Name: Poprawa ekstruzji mikrokryształów o wysokiej lepkości w celu czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej w laserach rentgenowskich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę optymalizacji ekstruzji mikrokryształów bakteriorodopsyny do czasowo-rozdzielczej krystalografii femtosekundowej. Protokół wykorzystuje trójdrożny sprzęgacz i kamerę wysokiej prędkości do zapewnienia stabilności próbki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Gebhardowi Schertlerowi, Rafaelowi Abeli i Chrisowi Milne'owi za poparcie stosowania wtryskiwaczy o wysokiej lepkości w PSI. Richard Neutze i jego zespół są znani z dyskusji na temat krystalografii czasowo-rozdzielczej i dostarczania próbek przy użyciu wtryskiwaczy o wysokiej lepkości. Za wsparcie finansowe dziękujemy Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki za granty 31003A_141235, 31003A_159558 (dla J.S.) i PZ00P3_174169 (dla P.N.). Projekt ten otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o udzielenie grantu nr 701646 Marie-Skłodowska-Curie.

1. Przygotowanie próbki kryształu białka
<ol>
	<li>Około 30 min przed wtryskiem próbki, należy pobrać 50 µL LCP na bazie monooleiny zawierającej kryształy do strzykawki o pojemności 100 µL.</li>
	<li>W przypadku wtrysku pod ciśnieniem atmosferycznym: do tylnej części drugiej strzykawki należy pobrać 10 µL parafiny w płynie. Trzymając strzykawkę pionowo, należy usunąć z niej pęcherzyki powietrza.
	<ol>
		<li>W przypadku wtrysku do środowiska próżniowego: do tylnej części drugiej strzykawki należy pobrać 5 µL MAG 7.9 oraz 5 µL parafiny w płynie. Trzymając strzykawkę pionowo, należy usunąć z niej pęcherzyki powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Strzykawkę z parafiną/MAG 7.9 należy podłączyć do standardowego łącznika strzykawek i usunąć powietrze z łącznika, delikatnie naciskając tłok, aż na końcówce igły łącznika pojawi się niewielka objętość (&lt;1 µL) parafiny/lipidów.</li>
	<li>Strzykawkę z próbką należy podłączyć do łącznika strzykawek, uważając, aby nie wprowadzić powietrza do próbki. Należy wymieszać ją z lipidami/parafiną, wielokrotnie przepuszczając materiał próbki przez łącznik.</li>
	<li>Do kolejnej strzykawki o pojemności 100 µL należy pobrać 20 µL wymieszanego wstępnie LCP (27% PEG, 100 mM Sorensen pH 5.6 + MO). W razie potrzeby należy usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Należy odłączyć pustą strzykawkę od łącznika i za pomocą standardowego łącznika strzykawek połączyć strzykawkę z wymieszanym wstępnie LCP ze strzykawką zawierającą kryształy. Próbkę należy przepuścić przez łącznik 100 razy. 
	UWAGA: Mieszanie próbki może spowodować jej niewielkie podgrzanie46. Mieszanie powinno odbywać się powoli, tak aby temperatura próbki pozostała na względnie stałym poziomie.</li>
	<li>Należy sprawdzić przejrzystość próbki pod źródłem światła. Jeśli utworzył się klarowny, homogeniczny LCP, należy przejść do kroku 1.9.</li>
	<li>Aby doprowadzić próbkę do fazy kubicznej, należy dodać 3 µL monooleiny i wymieszać 50 razy (zgodnie z opisem powyżej). Procedurę tę należy powtarzać tylko do momentu utworzenia się fazy przezroczystej, aby uniknąć nadmiaru monooleiny. 
	UWAGA: Formowanie się LCP jest zależne od temperatury47, a najlepsze wyniki uzyskuje się nieco powyżej 20 °C. Ilość dodatkowej monooleiny zależy od objętości pozostałego roztworu precypitantu przeniesionego z procesu krystalizacji.</li>
	<li>W ramach wstępnego testu sztywności próbki (oczekiwanej dla fazy LCP) oraz możliwości jej wyciśnięcia, należy odłączyć pustą strzykawkę od łącznika i trzymając strzykawkę pionowo, wycisnąć niewielką ilość próbki (&lt;2 µL) przez łącznik. Jeśli wyciśnięta próbka tworzy pionowy cylinder, jest ona gotowa do testów ekstruzji.</li>
	<li>Całkowitą objętość próbki należy dostosować do 100 µL poprzez dodanie większej ilości wymieszanego wstępnie LCP (jak w kroku 1.5).</li>
	<li>Strzykawkę z próbką oraz dwie puste strzykawki należy podłączyć do trójdrożnego łącznika strzykawek (usuwając powietrze z łącznika w sposób opisany wcześniej). Należy wymieszać próbkę co najmniej 50 razy (lub do uzyskania homogeniczności), przepuszczając połowę próbki do drugiej strzykawki, a następnie jednocześnie wciskając obie połowy próbki do trzeciej strzykawki.</li>
	<li>Strzykawkę z wymieszaną próbką należy umieścić pod mikroskopem stereoskopowym, aby zweryfikować homogeniczne rozłożenie kryształów.</li>
</ol>
