Name: Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj techniki manipulacji genami u Astyanax mexicanus: transgenezę Tol2, edycję CRISPR/Cas9 i knockdown morfolinami. Metody te umożliwiają badanie podstaw genetycznych adaptacji ewolucyjnych ryb jaskiniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Sunishce Thakur za pomoc w genotypowaniu i obrazowaniu zmutowanej ryby oca2 przedstawionej w <silna klasa="xfig">Rysunek 2. Praca ta była wspierana przez nagrodę National Science Foundation (NSF) 1656574 dla A.C.K., nagrodę NSF 1754321 dla J.K. i A.C.K. oraz nagrodę National Institutes of Health (NIH) R21NS105071 dla A.C.K. i E.R.D.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiliśmy metodologię manipulowania funkcją genów za pomocą morfolinosów, edycji genów CRISPR/Cas9 i metodologii transgenezy. Bogactwo technologii genetycznej i optymalizacja tych systemów u danio pręgowanego prawdopodobnie pozwoli na łatwe przeniesienie tych narzędzi do A. mexicanus 52. Ostatnie odkrycia wykorzystują te podejścia u A. mexicanus, ale pozostają one niedostatecznie wykorzystane w badaniu różnych cech morfologicznych, rozwojowych i behawioralnych...

Od czasu Darwin's Origin of Species1, naukowcy uzyskali dogłębny wgląd w to, jak cechy kształtują się ewolucyjnie w odpowiedzi na określone naciski środowiskowe i ekologiczne, dzięki organizmom jaskiniowym2. Tetra meksykańska, A. mexicanus, składa się z ocznych przodków "powierzchniowych", które zamieszkują rzeki w całym Meksyku i południowym Teksasie oraz z co najmniej 29 geograficznie izolowanych populacji pochodnych morfów jaskiniowych zamieszkujących Sierra del Abra i inne obszary północno-wschodniego Meksyku3. U A. mexicanus zidentyfikowano szereg cech związanych z jaskiniami, w tym zmienione zużycie tlenu, depigmentację, utratę oczu oraz zmienione zachowania związane z żerowaniem i żerowaniem4,5,<sup class="xref">6,7,8,9. A. mexicanus przedstawia potężny model do badania mechanizmów ewolucji konwergentnej ze względu na dobrze zdefiniowaną historię ewolucyjną, szczegółową charakterystykę środowiska ekologicznego oraz obecność niezależnie wyewoluowanych populacji jaskiniowych10,11. Wiele cech pochodzących z jaskiń, które są obecne u ryb jaskiniowych, w tym utrata wzroku, utrata snu, zwiększone żerowanie, utrata szkoły, zmniejszona agresja i zmniejszone reakcje na stres, ewoluowało wielokrotnie poprzez niezależne pochodzenie, często wykorzystując różne ścieżki genetyczne między jaskiniami8,12,13,14,15. Ta powtarzająca się ewolucja jest potężnym aspektem systemu A. mexicanus i może dostarczyć wglądu w bardziej ogólne pytanie, w jaki sposób systemy genetyczne mogą być zaburzone w celu wytworzenia podobnych fenotypów. 
Podczas gdy zastosowanie technologii genetycznej do mechanistycznego badania funkcji genów było ograniczone u wielu gatunków ryb (w tym A. mexicanus), ostatnie postępy w dziedzinie danio pręgowanego stanowią podstawę do rozwoju technologii genetycznej u ryb16,17,18,19,20. Liczne narzędzia są szeroko stosowane u danio pręgowanego do manipulowania ekspresją genów, a realizacja tych procedur od dawna jest ustandaryzowana. Na przykład wstrzyknięcie oligonukleotydów morfolino-olegonukleotydów (MO) na etapie pojedynczej komórki selektywnie blokuje RNA i zapobiega translacji przez krótki okres podczas