Poprawa ekstruzji mikrokryształów o wysokiej lepkości w celu czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej w laserach rentgenowskich

Protokół ten został opracowany w celu zapewnienia, że problemy często napotykane podczas seryjnych eksperymentów krystalograficznych z rozdzielczością czasową nie wpłyną negatywnie na jakość danych. Jedną z głównych zalet tej metody jest jej zdolność adaptacji do poszczególnych układów krystalicznych. Test wytłaczania kamery o dużej prędkości pozwala nam również bezpośrednio zmierzyć stabilność wytłaczania.

Najpierw należy załadować 50 mikrolitrów skrystalizowanego LCP na bazie monooleiny do strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów na około 30 minut przed wstrzyknięciem. W celu wstrzyknięcia do środowiska próżniowego należy załadować pięć mikrolitrów MAG 7,9 i pięć mikrolitrów ciekłej parafiny do tylnej części drugiej strzykawki. Trzymając strzykawkę pionowo, usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki.

Podłączyć strzykawkę z MAG 7.9 i parafiną do standardowego łącznika strzykawki. I usuń powietrze ze złączki, delikatnie naciskając tłok, aż niewielka objętość mieszaniny będzie widoczna na końcu igły łącznika. Podłączyć strzykawkę z próbką do złączki strzykawki pobierającej samochód, aby nie wprowadzać powietrza do próbki.

Wymieszać lipid i parafinę, wielokrotnie przepuszczając próbkę przez łącznik. Następnie załaduj 20 mikrolitrów wstępnie zmieszanego LCP do kolejnej strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów. Wyjąć pustą strzykawkę ze złączki i przymocować wstępnie zmieszany LCP do strzykawki zawierającej kryształ za pomocą standardowej złączki strzykawki.

Następnie przepuścić próbkę przez łącznik 100 razy. Aby wprowadzić próbkę w fazę sześcienną, dodaj trzy mikrolitry monooleiny i wymieszaj 50 razy. Powtarzaj tę procedurę tylko do momentu, gdy utworzy się przezroczysta faza, aby uniknąć nadmiaru monooleiny.

Jako wstępny test sztywności próbki i wytłaczania należy odłączyć pustą strzykawkę od łącznika strzykawki i trzymając strzykawkę pionowo, przecisnąć przez nią niewielką ilość próbnika. Jeśli wytłaczana próbka tworzy pionowy cylinder, oznacza to, że próbka jest gotowa do badania wytłaczania. Dostosuj całkowitą objętość próbki do 100 mikrolitrów, dodając więcej wstępnie zmieszanego LCP.

Podłączyć strzykawkę z próbką i dwie puste strzykawki do trójdrożnego łącznika strzykawki. Wymieszać co najmniej 50 razy, przepuszczając połowę próbki do drugiej strzykawki, a następnie jednocześnie wciskając obie połówki próbki do trzeciej strzykawki. Umieścić strzykawkę zawierającą zmieszaną próbkę pod mikroskopem stereoskopowym, aby sprawdzić jednorodny rozkład kryształów.

Oczyść pompę HPLC i wszystkie przewody wodne, aby upewnić się, że natężenia przepływu są dokładne. Następnie oczyść stopień hydrauliczny wtryskiwacza. Następnie włącz i podłącz aparat do dostarczonego oprogramowania.

Po uruchomieniu wideo na żywo w celu uzyskania wizualnej informacji zwrotnej umieść końcówkę dyszy na środku klatki i ustaw ją w ostrości za pomocą stolika trzyosiowego. Ustaw liczbę klatek na sekundę w aparacie na 1 000 klatek na sekundę. Następnie ustaw rozdzielczość na 512 na 512 pikseli.

Gdy czas ekspozycji jest teraz ustawiony przez liczbę klatek na sekundę, dostosuj poziom oświetlenia, aż dysza będzie widoczna. Zmień położenie końcówki dyszy tak, aby była wyśrodkowana od lewej do prawej i znajdowała się w górnej jednej trzeciej ramy. Ustaw kamerę w trybie poklatkowym.

Ustaw interwał na 30 sekund, a powtórzenia na 40 razy. Ustaw tryb wyzwalania na losowy. I wprowadź liczbę klatek do nagrania do 1 000.

Teraz załaduj do zbiornika 20 mikrolitrów próbki testowej i zamocuj dyszę kapilarną. Podłącz napełniony zbiornik do wtryskiwacza. Następnie podłącz przewód gazowy do portu na dyszy i rozpocznij przepływ gazu.

Następnie jednocześnie uruchom pompę i nagrywanie z kamery. Monitoruj wytłaczanie, aż ciśnienie pompy gwałtownie wzrośnie w pobliżu oczekiwanego czasu zakończenia. Następnie zatrzymaj nagrywanie, wyłącz pompę i odpowietrz ciśnienie w układzie, otwierając zawór nadmiarowy.

Następnie otwórz plik wideo z oprogramowaniem analitycznym i skalibruj narzędzia pomiarowe. Znajdź klatkę w filmie, w której widoczna jest możliwa do śledzenia funkcja w wyciągnięciu. Zapisz numer klatki.

Następnie przesuń wideo do klatki, w której ta sama funkcja jest widoczna, ale przesunęła się z pozycji w poprzednim kroku. Zapisz numer klatki. Korzystając z narzędzia do pomiaru w linii prostej, zmierz odległość od punktu początkowego i końcowego obiektu za pomocą miary analizy.

Powtórz poprzednie kroki kilka razy dla każdego segmentu filmu. Na koniec wykreśl serię danych. Idealnym materiałem wyjściowym do opisanej tutaj procedury są duże gęstości mikrokryształów wbudowanych w lepkie medium nośne dla wtryskiwacza.

Kryształy białek wykorzystano do zebrania danych TRSFX na temat pompowanej protonami bakterii rodopsyny, które ujawniły ultraszybkie zmiany zachodzące po absorpcji fotonów. Po przygotowaniu próbki za pomocą łącznika trójdrożnego, oględziny materiału w strzykawce wykazują jednorodność próbki. A obrazy mikroskopowe mogą potwierdzić gęstość kryształów.

Próbka znajduje się w fazie sześciennej, gdy podłoże doprowadzające jest klarowne i lepkie. Mętne mieszaniny wskazują, że próbka znajduje się w fazie gąbczastej lub blaszkowatej, ale nie są rozstrzygające, ponieważ wysoka gęstość krystaliczna może przesłaniać przejrzystość LCP. Test niskociśnieniowy w celu zidentyfikowania fazy gąbki można przeprowadzić, odciągając tłok strzykawki od próbki.

Podczas testu strumieniowego próbka powinna wytłaczać długą, ciągłą kolumnę LCP, która porusza się z prawie stałą prędkością. Próbki, które działają w trybie kapania, wskazują, że lepkość jest zbyt niska. Dane z próbek, które tworzą kolumnę, powinny pokazywać, że wytłaczanie utrzymuje się powyżej minimalnej prędkości podyktowanej parametrami doświadczalnymi.

Po optymalizacji przy użyciu tego protokołu, dane krystalograficzne szeregowe z rozdzielczością czasową mogą być zbierane w specjalistycznym obiekcie. Ujawni to zmiany konformacyjne w całym białku, gdy spełnia ono swoją funkcję.