Adsorpcja zarodników jako nierekombinowany system wyświetlania enzymów i antygenów
19 marca 2019
Ten protokół skupia się na wykorzystaniu zarodników bakteryjnych jako "żywego" narzędzia nanobiotechnologicznego do adsorpcji heterologicznych cząsteczek o różnych aktywnościach biologicznych. Przedstawiono również metody pomiaru wydajności adsorpcji.
Żywe zarodniki bakterii wykazujące antygen lub enzymy są funkcjonalnie aktywnymi nanocząstkami, które mogą być stosowane jako szczepionki błony śluzowej lub biokatalizatory. W zasadzie każde białko może być skutecznie adsorbowane przez zarodniki. Ta technika jest prosta i nie wymaga żadnych manipulacji genetycznych.
W związku z tym nie dochodzi do uwalniania organizmów rekombinowanych do środowiska. Oprócz wakcynologii błon śluzowych dla ludzi i zwierząt, zarodniki wykazujące enzymy mogą być opracowywane jako biokatalizatory wielokrotnego użytku. Zacznij od dwukrotnego znakowania oczyszczonych zarodników typu dzikiego B.subtilis dwu-pięcio- lub 10-mikrogramowymi stężeniami modelowego RFP w 200 mikrolitrach buforu wiążącego uzupełnionego 50-milimolowym cytrynianem sodu przez jedną godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza na kołyszącym się shakerze.
Pod koniec inkubacji mieszaniny wiążące należy zagnieździć przez odwirowanie i przenieść supernatanty do nowych stożkowych probówek w celu późniejszej analizy wydajności adsorpcji. Następnie przemyj granulki zarodników dwa razy 200 mikrolitrami buforu wiążącego na pranie, ponownie zawieszając granulki w 100 mikrolitrach świeżego buforu wiążącego po drugim myciu. W celu ekstrakcji białka powierzchniowego dodaj 50 mikrolitrów każdej zaadsorbowanej resuspension zarodników do 50 mikrolitrów 2X dodecylosiarczanu sodu-ditiotreitolu w celu rozpuszczenia powierzchniowych białek przetrwalnikowych.
Po 45 minutach w temperaturze 65 stopni Celsjusza zebrać mieszaniny przez odwirowanie i uruchomić 10 mikrolitrów każdej objętości wyekstrahowanych białek supernatant na western blot, używając monoklonalnego przeciwciała anty-His rozpoznającego znacznik He obecny na N-końcu mRFP w celu identyfikacji znakowanych białek powierzchniowych. Aby zlokalizować i określić ilościowo zaadsorbowane cząsteczki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, dodaj pięć mikrolitrów zaadsorbowanej resuspension zarodników do 95 mikrolitrów PBS i dodaj pięć mikrolitrów każdej powstałej zawiesiny na indywidualne szkiełka mikroskopowe. Umieść szkiełko nakrywkowe nasączone poli-L-lizyną na każdym szkiełku podstawowym i umieść jedno szkiełko na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.
Następnie, dla każdego pola, zapisz obrazy z mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji. Aby przeprowadzić analizę obrazu, otwórz obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej w programie ImageJ i wybierz opcję Obraz i Typ, aby potwierdzić, że wszystkie obrazy są w formacie ośmiobitowym. Z menu Analizuj wybierz opcję Ustaw pomiary i upewnij się, że wybrano opcje Obszar, Zintegrowana gęstość i Średnia wartość szarości.
Użyj narzędzia do rysowania lub zaznaczania, aby narysować linię wokół interesującego nas zarodnika, a następnie wybierz opcję Zmierz z menu Analizuj. Pojawi się wyskakujące okienko ze stosem wartości dla wybranego zarodnika. Po wybraniu co najmniej 50 zarodników wybierz kilka regionów, w których nie ma żadnych zarodników i powtórz pomiar, aby uzyskać odczyt fluorescencji tła.
Po uzyskaniu kilku pomiarów tła skopiuj wszystkie dane w oknie Wyniki do arkusza kalkulacyjnego i oblicz średnią zintegrowanej gęstości w obszarze wybranych zarodników oraz wartości fluorescencji tła, aby uzyskać skorygowaną fluorescencję całkowitą na komórkę. W celu oceny skuteczności adsorpcji pośredniej należy przeprowadzić sześć dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń oczyszczonego mRFP w stężeniu 0,5 nanograma na mikrolitr do końcowej objętości 250 mikrolitrów na rozcieńczenie w buforze wiążącym i odpowiednią liczbę doświadczalną dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń 100 mikrolitrów każdej zarezerwowanej próbki supernatantu zawierającej niezwiązaną frakcję mRFP reakcji adsorpcji ze 100 mikrolitrami buforu wiążącego na rozcieńczenie. Następnie należy przeciąć membranę nitrocelulozową z odcięciem 0,45 mikrometra do rozmiaru dziewięć na 10 centymetrów, aby pokryć obszar rozcieńczenia o wymiarach pięć na sześć kropek rozcieńczenia, nie wychodząc poza krawędź uszczelki aparatu do plam punktowych.