rozwoju21,22. Ponadto podejścia do edycji genów, takie jak zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/białko 9 związane z CRISPR (Cas9) i nukleaza efektorowa podobna do aktywatora transkrypcji (TALEN), pozwalają na generowanie zdefiniowanych delecji lub, w niektórych przypadkach, insercji poprzez rekombinację w genomach19,20,23,24. Transgeneza jest stosowana do manipulowania stabilną ekspresją lub funkcją genów w sposób specyficzny dla typu komórki. System Tol2 jest skutecznie wykorzystywany do generowania zwierząt transgenicznych poprzez jednoczesne wstrzykiwanie mRNA transpozazy z plazmidem DNA Tol2 zawierającym transgene25,26. System Tol2 wykorzystuje transpozazę Tol2 medaka do generowania stabilnych insercji linii zarodkowej konstruktu transgenicznego17. Generowanie transgeników Tol2 polega na jednoczesnym wstrzyknięciu plazmidu zawierającego transgen otoczony miejscami integracji Tol2 i mRNA dla transpozazy Tol217. System ten został wykorzystany do wygenerowania szeregu linii transgenicznych u danio pręgowanego, a ostatnio jego zastosowanie rozszerzyło się na dodatkowe pojawiające się systemy modelowe, w tym pielęgnice, karpiaki, cierniki, a ostatnio meksykańskie ryby jaskiniowe27,28,29,30. 
Chociaż ryba jaskiniowa jest fascynującym systemem biologicznym do wyjaśniania mechanizmów ewolucji cech, jej pełne możliwości jako modelu ewolucyjnego nie zostały w pełni wykorzystane. Było to częściowo spowodowane niezdolnością do bezpośredniego manipulowania funkcjami genetycznymi i komórkowymi31. Geny kandydujące regulujące złożone cechy zostały zidentyfikowane za pomocą badań loci cech ilościowych (QTL), ale walidacja tych genów kandydujących była trudna32,33,34. Ostatnio przejściowe knockdown za pomocą morpholinos, edycja genów za pomocą systemów CRISPR i TALEN oraz zastosowanie transgenezy za pośrednictwem Tol2 zostały wykorzystane do zbadania podstaw genetycznych leżących u podstaw wielu cech35,36,37,38. Wdrożenie i standaryzacja tych technik pozwoli na manipulacje, które badają molekularne i neuronalne podstawy cech biologicznych, w tym manipulację funkcją genów, znakowanie zdefiniowanych populacji komórek i ekspresję funkcjonalnych reporterów. Podczas gdy pomyślne wdrożenie tych narzędzi genetycznych do manipulowania funkcjami genów lub komórek zostało zademonstrowane w nowych systemach modelowych, w przypadku A. mexicanus nadal brakuje szczegółowych protokołów. 
A. mexicanus dostarcza krytycznego wglądu w mechanizmy ewolucji w odpowiedzi na zmieniające się środowisko i daje możliwość zidentyfikowania nowych genów regulujących różne cechy. Wiele czynników sugeruje, że A. mexicanus jest niezwykle elastycznym modelem do stosowania uznanych narzędzi genomicznych dostępnych obecnie w uznanych modelach genetycznych, w tym zdolności do łatwego utrzymywania ryb w laboratoriach, dużego rozmiaru lęgu, przezroczystości, sekwencjonowanego genomu i zdefiniowanych testów behawioralnych39. W tym miejscu opisano metodologię stosowania morfolinosów, transgenezy i edycji genów w populacjach powierzchniowych i jaskiniowych A. mexicanus. Szersze zastosowanie tych narzędzi u A. mexicanus pozwoli na mechanistyczne badanie procesów molekularnych leżących u podstaw ewolucji różnic rozwojowych, fizjologicznych i behawioralnych między rybami jaskiniowymi a rybami powierzchniowymi.

