Name: Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Naucz się edycji genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas9. Protokół umożliwia tworzenie linii knock-out i knock-in w ludzkim genomie. Metoda jest prosta i wydajna, dostępna także dla początkujących badaczy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.H.T. jest wspierany przez grant Biura Wspólnej Rady Agencji ds. Nauki, Technologii i Badań (1431AFG103), grant Narodowej Rady Badań Medycznych (OFIRG/0017/2016), granty National Research Foundation (NRF2013-THE001-046 i NRF2013-THE001-093), grant Ministerstwa Edukacji Tier 1 (RG50/17 (S)), grant na rozpoczęcie działalności z Uniwersytetu Technologicznego Nanyang oraz fundusze na konkurs International Genetically Engineering Machine (iGEM) od Nanyang Technological Uniwersytet.

<ol><li>Epinat, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+engineered+meganuclease+induces+homologous+recombination+in+yeast+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).</li>
<li>Arnould, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+I-CreI+derivatives+cleaving+sequences+from+the+human+XPC+gene+can+induce+highly+efficient+gene+correction+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).</li>
<li>Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganucleases+can+restore+the+reading+frame+of+a+mutated+dystrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin.</a> Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).</li>
<li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+sequence-specific+TAL+effectors+for+modulating+mammalian+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).</li>
<li>Boch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+code+of+DNA+binding+specificity+of+TAL-type+III+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors.</a> Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).</li>
<li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501(2009).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+Cas9+in+complex+with+guide+RNA+and+target+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA.</a> Cell. 156 (5), 935-949 (2014).</li>
<li>Yamano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+Cpf1+in+Complex+with+Guide+RNA+and+Target+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA.</a> Cell. 165 (4), 949-962 (2016).</li>
<li>Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference+directs+strand+specific+spacer+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition.</a> PLoS One. 7 (4), e35888(2012).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li>
<li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadening+the+targeting+range+of+Staphylococcus+aureus+CRISPR-Cas9+by+modifying+PAM+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition.</a> Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> Elife. 2, e00471(2013).</li>
<li>Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+engineering+in+human+cells+with+the+Cas9+RNA-guided+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+CRISPR-Cas+systems+reveals+design+principles+for+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells.</a> Genome Biology. 19 (1), 62(2018).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Kim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+with+a+small+Cas9+orthologue+derived+from+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni.</a> Nature Communications. 8, 14500(2017).</li>
<li>Edraki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Compact%2C+High-Accuracy+Cas9+with+a+Dinucleotide+PAM+for+In+Vivo+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing.</a> Molecular Cell. , (2018).</li>
<li>Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+PAM+specificity+of+a+highly+similar+SpCas9+ortholog%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li>
<li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+thermophilus+CRISPR-Cas9+Systems+Enable+Specific+Editing+of+the+Human+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Therapy%22%5BJournal%5D)">Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome.</a> Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).</li>
<li>Esvelt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+Cas9+proteins+for+RNA-guided+gene+regulation+and+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing.</a> Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).</li>
<li>Boratyn, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%3A+a+more+efficient+report+with+usability+improvements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">BLAST: a more efficient report with usability improvements.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP%3A+a+CRISPR%2FCas9+and+TALEN+web+tool+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).</li>
<li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-CRISP%3A+fast+CRISPR+target+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148(2016).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-homologous+DNA+increases+gene+disruption+efficiency+by+altering+DNA+repair+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes.</a> Nature Communications. 7, 12463(2016).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Zhang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+precise+knockin+with+a+double+cut+HDR+donor+after+CRISPR%2FCas9-mediated+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage.</a> Genome Biology. 18 (1), 35(2017).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cpf1+mediates+efficient+homology-directed+repair+and+temperature-controlled+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing.</a> Nature Communications. 8 (1), 2024(2017).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766(2014).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+scarless+human+stem+cell+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Optimization of scarless human stem cell genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

System CRISPR-Cas to potężna, rewolucyjna technologia inżynierii genomów i transkryptomów roślin i zwierząt. Stwierdzono, że wiele gatunków bakterii zawiera systemy CRISPR-Cas, które mogą być potencjalnie przystosowane do celów inżynierii genomu i transkryptomu44. Chociaż endonukleaza Cas9 ze Streptococcus pyogenes (SpCas9) była pierwszym enzymem, który został z powodzeniem zastosowany w komórkach ludzkich 21,22,23,24, wykazano również, że enzymy z innych gatunków bakterii, w tym te pokaz...

