozpoczęciem zadania umieść każdą mysz w nowej klatce i przenieś klatkę do labiryntu Barnesa.

Aby się przyzwyczaić, pozwól zwierzęciu pozostać w pomieszczeniu przez 30 minut przed zadaniem. Następnie wyjmij mysz z klatki i delikatnie umieść zwierzę w skrzynce ewakuacyjnej i pozwól mu tam pozostać przez minutę. Po minucie delikatnie wyjmij mysz z pudełka ewakuacyjnego, umieść zwierzę na środku areny i umieść na nim komorę startową.

Po dziesięciu sekundach podnieś komorę startową i pozwól zwierzęciu eksplorować arenę przez trzy minuty. Cicho przenieś się do obszaru komputera, załóż nauszniki i wywołaj negatywny bodziec słuchowy składający się z głośnego białego szumu. Następnie rozpocznij filmowanie i obserwuj zachowanie zwierzęcia na monitorze komputera.

Należy pamiętać, że labirynt powinien być używany do testowania białych myszy. Pod labiryntem należy również umieścić czarną matę, w której ma być używane oprogramowanie systemu śledzenia skrzynek. Skonfiguruj oprogramowanie do śledzenia wideo i wyodrębnij interesujące Cię parametry z nagranych filmów.

W celu oceny biochemicznej należy wypreparować tkanki hipokampa, homogenizować je w buforze próbki, odwirować, a następnie ocenić poziom ATP za pomocą metody spektrofotometrycznej. Transmisja światła laserowego o długości 660 nm przez czaszkę i skórę głowy starszych myszy wynosiła około 16%Wartość około 10% mierzono również jako przepuszczalność lasera przez jednomilimetrowy wycinek starzejącej się tkanki mózgowej. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w logarytmie aktywności ruchowej w teście otwartym pomiędzy wszystkimi grupami doświadczalnymi.

Dane z zadania labiryntu Barnesa wykazały, że czasy opóźnienia starszych zwierząt kontrolnych są oczywiście dłuższe niż w młodej grupie kontrolnej w trzecim i czwartym dniu sesji treningowej. Jednak leczenie czerwonym laserem znacznie skróciło czas opóźnienia w czwartym dniu. W sesji próbnej rekwizytów starsze zwierzęta kontrolne spędzają znacznie krótszy czas w kwadrancie docelowym w porównaniu z młodymi zwierzętami kontrolnymi.

Jednak starzejące się myszy leczone laserem spędzały znacznie dłuższy czas w docelowych kwadrantach w porównaniu ze starzejącymi się myszami kontrolnymi. Dane bioenergetyczne hipokampa ujawniają spadek poziomu ATP u starzejących się zwierząt kontrolnych. Z drugiej strony, leczenie czerwonym laserem znacznie zwiększa średnią zawartość ATP w hipokampie starszych myszy.

Opisano protokół laboratoryjny przeprowadzający procedurę przezczaszkowej terapii fotobiomudulacyjnej u myszy. Nasz protokół można dostosować do dowolnych innych zwierząt laboratoryjnych, które są często używane w dziedzinie neuronauki translacyjnej, takich jak królik, pies, małpa i tak dalej. Na podstawie naszych badań, niski poziom światła czerwonego może przywrócić dysfunkcję hipokampa w starzejącym się mózgu poprzez zwiększenie produkcji ATP, co znajduje odzwierciedlenie w ulepszonej funkcji pamięci przestrzennej.

W tej metodzie, w oparciu o którą obszary mózgu są dotknięte patologią, konieczne jest optymalne dostosowanie kilku parametrów fizycznych i leczniczych, w tym czasu napromieniania, interwału leczenia, zastosowanego promieniowania i fluencji, aby osiągnąć lepsze wyniki. Przezczaszkowa terapia fotobiomodulacyjna jest proponowana jako obiecujące podejście do poprawy metabolizmu mózgu i poprawy funkcji poznawczych, które może być potencjalną strategią w przypadku związanego z wiekiem spadku funkcji poznawczych i chorób neurodegeneracyjnych.