2. Testowanie ekstruzji próbki przy użyciu zestawu z kamerą wysokiej prędkości
<ol>
	<li>Wyznaczanie parametrów eksperymentalnych.
	<ol>
		<li>Wybierz rozmiar dyszy do testu. 
		UWAGA: Rozmiary dysz wynoszą zazwyczaj 50 lub 75 µm średnica wewnętrzna (ID), lecz każdy rozmiar od około 30-100 µm Można rozważyć zastosowanie ID. Wybór opiera się na kompromisie między średnim czasem zapychania, rozpraszaniem tła, zużyciem próbki a odsetkiem trafień.</li>
		<li>Oblicz optymalną prędkość przepływu na podstawie eksperymentalnej wielkości plamki laserowej (1/e^2)2 średnica) oraz schemat gromadzenia danych (np. przeplatanie fazy jasnej i ciemnej), który zostanie zastosowany w XFEL.</li>
		<li>Obliczyć pożądany przepływ (<img alt="Koncepcja równowagi, ΣFx=0, schemat z siłami; analiza równowagi statycznej w mechanice." src="/files/ftp_upload/59087/59087eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">) próbki przy optymalnej prędkości przepływu (<img alt="Schemat równowagi statycznej z równaniami ΣFx=0, przedstawiający wektory sił i kąty do analizy." src="/files/ftp_upload/59087/59087eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2">) oraz wybranej średnicy dyszy (<img alt="Diagram równowagi statycznej, ΣFx=0, wizualizacja bilansu sił, edukacyjna metoda fizyki" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3">): 
		<img alt="Równanie przepływu płynu \(Q_s = v_e \pi \frac{d^2}{4}\), opisujące analizę natężenia przepływu w rurze." src="/files/ftp_upload/59087/59087eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4"> 
		Wyznacz prędkość przepływu (<img alt="Symbol fazy ilościowej (Qₚ), reprezentujący równowagę statyczną w równaniach fizycznych." src="/files/ftp_upload/59087/59087eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5">) należy wprowadzić do pompy HPLC na podstawie współczynnika wzmocnienia (<img alt="Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, ilustrujący siły i równowagę w układzie do analizy wektorowej." src="/files/ftp_upload/59087/59087eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 6">) wtryskiwacza. 
		<img alt="Równanie zjawisk transportowych, Qp=QsA, równanie matematyczne istotne w badaniach nad dynamiką płynów." src="/files/ftp_upload/59087/59087eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 7"> 
		Oblicz maksymalne ciśnienie (<img alt="Równowaga statyczna, wzór ΣFx=0, schemat wektorów sił, ilustrujący zasady równowagi." src="/files/ftp_upload/59087/59087eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 8">) z ciśnienia znamionowego złączy dysz (<img alt="Równowaga statyczna, symbol RMAX, stosowany w równaniach fizycznych dla warunków promienia maksymalnego." src="/files/ftp_upload/59087/59087eq9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 9">) oraz współczynnik wzmocnienia wtryskiwacza (<img alt="Schemat równowagi statycznej z wzorem ΣFx=0; schemat ciała swobodnego; siły i wektory." src="/files/ftp_upload/59087/59087eq10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 10">): 
		<img alt="Wzór na obliczanie mocy \( P_{\text{MAX}} = \frac{R_{\text{MAX}}}{A} \), równanie fizyczne." src="/files/ftp_upload/59087/59087eq11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 11"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja wtryskiwacza do ekstruzji materiałów o wysokiej lepkości do zastosowań offline, zgodnie z przedstawionym schematem w Rycina 1. 
	UWAGA: Inżektor działa na zasadzie ekstruzji hydraulicznej zasilanej pompą HPLC i wykorzystuje współpłynącą osłonę z gazu helu sterowaną przez regulator gazu. Konfiguracja pompy i regulatora nie jest omawiana w niniejszym protokole. Patrz rozdział czwarty w James (2015).48 do szczegółowego podręcznika.
	<ol>
		<li>Przepłucz pompę oraz wszystkie linie wodne, aby zapewnić dokładność przepływów. Przepłucz stopień hydrauliczny injektora.</li>
		<li>Zamocuj injektor (lub kamerę) na stole trójosiowym, aby ułatwić kadrowanie i ustawienie ostrości w nagraniach wideo o wysokiej prędkości. Pozostaw wokół miejsca iniekcji miejsce na obiektyw, oświetlenie, ekran refleksyjny oraz mały zlew do zbierania zużytej próbki.</li>
		<li>Należy skonstruować „dyszę atrapy” (pusty zbiornik z przymocowaną dyszą) i zainstalować ją na wtryskiwaczu, aby ułatwić pozycjonowanie, ustawienie ostrości i oświetlenie.</li>
		<li>Zamontuj kamerę wysokich prędkości tak, aby końcówka dyszy znajdowała się w pobliżu punktu ogniskowania obiektywu.</li>