<table><tbody><tr><td>Hodowla ryb i zaopatrzenie jaj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siatka na ryby o drobnych oczkach</td><td>Penn Plax</td><td>BN4</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz akwarium</td><td>Aqueon</td><td>100106108</td><td></td></tr><tr><td>Pułapki na jajka</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>NA</td><td>Zaprojektuj i stwórz plastikową kratkę do umieszczenia na dnie zbiornika, aby chronić jaja</td></tr><tr><td>Pipety szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Żarówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Foremki do jaj</td><td>Adaptacyjne narzędzia naukowe</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Morpholino supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Control Morpholino</td><td>Gene Tools, LLC</td><td>Standardowa kontrola olio</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowe narzędzia genowe Morpholino</td><td>, LLC</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><<tr><td>em>CRISPR supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cas9 Plasmid</td><td>AddGene</td><td>46757</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA GoTaq</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>KOD Hot Start Taq</td><td>EMD Millipore</td><td>71-842-3</td><td></td></tr><tr><td>Startery</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Niestandardowy</td><td></td></tr><tr><td>zestaw T7 Megascript</td><td>Zestaw Ambion/Thermofisher</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>mMessage Zestaw mMachine T3</td><td>Ambion/Thermofisher</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Zestaw</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>Tol2 transgenesis supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCS-zT2TP</td><td>plazmid Kawakami et al., 2004</td><td>Prośba od starszego autora</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF Restriction Enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SP6 mMessenger Kit</td><td>Ambion/Thermofisher</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Mikroiniekcyjne materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szklane rurki kapilarne</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Picowtryskiwacz</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa mikrofonizatora</td><td>World Precision Instruments</td><td>Podstawa z blachy stalowej, 10 funtów</td><td></td></tr></tbody></table>

manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Zwierzęta jaskiniowe dostarczają fascynującego systemu do badania mechanizmów ewolucyjnych i podstaw genetycznych leżących u podstaw zmian w wielu złożonych cechach, takich jak zwyrodnienie oczu, albinizm, utrata snu, hiperfagia i przetwarzanie sensoryczne. Gatunki ryb jaskiniowych z całego świata wykazują zbieżną ewolucję cech morfologicznych i behawioralnych ze względu na wspólne naciski środowiskowe między różnymi systemami jaskiniowymi. W warunkach laboratoryjnych badano różne gatunki jaskiniowe. Meksykańska tetra, Astyanax mexicanus, z formami widzącymi i niewidomymi, dostarczyła unikalnych spostrzeżeń na temat procesów biologicznych i molekularnych leżących u podstaw ewolucji złożonych cech i jest dobrze przygotowana jako wyłaniający się system modelowy. Podczas gdy geny kandydujące regulujące ewolucję różnych procesów biologicznych zostały zidentyfikowane u A. mexicanus, zdolność do walidacji roli poszczególnych genów była ograniczona. Zastosowanie technologii transgenezy i edycji genów ma potencjał, aby przezwyciężyć tę istotną przeszkodę i zbadać mechanizmy leżące u podstaw ewolucji złożonych cech. W tym miejscu opisujemy inną metodologię manipulowania ekspresją genów u A. mexicanus. Podejścia obejmują wykorzystanie morfolinosów, transgenezy Tol2 i systemów edycji genów, powszechnie stosowanych w danio pręgowanym i innych modelach ryb, do manipulowania funkcją genów u A. mexicanus. Protokoły te zawierają szczegółowe opisy procedur hodowlanych w określonym czasie, pobierania zapłodnionych jaj, wstrzykiwań i selekcji zwierząt modyfikowanych genetycznie. Te podejścia metodologiczne pozwolą na zbadanie mechanizmów genetycznych i neuronalnych leżących u podstaw ewolucji różnorodnych cech u A. mexicanus.

Wiele populacji zamieszkujących jaskinie ryb A. mexicanus wykazuje zredukowany sen oraz zwiększoną czujność/aktywność w porównaniu do ich konspecyficznych osobników żyjących na powierzchni14. Hipokretyna/oreksyna (HCRT) jest wysoce konserwowanym neuropeptydem, który działa zwiększając czujność, a zaburzenia w szlaku HCRT powodują narkolepsję u ludzi i innych ssaków47,48. Wykazaliśmy wcześniej, że jaskiniowe A. mexicanus c...

