Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Potranslacyjna modyfikacja białek przez małe białko ubikwitynę bierze udział w wielu zdarzeniach w komórce. Niniejsze badanie stanowi oryginalne uzupełnienie zestawu narzędzi do analizy ubikwitynacji białek. Używamy technik wzbogacania i spektrometrii mas, aby odkryć głęboki ubikwitinom.

Wprowadziliśmy kilka ulepszeń w analizie peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek. Obejmują one frakcjonowanie surowych peptydów przed wzbogaceniem oraz zastosowanie bardziej zaawansowanych ustawień fragmentacji peptydów w Orbitrap. W sumie skutkuje to większym pokryciem wszechobecnościnem.

Kilka aspektów protokołu trudno opisać słowami. Wizualizacja niektórych kluczowych kroków jest niezbędna, aby móc powtórzyć te analizy przez różnych operatorów w innym laboratorium. Procedura zostanie zademonstrowana przez Karela Bezstarosti, który jest starszym technikiem w moim laboratorium.

Zacznij od przygotowania hodowanych komórek lub tkanki mózgowej myszy do eksperymentu. Jeśli pracujesz z komórkami, zlizuj osad komórkowy z jednej 150-centymetrowej kwadratowej płytki hodowlanej w dwóch mililitrach lodowatego, 50-milimolowego Tris HCL z 0,5% deoksycholanem sodu. Gotuj lizat w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie poddawaj go sonikacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. W przypadku stosowania tkanki mózgowej myszy in vivo, należy ją poddać lizie w lodowatym buforze zawierającym 100 milimolowy Tris HCL, 12-milimolowy deoksycholan sodu i 12-milimolowy N-lauroilosarkozynian sodu. Sonikuj lizat przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie gotuj przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Następnie określ ilościowo całkowitą ilość białka za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA o absorpcji kalorymetrycznej, który powinien wynosić co najmniej kilka miligramów, aby zapewnić skuteczną immunoprecypitację peptydu diGly. W eksperymentach SILAC należy wymieszać lekkie i ciężkie znakowane białka w stosunku jeden do jednego w oparciu o całkowitą ilość białka.

Zredukuj wszystkie białka za pomocą pięciu milimolowych DTT przez 30 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza. A następnie alkiluj je 10-milimolowym jodoacetamidem przez 15 minut w ciemności. Następnie wytrawianie białek za pomocą Lys-C przez cztery godziny.

I trawienie trypsyny przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza lub w temperaturze pokojowej. Następnego dnia podziel próbkę na dwie dwumililitrowe probówki Eppendorfa i dodaj TFA do strawionej próbki do końcowego stężenia 0,5%Odwiruj ją w temperaturze 10 000 razy G przez 10 minut, aby wytrącić i usunąć cały detergent. Zebrać peptyd zawierający supernatant do późniejszego frakcjonowania.

Do frakcjonowania peptydów tryptycznych należy użyć chromatografii C18 z odwróconymi fazami o wysokim pH. Przygotuj pusty sześciomililitrowy wkład kolumnowy wypełniony 0,5 grama materiału fazy stacjonarnej na około 10 miligramów trawienia białka. Załaduj peptydy na przygotowaną kolumnę i przemyj ją około 10 objętościami 0,1% TFA, a następnie 10 objętościami wody.

Eluować peptydy na trzy frakcje, używając 10 objętości kolumn 10-milimolowego mrówczanu amonu z odpowiednio siedmioma, 13,5 i 50% acetonitrylem. Następnie litholyzuj wszystkie frakcje. Jedna partia przeciwciał przeciwko motywowi resztkowemu ubikwityny sprzężonej z białkiem Zawiesina kulki agarozy jest dzielona na sześć równych frakcji.

Rozpuść trzy frakcje peptydowe zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i odwiruj szczątki. Dodać supernatanty trzech frakcji do zawiesiny perełek, pozostawiając pozostałe trzy frakcje na lodzie. I inkubuj je przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza na jednostce rotatora.

Następnie odkręć koraliki. Przenieść supernatant do świeżej partii kulek. I powtórzyć inkubację z pozostałymi trzema frakcjami gnojowicy perełek.

Przechowuj supernatanty do późniejszej globalnej analizy proteomu. I przenieś kulki na końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów wyposażone we wtyczkę filtra GFF. Umieść końcówki w 1,5-mililitrowych probówkach wyposażonych w adapter końcówki wirówki i umyj koraliki trzykrotnie 200 mikrolitrami lodowatego buforu IAP, a następnie trzykrotnie przepłucz lodowatą oczyszczoną wodą.

Wiruj kolumny z prędkością 200 razy G przez dwie minuty między praniami, uważając, aby kolumna nie wyschła. Po ostatnim płukaniu wymyj peptydy w dwóch cyklach po 50 mikrolitrach 0,15% TFA. Odsolić peptydy za pomocą końcówki stolika C18 i wysuszyć je za pomocą wirowania próżniowego.