		<li>Umieść ekran refleksyjny za injektorem i dostosuj oświetlenie tak, aby dysza była podświetlona z przodu.</li>
		<li>Włącz kamerę i połącz się z nią za pomocą dostarczonego oprogramowania. Przy uruchomionym podglądzie wideo w czasie rzeczywistym ustaw końcówkę dyszy w centrum kadru i ustaw ostrość za pomocą stolika trójosiowego.</li>
		<li>Reguluj oświetlenie do momentu, aż dysza będzie wyraźnie widoczna, a tło zostanie równomiernie oświetlone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja kamery do rejestrowania przyspieszonych filmów poklatkowych o wysokiej prędkości.
	<ol>
		<li>Ustaw częstotliwość klatek na 1000 fps. Ustaw rozdzielczość na 512 x 512 pikseli.</li>
		<li>Po ustawieniu czasu ekspozycji za pomocą częstotliwości klatek, należy dostosować poziom oświetlenia do momentu, aż dysza stanie się widoczna (tj. nie będzie niedoświetlona ani prześwietlona). Należy ponownie ustawić końcówkę dyszy tak, aby znajdowała się w centrum w poziomie oraz w górnej jednej trzeciej kadru.</li>
		<li>Przeprowadź korekcję tła lub operacje balansu bieli.</li>
		<li>Skonfiguruj aparat w trybie poklatkowym (time-lapse). Ustaw interwał na 30 s i powtórzenia do 40 razyustaw tryb wyzwalania na losowy (lub losowy reset) i wprowadź liczbę klatek do zarejestrowania 1000.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij zbiornik za pomocą 20 µL próbki testowej, a następnie przymocuj dyszę kapilarną.</li>
	<li>Podłącz napełniony zbiornik do injektora. Podłącz linię gazową do portu w dyszy i uruchom przepływ gazu.</li>
	<li>Ręcznie przesuń tłok, otwierając zawór liniowy i naciskając strzykawkę. Zamknij zawór, gdy tłok uzyska stały kontakt z próbką w zbiorniku.</li>
	<li>Zaprogramuj pompę z obliczonym przepływem i ustaw maksymalne ciśnienie na obliczoną wartość (patrz krok 2.1.3).</li>
	<li>Jednocześnie uruchomić pompę i nagrywanie kamerą.</li>
	<li>Wraz z rozpoczęciem ekstruzji należy dostosować ciśnienie gazu w celu zwiększenia stabilności. Należy zwiększyć ciśnienie gazu, jeśli w końcówce dyszy zamiast kolumny cieczy tworzy się kropla. Należy zmniejszyć ciśnienie, jeśli ekstruzja ulega przerwaniu z powodu nadmiernego ścinania przez przepływ gazu lub gdy występują szybkie oscylacje (efekt biczowania).</li>
	<li>Monitoruj proces ekstruzji (zazwyczaj 10 min wystarcza do stwierdzenia uzyskania warunków homogenicznego przepływu), a gdy ciśnienie pompy gwałtownie wzrośnie w pobliżu przewidywanego czasu zakończenia, przerwij rejestrację, wyłącz pompę i upuść ciśnienie z układu, otwierając zawór bezpieczeństwa.</li>
	<li>Analiza plików wideo 
	UWAGA: W przypadku oczywistej niewystarczalności ekstruzji próbki szczegółowa analiza nie jest wymagana. Niemniej jednak nadal użyteczne jest zidentyfikowanie trybu awarii, aby umożliwić optymalizację próbki.
	<ol>
		<li>Otwórz plik wideo w oprogramowaniu do analizy (np. Fiji)49) i skalibrować narzędzia pomiarowe.</li>
		<li>Skalibruj pomiary, wybierając za pomocą narzędzia wyboru linii odcinek o znanej długości na obrazie wideo. Otwórz Ustawienie skali okno poprzez Analiza | Ustawienie skali i wprowadź znaną odległość oraz jednostki miary. 
		UWAGA: Znana średnica dyszy zapewnia odpowiednią długość kalibracyjną dla tych pomiarów.</li>
		<li>Znajdź w filmie klatkę, w której w ekstrudacie widoczna jest cecha możliwa do śledzenia (np. kryształ). Zapisz numer klatki.</li>
		<li>Przewiń wideo do klatki, w której ta sama cecha jest widoczna, lecz przesunęła się ze swojej pozycji z poprzedniego kroku. Zapisz numer klatki.</li>
		<li>Używając narzędzia do pomiaru linii prostych, zmierz odległość od punktu początkowego do końcowego cechy poprzez Analizuj | Mierz. 
		UWAGA: Im dłuższy dystans śledzenia, tym mniejszy wpływ błędów pomiarowych na obliczenia</li>
		<li>Oblicz prędkość strumienia na podstawie zmierzonej odległości i upływu czasu (liczba klatek podzielona przez częstotliwość klatek na sekundę).</li>
		<li>Powtórz kroki 2.11.3–2.11.6 kilka razy dla każdego segmentu filmu.</li>
		<li>Wykreśl serie danych zgodnie z Rysunek 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Metoda TR-SFX z wstrzykiwaczem do wytłaczania lepkiego okazała się skuteczną techniką do badań dynamiki strukturalnej bakteriorodopsyny 9,10 i fotosystemu II13, a obecnie wydaje się gotowa do badania białek napędzających inne procesy fotobiologiczne, takie jak transport jonów sterowany światłem lub percepcja sensoryczna 5,50. Opisane powyżej protokoły zostały zaprojektowane w celu ...

