Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Ten protokół wykorzystuje CRISPR-Cas9 do tworzenia linii knock-out lub knock-in. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta i wydajna do naśladowania, szczególnie dla początkujących badaczy. W przypadku pasażowania komórek należy potraktować komórki hodowane przez noc dwoma mililitrami 0,25% trypsyny EDTA na płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty.

Gdy komórki podniosą się z dna płytki, zneutralizuj reakcję enzymatyczną za pomocą dwóch mililitrów pożywki do hodowli komórkowej i przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach świeżej pożywki do hodowli komórkowych w celu policzenia. Następnie wysiewaj 1,8 razy 10 do piątej komórki do jednego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w celu hodowli przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

W celu transfekcji komórek należy dodać odpowiednią objętość mieszanki do transfekcji zawierającej plazmid CRISPR o odpowiednim stężeniu do odpowiedniej objętości odczynnika do transfekcji, zgodnie z projektem doświadczalnym i instrukcjami producenta. Po inkubacji mieszanki transfekcyjnej w temperaturze pokojowej przez zalecany okres czasu, dodać roztwór do komórek w sposób kroplowy. Następnie delikatnie zakręć płytką, aby wymieszać i umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Pod koniec transfekcji dodaj 150 mikrolitrów trypsyny-EDTA, aby zdysocjować komórki, jak właśnie pokazano, i zbierz oderwane komórki przez odwirowanie. Zawiesić osad w 2% płodowej surowicy bydlęcej w PBS i przefiltrować komórki przez sitko o siatce 30 mikrometrów do pięciomililitrowego sortowania komórek aktywowanego fluorescencją lub probówki FACS. Następnie użyj nietransfekowanych komórek, aby ustawić bramkę kontroli ujemnej na cytometrze przepływowym i posortować transfekowane komórki zgodnie z markerem fluorescencyjnym na plazmidzie CRISPR używanym do transfekcji do probówki zawierającej 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowej.

Po zebraniu wszystkich transfekowanych komórek, należy je osadzać przez odwirowanie z maksymalną prędkością i ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach pożywki do hodowli komórkowych. Wysiewaj 200 mikrolitrów komórek do jednego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i pozwól komórkom zregenerować się przez kilka dni w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pozostałe 100 mikrolitrów posortowanych komórek należy osadzać z maksymalną prędkością przez pięć minut i ekstrahować genomowe DNA z powstałej osadki zgodnie ze standardowymi protokołami ekstrakcji DNA.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów buforu reakcji łańcuchowej polimerazy, jeden mikrolitr mieszaniny deoksynukleotydów, 2,5 mikrolitra zdefiniowanego przez użytkownika startera odwrotnego, 0,5 mikrolitra polimerazy DNA, dwa do pięciu mikrolitrów wyekstrahowanej matrycy genomowego DNA i wystarczającą ilość podwójnie destylowanej wody, aby doprowadzić reakcję do końcowej objętości 50 mikrolitrów. Uruchom mieszaninę na termocyklerze i rozpuść reakcję na 2% żelu agarozowym przy użyciu buforu 1X TAE zgodnie ze standardowymi protokołami. Użyj czystego, ostrego skalpela, aby wyciąć produkt reakcji łańcucha polimerazy i oczyścić DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.

Zmierzyć stężenie produktu za pomocą spektrofotometru o absorbancji 260 nanometrów. Przygotować mieszaninę testową zawierającą 200 nanogramów wyizolowanego DNA, dwa mikrolitry buforu reakcyjnego endonukleazy T7 I i wystarczającą ilość podwójnie destylowanej wody, aby doprowadzić końcową objętość mieszaniny do 19 mikrolitrów. Ponownie wyżarzyć produkt reakcji łańcuchowej polimerazy w termocyklerze przy wskazanych parametrach i wymieszać pięć jednostek endonukleazy T7 I z ponownie wyżarzonym produktem przez 50 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji rozpuść strawione DNA na 2,5% żelu agarozowym za pomocą buforu 1X TAE i zobrazuj żel w odpowiednim systemie obrazowania żelu. Otwórz obraz żelu w ImageJ i narysuj prostokątne pudełko wokół opaski jak najbliżej jej granicy. Kliknij przycisk Analizuj i ustaw pomiary, potwierdzając, że opcje obszaru, średniej wartości szarości i zintegrowanej gęstości są zaznaczone.

Kliknij przycisk OK i wybierz opcję Analizuj i mierz. Średnia, czyli wartość gęstości natężenia surowego, wskazuje na natężenie pasma. Kiedy komórki transfekowane hodowlą zaczną się zlewać, odłącz je za pomocą trypsyny-EDTA, jak pokazano, i rozsiew komórki z rzadka w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej, aby zapewnić wystarczającą ilość miejsca dla wzrostu poszczególnych kolonii przed powrotem komórek do inkubatora hodowli komórkowych.

Kiedy kolonie zaczną się formować, użyj mikroskopu z czterokrotnym powiększeniem, aby wybrać poszczególne kolonie do przeniesienia do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki zawierającej 500 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych na studzienkę. Uważaj, aby końcówka nie dotykała otaczających kolonii, aby zapobiec mieszaniu się kolonii w poszczególnych studzienkach lub wybierać z obszaru o rzadkim wzroście kolonii. Po wybraniu wszystkich klonów umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, aż kultury zaczną się zlewać.

Ponieważ niestrawione plazmidy są nadmiernie zwinięte, mają tendencję do szybszego biegania niż ich zlinearyzowane odpowiedniki. Aby ustalić, czy oligonukleotydy zostały pomyślnie sklonowane do szkieletu plazmidu CRISPR, przeprowadza się PCR kolonii, a dodatnie klony są inokulowane przed ekstrakcją plazmidów i wysłaniem do sekwencjonowania Sangera. Sygnał fluorescencyjny można łatwo zobrazować pod mikroskopem po pomyślnym dostarczeniu plazmidów, co pozwala na sortowanie transfekowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Test endonukleazy T7 I przeprowadza się w celu sprawdzenia wydajności rozszczepienia genomowego DNA, obliczonej na podstawie intensywności prążków obserwowanych na żelu agarozowym. Dodatkowo, jeśli eksperyment oparty na naprawie ukierunkowany na homologię ma na celu włączenie miejsca restrykcyjnego w locus docelowym, można przeprowadzić test polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego z odpowiednim enzymem restrykcyjnym. Aby dodatkowo zweryfikować, czy gen kodujący białko został pomyślnie dezaktywowany, można przeprowadzić Western blot, aby upewnić się, że nie ma docelowego białka.

Sortowanie komórek po transfekcji eliminuje komórki bez wbudowanych plazmidów, zwiększając w ten sposób odsetek komórek przesiewanych na późniejszych etapach jako posiadające gen nokautujący lub wybijający. Dzięki opracowaniu tej techniki jesteśmy teraz w stanie wyprodukować linie komórkowe knock-out do badania funkcji genów oraz linie komórkowe knock-in do modelowania konkretnych chorób, aby zrozumieć ich mechanizm.