Name: Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Poznaj metodę wzbogacania peptydów diGly i spektrometrii masowej do analizy ubikwitynowanych białek. Technika ta zapewnia głębsze pokrycie ubikwitynomu i większą liczbę identyfikacji w porównaniu do dotychczasowych podejść.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest częścią projektu "Proteins at Work", programu Holenderskiego Centrum Proteomiki finansowanego przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO) jako część National Roadmap Large-Scale Research Facilities (numer projektu 184.032.201).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (EDC) Erasmus MC.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Hodowane komórki
	<ol>
		<li>Wybierz interesującą Cię linię komórkową (np. HeLa lub komórki kostniakomięsaka [U2OS]) i hoduj komórki w pożywce Minimal Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 jednostkami/ml penicyliny/streptomycyny.</li>
		<li>W przypadku ilościowych eksperymentów proteomicznych, hodowla komórek w DMEM pozbawionych argininy i lizyny. Pożywkę należy uzupełnić 10% dializowaną płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny i alaniną-glutaminą. Przygotuj dwa rodzaje pożywki, dodając konwencjonalną lizynę i argininę ("Light" Medium) lub lizynę-8 (13C6;15N2) i arginina-10 (13C6;15N4) ("Ciężki" Średni).</li>
		<li>Partie hodowli komórek w pożywce lekkiej (tj. nieznakowanej) i pożywce ciężkiej (tj. znakowanej, SILAC) przez co najmniej sześć podwojeń przed ekspansją i obróbką, aby upewnić się, że wszystkie białka w kulturze ciężkiej pożywki są znakowane ciężkim stabilnym izotopem zawierającym aminokwasy.</li>
		<li>Traktować komórki przez 8 godzin 10 μM inhibitora proteasomu bortezomibu lub równoważną objętością DMSO jako próbne leczenie. Umyj komórki PBS, zdysocjuj je za pomocą 1% trypsyny/EDTA i otul komórki.</li>
		<li>Poddać lizie osad komórkowy z jednej płytki hodowlanej o długości 150 cm2 na badane warunki w 2 ml lodowatego 50 mM Tris-HCl (pH = 8,2) z 0,5% deoksycholanem sodu (DOC). Gotować lizat w temperaturze 95 °C przez 5 minut i sonikować przez 10 minut (ustawienie "H" dla sonikatora wymienionego w Tabeli Materiałów) w temperaturze 4 °C. Nie zalecamy stosowania inhibitorów deubikwitynazy, takich jak N-etylomaleimid (NEM), ponieważ może to wprowadzić niepożądane modyfikacje białek, które mogą skomplikować identyfikację peptydów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tkanka mózgowa myszy in vivo
	<ol>
		<li>W przypadku stosowania tkanki in vivo należy poddać ją lizie w lodowatym buforze zawierającym 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 12 mM DOC sodu i 12 mM N-lauroilosarkosynianu sodu17. Sonikować lizat przez 10 minut (ustawienie "H" dla sonikatora wymienionego w Tabeli Materiałów) w temperaturze 4 °C i gotować lizat przez 5 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo całkowitą ilość białka za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA z absorbancją, metodą kolorymetryczną. Całkowita ilość białka powinna wynosić co najmniej kilka miligramów, aby zapewnić skuteczną immunoprecypitację peptydów diGly (IP). W eksperymentach SILAC należy zmieszać lekkie i ciężkie znakowane białka w stosunku 1:1 w oparciu o całkowitą ilość białka.</li>