Seryjna krystalografia femtosekundowa (SFX) to technika biologii strukturalnej, która wykorzystuje unikalne właściwości rentgenowskich laserów na swobodnych elektronach (XFEL) do określania struktur temperatury pokojowej z tysięcy kryształów o rozmiarach mikrometrów, jednocześnie wyprzedzając większość uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem przez zasadę "dyfrakcji przed zniszczeniem"1,2,3.
W czasowym rozszerzeniu SFX (TR-SFX), impulsy femtosekundowe z XFEL są używane do badania zmian strukturalnych w białkach4,5. Białko będące przedmiotem zainteresowania jest aktywowane za pomocą lasera optycznego (lub innego wyzwalacza aktywności) tuż przed wystrzeleniem przez XFEL w konfiguracji pompa-sonda. Dzięki precyzyjnemu kontrolowaniu opóźnienia między impulsami pompy i sondy, białko docelowe może być wychwytywane w różnych stanach. Molekularne filmy przedstawiające zmiany strukturalne na przestrzeni jedenastu rzędów wielkości w czasie pokazują moc nowych źródeł XFEL do badania dynamiki kilku celów białkowych6,7,8,9,10,11,12,13. Zasadniczo, metoda ta łączy dynamiczne techniki spektroskopowe i statyczne techniki strukturalne w jedną, zapewniając wgląd w dynamikę białek w rozdzielczości bliskiej atomowej.
Proste systemy dla TR-SFX mogą zawierać endogenny wyzwalacz aktywacji za pomocą światłoczułego komponentu, takiego jak siatkówka, w bakteriorodopsyny (bR)9,10, chromofory w fotosystemie II12,13, fotoaktywne żółte białko (PYP)6,7 odwracalnie fotoprzełączalne białko fluorescencyjne11, lub fotolizowalny tlenek węgla w mioglobinie8. Ekscytujące warianty techniki, które wciąż są w fazie rozwoju, opierają się na schematach mieszania i wstrzykiwania14,15 do badania reakcji enzymatycznych lub pola elektrycznego używanego do wywoływania zmian strukturalnych16. Biorąc pod uwagę, że źródła XFEL są dostępne dopiero od kilku lat i ekstrapolują dotychczasowe sukcesy na przyszłość, metoda ta wykazuje potencjał jako prawdziwy przełom w odniesieniu do naszego zrozumienia funkcjonowania białek.
Ponieważ próbki biologiczne są niszczone przez jednorazowe wystawienie na działanie impulsu XFEL o dużej mocy, konieczne było nowe podejście do krystalografii białek. Wśród tych procedur należało opracować zdolność do hodowania dużych ilości jednorodnych mikrokryształów17,18,19. Aby umożliwić zbieranie danych w XFEL, kryształy te muszą zostać dostarczone, wyrzucone, a następnie odnowione dla każdego impulsu XFEL. Biorąc pod uwagę, że XFEL wystrzeliwują użyteczne impulsy z częstotliwością 10-120 Hz, dostarczanie próbki musi być szybkie, stabilne i niezawodne, przy jednoczesnym zachowaniu kryształów w stanie nienaruszonym i ograniczeniu zużycia. Jednym z najbardziej udanych rozwiązań jest wtryskiwacz do mikroekstruzji o wysokiej lepkości, który dostarcza ciągłą kolumnę krystalicznej fazy lipidowej sześciennej (LCP) w temperaturze pokojowej przez pulsacyjną wiązkę promieniowania rentgenowskiego20. Losowo zorientowane kryształy, osadzone w strumieniu LCP, które są przechwytywane przez impulsy XFEL, rozpraszają promieniowanie rentgenowskie na detektor, w którym rejestrowany jest wzór dyfrakcyjny. LCP był naturalnym wyborem dla pożywki do dostarczania próbek, ponieważ jest często używany jako pożywka wzrostowa dla kryształów białek błonowych17,21,22,23, jeszcze inne nośniki o wysokiej lepkości24,25,26,27,28,29,30 i rozpuszczalne białka31 zostały również użyte w wtryskiwaczu. SFX z wtryskiwaczem o wysokiej lepkości odniósł sukces podczas określania struktury białek błonowych13,32 z uwzględnieniem receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCRs)33,34,35,36,37, z jakością danych wystarczającą do natywnego fazowania38,39 przy jednoczesnej efektywności zarówno czasowej, jak i próbki. Obecnie wtryskiwacze te są używane bardziej rutynowo do pomiarów temperatury pokojowej w źródłach synchrotronowych28,30,40,41, a także podczas bardziej wymagających technicznie eksperymentów TR-SFX w XFELs9,10,13,42.
Porównywalne eksperymenty TR-SFX zostały przeprowadzone przy użyciu innych typów wtryskiwaczy, takich jak dostarczanie fazy ciekłej w dyszy skoncentrowanej na przepływie6,7,12, jednak ta metoda wymaga ilości białka, które nie są dostępne dla wielu biologicznie interesujących celów. W celu określenia struktur statycznych za pomocą wytłaczania lepkiego zgłoszono średnie zużycie 0,072 mg białka na 10 000 indeksowanych wzorów dyfrakcyjnych w porównaniu do 9,35 mg dla dysz strumieniowych z cieczą (tj. około 130 razy większa wydajność próbki)20. Wykazano, że wtryskiwacz o wysokiej lepkości jest realnym urządzeniem do dostarczania próbek dla TR-SFX, poświęcając tylko część tej wydajności próbki43. Na przykład w Nogly et al. (2018)10 zużycie próbki wynosiło około 1,5 mg na 10 000 indeksowanych wzorców, co wypada korzystnie w porównaniu z podobnymi eksperymentami TR-SFX z użyciem PYP, w których średnie zużycie próbki było znacznie wyższe i zawierało 74 mg białka na 10 000 indeksowanych wzorców6. Wtryskiwacze o wysokiej lepkości mają zatem wyraźne zalety, gdy ilość dostępnego białka jest ograniczona lub gdy kryształy są hodowane bezpośrednio w LCP.
Dla TR-SFX korzystającego z wtryskiwaczy o wysokiej lepkości w celu uzyskania najbardziej wiarygodnych danych należy rozwiązać kilka problemów technicznych: prędkość przepływu musi pozostać powyżej minimalnej wartości krytycznej; współczynnik trafień powinien być utrzymany na poziomie, który nie powoduje spowolnienia zbierania danych (np. więcej niż 5%); a próbka musi być dostarczona bez nadmiernych zakłóceń. Idealnie byłoby, gdyby warunki te zostały spełnione na długo przed zaplanowanym eksperymentem TR-SFX, aby jak najefektywniej wykorzystać dostępny czas XFEL. Zasadniczo spowolnienie strumienia LCP może pozwolić na sondowanie kryształów, które zostały aktywowane więcej niż jednym optycznym impulsem laserowym i skutkują mieszanymi stanami aktywnymi, lub sondowanie pompowanego materiału, gdy spodziewany jest materiał pompowany w wiązce. Dodatkową korzyścią płynącą ze wstępnego testowania wtrysku jest to, że przestoje podczas zbierania danych w XFEL są zminimalizowane, ponieważ czas przeznaczony na wymianę zatkanych dysz, wymianę próbek niewytłaczanych i inne zadania konserwacyjne są zredukowane.
Tutaj prezentujemy metodę optymalizacji dostarczania próbek do zbierania danych TR-SFX za pomocą wtryskiwacza do mikroekstruzji o wysokiej lepkości. Dla uproszczenia, opisane metody nie opierają się na dostępie do źródła promieniowania rentgenowskiego, chociaż prace na synchrotronowej linii badawczej29 dostarczyłyby dalszych informacji na temat oczekiwanych wskaźników trafień i dyfrakcji kryształów. Nasze protokoły zostały opracowane w celu optymalizacji eksperymentów mających na celu uchwycenie izomeryzacji siatkówki w bakteriorodopsyny pompy protonowej10 i są przeprowadzane w dwóch fazach, zaczynając od przygotowania próbek kryształów do wytłaczania, a następnie monitorowania ekstruzji za pomocą szybkiej konfiguracji kamery. W pierwszej fazie krystaliczny LCP miesza się z dodatkowym LCP, lipidami o niskiej temperaturze przejścia lub innymi dodatkami, aby zapewnić, że końcowa mieszanina nadaje się do dostarczenia do środowiska próbki bez zatykania lub spowalniania. Nowy trójdrożny łącznik strzykawki został opracowany w celu poprawy wydajności mieszania i jednorodności próbki. Druga faza składa się z testu wytłaczania zarejestrowanego przez szybką kamerę w celu bezpośredniego pomiaru stabilności prędkości wytłaczania. Po analizie danych wideo można wprowadzić poprawki do protokołu przygotowania próbki w celu poprawy wyników eksperymentu. Procedury te mogą być dostosowane do przygotowania innych białek do zbierania danych TR-SFX, przy minimalnych modyfikacjach, i przyczynią się do efektywnego wykorzystania ograniczonego czasu wiązki XFEL. Dzięki nowym obiektom XFEL, które dopiero rozpoczynają swoją działalność44,45 i przeniesieniu metod zbierania danych szeregowych opartych na wtryskiwaczach do synchrotronów28,30,40,41, najbliższe lata z pewnością przyniosą nowe, ekscytujące spojrzenie na dynamikę strukturalną coraz szerszego zakresu celów białkowych.