Umieść wstępnie zwilżoną membranę w aparacie do plam punktowych. Sprawdź prawidłowy rozmiar membrany i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione między membraną a uszczelką. Zmontuj aparat do igrania w kropki zgodnie z opisem producenta i przykryj nieużywaną część aparatu, aby zapobiec przepływowi powietrza przez te studzienki.
Gdy aparatura jest gotowa, załadować wzorzec na dwa najbardziej zewnętrzne tory, a próbki na środkowych pasach 100 mikrolitrów każdego odpowiedniego rozcieńczenia na studzienkę. Po załadowaniu wszystkich próbek włącz pompę próżniową na dwie minuty, a następnie zatrzymaj próżnię i pozwól próbkom przefiltrować się grawitacyjnie przez membranę. Po 10 minutach umyj każdą studzienkę 100 mikrolitrami PBS.
Uruchom pompę próżniową na kolejne pięć minut. Gdy bufor myjący całkowicie opróżni się z aparatu, gdy próżnia jest włączona, poluzuj i ostrożnie otwórz aparat do igłówek. Następnie przetworzyć membranę zgodnie ze standardowymi protokołami western blot.
W przypadku analizy densytometrycznej filtru otwórz ImageJ i obrysuj każdą kropkę, aby zmierzyć gęstość zintegrowaną za pomocą polecenia Analizuj, Zmierz, jak pokazano. Aby dokonać korekcji tła obrazu, narysuj okrąg w pustym obszarze i zmierz jego zintegrowaną gęstość, jak pokazano. Skoreluj zintegrowaną gęstość standardowych kropek z ilością załadowanego białka, aby uzyskać linię kalibracyjną i użyj krzywej kalibracyjnej do ekstrapolacji stężenia mRFP w każdej kropce próbki.
Następnie można obliczyć stężenie mRFP pozostającego we frakcjach niezwiązanych. Obecność białek o oczekiwanej wielkości tylko w pasach obciążonych ekstraktem zaadsorbowanych zarodników wskazuje na udaną reakcję adsorpcji. Bezpośrednia ocena skuteczności adsorpcji zależy od zastosowanego białka heterologicznego i może być przeprowadzona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytofluorymetrii frakcji osadu po frakcjonowaniu reakcji adsorpcji.
Kwantyfikacja sygnałów fluorescencyjnych obecnych na zarodnikach może być następnie przeprowadzona za pomocą ImageJ, jak pokazano. Pośrednią analizę skuteczności adsorpcji można przeprowadzić za pomocą analizy punktowej frakcji supernatantu zawierającej białko niezwiązane, a późniejsza analiza densytometryczna białka niezwiązanego pozwala na pośrednie obliczenie ilości białka zaadsorbowanego na zarodnikach. Chociaż w zasadzie każde białko może być adsorbowane do stosowania jako szczepionki śluzówkowe lub biokatalizatory, w praktyce skuteczność adsorpcji zależy od miejsc białkowych i właściwości chemicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół demonstruje wykorzystanie przetrwalników bakteryjnych jako funkcjonalnych nanocząsteczek do adsorpcji cząsteczek heterologicznych. Przetrwalniki te mogą służyć jako szczepionki śluzówkowe lub biokatalizatory, zapewniając prostą metodę, która pozwala uniknąć manipulacji genetycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nanobiotechnologia
- Immunologia
- Biokataliza
Wprowadzenie
- Zarodniki bakteryjne mogą eksponować antygeny lub enzymy.
- Pełnią one funkcję aktywnych nanocząsteczek.
- Technika ta nie wiąże się z uwalnianiem organizmów rekombinowanych do środowiska.
- Zastosowania obejmują wakcynologię błon śluzowych oraz biokatalizę opartą na enzymach.
Cel badania
- Zbadanie możliwości wykorzystania przetrwalników bakterii do adsorpcji białek.
- Opracowanie metody tworzenia szczepionek śluzówkowych.
- Zbadanie potencjału przetrwalników jako biokatalizatorów wielokrotnego użytku.
Zastosowane metody
- Znakowanie oczyszczonych przetrwalników szczepu dzikiego B.subtilis modelowym białkiem RFP.
- Zastosowanie różnych stężeń RFP w buforze wiążącym.
- Przeprowadzenie eksperymentu w temperaturze 25 °C na wytrząsarce orbitalnej.
- Pomiar wydajności adsorpcji.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia efektywną adsorpcję białek na zarodnikach.