	<li>Zredukować wszystkie białka za pomocą 5 mM 1,4-ditiotreitolu przez 30 minut w temperaturze 50 °C, a następnie alkilować je 10 mM jodoacetamidem przez 15 minut w ciemności. Przeprowadzić trawienie białka za pomocą Lys-C (stosunek enzymu do substratu 1:200) przez 4 godziny, a następnie trawienie przez noc trypsyną (stosunek enzymu do substratu 1:50) w temperaturze 30 °C lub w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Dodać kwas trifluorooctowy (TFA) do strawionej próbki do końcowego stężenia 0,5% i odwirować próbkę przy 10 000 x g przez 10 minut w celu wytrącenia i usunięcia całego detergentu. Zebrać supernatant zawierający peptydy do późniejszego frakcjonowania.</li>
</ol>
2. Frakcjonowanie peptydów offline
<ol>
	<li>Użyć chromatografii C18 o wysokim pH z fazami odwróconymi (RP) z polimerowym materiałem fazy stacjonarnej (300 A, 50 μM; patrz Tabela Materiałów) załadowanym do pustego wkładu kolumnowego w celu frakcjonowania peptydów tryptycznych. Wielkość złoża fazy stacjonarnej musi być dostosowana do ilości trawionego białka, które ma być frakcjonowane. Przygotować pusty wkład kolumnowy o pojemności 6 ml (patrz Tabela materiałów) wypełniony 0,5 g materiału fazy stacjonarnej na ~10 mg trawienia białka. Stosunek trawienia białka do fazy stacjonarnej powinien wynosić około 1:50 (w/w).</li>
	<li>Załadować peptydy do przygotowanej kolumny i przemyć kolumnę około 10 objętościami kolumny 0,1% TFA, a następnie około 10 objętościami kolumnyH2O.</li>
	<li>Rozpuść peptydy na trzy frakcje z 10 objętościami kolumn 10 mM roztworu mrówczanu amonu (pH = 10) z odpowiednio 7%, 13,5% i 50% acetonitrylu (AcN). Liofilizuj wszystkie frakcje do kompletności.</li>
	<li>Użyj przeciwciał przeciwko motywowi resztki ubikwityny (K-ε-GG) sprzężonych z kulkami agarozowymi białka A w celu wzbogacenia immunologicznego peptydów diGly. Ponieważ dokładna ilość przeciwciał w partii kulek jest informacją zastrzeżoną i nie jest ujawniana przez producenta, zaleca się stosowanie tej samej definicji dla partii kulek, co producent, aby uniknąć nieporozumień. Umyj jedną partię tych kulek 2x PBS i podziel zawiesinę kulki na sześć równych frakcji. Zobacz Rysunek 1 dla szczegółowego schematu eksperymentalnego.</li>
	<li>Rozpuścić trzy frakcje peptydowe zebrane w kroku 2.3 w 1,4 ml buforu składającego się z 50 mM MOPS, 10 mM fosforanu sodu i 50 mM NaCl (pH = 7,2) i odwirować zanieczyszczenia.</li>
	<li>Dodać supernatanty frakcji do kulek przeciwciała dwupoziomowego i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C na rotatorze. Odwirować kulki i przenieść supernatant do świeżej partii kulek przeciwciał i ponownie inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przechowuj supernatanty do późniejszej globalnej analizy proteomu (GP).</li>
	<li>Przenieś kulki z każdej frakcji do końcówki do pipety o pojemności 200 μl wyposażonej w zatyczkę filtrującą GF/F, która zatrzymuje kulki. Umieść końcówkę pipety z koralikami w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wyposażonej w adapter końcówki wirówki. Przemyć kulki 3x 200 μl lodowatego buforu IAP, a następnie 3x 200 μl lodowatego miliQH 2O. Przed każdym etapem płukania należy odwirować kolumnę przy 200 x g przez 2 minuty, ale należy uważać, aby kolumna nie wyschła. Eluować peptydy za pomocą 2 cykli po 50 μl 0,15% TFA.</li>
	<li>Odsolić peptydy za pomocą końcówki do stopniowania C18 (zasadniczo końcówki pipety o pojemności 200 μl z dwoma krążkami C18) i wysuszyć je do pełnej konsystencji za pomocą wirowania próżniowego.</li>
</ol>
3. Nanoflow LC-MS/MS