<table><tbody><tr><td>Sprzęgło strzykawki Mosquito LCP</td><td>Sklep laboratoryjny TTP</td><td>3072-01050</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 1710 RNR, 100 i mikro; l</td><td>Hamilton</td><td>HA-81065</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 1750 RNR, 500 i mikro; l</td><td>Hamilton</td><td>HA-81265</td><td></td></tr><tr><td>Monooleina</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>M-239</td><td></td></tr><tr><td>7.9 MAG</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>850534O</td><td></td></tr><tr><td>50% w/v PEG 2000</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD2-250-7</td><td></td></tr><tr><td>Parafina (ciecz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.07162</td><td></td></tr><tr><td>Szybka kamera</td><td>Photron</td><td></td><td>Photron Mini AX</td></tr><tr><td>Obiektyw o dużym powiększeniu</td><td>Navitar</td><td></td><td>12X Zoom Lens System</td></tr><tr><td>trzyosiowy</td><td>ThorLabs</td><td>PT3/M</td><td></td></tr><tr><td>Światłowód</td><td>lekki Thorlabs</td><td>OSL2</td><td></td></tr><tr><td>Stopione włókno krzemionkowe</td><td>Molex/Polymicro</td><td>TSP-505375</td><td></td></tr><tr><td>Lite tulejka dotykowa</td><td>IDEX</td><td>LT-100</td><td></td></tr><tr><td>ASU wtryskiwacz o wysokiej lepkości</td> Uniwersytet <td></td><td>Stanowy Arizony</td><td>Do kupienia w pompie Uwe Weierstall (weier@asu.edu)</td></tr> <tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>LC-20AD</td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczny regulator gazu</td><td>Proporcja Powietrze</td><td>GP1</td><td></td></tr></tbody></table>