Wykonaj eksperymenty LC-MS/MS na czułym spektrometrze mas sprzężonym z nanoprzepływowym systemem LC. Kolumna jest ustawiona zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i utrzymywana w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Używaj spektrometru mas w trybie akwizycji zależnej od danych.

Zbieraj widma masowe MS1 w wysokiej rozdzielczości z automatycznym ustawieniem celu o kontrolowanym wzmocnieniu 4E5 i maksymalnym czasem wtrysku wynoszącym 50 milisekund. Przeprowadzić analizę spektrometrii mas w najbardziej intensywnym pierwszym trybie, stosując metodę maksymalnej prędkości z całkowitym czasem cyklu wynoszącym trzy sekundy. Następnie wykonaj drugą rundę analizy DDA MS w najmniej intensywnym pierwszym trybie, co zapewni optymalne wykrywanie peptydów o niskiej liczebności.

Przefiltruj jony prekursorowe zgodnie z ich stanami naładowania i przypisania pików monoizotopowych. I wykluczaj wcześniej przesłuchiwane prekursory dynamicznie przez 60 sekund. Wyizolować prekursory peptydów za pomocą kwadrupolowego filtra masowego ustawionego na szerokość 1,6 Thomsona.

Następnie zbierz widma MS2 w pułapce jonowej przy automatycznej kontroli wzmocnienia 7E3 z maksymalnym czasem wtrysku 50 milisekund i energią zderzenia HCD wynoszącą 30%Analizuj surowe pliki spektrometrii mas za pomocą odpowiedniej wyszukiwarki, takiej jak bezpłatny pakiet oprogramowania MaxQuant oparty na wyszukiwarce Andromeda. Otwórz program MaxQuant i wybierz odpowiednie pliki danych pierwotnych. Ustaw liczbę procesorów i kliknij zakładkę parametrów specyficznych dla grupy.

Wybierz trawienie i pozwól na trzy pominięte rozszczepienia. Następnie wybieramy modyfikacje i dodajemy diGly do modyfikacji zmiennych. Wybierz zakładkę parametrów globalnych i dodaj poprawną bazę danych sekwencji białek.

Pozostaw inne ustawienia jako domyślne i naciśnij start, aby przeprowadzić wyszukiwanie w bazie danych. W przypadku analizy ilościowej plików eksperymentu SILAC ustaw liczebność na dwa i wybierz etykiety ciężkich aminokwasów. Po zakończeniu wyszukiwania zaimportuj pliki tekstowe do Perseusa.

Protokół ten wykorzystano do identyfikacji miejsc ubikwitynacji w białkach z hodowanych komórek i materiału in vivo poprzez wykrywanie peptydów diGly za pomocą nanoflow LC-MS/MS. Wprowadzono kilka ulepszeń do istniejącego protokołu, co zaowocowało większą liczbą wykrytych peptydów diGly. Przed immunoprecypitacją przeprowadzono surowe frakcjonowanie na trzy frakcje.

Jedna z frakcji zawiera własny zmodyfikowany przez ubikwitynę peptyd tryptyczny diGly K48, który charakteryzuje się szerokim pikiem w chromatogramie LC. Co więcej, reżim fragmentacji peptydów został dostosowany tak, aby połączyć przebiegi LC-MS z najwyższymi reżimami pierwszej i najniższej pierwszej fragmentacji w procedurze analizy danych, w wyniku czego uzyskano ponad 4 000 dodatkowych unikalnych peptydów diGly. Ponad 23 000 peptydów diGly można rutynowo zidentyfikować z pojedynczej próbki komórek HeLa traktowanych inhibitorem proteasomu.

Spośród wszystkich peptydów diGly zidentyfikowanych w trzech badaniach przesiewowych replik biologicznych, ponad 9 000 było obecnych we wszystkich trzech, podczas gdy ponad 17 000 było obecnych w co najmniej dwóch z trzech powtórzeń. Liczba identyfikacji peptydów jest w dużym stopniu uzależniona od ilości materiału wejściowego. W zależności od materiału wyjściowego można spodziewać się przybliżonej liczby zidentyfikowanych peptydów diGly, ale liczby te są jedynie szacunkowe i będą również zależeć od rodzaju użytego spektrometru masowego.

Podczas realizacji tego protokołu z pewnością korzystne byłoby wcześniejsze doświadczenie z metodami proteomicznymi opartymi na spektrometrii mas oraz obsługą i analizą niewielkich ilości próbek. Oprogramowanie MaxQuant można zastąpić dowolnym innym algorytmem przeszukiwania baz danych. Można również użyć innego typu spektrometru masowego.

Wyniki w zakresie identyfikacji peptydów mogą się nieznacznie różnić, ale jest to typowe dla każdego testu proteomicznego opartego na spektrometrii mas. Ubikwityna jest ważna w postępie degradacji białek, w której pośredniczy, ale odgrywa również rolę w wielu innych procesach zachodzących w komórce. Głębsza wiedza na temat ubikwityny jako modyfikacji potranslacyjnej jest kluczowa dla lepszego zrozumienia jej funkcji.