Zdolność do edycji genomu każdego organizmu żywego znajduje wiele zastosowań biomedycznych i biotechnologicznych, takich jak korekcja mutacji wywołujących choroby, tworzenie precyzyjnych modeli komórkowych do badań nad chorobami czy generowanie upraw rolniczych o pożądanych cechach. Od początku stulecia opracowano różne technologie inżynierii genomu w komórkach ssaków, w tym meganukleazy1,2,3, nukleazy z palcem cynkowym4,5 oraz nukleazy z efektorami podobnymi do aktywatorów transkrypcji (TALENs)6,7,8,9. Jednakże te wcześniejsze technologie są albo trudne do zaprogramowania, albo żmudne w składaniu, co hamuje ich powszechne zastosowanie w badaniach naukowych i przemyśle.
W ostatnich latach system CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) – Cas (CRISPR-associated) wyłonił się jako potężna, nowa technologia inżynierii genomu10,11. Pierwotnie będący adaptacyjnym układem odpornościowym bakterii, został z sukcesem wdrożony do modyfikacji genomu roślin i zwierząt, w tym ludzi. Głównym powodem, dla którego CRISPR-Cas zyskał tak dużą popularność w tak krótkim czasie, jest fakt, że element doprowadzający kluczową endonukleazę Cas, taką jak Cas9 lub Cas12a (znaną również jako Cpf1), w odpowiednie miejsce w genomie, stanowi po prostu krótki fragment chimerycznego pojedynczego przewodniego RNA (sgRNA), który jest łatwy do zaprojektowania i tani w syntezie. Po zwerbowaniu do miejsca docelowego, enzym Cas działa jak molekularne nożyczki i przecina związane DNA za pomocą swoich domen RuvC, HNH lub Nuc12,13,14. Powstałe w ten sposób pęknięcie dwuniciowe (DSB) jest następnie naprawiane przez komórki za pośrednictwem drogi niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) lub naprawy kierowanej homologią (HDR). W przypadku braku matrycy naprawczej, DSB jest naprawiane przez podatną na błędy drogę NHEJ, co może prowadzić do pseudolosowych insercji lub delecji nukleotydów (indeli) w miejscu cięcia, potencjalnie powodując mutacje przesunięcia ramki odczytu w genach kodujących białka. Jednak w obecności matrycy donorowej zawierającej pożądane zmiany w DNA, DSB jest naprawiane przez wysokowierną drogę HDR. Do powszechnie stosowanych typów matryc donorowych należą jednoniciowe oligonukleotydy (ssODN) oraz plazmidy. Te pierwsze są zazwyczaj stosowane, gdy zamierzone zmiany w DNA są niewielkie (na przykład zmiana pojedynczej pary zasad), natomiast te drugie są zazwyczaj wykorzystywane, gdy chce się wprowadzić stosunkowo długą sekwencję (na przykład sekwencję kodującą zielone białko fluorescencyjne lub GFP) do locus docelowego.
Aktywność endonukleazy białka Cas wymaga obecności motywu PAM (protospacer adjacent motif) w miejscu docelowym15. PAM dla Cas9 znajduje się na końcu 3’ protospacera, natomiast PAM dla Cas12a (zwanego również Cpf1) znajduje się na końcu 5’16. Kompleks Cas-przewodzące RNA nie jest w stanie wprowadzić DSB, jeśli PAM jest nieobecny17. Zatem PAM nakłada ograniczenia na lokalizacje genomiczne, w których dana nukleaza Cas jest w stanie dokonać cięcia. Na szczęście nukleazy Cas z różnych gatunków bakterii wykazują zazwyczaj różne wymagania dotyczące PAM. Dzięki zintegrowaniu różnych systemów CRISPR-Cas w naszym zestawie narzędzi inżynieryjnych możemy rozszerzyć zakres miejsc w genomie, które mogą być celem modyfikacji. Co więcej, naturalny enzym Cas może zostać zmodyfikowany lub ewoluować tak, aby rozpoznawał alternatywne sekwencje PAM, co dodatkowo poszerza zakres celów genomicznych dostępnych do manipulacji18,19,20.
Choć do celów inżynierii genomu dostępnych jest wiele systemów CRISPR-Cas, większość użytkowników tej technologii polegała głównie na nukleazie Cas9 z Streptococcus pyogenes (SpCas9) z kilku powodów. Po pierwsze, wymaga ona stosunkowo prostej sekwencji PAM NGG, w przeciwieństwie do wielu innych białek Cas, które mogą przecinać DNA tylko w obecności bardziej złożonych PAM. Po drugie, jest to pierwsza endonukleaza Cas, która została z sukcesem zastosowana w komórkach ludzkich21,22,23,24. Po trzecie, SpCas9 jest do tej pory najlepiej scharakteryzowanym enzymem. Gdyby badacz chciał użyć innej nukleazy Cas, często nie byłby pewien, jak najlepiej zaprojektować eksperyment i jak inne enzymy będą funkcjonować w różnych kontekstach biologicznych w porównaniu do SpCas9.
Aby wyjaśnić względną wydajność różnych systemów CRISPR-Cas, przeprowadziliśmy niedawno systematyczne porównanie pięciu endonukleaz Cas – SpCas9, enzymu Cas9 z Staphylococcus aureus (SaCas9), enzymu Cas9 z Neisseria meningitidis (NmCas9), enzymu Cas12a z Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a) oraz enzymu Cas12a z bakterii Lachnospiraceae ND2006 (LbCas12a)25. Dla zapewnienia rzetelnego porównania, oceniliśmy poszczególne nukleazy Cas, wykorzystując ten sam zestaw miejsc docelowych oraz inne identyczne warunki eksperymentalne. Badanie to określiło również parametry projektowe dla każdego systemu CRISPR-Cas, które mogą służyć jako przydatny punkt odniesienia dla użytkowników tej technologii. W niniejszym opracowaniu, aby lepiej umożliwić badaczom wykorzystanie systemu CRISPR-Cas, przedstawiamy protokół krok po kroku dla optymalnej edycji genomu z użyciem różnych enzymów Cas9 i Cas12a (patrz Rycina 1). Protokół ten zawiera nie tylko szczegóły eksperymentalne, ale także istotne uwagi projektowe, mające na celu zmaksymalizowanie prawdopodobieństwa sukcesu edycji genomu w komórkach ssaków.