Opisujemy podejścia do manipulacji genami w systemie modelu ewolucyjnego Astyanax mexicanus. Opisano trzy różne techniki: transgenezę za pośrednictwem Tol2, ukierunkowaną manipulację genomem za pomocą CRISPR/Cas9 oraz knockdown ekspresji za pomocą morpholinos. Narzędzia te powinny ułatwić bezpośrednie badanie genów leżących u podstaw zmienności między formami zamieszkującymi powierzchnię i jaskinie.

Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Zwierzęta jaskiniowe stanowią fascynujący system do badania różnych cech morfologicznych, rozwojowych i behawioralnych. Jednak jednym z czynników ograniczających w tworzeniu tego modelowego systemu jest brak narzędzi genetycznych, które pozwoliłyby nam manipulować funkcją genów. Tutaj pokazujemy trzy różne podejścia do manipulowania funkcją genów u meksykańskiej ryby jaskiniowej, Astyanax mexicanus.Narzędzia te umożliwią zbadanie genów leżących u podstaw naturalnych różnic między rybami powierzchniowymi a jaskiniowymi oraz ich związku z fenotypami. Bethany Stahl, utalentowana doktorantka w moim laboratorium, zademonstruje tę procedurę. Przed rozpoczęciem procedury napełnij 100-mililitrową szalkę Petriego ciepłą 3% agarozą rozpuszczoną w wodzie z systemu rybnego i ostrożnie umieść formę do wstrzykiwania jaj w agarozie pod kątem 45 stopni, a następnie powoli opuść formę do agarozy, aby uniknąć uwięzienia powietrza pod formą.Gdy agaroza zastygnie, ostrożnie usuń formę, a następnie przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Następnie wyciągnij igły z kapilar ze szkła borokrzemianowego i ściągacz igieł do elektrod zgodnie z wytycznymi producenta. W dniu wstrzyknięcia należy za pomocą szklanej pipety przenieść jaja jednokomórkowe do płytki iniekcyjnej, wypełniając do pięciu rzędów płytki iniekcyjnej po 30 do 40 jaj w rzędzie.Utrzymuj jaja nawodnione niewielką ilością wody z systemu rybnego. Rozmrozić Morpholino na lodzie i przygotować roztwór do wstrzykiwań tak, aby wstrzyknąć 400 pikogramów Morpholino na jajko, używając długiej końcówki pipety Microloader lub dodając dwa do czterech mikrolitrów bolusa na końcu. Po załadowaniu wszystkich igieł należy za pomocą kleszczyków odciąć nadmiar długości końcówek igły do wstrzykiwań i zamontować pierwszą igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikrowstrzykiwacza pikolitrowego.Następnie umieść naczynie do wstrzykiwań pod mikroskopem preparacyjnym i użyj mikromanipulatora, aby przeniknąć igłą do każdego jajka przed wstrzyknięciem jednego nanolitra roztworu do wstrzykiwań Morpholino bezpośrednio do żółtka. W przypadku wstrzyknięcia CRISPR wymieszaj 25 pikogramów przewodnikowego RNA z 300 pikogramami informacyjnego RNA związanego z białkiem 9 związanym z CRISPR i wstrzyknij dwa nanolitry powstałego roztworu RNA do każdego zarodka, jak pokazano. W przypadku transpozazy Tol2 i