poprawa ekstruzji mikrokryształów o wysokiej lepkości w celu czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej w laserach rentgenowskich

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Wtryskiwacze mikroekstruzji o wysokiej lepkości znacznie zmniejszyły zużycie próbek w seryjnych femtosekundowych eksperymentach krystalograficznych (SFX) przy laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach (XFEL). Seria eksperymentów z wykorzystaniem bakteriorodopsyny napędzanej światłem pompy protonowej dodatkowo ustaliła, że wstrzykiwacze te są preferowaną opcją dostarczania kryształów do czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej (TR-SFX) w celu rozwiązania zmian strukturalnych białek po fotoaktywacji. Aby uzyskać wiele migawek strukturalnych o wysokiej jakości, konieczne jest zebranie dużych ilości danych i zapewnienie odstępu kryształów między każdym impulsem lasera pompy. Tutaj szczegółowo opisujemy, w jaki sposób zoptymalizowaliśmy wytłaczanie mikrokryształów bakteriorodopsyny dla naszych ostatnich eksperymentów TR-SFX w koherentnym źródle światła Linac (LCLS). Celem metody jest optymalizacja ekstruzji w celu uzyskania stabilnego i ciągłego przepływu przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej gęstości kryształów, aby zwiększyć szybkość, z jaką można zbierać dane w eksperymencie TR-SFX. Cel ten osiągamy poprzez przygotowanie lipidowej fazy sześciennej z jednorodnym rozkładem kryształów za pomocą nowatorskiego trójdrożnego urządzenia sprzęgającego strzykawkę, a następnie dostosowanie składu próbki na podstawie pomiarów stabilności ekstruzji wykonanych za pomocą szybkiej kamery. Metodologia może być dostosowana w celu optymalizacji przepływu innych mikrokryształów. Konfiguracja będzie dostępna dla użytkowników nowego szwajcarskiego lasera na swobodnych elektronach.

Idealnym materiałem wyjściowym dla opisanych tutaj procedur (Rysunek 3) są wysokie gęstości mikrokryształów zawieszonych w lepkim medium nośnym dla injektora. Procedura wymaga około 50 µL nośnika z kryształami dla każdego przygotowania. Mogą one być hodowane bezpośrednio w LCP, tak jak w przypadku bR9,10 użytego tutaj jako przykład (Rysunek 4), lub przygotowane przy użyci...

Powodzenie eksperymentu z seryjną krystalografią femtosekundową z rozdzielczością czasową zależy od efektywnego dostarczania próbki. W tym miejscu opisujemy protokoły optymalizujące wytłaczanie mikrokryształów bakteriorodopsyny z wtryskiwacza do mikroekstruzji o wysokiej lepkości. Metodologia opiera się na homogenizacji próbki za pomocą nowatorskiego łącznika trójdrożnego i wizualizacji za pomocą szybkiej kamery.