<ol>
	<li>Wykonaj eksperymenty LC-MS/MS na czułym spektrometrze mas sprzężonym z nanoprzepływowym systemem LC.</li>
	<li>Użyj wewnętrznie wypełnionej 50 cm kolumny z odwróconymi fazami o średnicy wewnętrznej 75 μm, wypełnionej żywicą CSH130 (3,5 μm, 130 A) i eluuj peptydy o gradiencie 2−28% (AcN, 0,1% FA) przez 120 minut przy 300 nL/min. Alternatywnie użyj dostępnych na rynku kolumn LC o podobnych właściwościach. Utrzymuj kolumnę w temperaturze 50 °C za pomocą pieca kolumnowego, npample, (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wykonaj analizę spektrometrii mas.
	<ol>
		<li>Spektrometr mas musi pracować w trybie akwizycji zależnej od danych (DDA). Widma masowe MS1 powinny być zbierane w wysokiej rozdzielczości (np. 120 000), z ustawieniem celu automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) na 4E5 i maksymalnym czasem wstrzykiwania 50 ms w przypadku spektrometru masowego Orbitrap.</li>
		<li>Najpierw wykonaj analizę spektrometrii mas w trybie "Najpierw najwyższa intensywność". W ten sposób najintensywniejszy jon jest wybierany najpierw do fragmentacji, następnie drugi co do wielkości i tak dalej, przy użyciu metody maksymalnej prędkości z całkowitym czasem cyklu wynoszącym 3 s. Następnie wykonaj drugą rundę analizy DDA MS w trybie "Najpierw najniższa intensywność", tak aby najpierw wybrany był jon o najmniejszej intensywności, a następnie drugi najniższy i tak dalej. Strategia ta zapewnia optymalne wykrywanie peptydów o bardzo niskiej liczebności.</li>
		<li>Filtruj jony prekursorowe zgodnie z ich stanami naładowania (2-7 ładunków) i monoizotopowym przypisaniem pików. Wykluczaj wcześniej badane prekursory dynamicznie przez 60 sekund. Wyizolować prekursory peptydów za pomocą kwadrupolowego filtra masowego ustawionego na szerokość 1,6 Th.</li>
		<li>Zbieraj widma MS2 w pułapce jonowej przy AGC 7E3 z maksymalnym czasem wtrysku 50 ms i energią zderzenia HCD wynoszącą 30%.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Analizuj surowe pliki spektrometrii mas za pomocą odpowiedniej wyszukiwarki, takiej jak bezpłatny pakiet oprogramowania MaxQuant oparty na wyszukiwarce Andromeda18,19. W MaxQuant wybierz ustawienia domyślne z kilkoma adaptacjami, które są wskazane poniżej. Ustaw specyficzność enzymatyczną na trypsynę, z maksymalną liczbą pominiętych rozszczepień zwiększoną do trzech. Ustaw lizynę z pozostałością diGly (+114,04 Da), utlenianie metioniny i N-końcową acetylację jako zmienne modyfikacje, a ustaw karbamidometylację cysteiny jako ustaloną modyfikację.</li>
	<li>Przeszukaj bazę danych w pliku FASTA zawierającym sekwencje białek pobrane na przykład z repozytorium Uniprot (<a href="https://www.uniprot.org/downloads" target="_blank">https://www.uniprot.org/downloads</a>) w połączeniu z wabikiem i standardową bazą danych wspólnych zanieczyszczeń, która jest automatycznie dostarczana przez MaxQuant. Ustaw współczynnik fałszywych wykryć (FDR) na 1% i ustaw minimalny wynik dla zmodyfikowanych peptydów (diGly) na 40 (wartość domyślna). Wykluczyć peptydy zidentyfikowane z C-końcową zmodyfikowaną cyfrowo modyfikowaną resztą lizyny z dalszej analizy.</li>
	<li>W przypadku analizy ilościowej plików eksperymentu SILAC ustaw liczebność na "2" i powtórz krok 4.2.</li>
	<li>Wykonuj wszystkie dalsze analizy (np. statystyczne, analizy ontologii genów) za pomocą modułu Perseus module20 pakietu oprogramowania MaxQuant.</li>
</ol>