wstrzyknięcia plazmidu flankowanego Tol2 połącz 25 nanogramów na mikrolitr informacyjnego RNA Tol2 z 25 nanogramami na mikrolitr konstruktu plazmidowego Tol2 i czerwienią fenolową w wodzie wolnej od RNaz.Następnie wstrzyknąć jeden nanolitr roztworu do każdego zarodka, jak właśnie pokazano. Aby przeprowadzić badania przesiewowe zwierząt, którym wstrzyknięto Morpholino po czterech dniach od wstrzyknięcia, w zależności od interesującego genu, należy wizualizować larwy ryb pod mikroskopem stereoskopowym, aby obserwować fenotyp wstrzykniętych zwierząt lub nagrywać wideo w celu pomiaru zachowania. Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem indeli CRISPR, przenieś zarodki wstrzyknięte za pomocą CRISPR do probówek PCR i wyekstrahuj DNA zgodnie ze standardowymi protokołami ekstrakcji DNA dla reakcji łańcuchowej polimerazy lub analizy PCR.Aby ocenić mutagenezę, uruchom pięć mikrolitrów produktu PCR na 3% żelu agarozowym o napięciu 70 woltów przez trzy godziny. Niemutagenne DNA typu dzikiego spowoduje powstanie odrębnego prążka, podczas gdy zmutowane DNA stworzy prążek rozmazowy. Jaskinia A mexicanus, któremu wstrzyknięto kontrolny Morpholino, wykazuje znacznie większą aktywność lokomotoryczną i skrócony sen w ciągu 24 godzin, w porównaniu z rybami powierzchniowymi, którym wstrzyknięto jajecznicę Morpholino.Wstrzyknięcie hipokretyny oreksyny Morpholino ma niewielki wpływ na sen u ryb powierzchniowych w porównaniu z rybami z grupy kontrolnej. W przeciwieństwie do tego, knockdown hipokretyny oreksyny poprzez wstrzyknięcie Morfolino ma znaczący wpływ na sen u ryb żyjących w jaskiniach, zapewniając bezpośredni związek między ekspresją hipokretyny oreksyny a utratą snu. Mutageneza genu OCA2 u ryb powierzchniowych za pośrednictwem CRPSR powoduje, że niektóre osobniki są homozygotyczne pod względem dodatniego allelu OCA2 typu dzikiego i są związane z posiadaniem pigmentacji, podczas gdy osoby, które mają dwie kopie ujemnego allelu OCA2 z mutacją CRISPR, są albinosami, co zapewnia bezpośredni związek między zmutowanym genem OCA2 a albinizmem u ryb jaskiniowych.Wybierz dodatni F0 dla transgenu przenoszonego przez Tol2 do krzyżówki wstecznej z typem dzikim, aby wygenerować stabilne linie F1. Umożliwia to obrazowanie wapnia na żywo w celu odkrycia różnic w aktywności neuronalnej, pośredniczenia w zmianach zachowania w środowisku jaskiniowym, kładąc podwaliny pod ekspresję wielu dodatkowych transgenów w celu scharakteryzowania i manipulowania funkcją genów w A mexicanus. Najważniejsze rzeczy, o których należy pamiętać, to szczelne nałożenie jaj na talerz, prawidłowe przycięcie igły i optymalizacja mikroiniekcji.Po udanym nokaucie genetycznym, integracji transgenu lub edycji genów za pośrednictwem CRISPR, ryby te mogą być wykorzystywane do analiz rozwojowych, behawioralnych i aktywności mózgu.