- Wykazano potencjał w opracowywaniu szczepionek śluzówkowych.
- Kierunek ten okazał się wykonalny w kontekście tworzenia biokatalizatorów wielokrotnego użytku.
- Przedstawiono prostą, niegenetyczną metodę adsorpcji białek.
Wnioski
- Zarodniki bakterii są skutecznymi narzędziami do adsorpcji białek.
- Mogą być one wykorzystywane w opracowywaniu szczepionek oraz biokatalizatorów.
- Metoda ta jest prosta i bezpieczna dla środowiska.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Adsorpcja na zarodnikach zapewnia platformę niezależną od rekombinacji genetycznej do prezentacji enzymów i antygenów, umożliwiając szybki rozwój szczepionek śluzówkowych oraz wielokrotnie używanych biokatalizatorów bez konieczności modyfikacji genetycznych. To podejście zmniejsza ryzyko dla środowiska i upraszcza stabilizację białek w niekorzystnych warunkach. Metoda wspiera wczesne etapy walidacji celów terapeutycznych i rozwój testów, oferując stabilny, ilościowy system prezentacji do ekraningu funkcjonalnego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju bioproduktów leczniczych
Wczesne Odkrycie i Walidacja Celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji białek poprzez prezentację na powierzchni stabilnych zarodników, wspierając testowanie hipotez dotyczących celów badawczych.
- Wartość operacyjna: Unika konstruowania szczepów rekombinowanych, skracając harmonogram i zmniejszając złożoność biobezpieczeństwa na wczesnym etapie odkrywania.
Opracowywanie testów i badania wstępne
- Wartość naukowa: Zapewnia ilościowe metryki wydajności adsorpcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i metody dot blot, umożliwiając standaryzację testów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wielokrotne wykorzystywanie enzymów przyłączonych do zarodników w kolejnych cyklach reakcji, poprawiając przepustowość badań i oszczędność odczynek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera rozwój szczepionek śluzówkowych poprzez stabilizację adsorbowanych antygenów przed degradacją, zwiększając istotność immunologiczną.
- Wartość operacyjna: Ułatwia skalowalną produkcję opartych na zarodnikach biokatalizatorów do testowania aktywności enzymatycznej na etapie przedklinicznym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda integruje się z wczesnymi etapami badań jako system ekspresji do walidacji celów, przechodzi do etapu badań poprzez ilościowe odczyty adsorpcji, a także wspiera ciągłość prac przedklinicznych dzięki możliwości wielokrotnego wykorzystywania prezentowanych antygenów lub enzymów.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia funkcjonalne badanie kandydatów białkowych poprzez prezentację na powierzchni bez konieczności inżynierii genetycznej.
- Badania selekcyjne: Generuje ilościowe dane fluorescencyjne i densytometryczne w celu porównania skuteczności adsorpcji w różnych warunkach.
- Analiza: Wykorzystuje pomiary gęstości całkowitej oparte na programie ImageJ oraz kalibrację testu plamkowego do dokładnego określenia frakcji związanych i nieswiązanych.
- Badania translacyjne: Wiąże się z rozwojem szczepionek i biokatalizatorów dzięki stabilizowanym funkcjonalnym białkom prezentowanym na powierzchni.
- Powtarzalne wykorzystanie w przemyśle: Prezentuje zarodniki jako regenerowalną platformę umożliwiającą wielokrotne cykle adsorpcji, co zmniejsza długoterminowe koszty odczynników.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa wiarygodność przewidywań poprzez zachowanie aktywności i struktury białek dzięki stabilizacji za pomocą zarodników.
- Wartość operacyjna: Standardyzuje prezentację białek za pomocą odtwarzalnych protokołów adsorpcji i etapów przemywania.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza ryzyko biologiczne w późnych etapach poprzez unikanie organizmów rekombinowanych i umożliwienie bezpiecznego dla środowiska wdrożenia.
- Wpływ na portfel projektów: Wspiera postęp kandydatów na szczepionki i enzymy z uwzględnieniem ryzyka dzięki reużywalnym systemom prezentacji nie wymagającym zgodności z GMP.
Zagadnienia dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w znakowaniu białek, mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizie typu dot blot.
- Zależy od dostępu do wirówek, szakerów obrotowych, mikroskopów fluorescencyjnych oraz oprogramowania ImageJ do analizy ilościowej.
- Wymaga standaryzacji warunków buforu wiązania i oczyszczania spor między różnymi zespołami.
- Skuteczność adsorpcji zależy od chemii powierzchni białka i wymaga optymalizacji empirycznej dla każdego celu.
- Ponowne wykorzystywanie spor jest ograniczone stopniową utratą aktywności w kolejnych cyklach, co wymaga okresowych kontroli jakości.