<ol><li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li>
<li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%3A+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li>
<li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li>
<li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li>
<li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li>
<li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li>
<li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li>
<li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proteome-wide%2C+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284(2011).</li>
<li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li>
<li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li>
<li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
<li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li>
<li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li>
<li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+standard+absolute+quantification+%28PSAQ%29+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li>
<li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opisany tutaj protokół został zastosowany do próbek z różnych źródeł biologicznych, takich jak hodowane komórki i tkanki in vivo. We wszystkich przypadkach zidentyfikowaliśmy tysiące peptydów diGly, pod warunkiem, że całkowita ilość białka wynosiła co najmniej 1 mg. Wzbogacanie przy użyciu specyficznych przeciwciał jest bardzo wydajne, biorąc pod uwagę, że z lizatów całych komórek zidentyfikowano co najwyżej 100-150 bardzo mało obfitych peptydów diGly, jeśli nie zastosowano procedur wzbogacania ubikwitynowanych białek lu...

Koniugacja ubikwityny z białkami oznacza je do degradacji przez proteasom i jest kluczowym procesem w proteostazie. C-końcowa grupa karboksylowa ubikwityny tworzy wiązanie izopeptydowe z grupą lizynową ε-aminową docelowego białka1,2. Ponadto ubikwityna może być przyłączana do innych modułów ubikwityny, co powoduje tworzenie jednorodnych (tj. K48 lub K11) lub rozgałęzionych (tj. niejednorodnych lub mieszanych) struktur poliubikwityny1,3. Najbardziej znaną funkcją ubikwityny jest jej rola w degradacji proteasomalnej, w której pośredniczy poliubikwityna związana z K48. Stało się jednak jasne, że zarówno mono-, jak i poliubikwitynacja odgrywają również rolę w wielu procesach, które są niezależne od degradacji przez proteasom. Na przykład łańcuchy połączone z K63 odgrywają niedegradacyjną rolę w transporcie wewnątrzkomórkowym, degradacji lizosomalnej, sygnalizacji kinazy i odpowiedzi na uszkodzenie DNA4,5. Pozostałe sześć typów sprzężeń jest mniej licznych, a ich role są nadal w dużej mierze enigmatyczne, chociaż pojawiają się pierwsze wskazówki dotyczące ich funkcji w komórce, głównie z powodu rozwoju nowych narzędzi umożliwiających wykrywanie specyficzne dla sprzężenia6,7.
Spektrometria mas stała się nieodzownym narzędziem do analiz proteomów i obecnie tysiące różnych białek z praktycznie każdego źródła biologicznego można zidentyfikować w jednym eksperymencie. Dodatkową warstwę złożoności stanowią modyfikacje potranslacyjne (PTM) białek (np. fosforylacja, metylacja, acetylacja i ubikwitynacja), które mogą modulować aktywność białek. Identyfikacja białek zawierających PTM na dużą skalę stała się również możliwa dzięki postępom w dziedzinie spektrometrii mas. Stosunkowo niska stechiometria peptydów zawierających PTM w porównaniu z ich niezmodyfikowanymi odpowiednikami stanowi wyzwanie techniczne, a przed analizą spektrometrii mas na ogół konieczne są etapy wzbogacania biochemicznego. W ciągu ostatnich dwóch dekad opracowano kilka różnych specyficznych metod wzbogacania do analizy PTM.
Ze względu na wieloaspektowość roli ubikwitynacji białek w komórce, istnieje duże zapotrzebowanie na rozwój metod analitycznych do wykrywania miejsc ubikwitynacji na białkach8. Zastosowanie metod spektrometrii mas doprowadziło do eksplozji liczby zidentyfikowanych miejsc ubikwitynacji w białkach muszek owocowych, myszy, ludzi i drożdży9,10,11,12,13,14. Ważnym krokiem było opracowanie strategii wzbogacania opartych na immunoprecypitacji na poziomie peptydów z wykorzystaniem przeciwciał skierowanych przeciwko motywowi pozostałości K-ε-GG (określanemu również jako "diglicyna" lub "diGly"). Te peptydy diGly są wytwarzane podczas trawienia ubikwitynowanych białek przy użyciu trypsyny jako proteazy15,16.