<img alt="Schemat procesu edycji genów CRISPR; projektowanie sgRNA, klonowanie, transdukcja komórek, przesiewanie klonów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd schematu postępowania w celu generowania zmodyfikowanych linii komórkowych człowieka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Kinaza polinukleotydowa T4 (PNK)</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna krewetek (rSAP)</td><td>NEB</td><td>M0371</td><td></td></tr><tr><td>Bufor tris-octano-EDTA (TAE), 50X</td><td>1st Base</td><td>BUF-3000-50X4L</td><td>Rozcieńczyć do 1X przed użyciem. Roztwór 1X zawiera 40 mM Tris, 20 mM kwasu octowego i 1 mM EDTA.</td></tr><tr><td>Bufor Tris-EDTA (TE), 10X</td><td>1st Base</td><td>BUF-3020-10X4L</td><td>Rozcieńczyć do 1X przed użyciem. Roztwór 1X zawiera 10 mM Tris (pH 8,0) i 1 mM EDTA.&nbsp;</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>NEB</td><td>R0539</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>NEB</td><td>R0580</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>400 000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiego ligowania</td><td>NEB</td><td>M2200</td><td>Alternatywa dla ligazy DNA T4.</td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiej ligacji DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1423</td><td>Alternatywa dla ligazy DNA T4.</td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania Zero Blunt TOPO PCR</td><td>Thermo Scientific</td><td>451245</td><td>Roztwór soli jest dostarczany z wektorem TOPO w zestawie.</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td>Zestaw do montażu Gibsona.</td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Chemicznie kompetentny bulion E.Coli</td><td>Thermo Scientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox), proszek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>Rozpuszcza w ddH20 i autoklaw przed użyciem</td></tr> LB <tr><td>Bulion z agarem (Lennox), proszek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897</td><td>Rozpuszcza w ddH20 i autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>SOC</td><td></td> - <td>-</td><td>2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glukozy w 1 l bulionu LB</td></tr><tr><td>Ampicylina (sód), USP</td><td>Grade Gold Biotechnology</td><td>A-301</td><td></td></tr><tr><td>REDiant 2X PCR Mastermix</td><td>1st Base</td><td>BIO-5185</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>1st Base</td><td>BIO-1000</td><td></td></tr><tr><td>T7 Endonukleaza I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw miniprep do ekstrakcji plazmidowego DNA</td><td>Favorgen</td><td>FAPDE 300</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle (DMEM), hyklon o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>SH30081,01</td><td>4,5 g / l glukozy, bez L-glutaminy, HEPES i pirogronianu sodu</td></tr><tr><td>L-glutamina, 200mM</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, 10, 000U/ml</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA, 1X</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Bydło płodowe Serum</td><td>Hyclone</td><td>SV30160</td><td>FBS jest inaktywowane termicznie przed użyciem w temperaturze 56 oC przez 30 minut</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1X</td><td>odczynnik</td> do transfekcji Gibco <td>20012</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME</td><td>Polyplus Transfection</td><td>114-75</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do ekstrakcji DNA QuickExtract, 1,0</td><td>Epicentrum</td><td>LUCG-QE09050</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do genomowego DNA ISOLATE II</td><td>Bioline</td><td>BIO-52067</td><td>Alternatywa dla QuickExtract</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity DNA Polymeraza</td><td>NEB</td><td>M0491</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynukleotyd (dNTP) Mieszanina roztworów</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>6X Barwnik ładujący DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 7,6) 0,03% błękitu bromofenolowego, 0,03% cyjanolu ksylenu FF, 60% glicerolu, 60 mM</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy EDTA, Set3</td><td>Merck</td><td></td><td></td>539134</tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa, 0,2 i mikro; m</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris-glycine-SDS, 10X</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>Rozcieńczyć do 1X przed użyciem. Roztwór 1x zawiera 25 mM Tris, 192 mM glicyny i 0,1% SDS.</td></tr><tr><td>Bufor tris-glicynowy, 10X</td><td>1st base</td><td>BUF-2020</td><td>Rozcieńczyć do 1X przed użyciem. Roztwór 1x zawiera 25 mM Tris i 192 mM glicyny.</td></tr><tr><td>Ponceau S roztwór</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>TBS, 20X</td><td>1st base</td><td>BUF-3030</td><td>Rozcieńczyć do 1X przed użyciem. 1x roztwór zawiera 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 150 mM NaCl.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko do testu immunologicznego</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31149-75</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright Sirius-femtogram HRP</td><td>Advansta</td><td>K12043</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało dla &beta;-aktyny (C4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td>Numer partii: C0916</td></tr><tr><td>System MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL System obrazowania komórek</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid CRISPR: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>System pojedynczego wektora: gRNA ulega ekspresji z tego samego plazmidu.</td></tr><tr><td>Plazmid CRISPR: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td><td>Addgene</td><td>61591</td><td>System pojedynczego wektora: gRNA ulega ekspresji z tego samego plazmidu.</td></tr><tr><td>Plazmid CRISPR: xCas9 3.7</td><td>Addgene</td><td>108379</td><td>System podwójnego wektora: gRNA ulega ekspresji z innego plazmidu.</td></tr><tr><td>Plazmid CRISPR: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td>System pojedynczych wektorów: gRNA ulega ekspresji z tego samego plazmidu.</td></tr><tr><td>Plazmid CRISPR: hCas9</td><td>Addgene</td><td>41815</td><td>System podwójnego wektora: gRNA ulega ekspresji z innego plazmidu.</td></tr><tr><td>Plazmid CRISPR: eSpCas9(1.1)</td><td>Addgene</td><td>71814</td><td>System pojedynczego wektora: gRNA ulega ekspresji z tego samego plazmidu.</td></tr><tr><td>Plazmid CRISPR: VP12 (SpCas9-HF1)</td><td>Addgene</td><td>72247</td><td>System dwuwektorowy: gRNA ulega ekspresji z innego plazmidu.</td></tr></tbody></table>

edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu crispr-cas

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

System CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) funkcjonuje naturalnie w bakteryjnej odporności adaptacyjnej, ale został z powodzeniem wykorzystany do inżynierii genomu w wielu różnych organizmach żywych. Najczęściej endonukleaza 9 (Cas9) lub Cas12a związana z CRISPR typu dzikiego jest używana do rozszczepiania określonych miejsc w genomie, po czym dwuniciowe pęknięcie DNA jest naprawiane za pośrednictwem szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) lub szlaku naprawy kierowanej homologią (HDR) w zależności od tego, czy szablon dawcy jest odpowiednio nieobecny, czy obecny. Do tej pory wykazano, że systemy CRISPR pochodzące od różnych gatunków bakterii są zdolne do edycji genomu w komórkach ssaków. Jednak pomimo pozornej prostoty technologii, należy wziąć pod uwagę wiele parametrów projektowych, które często pozostawiają użytkowników w zakłopotaniu, jak najlepiej przeprowadzić eksperymenty z edycją genomu. W tym miejscu opisujemy kompletny przepływ pracy od projektu eksperymentalnego do identyfikacji klonów komórkowych, które zawierają pożądane modyfikacje DNA, w celu ułatwienia pomyślnego przeprowadzenia eksperymentów z edycją genomu w liniach komórkowych ssaków. Zwracamy uwagę na kluczowe kwestie, na które użytkownicy powinni zwrócić uwagę, w tym wybór systemu CRISPR, długość przekładki i projekt jednoniciowego szablonu dawcy oligodeoksynukleotydu (ssODN). Przewidujemy, że ten przepływ pracy będzie przydatny w badaniach nad nokautem genów, modelowaniu chorób lub generowaniu reporterowych linii komórkowych.