manipulation-of-gene-function-in-mexican-cavefish

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film opisuje technikę nokautowania genów za pomocą mikroiniekcji blokujących translację morfolinosów w stadium jednokomórkowym ryby jaskiniowej. Morfolinos to oligonukleotydy DNA, które wiążą się z komplementarną sekwencją docelowego mRNA i blokują jej translację do białka. W związku z tym morfoliny są używane jako narzędzia molekularne do przejściowego zatrzymywania lub zmniejszania ekspresji genu.

Edycja genów za pośrednictwem morfolino: technika knockdownu genów wykorzystująca translacyjne blokowanie oligonukleotydów morfolino w jednokomórkowych jajach ryb jaskiniowych

W tym artykule demonstrujemy metodę manipulowania ekspresją genów w komórkach komorowych dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino. Przedstawiamy tę metodę jako skuteczny i szybki protokół, który można wykorzystać do badań funkcjonalnych w mózgu dorosłego kręgowca.

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Informujemy tutaj o solidnej i efektywnej ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu mRNA do niezapłodnionych oocytów Branchiostoma lanceolatum. Opracowanie techniki mikroiniekcji w tym podstawowym strunacie utoruje drogę dla dalekosiężnych innowacji technicznych w tym powstającym systemie modelowym, w tym obrazowania in vivo i manipulacji specyficznych dla genów.

Ekspresja białek fluorescencyjnych w Branchiostoma lanceolatum przez wstrzyknięcie mRNA do niezapłodnionych oocytów

Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.

Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

Mutageneza ukierunkowana na geny jest teraz możliwa w szerokim zakresie organizmów przy użyciu technik edycji genomu. W tym miejscu demonstrujemy protokół celowanej mutagenezy genów przy użyciu aktywatora transkrypcji, takiego jak nukleazy efektorowe (TALEN) u Astyanax mexicanus, gatunku ryb, który obejmuje ryby powierzchniowe i jaskiniowe.

Edycja genomu w Astyanax mexicanus przy użyciu nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALEN)

W tym protokole pokazujemy, jak hodować dorosłe osobniki Astyanax mexicanus, hodować larwy i przeprowadzać immunohistochemię na rybach po larwie, aby porównać fenotypy morfotypów powierzchniowych i jaskiniowych.

Hodowla meksykańskiego Tetra Astyanax mexicanus w celu analizy fenotypów postlarwalnych i immunohistochemii całego wierzchowca

Tutaj prezentujemy metody wysokoprzepustowego badania szeregu zachowań meksykańskich ryb jaskiniowych i istotnego barwienia systemu mechanosensorycznego. Metody te wykorzystują wolne oprogramowanie i niestandardowe skrypty, zapewniając praktyczną i opłacalną metodę badania zachowań.

Śledzenie behawioralne i obrazowanie neuromastu meksykańskich ryb jaskiniowych

Ten protokół umożliwia wizualizację ekspresji genów u embrionalnych ryb jaskiniowych Astyanax. Podejście to zostało opracowane w celu maksymalizacji sygnału ekspresji genów, przy jednoczesnej minimalizacji niespecyficznego barwienia tła.

Wholemount Hybrydyzacja in situ dla zarodków Astyanax

Ten protokół szczegółowo opisuje metodologię ilościowego określania zachowań lokomotorycznych i snu u meksykańskich ryb jaskiniowych. Poprzednie analizy zostały rozszerzone o pomiar tych zachowań u ryb trzymanych społecznie. System ten może być szeroko stosowany do badania snu i aktywności innych gatunków ryb.

Zautomatyzowane pomiary snu i aktywności lokomotorycznej u meksykańskich ryb jaskiniowych

Zapłodnienie in vitro jest powszechnie stosowaną techniką z różnymi organizmami modelowymi do utrzymania populacji laboratoryjnych i produkcji zsynchronizowanych zarodków do dalszych zastosowań. Tutaj przedstawiamy protokół, który implementuje tę technikę dla różnych populacji meksykańskiej ryby tetra, Astyanax mexicanus.

Pobieranie gamet i zapłodnienie in vitro Astyanax mexicanus

Ten artykuł przedstawia podstawowe warunki laboratoryjne i protokoły dla reżimu przyrostu temperatury w celu stymulowania maksymalnego tarła u meksykańskiej tetra Astyanax mexicanus, która jest nowym modelem do badań rozwojowych i ewolucyjnych.

Przyrostowe zmiany temperatury dla maksymalnej hodowli i tarła w Astyanax mexicanus

Poznaj techniki manipulacji genami u Astyanax mexicanus: transgenezę Tol2, edycję CRISPR/Cas9 i knockdown morfolinami. Metody te umożliwiają badanie podstaw genetycznych adaptacji ewolucyjnych ryb jaskiniowych.

Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

Przeglądaj więcej filmów