Tutaj prezentujemy zoptymalizowany przepływ pracy do wzbogacania peptydów diGly za pomocą immunooczyszczania i późniejszej detekcji za pomocą spektrometrii mas Orbitrap. Korzystając z kombinacji kilku modyfikacji istniejących procesów pracy, zwłaszcza na etapie przygotowania próbki i spektrometrii mas, możemy teraz rutynowo zidentyfikować ponad 23 000 peptydów diGly z pojedynczej próbki komórek HeLa traktowanych inhibitorem proteasomu i ~10 000 z nieleczonych komórek HeLa. Zastosowaliśmy ten protokół do lizatów zarówno z nieznakowanych, jak i stabilnych izotopów znakowanych aminokwasami w hodowlach komórkowych (SILAC) znakowanych komórkami HeLa, a także do próbek endogennych, takich jak tkanka mózgowa.
Ten przepływ pracy stanowi cenne uzupełnienie repertuaru narzędzi do analizy miejsc ubikwitynacji w celu odkrycia głębokiego ubikwitinomu. Poniższy protokół szczegółowo opisuje wszystkie kroki przepływu pracy.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithioerythritol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>3M Empore C18 Octadecyl disks</td><td>Supelco</td><td>66883-U</td><td>produkt wycofany z produkcji w Supelco; CDS Analytical to nowy producent (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td></tr><tr><td>Żywicy im. mrówczanu amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Bortezomib</td><td>UBPbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSH130, 3,5 &mu; m, 130 i Aring;</td><td>Wody</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nanoLC 1200</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GF/F zatyczka filtra</td><td>Whatman</td><td>1825-021</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lizyna, Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lizyna-8 (13C6; 15N2), arginina-10 (13C6; 15N4)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lizylowa endopeptydaza (LysC)</td> <td>Wako Pure Chemicals</td><td>129-02541</td><td></td></tr><tr><td>Konstrukcja MPI piekarnika NanoLC</td><td>, MS Wil GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa N-lauroilsarkozyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5125</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Orbitrap Fusion Lumos</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>ThermoFisher / Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PLRP-S (300 &Aring;, 50 &micro; m) polimerowe cząstki o odwróconej fazie</td><td>Agilent Technologies</td><td>PL1412-2K01</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-&epsilon;-GG) Kit</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>5562</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge</td><td>Wody</td><td>WAT036790</td><td>Usuń materiał tC18 z wkładu przed napełnieniem wkładu PLRP-S</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, ThermoFisher z powłoką TPCK</td><td></td><td>20233</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Potranslacyjna modyfikacja białek przez małe białko ubikwityna jest zaangażowana w wiele zdarzeń komórkowych. Po tryptycznym trawieniu ubikwitynowanych białek, peptydy z pozostałością diglicyny sprzężonej z grupą aminową lizyny epsilon ("K-ε-diglicyna" lub po prostu "diGly") mogą być użyte do wyśledzenia pierwotnego miejsca modyfikacji. Skuteczne oczyszczanie immunologiczne peptydów diGly w połączeniu z czułym wykrywaniem za pomocą spektrometrii mas spowodowało ogromny wzrost liczby zidentyfikowanych do tej pory miejsc ubikwitynacji. Wprowadziliśmy kilka ulepszeń w tym przepływie pracy, w tym frakcjonowanie peptydów w odwróconej fazie offline o wysokim pH przed procedurą wzbogacania oraz włączenie bardziej zaawansowanych ustawień fragmentacji peptydów do wielopola routingu jonów. Ponadto bardziej efektywne oczyszczanie próbki za pomocą zatyczki opartej na filtrze w celu zatrzymania kulek przeciwciała skutkuje większą specyficznością dla peptydów diGly. Ulepszenia te skutkują rutynowym wykrywaniem ponad 23 000 peptydów diGly z lizatów komórek ludzkiego raka szyjki macicy (HeLa) po zahamowaniu proteasomu w komórce. Pokazujemy skuteczność tej strategii w dogłębnej analizie profili ubikwitinomu kilku różnych typów komórek oraz próbek in vivo, takich jak tkanka mózgowa. Badanie to stanowi oryginalny dodatek do zestawu narzędzi do analizy ubikwitynacji białek w celu odkrycia głęboko komórkowego ubikwitinomu.