Aby przeprowadzić eksperyment edycji genomu, należy sklonować plazmid CRISPR wykazujący ekspresję sgRNA skierowanego do badanego locus. W pierwszej kolejności plazmid jest trawiony enzymem restrykcyjnym (zazwyczaj enzymem typu IIs) w celu jego linearyzacji. Zaleca się rozdzielenie produktu trawienia w 1% żelu agarozowym wraz z nietrawionym plazmidem, aby odróżnić trawienie całkowite od częściowego. Ponieważ nietrawione plazmidy są superzwinięte, mają one tendencję do szybszej migracji niż ich liniowe odpowiedniki (patrz ...

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Ten protokół wykorzystuje CRISPR-Cas9 do tworzenia linii knock-out lub knock-in. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta i wydajna do naśladowania, szczególnie dla początkujących badaczy. W przypadku pasażowania komórek należy potraktować komórki hodowane przez noc dwoma mililitrami 0,25% trypsyny EDTA na płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty.Gdy komórki podniosą się z dna płytki, zneutralizuj reakcję enzymatyczną za pomocą dwóch mililitrów pożywki do hodowli komórkowej i przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach świeżej pożywki do hodowli komórkowych w celu policzenia. Następnie wysiewaj 1,8 razy 10 do piątej komórki do jednego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w celu hodowli przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.W celu transfekcji komórek należy dodać odpowiednią objętość mieszanki do transfekcji zawierającej plazmid CRISPR o odpowiednim stężeniu do odpowiedniej objętości odczynnika do transfekcji, zgodnie z projektem doświadczalnym i instrukcjami producenta. Po inkubacji mieszanki transfekcyjnej w temperaturze pokojowej przez zalecany okres czasu, dodać roztwór do komórek w sposób kroplowy. Następnie delikatnie zakręć płytką, aby wymieszać i umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Pod koniec transfekcji dodaj 150 mikrolitrów trypsyny-EDTA, aby zdysocjować komórki, jak właśnie pokazano, i zbierz oderwane komórki przez odwirowanie. Zawiesić osad w 2% płodowej surowicy bydlęcej w PBS i przefiltrować komórki przez sitko o siatce 30 mikrometrów do pięciomililitrowego sortowania komórek aktywowanego fluorescencją lub probówki FACS. Następnie użyj nietransfekowanych komórek, aby ustawić bramkę kontroli ujemnej na cytometrze przepływowym i posortować transfekowane komórki zgodnie z markerem fluorescencyjnym na plazmidzie CRISPR używanym do transfekcji do probówki zawierającej 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowej.Po zebraniu wszystkich transfekowanych komórek, należy je osadzać przez odwirowanie z maksymalną prędkością i ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach pożywki do hodowli komórkowych. Wysiewaj 200 mikrolitrów komórek do jednego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i pozwól komórkom zregenerować się przez kilka dni w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pozostałe 100 mikrolitrów posortowanych komórek należy osadzać z maksymalną prędkością przez pięć minut i ekstrahować genomowe DNA z powstałej osadki zgodnie ze standardowymi protokołami ekstrakcji DNA.Następnie dodaj 10 mikrolitrów buforu reakcji łańcuchowej polimerazy, jeden mikrolitr mieszaniny deoksynukleotydów, 2,5 mikrolitra zdefiniowanego przez użytkownika startera odwrotnego, 0,5 mikrolitra polimerazy DNA, dwa do pięciu mikrolitrów wyekstrahowanej matrycy genomowego DNA i wystarczającą ilość podwójnie destylowanej wody, aby doprowadzić reakcję do końcowej objętości 50 mikrolitrów. Uruchom mieszaninę na termocyklerze i rozpuść reakcję na 2% żelu agarozowym przy użyciu buforu 1X TAE zgodnie ze standardowymi protokołami. Użyj czystego, ostrego skalpela, aby wyciąć produkt reakcji łańcucha polimerazy i oczyścić DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.Zmierzyć stężenie produktu za pomocą spektrofotometru o absorbancji 260 nanometrów. Przygotować mieszaninę testową zawierającą 200 nanogramów wyizolowanego DNA, dwa mikrolitry buforu reakcyjnego endonukleazy T7 I i wystarczającą ilość