Poprawa ekstruzji mikrokryształów o wysokiej lepkości w celu czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej w laserach rentgenowskich

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Protokół ten został opracowany w celu zapewnienia, że problemy często napotykane podczas seryjnych eksperymentów krystalograficznych z rozdzielczością czasową nie wpłyną negatywnie na jakość danych. Jedną z głównych zalet tej metody jest jej zdolność adaptacji do poszczególnych układów krystalicznych. Test wytłaczania kamery o dużej prędkości pozwala nam również bezpośrednio zmierzyć stabilność wytłaczania.Najpierw należy załadować 50 mikrolitrów skrystalizowanego LCP na bazie monooleiny do strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów na około 30 minut przed wstrzyknięciem. W celu wstrzyknięcia do środowiska próżniowego należy załadować pięć mikrolitrów MAG 7,9 i pięć mikrolitrów ciekłej parafiny do tylnej części drugiej strzykawki. Trzymając strzykawkę pionowo, usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki.Podłączyć strzykawkę z MAG 7.9 i parafiną do standardowego łącznika strzykawki. I usuń powietrze ze złączki, delikatnie naciskając tłok, aż niewielka objętość mieszaniny będzie widoczna na końcu igły łącznika. Podłączyć strzykawkę z próbką do złączki strzykawki pobierającej samochód, aby nie wprowadzać powietrza do próbki.Wymieszać lipid i parafinę, wielokrotnie przepuszczając próbkę przez łącznik. Następnie załaduj 20 mikrolitrów wstępnie zmieszanego LCP do kolejnej strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów. Wyjąć pustą strzykawkę ze złączki i przymocować wstępnie zmieszany LCP do strzykawki zawierającej kryształ za pomocą standardowej złączki strzykawki.Następnie przepuścić próbkę przez łącznik 100 razy. Aby wprowadzić próbkę w fazę sześcienną, dodaj trzy mikrolitry monooleiny i wymieszaj 50 razy. Powtarzaj tę procedurę tylko do momentu, gdy utworzy się przezroczysta faza, aby uniknąć nadmiaru monooleiny.Jako wstępny test sztywności próbki i wytłaczania należy odłączyć pustą strzykawkę od łącznika strzykawki i trzymając strzykawkę pionowo, przecisnąć przez nią niewielką ilość próbnika. Jeśli wytłaczana próbka tworzy pionowy cylinder, oznacza to, że próbka jest gotowa do badania wytłaczania. Dostosuj całkowitą objętość próbki do 100 mikrolitrów, dodając więcej wstępnie zmieszanego LCP.Podłączyć strzykawkę z próbką i dwie puste strzykawki do trójdrożnego łącznika strzykawki. Wymieszać co najmniej 50 razy, przepuszczając połowę próbki do drugiej strzykawki, a następnie jednocześnie wciskając obie połówki próbki do trzeciej strzykawki. Umieścić strzykawkę zawierającą zmieszaną próbkę pod mikroskopem stereoskopowym, aby sprawdzić jednorodny rozkład kryształów.Oczyść pompę HPLC i wszystkie przewody wodne, aby upewnić się, że natężenia przepływu są dokładne. Następnie oczyść stopień hydrauliczny wtryskiwacza. Następnie włącz i podłącz aparat do dostarczonego oprogramowania.Po uruchomieniu wideo na żywo w celu uzyskania wizualnej informacji zwrotnej umieść końcówkę dyszy na środku klatki i ustaw ją w ostrości za pomocą stolika trzyosiowego. Ustaw liczbę klatek na sekundę w aparacie na 1 000 klatek na sekundę. Następnie ustaw rozdzielczość na 512 na 512 pikseli.Gdy czas ekspozycji jest teraz ustawiony przez liczbę klatek na sekundę, dostosuj poziom oświetlenia, aż dysza będzie widoczna. Zmień położenie końcówki dyszy tak, aby była wyśrodkowana od lewej do prawej i znajdowała się w górnej jednej trzeciej ramy. Ustaw kamerę w trybie poklatkowym.Ustaw interwał na 30 sekund, a powtórzenia na 40 razy. Ustaw tryb wyzwalania na losowy. I wprowadź liczbę klatek do nagrania do 1 000.Teraz załaduj do zbiornika 20 mikrolitrów próbki testowej i zamocuj dyszę kapilarną. Podłącz napełniony zbiornik do wtryskiwacza. Następnie podłącz przewód gazowy do portu na dyszy i rozpocznij przepływ gazu.Następnie jednocześnie uruchom pompę i nagrywanie z kamery. Monitoruj wytłaczanie, aż ciśnienie pompy gwałtownie wzrośnie w pobliżu oczekiwanego czasu zakończenia. Następnie zatrzymaj nagrywanie, wyłącz pompę i odpowietrz ciśnienie w układzie, otwierając zawór nadmiarowy.Następnie otwórz plik wideo z oprogramowaniem analitycznym i skalibruj narzędzia pomiarowe. Znajdź klatkę w filmie, w której widoczna jest możliwa do śledzenia funkcja w wyciągnięciu. Zapisz numer klatki.Następnie przesuń wideo do klatki, w której ta sama funkcja jest widoczna, ale przesunęła się z pozycji w poprzednim kroku. Zapisz numer klatki. Korzystając z narzędzia do pomiaru w linii prostej, zmierz odległość od punktu początkowego i końcowego obiektu za pomocą miary analizy.Powtórz poprzednie kroki kilka razy dla każdego segmentu filmu. Na koniec wykreśl serię danych. Idealnym materiałem wyjściowym do opisanej tutaj procedury są duże gęstości mikrokryształów wbudowanych w lepkie medium nośne dla wtryskiwacza.Kryształy białek wykorzystano do zebrania danych TRSFX na temat pompowanej protonami bakterii rodopsyny, które ujawniły ultraszybkie zmiany zachodzące po absorpcji fotonów. Po przygotowaniu próbki za pomocą łącznika trójdrożnego, oględziny materiału w strzykawce wykazują jednorodność próbki. A obrazy mikroskopowe mogą potwierdzić gęstość kryształów.Próbka znajduje się w fazie sześciennej, gdy podłoże doprowadzające jest klarowne i lepkie. Mętne mieszaniny wskazują, że próbka znajduje się w fazie gąbczastej lub blaszkowatej, ale nie są rozstrzygające, ponieważ wysoka gęstość krystaliczna może przesłaniać przejrzystość LCP. Test niskociśnieniowy w celu zidentyfikowania fazy gąbki można przeprowadzić, odciągając tłok strzykawki od próbki.Podczas testu strumieniowego próbka powinna wytłaczać długą, ciągłą kolumnę LCP, która porusza się z prawie stałą prędkością. Próbki, które działają w trybie kapania, wskazują, że lepkość jest zbyt niska. Dane z próbek, które tworzą kolumnę, powinny pokazywać, że wytłaczanie utrzymuje się powyżej minimalnej prędkości podyktowanej parametrami doświadczalnymi.Po optymalizacji przy użyciu tego protokołu, dane krystalograficzne szeregowe z rozdzielczością czasową mogą być zbierane w specjalistycznym obiekcie. Ujawni to zmiany konformacyjne w całym białku, gdy spełnia ono swoją funkcję.