Proteiny ubikwitynowane pozostawiają pozostałość diglicyny o masie 114,04 Da na resztach lizyny w białku docelowym po trawieniu białek trypsyną. Różnica masy spowodowana przez ten motyw została wykorzystana do jednoznacznego rozpoznania miejsca ubikwitynowania w eksperymencie z wykorzystaniem spektrometrii mas. Strategia opisana w niniejszym opracowaniu stanowi nowoczesną metodę wzbogacania i późniejszej identyfikacji peptydów diGly za pomocą nanoflow LC-MS/MS (Rycina...

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Potranslacyjna modyfikacja białek przez małe białko ubikwitynę bierze udział w wielu zdarzeniach w komórce. Niniejsze badanie stanowi oryginalne uzupełnienie zestawu narzędzi do analizy ubikwitynacji białek. Używamy technik wzbogacania i spektrometrii mas, aby odkryć głęboki ubikwitinom.Wprowadziliśmy kilka ulepszeń w analizie peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek. Obejmują one frakcjonowanie surowych peptydów przed wzbogaceniem oraz zastosowanie bardziej zaawansowanych ustawień fragmentacji peptydów w Orbitrap. W sumie skutkuje to większym pokryciem wszechobecnościnem.Kilka aspektów protokołu trudno opisać słowami. Wizualizacja niektórych kluczowych kroków jest niezbędna, aby móc powtórzyć te analizy przez różnych operatorów w innym laboratorium. Procedura zostanie zademonstrowana przez Karela Bezstarosti, który jest starszym technikiem w moim laboratorium.Zacznij od przygotowania hodowanych komórek lub tkanki mózgowej myszy do eksperymentu. Jeśli pracujesz z komórkami, zlizuj osad komórkowy z jednej 150-centymetrowej kwadratowej płytki hodowlanej w dwóch mililitrach lodowatego, 50-milimolowego Tris HCL z 0,5% deoksycholanem sodu. Gotuj lizat w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.Następnie poddawaj go sonikacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. W przypadku stosowania tkanki mózgowej myszy in vivo, należy ją poddać lizie w lodowatym buforze zawierającym 100 milimolowy Tris HCL, 12-milimolowy deoksycholan sodu i 12-milimolowy N-lauroilosarkozynian sodu. Sonikuj lizat przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie gotuj przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Następnie określ ilościowo całkowitą ilość białka za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA o absorpcji kalorymetrycznej, który powinien wynosić co najmniej kilka miligramów, aby zapewnić skuteczną immunoprecypitację peptydu diGly. W eksperymentach SILAC należy wymieszać lekkie i ciężkie znakowane białka w stosunku jeden do jednego w oparciu o całkowitą ilość białka.Zredukuj wszystkie białka za pomocą pięciu milimolowych DTT przez 30 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza. A następnie alkiluj je 10-milimolowym jodoacetamidem przez 15 minut w ciemności. Następnie wytrawianie białek za pomocą Lys-C przez cztery godziny.I trawienie trypsyny przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza lub w temperaturze pokojowej. Następnego dnia podziel próbkę na dwie dwumililitrowe probówki Eppendorfa i dodaj TFA do strawionej próbki do końcowego stężenia 0,5%Odwiruj ją w temperaturze 10 000 razy G przez 10 minut, aby wytrącić i usunąć cały detergent. Zebrać peptyd zawierający supernatant do późniejszego frakcjonowania.Do frakcjonowania peptydów tryptycznych należy użyć chromatografii C18 z odwróconymi fazami o wysokim pH. Przygotuj pusty sześciomililitrowy wkład kolumnowy wypełniony 0,5 grama materiału fazy stacjonarnej na około 10 miligramów trawienia białka. Załaduj peptydy na przygotowaną kolumnę i przemyj ją około 10 objętościami 0,1% TFA, a następnie 10 objętościami wody.Eluować peptydy na trzy frakcje, używając 10 objętości kolumn 10-milimolowego mrówczanu amonu z odpowiednio siedmioma, 13,5 i 50% acetonitrylem. Następnie litholyzuj wszystkie frakcje. Jedna partia przeciwciał przeciwko motywowi resztkowemu ubikwityny sprzężonej z białkiem Zawiesina kulki agarozy jest dzielona na sześć równych frakcji.Rozpuść trzy frakcje peptydowe zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i odwiruj szczątki. Dodać supernatanty trzech frakcji do zawiesiny perełek, pozostawiając pozostałe trzy frakcje na lodzie. I inkubuj je przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza na jednostce rotatora.Następnie odkręć koraliki. Przenieść supernatant do świeżej partii kulek. I powtórzyć inkubację z pozostałymi trzema frakcjami gnojowicy perełek.Przechowuj supernatanty do późniejszej globalnej analizy proteomu. I przenieś kulki na końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów wyposażone we wtyczkę filtra GFF. Umieść końcówki w 1,5-mililitrowych probówkach wyposażonych w adapter końcówki wirówki i umyj koraliki