Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

Zwierzęta jaskiniowe stanowią fascynujący system do badania różnych cech morfologicznych, rozwojowych i behawioralnych. Jednak jednym z czynników ograniczających w tworzeniu tego modelowego systemu jest brak narzędzi genetycznych, które pozwoliłyby nam manipulować funkcją genów. Tutaj pokazujemy trzy różne podejścia do manipulowania funkcją genów u meksykańskiej ryby jaskiniowej, Astyanax mexicanus.

Narzędzia te umożliwią zbadanie genów leżących u podstaw naturalnych różnic między rybami powierzchniowymi a jaskiniowymi oraz ich związku z fenotypami. Bethany Stahl, utalentowana doktorantka w moim laboratorium, zademonstruje tę procedurę. Przed rozpoczęciem procedury napełnij 100-mililitrową szalkę Petriego ciepłą 3% agarozą rozpuszczoną w wodzie z systemu rybnego i ostrożnie umieść formę do wstrzykiwania jaj w agarozie pod kątem 45 stopni, a następnie powoli opuść formę do agarozy, aby uniknąć uwięzienia powietrza pod formą.

Gdy agaroza zastygnie, ostrożnie usuń formę, a następnie przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Następnie wyciągnij igły z kapilar ze szkła borokrzemianowego i ściągacz igieł do elektrod zgodnie z wytycznymi producenta. W dniu wstrzyknięcia należy za pomocą szklanej pipety przenieść jaja jednokomórkowe do płytki iniekcyjnej, wypełniając do pięciu rzędów płytki iniekcyjnej po 30 do 40 jaj w rzędzie.

Utrzymuj jaja nawodnione niewielką ilością wody z systemu rybnego. Rozmrozić Morpholino na lodzie i przygotować roztwór do wstrzykiwań tak, aby wstrzyknąć 400 pikogramów Morpholino na jajko, używając długiej końcówki pipety Microloader lub dodając dwa do czterech mikrolitrów bolusa na końcu. Po załadowaniu wszystkich igieł należy za pomocą kleszczyków odciąć nadmiar długości końcówek igły do wstrzykiwań i zamontować pierwszą igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikrowstrzykiwacza pikolitrowego.

Następnie umieść naczynie do wstrzykiwań pod mikroskopem preparacyjnym i użyj mikromanipulatora, aby przeniknąć igłą do każdego jajka przed wstrzyknięciem jednego nanolitra roztworu do wstrzykiwań Morpholino bezpośrednio do żółtka. W przypadku wstrzyknięcia CRISPR wymieszaj 25 pikogramów przewodnikowego RNA z 300 pikogramami informacyjnego RNA związanego z białkiem 9 związanym z CRISPR i wstrzyknij dwa nanolitry powstałego roztworu RNA do każdego zarodka, jak pokazano. W przypadku transpozazy Tol2 i wstrzyknięcia plazmidu flankowanego Tol2 połącz 25 nanogramów na mikrolitr informacyjnego RNA Tol2 z 25 nanogramami na mikrolitr konstruktu plazmidowego Tol2 i czerwienią fenolową w wodzie wolnej od RNaz.

Następnie wstrzyknąć jeden nanolitr roztworu do każdego zarodka, jak właśnie pokazano. Aby przeprowadzić badania przesiewowe zwierząt, którym wstrzyknięto Morpholino po czterech dniach od wstrzyknięcia, w zależności od interesującego genu, należy wizualizować larwy ryb pod mikroskopem stereoskopowym, aby obserwować fenotyp wstrzykniętych zwierząt lub nagrywać wideo w celu pomiaru zachowania. Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem indeli CRISPR, przenieś zarodki wstrzyknięte za pomocą CRISPR do probówek PCR i wyekstrahuj DNA zgodnie ze standardowymi protokołami ekstrakcji DNA dla reakcji łańcuchowej polimerazy lub analizy PCR.

Aby ocenić mutagenezę, uruchom pięć mikrolitrów produktu PCR na 3% żelu agarozowym o napięciu 70 woltów przez trzy godziny. Niemutagenne DNA typu dzikiego spowoduje powstanie odrębnego prążka, podczas gdy zmutowane DNA stworzy prążek rozmazowy. Jaskinia A mexicanus, któremu wstrzyknięto kontrolny Morpholino, wykazuje znacznie większą aktywność lokomotoryczną i skrócony sen w ciągu 24 godzin, w porównaniu z rybami powierzchniowymi, którym wstrzyknięto jajecznicę Morpholino.

Wstrzyknięcie hipokretyny oreksyny Morpholino ma niewielki wpływ na sen u ryb powierzchniowych w porównaniu z rybami z grupy kontrolnej. W przeciwieństwie do tego, knockdown hipokretyny oreksyny poprzez wstrzyknięcie Morfolino ma znaczący wpływ na sen u ryb żyjących w jaskiniach, zapewniając bezpośredni związek między ekspresją hipokretyny oreksyny a utratą snu. Mutageneza genu OCA2 u ryb powierzchniowych za pośrednictwem CRPSR powoduje, że niektóre osobniki są homozygotyczne pod względem dodatniego allelu OCA2 typu dzikiego i są związane z posiadaniem pigmentacji, podczas gdy osoby, które mają dwie kopie ujemnego allelu OCA2 z mutacją CRISPR, są albinosami, co zapewnia bezpośredni związek między zmutowanym genem OCA2 a albinizmem u ryb jaskiniowych.

Wybierz dodatni F0 dla transgenu przenoszonego przez Tol2 do krzyżówki wstecznej z typem dzikim, aby wygenerować stabilne linie F1. Umożliwia to obrazowanie wapnia na żywo w celu odkrycia różnic w aktywności neuronalnej, pośredniczenia w zmianach zachowania w środowisku jaskiniowym, kładąc podwaliny pod ekspresję wielu dodatkowych transgenów w celu scharakteryzowania i manipulowania funkcją genów w A mexicanus. Najważniejsze rzeczy, o których należy pamiętać, to szczelne nałożenie jaj na talerz, prawidłowe przycięcie igły i optymalizacja mikroiniekcji.

Po udanym nokaucie genetycznym, integracji transgenu lub edycji genów za pośrednictwem CRISPR, ryby te mogą być wykorzystywane do analiz rozwojowych, behawioralnych i aktywności mózgu.