improving-high-viscosity-extrusion-microcrystals-for-time-resolved

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisujemy procedury przygotowania i dostarczania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do krystalografii szeregowej w laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach i źródłach synchrotronowych. Protokoły te mogą być również stosowane do wprowadzania i dostarczania rozpuszczalnych mikrokryształów białek, co prowadzi do znacznego zmniejszenia zużycia próbki w porównaniu z wstrzykiwaniem cieczy.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Opisujemy eksperyment mający na celu zbadanie uszkodzeń elektronowych indukowanych w nanokryształach buckminsterfullerenu (C60) przez intensywne, femtosekundowe impulsy promieniowania rentgenowskiego. Eksperyment wykazał, że dynamika elektronów indukowana promieniowaniem rentgenowskim w C60 nie jest stochastyczna, ale silnie skorelowana, rozciągając się na setki komórek elementarnych w obrębie kryształów1.

Pomiary korelacji elektronowych dalekiego zasięgu podczas eksperymentów dyfrakcji femtosekundowej wykonywanych na nanokryształach buckminsterfullerenu

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak przygotować próbki krystalografii seryjnej do zbierania danych na wtryskiwaczu o wysokiej lepkości, Lipidico, niedawno uruchomionym w australijskim synchrotronie.

Protokół iniekcji lipidico do pomiarów krystalografii seryjnej w australijskim synchrotronie

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Celem tego artykułu jest dać widzowi solidne zrozumienie, jak przekształcić ich protokół małej objętości dyfuzji parowej, do hodowli dużych, pojedynczych kryształów białka, w metodę mikrokrystalizacji wsadowej o dużej objętości dla krystalografii szeregowej.

Optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej

Prezentujemy obszerny przewodnik po przygotowywaniu próbek do stałego celu, zbieraniu danych i przetwarzaniu danych dla szeregowej krystalografii synchrotronowej na linii badawczej Diamond I24.

Poprawiono zbieranie danych szeregowych celu w Diamond Light Source

Stosunek sygnału do szumu danych jest jednym z najważniejszych czynników przy wykonywaniu pomiarów dyfrakcji rentgenowskiej z mikrokryształów. Linia badawcza VMXm zapewnia środowisko o niskim poziomie hałasu i mikrowiązkę do takich eksperymentów. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbek do montażu i chłodzenia mikrokryształów dla VMXm i innych linii badawczych do krystalografii makromolekularnej mikrofokusowej.

Rurociąg przygotowania próbek mikrokryształów na linii badawczej VMXm

Ten wkład opisuje, jak skonfigurować krystalizację białek na urządzeniach typu kryształ na krysztale oraz jak przeprowadzić automatyczne szeregowe zbieranie danych w temperaturze pokojowej za pomocą platformy krystalizacji na chipie.

Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Poznaj metodę optymalizacji ekstruzji mikrokryształów bakteriorodopsyny do czasowo-rozdzielczej krystalografii femtosekundowej. Protokół wykorzystuje trójdrożny sprzęgacz i kamerę wysokiej prędkości do zapewnienia stabilności próbki.

Poprawa ekstruzji mikrokryształów o wysokiej lepkości w celu czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej w laserach rentgenowskich (Wideo) | JoVE Journal

Poprawa ekstruzji mikrokryształów o wysokiej lepkości w celu czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej w laserach rentgenowskich

Przeglądaj więcej filmów