trzykrotnie 200 mikrolitrami lodowatego buforu IAP, a następnie trzykrotnie przepłucz lodowatą oczyszczoną wodą.Wiruj kolumny z prędkością 200 razy G przez dwie minuty między praniami, uważając, aby kolumna nie wyschła. Po ostatnim płukaniu wymyj peptydy w dwóch cyklach po 50 mikrolitrach 0,15% TFA. Odsolić peptydy za pomocą końcówki stolika C18 i wysuszyć je za pomocą wirowania próżniowego.Wykonaj eksperymenty LC-MS/MS na czułym spektrometrze mas sprzężonym z nanoprzepływowym systemem LC. Kolumna jest ustawiona zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i utrzymywana w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Używaj spektrometru mas w trybie akwizycji zależnej od danych.Zbieraj widma masowe MS1 w wysokiej rozdzielczości z automatycznym ustawieniem celu o kontrolowanym wzmocnieniu 4E5 i maksymalnym czasem wtrysku wynoszącym 50 milisekund. Przeprowadzić analizę spektrometrii mas w najbardziej intensywnym pierwszym trybie, stosując metodę maksymalnej prędkości z całkowitym czasem cyklu wynoszącym trzy sekundy. Następnie wykonaj drugą rundę analizy DDA MS w najmniej intensywnym pierwszym trybie, co zapewni optymalne wykrywanie peptydów o niskiej liczebności.Przefiltruj jony prekursorowe zgodnie z ich stanami naładowania i przypisania pików monoizotopowych. I wykluczaj wcześniej przesłuchiwane prekursory dynamicznie przez 60 sekund. Wyizolować prekursory peptydów za pomocą kwadrupolowego filtra masowego ustawionego na szerokość 1,6 Thomsona.Następnie zbierz widma MS2 w pułapce jonowej przy automatycznej kontroli wzmocnienia 7E3 z maksymalnym czasem wtrysku 50 milisekund i energią zderzenia HCD wynoszącą 30%Analizuj surowe pliki spektrometrii mas za pomocą odpowiedniej wyszukiwarki, takiej jak bezpłatny pakiet oprogramowania MaxQuant oparty na wyszukiwarce Andromeda. Otwórz program MaxQuant i wybierz odpowiednie pliki danych pierwotnych. Ustaw liczbę procesorów i kliknij zakładkę parametrów specyficznych dla grupy.Wybierz trawienie i pozwól na trzy pominięte rozszczepienia. Następnie wybieramy modyfikacje i dodajemy diGly do modyfikacji zmiennych. Wybierz zakładkę parametrów globalnych i dodaj poprawną bazę danych sekwencji białek.Pozostaw inne ustawienia jako domyślne i naciśnij start, aby przeprowadzić wyszukiwanie w bazie danych. W przypadku analizy ilościowej plików eksperymentu SILAC ustaw liczebność na dwa i wybierz etykiety ciężkich aminokwasów. Po zakończeniu wyszukiwania zaimportuj pliki tekstowe do Perseusa.Protokół ten wykorzystano do identyfikacji miejsc ubikwitynacji w białkach z hodowanych komórek i materiału in vivo poprzez wykrywanie peptydów diGly za pomocą nanoflow LC-MS/MS. Wprowadzono kilka ulepszeń do istniejącego protokołu, co zaowocowało większą liczbą wykrytych peptydów diGly. Przed immunoprecypitacją przeprowadzono surowe frakcjonowanie na trzy frakcje.Jedna z frakcji zawiera własny zmodyfikowany przez ubikwitynę peptyd tryptyczny diGly K48, który charakteryzuje się szerokim pikiem w chromatogramie LC. Co więcej, reżim fragmentacji peptydów został dostosowany tak, aby połączyć przebiegi LC-MS z najwyższymi reżimami pierwszej i najniższej pierwszej fragmentacji w procedurze analizy danych, w wyniku czego uzyskano ponad 4 000 dodatkowych unikalnych peptydów diGly. Ponad 23 000 peptydów diGly można rutynowo zidentyfikować z pojedynczej próbki komórek HeLa traktowanych inhibitorem proteasomu.Spośród wszystkich peptydów diGly zidentyfikowanych w trzech badaniach przesiewowych replik biologicznych, ponad 9 000 było obecnych we wszystkich trzech, podczas gdy ponad 17 000 było obecnych w co najmniej dwóch z trzech powtórzeń. Liczba identyfikacji peptydów jest w dużym stopniu uzależniona od ilości materiału wejściowego. W zależności od materiału wyjściowego można spodziewać się przybliżonej liczby zidentyfikowanych peptydów diGly, ale liczby te są jedynie szacunkowe i będą również zależeć od rodzaju użytego spektrometru masowego.Podczas realizacji tego protokołu z pewnością korzystne byłoby wcześniejsze doświadczenie z metodami proteomicznymi opartymi na spektrometrii mas oraz obsługą i analizą niewielkich ilości próbek. Oprogramowanie MaxQuant można zastąpić dowolnym innym algorytmem przeszukiwania baz danych. Można również użyć innego typu spektrometru masowego.Wyniki w zakresie identyfikacji peptydów mogą się nieznacznie różnić, ale jest to typowe dla każdego testu proteomicznego opartego na spektrometrii mas. Ubikwityna jest ważna w postępie degradacji białek, w której pośredniczy, ale odgrywa również rolę w wielu innych procesach zachodzących w komórce. Głębsza wiedza na temat ubikwityny jako modyfikacji potranslacyjnej jest kluczowa dla lepszego zrozumienia jej funkcji.