podwójnie destylowanej wody, aby doprowadzić końcową objętość mieszaniny do 19 mikrolitrów. Ponownie wyżarzyć produkt reakcji łańcuchowej polimerazy w termocyklerze przy wskazanych parametrach i wymieszać pięć jednostek endonukleazy T7 I z ponownie wyżarzonym produktem przez 50 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji rozpuść strawione DNA na 2,5% żelu agarozowym za pomocą buforu 1X TAE i zobrazuj żel w odpowiednim systemie obrazowania żelu. Otwórz obraz żelu w ImageJ i narysuj prostokątne pudełko wokół opaski jak najbliżej jej granicy. Kliknij przycisk Analizuj i ustaw pomiary, potwierdzając, że opcje obszaru, średniej wartości szarości i zintegrowanej gęstości są zaznaczone.Kliknij przycisk OK i wybierz opcję Analizuj i mierz. Średnia, czyli wartość gęstości natężenia surowego, wskazuje na natężenie pasma. Kiedy komórki transfekowane hodowlą zaczną się zlewać, odłącz je za pomocą trypsyny-EDTA, jak pokazano, i rozsiew komórki z rzadka w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej, aby zapewnić wystarczającą ilość miejsca dla wzrostu poszczególnych kolonii przed powrotem komórek do inkubatora hodowli komórkowych.Kiedy kolonie zaczną się formować, użyj mikroskopu z czterokrotnym powiększeniem, aby wybrać poszczególne kolonie do przeniesienia do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki zawierającej 500 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych na studzienkę. Uważaj, aby końcówka nie dotykała otaczających kolonii, aby zapobiec mieszaniu się kolonii w poszczególnych studzienkach lub wybierać z obszaru o rzadkim wzroście kolonii. Po wybraniu wszystkich klonów umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, aż kultury zaczną się zlewać.Ponieważ niestrawione plazmidy są nadmiernie zwinięte, mają tendencję do szybszego biegania niż ich zlinearyzowane odpowiedniki. Aby ustalić, czy oligonukleotydy zostały pomyślnie sklonowane do szkieletu plazmidu CRISPR, przeprowadza się PCR kolonii, a dodatnie klony są inokulowane przed ekstrakcją plazmidów i wysłaniem do sekwencjonowania Sangera. Sygnał fluorescencyjny można łatwo zobrazować pod mikroskopem po pomyślnym dostarczeniu plazmidów, co pozwala na sortowanie transfekowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej.Test endonukleazy T7 I przeprowadza się w celu sprawdzenia wydajności rozszczepienia genomowego DNA, obliczonej na podstawie intensywności prążków obserwowanych na żelu agarozowym. Dodatkowo, jeśli eksperyment oparty na naprawie ukierunkowany na homologię ma na celu włączenie miejsca restrykcyjnego w locus docelowym, można przeprowadzić test polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego z odpowiednim enzymem restrykcyjnym. Aby dodatkowo zweryfikować, czy gen kodujący białko został pomyślnie dezaktywowany, można przeprowadzić Western blot, aby upewnić się, że nie ma docelowego białka.Sortowanie komórek po transfekcji eliminuje komórki bez wbudowanych plazmidów, zwiększając w ten sposób odsetek komórek przesiewanych na późniejszych etapach jako posiadające gen nokautujący lub wybijający. Dzięki opracowaniu tej techniki jesteśmy teraz w stanie wyprodukować linie komórkowe knock-out do badania funkcji genów oraz linie komórkowe knock-in do modelowania konkretnych chorób, aby zrozumieć ich mechanizm.

genome-editing-in-mammalian-cell-lines-using-crispr-cas

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Protokół opisuje metody edycji epigenomu opartej na CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) w ludzkich liniach komórkowych przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i nukleofekcji mRNA.

Edycja epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i dostarczania nukleofekcji mRNA

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Naucz się edycji genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas9. Protokół umożliwia tworzenie linii knock-out i knock-in w ludzkim genomie. Metoda jest prosta i wydajna, dostępna także dla początkujących badaczy.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Przeglądaj więcej filmów