detection-protein-ubiquitination-sites-peptide-enrichment-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ubikwitynacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Mutacje genów zaangażowanych w tę modyfikację są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych in vivo oraz w probówkach in vitro.

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

W tym filmie pokazujemy immunologiczne wytrącanie fosfopeptydów z mieszaniny peptydów na podstawie przeciwciał. Wzbogacone fosfopeptydy są zagęszczane próżniowo i przechowywane do dalszej analizy.

Wzbogacanie fosfopeptydów: technika immunoprecypitacji oparta na przeciwciałach w celu oddzielenia specyficznych fosforylowanych peptydów od złożonych mieszanin peptydowych

Ten film opisuje metodę ekstrakcji i oczyszczania ubikwitynylowanych peptydów zawierających pozostałości peptydów di-glicyny ze złożonej mieszaniny peptydów. Przedstawiona metoda może pomóc w identyfikacji pierwotnych miejsc ubikwitynacji w białku.

Ekstrakcja peptydów ubikwitynylowanych na podstawie powinowactwa immunologicznego: technika selektywnej ekstrakcji peptydów oznaczonych ubikwityną z oczyszczonych frakcji peptydowych

Ten protokół opisuje procedurę ekstrakcji i wzbogacania fosfopeptydów z linii komórkowych lub tkanek raka prostaty w celu analizy fosfoproteomu za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Wzbogacanie fosfopeptydem w połączeniu z bezznacznikową ilościową spektrometrią mas w celu zbadania fosfoproteomu w raku prostaty

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Ta metoda opisuje ocenę globalnych zmian w topologii łańcucha ubikwityny. Ocena jest przeprowadzana poprzez zastosowanie ukierunkowanego podejścia proteomicznego opartego na spektrometrii mas.

Analiza łańcucha ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji

Ubikwitylacja CENP-A jest ważnym wymogiem dla depozycji CENP-A w centromerze, dziedziczonym przez dimeryzację między podziałami komórkowymi i nieodzownym dla żywotności komórki. Tutaj opisujemy analizę spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji białka CENP-A (EYFP-CENP-A) znakowanego EYFP.

Analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji CENP-A znakowanego EYFP (EYFP-CENP-A)

Udostępniamy szczegółowy protokół testu ubikwitylacji specyficznego substratu i ligazy ubikwityny E3 w komórkach ssaków. HEK293T linie komórkowe wykorzystano do nadekspresji białek, poliubikwitylowany substrat oczyszczono z lizatów komórkowych metodą immunoprecypitacji i rozdzielono w SDS-PAGE. Do wizualizacji tej modyfikacji potranslacyjnej wykorzystano immunoblotting.

Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Protokół opisuje krok po kroku metodę oczyszczania ubikwitynowanych białek z komórek ssaków na przykładzie białka supresorowego p53. Ubikwitynowane białka p53 oczyszczono z komórek w rygorystycznych warunkach niedenaturacji i denaturacji.

Oczyszczanie ubikwitynowanych białek p53 z komórek ssaków

Ubikwitynacja jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych w komórkach ssaków oraz porównujemy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji. Nadekspresja białek w HEK293T komórkach została wywołana przejściową transfekcją, a białka ubikwitynowane wykryto analizą western blota.

Porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem SMAD2/SMURF2 jako modelu

Poznaj metodę wzbogacania peptydów diGly i spektrometrii masowej do analizy ubikwitynowanych białek. Technika ta zapewnia głębsze pokrycie ubikwitynomu i większą liczbę identyfikacji w porównaniu do dotychczasowych podejść.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów