Name: Adsorpcja zarodników jako nierekombinowany system wyświetlania enzymów i antygenów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj metodę adsorpcji białek na zarodnikach bakteryjnych Bacillus subtilis do tworzenia szczepionek śluzowych i biokatalizatorów. Technika jest prosta, nie wymaga modyfikacji genetycznych i jest bezpieczna dla środowiska.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" do L. Baccigalupi, tytuł projektu "SP-LAY: Zarodniki bakteryjne jako żywa platforma do wyświetlania białek".

1. Reakcja adsorpcji
<ol>
	<li>Inkubować 2, 5 i 10 μg mRFP z 2 x 109 oczyszczonymi zarodnikami B. subtilis typu dzikiego w 200 μl buforu wiążącego, 50 mM cytrynianu sodu, pH 4,0 (16,7 mM cytrynian sodu dwuwodny; 33,3 mM kwas cytrynowy) przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C na kołyszącej się wytrząsarce (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Odwirować mieszaniny wiążące (13 000 x g przez 10 min) w celu frakcjonowania granulek (P2, P5 i P10) i supernatantów (S2, S5 i S10). Przechowywać supernatanty w celu pośredniej oceny skuteczności adsorpcji opisanej w kroku 3.2.</li>
	<li>Przemyć granulki 2x 200 μL buforu wiążącego i ponownie zawiesić je w 100 μl buforu wiążącego i użyć do następnej analizy. 
	UWAGA: Reakcja wiązania zachodzi preferencyjnie przy wartości pH niższej niż punkt izoelektryczny białka; zazwyczaj stosuje się 1,5 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), pH 4,0 lub 50 mM cytrynianu sodu, pH 4,0.</li>
</ol>
2. Bezpośrednia ocena efektywności adsorpcji
<ol>
	<li>Ekstrakcja białek powierzchniowych i analiza western blot
	<ol>
		<li>Weź 50 μl reprodukcji zarodników zaadsorbowanych przez mRFP (P2, P5 i P10 z kroku 1.3) i dodaj 50 μl 2x dodecylosiarczanu sodu (SDS)-ditiotreitolu (DTT) (0,1 M Tris-HCl, pH 6,8; 2% SDS; 0,1 M DTT), aby rozpuścić powierzchniowe białka przetrwalnikowe.</li>
		<li>Używaj wolnego, oczyszczonego mRFP i ekstraktów z tych samych ilości zarodników, które nie są adsorbowane do białka, jako odpowiednio kontroli pozytywnej i ujemnej.</li>
		<li>Po 45 minutach inkubacji w temperaturze 65 °C, odwirować (13 000 x g przez 10 minut) mieszaniny i przeanalizować 10 μl wyekstrahowanych białek (supernatantu) metodą western blot z przeciwciałem monoklonalnym anty-His rozpoznającym znacznik He obecny na N-końcu mRFP (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacje mikroskopem fluorescencyjnym 
	UWAGA: Stosując fluorescencyjne białka heterologiczne lub przeprowadzając analizę immunofluorescencyjną, możliwe jest zlokalizowanie i ilościowe określenie zaadsorbowanych cząsteczek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
	<ol>
		<li>Weź 5 μl rekompozycji zaadsorbowanych zarodników z kroku 1.3 i dodaj 95 μL 1x PBS, pH 4,0, aby uzyskać ~1 x 106 zarodników/μL.</li>
		<li>Umieścić 5 μl zawiesiny na szkiełku mikroskopowym, przykryć je szkiełkiem nakrywkowym uprzednio potraktowanym poli-l-lizyną przez 30 s i obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
		<li>Dla każdego pola zapisz obraz z mikroskopii z kontrastem fazowym i obraz z mikroskopii fluorescencyjnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
		UWAGA: Alternatywnie, zarodniki fluorescencyjne można analizować za pomocą cytofluorymetrii. Ponownie zawiesić łącznie 106 zarodników zaadsorbowanych lub niezaadsorbowanych białkiem heterologicznym w 1 ml 1x PBS, pH 4,0 i przeanalizować zawiesinę za pomocą cytometru przepływowego (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych za pomocą ImageJ
	<ol>
		<li>Otwórz obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą oprogramowania ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) i sprawdź, czy wszystkie obrazy są w formacie 8-bitowym (punkt menu Obraz | Rodzaj | 8-bitowy).</li>
		<li>W razie potrzeby dostosuj kontrast (punkt menu Obraz | Dostosuj | Jasność Kontrast) i sprawdź, czy skala obrazu to PIKSEL (Obraz | Ustaw skalę).</li>
		<li>Z menu Analizuj wybierz opcję Ustaw miary. Upewnij się, że wybrano opcje Obszar, Gęstość zintegrowana i Średnia wartość szarości.</li>
		<li>Narysuj linię wokół interesującego Cię zarodnika za pomocą dowolnego narzędzia do rysowania/zaznaczania (np. koła, wielokąta lub dowolnego kształtu) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Wybierz Mierz z menu Analizuj (lub naciśnij cmd + M). Pojawia się wyskakujące okienko ze stosem wartości dla tego pierwszego zarodnika (Rysunek 3).</li>
		<li>Powtórz te dwa kroki dla co najmniej 50 innych zarodników w polu widzenia wybranym do pomiaru.</li>
		<li>Wybierz kilka obszarów bez żadnych zarodników (które nie mają fluorescencji) i powtórz pomiar; będzie to tło. 
		UWAGA: Rozmiar nie jest ważny. Te odpowiednie wartości fluorescencji tła zostaną użyte do ręcznego odjęcia tła.</li>
		<li>Zaznacz wszystkie dane w oknie Wyniki i skopiuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego.</li>
		<li>Obliczyć średnią zintegrowanej gęstości i powierzchni wybranych zarodników oraz wartości fluorescencji tła i wykorzystać je do uzyskania skorygowanej całkowitej fluorescencji na komórkę (CTCF) przy użyciu wzoru: CTCF = średnia gęstość zintegrowana - (średnia powierzchnia x średnia fluorescencja tła). 
		UWAGA: Alternatywnie, jeśli wszystkie zarodniki wydają się dobrze oddzielone, możliwe jest przeanalizowanie wszystkich zarodników pola obrazu za pomocą funkcji Analizuj cząstki, postępując zgodnie z instrukcją ImageJ. Aby uniknąć sytuacji, w której oprogramowanie odczytuje określone agregaty fluorescencji lub zarodników, wymiar cząstek musi być ustawiony na pikselˆ2 = 50-200 (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pośrednia ocena efektywności adsorpcji
<ol>
	<li>Przygotować seryjne rozcieńczenia dla oczyszczonego białka.
	<ol>
		<li>Przygotować pierwszą probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą 250 μl oczyszczonego mRFP o końcowym stężeniu 0,5 ng/μl, używając buforu wiążącego. Ta objętość jest wystarczająca do załadowania dwóch pasów ruchu.</li>
		<li>Wykonać sześć dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych po 250 μl (objętość końcowa) każde, używając buforu wiążącego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować dwukrotne seryjne rozcieńczenia dla próbek sklarowanych nad osadem zawierających niezwiązaną frakcję mRFP reakcji adsorpcji (S2, S5 i S10 z kroku 1.2).
	<ol>
		<li>Umieścić 100 μl każdego supernatantu w probówce o pojemności 1,5 ml i dodać 100 μl buforu wiążącego. Wykonać sześć dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych po 200 μl (objętość końcowa) każde, używając buforu wiążącego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyciąć membranę nitrocelulozową (odcięcie 0,45 μm) o wymiarach 9 cm x 10 cm, aby pokryć obszar 5 (liczba próbek) x 6 (liczba rozcieńczeń) punktów. Membrana nie powinna wystawać poza krawędź uszczelki aparatu do igłówek.</li>
	<li>Umieść wstępnie zwilżoną membranę w aparacie do plam punktowych. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione między membraną a uszczelką. Przykryj nieużywaną część aparatu taśmą lub folią parafinową, aby zapobiec przepływowi powietrza przez te studzienki.</li>
	<li>Zmontuj aparat do igrania w kropki zgodnie z opisem producenta.</li>
	<li>Jeśli podczas montażu używana jest próżnia, należy ponownie uwodnić membranę 100 μl 1x PBS na studzienkę, aby zapewnić równomierne wiązanie antygenu i zapobiec powstawaniu halo lub słabego sygnału wykrywania.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij bufor ze studzienek za pomocą podciśnienia. Gdy tylko roztwór buforowy spłynie ze wszystkich studzienek, zatrzymaj pompę próżniową i odłącz ją.</li>
	<li>Załaduj wzorzec na dwa najbardziej zewnętrzne pasy, a próbki na środku (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). Napełnić odpowiednie studzienki 100 μl każdego rozcieńczenia. Ta sama objętość użyta dla każdej studzienki powinna zapewnić jednorodną filtrację wszystkich studzienek na próbki.</li>
	<li>Włącz pompę próżniową na 2 minuty, zatrzymaj ją, a następnie pozwól próbce przefiltrować się przez membranę przez przepływ grawitacyjny.</li>
	<li>Umyć wszystkie studzienki 100 μl 1x PBS i pozostawić pompę próżniową na pracę przez kolejne 5 minut po całkowitym opróżnieniu buforu płuczącego z aparatu.</li>
	<li>Przy włączonym odkurzaczu poluzuj i ostrożnie otwórz aparat do iluminacji punktowej.</li>
	<li>Wyłącz próżnię, weź membranę i przetwarzaj ją zgodnie z protokołem western blot.</li>
	<li>Wykonaj analizę densytometryczną filtra przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, takiego jak ImageJ.
	<ol>
		<li>Zmierz zintegrowaną gęstość każdej kropki, obrysowując je okręgiem o tym samym obszarze i używając polecenia Analizuj/Mierz.</li>
		<li>Dokonaj korekcji tła obrazu, rysując okrąg w pustym obszarze i mierząc jego zintegrowaną gęstość lub używając polecenia Przetwarzaj/Odejmij tło.</li>
		<li>Skoreluj zintegrowaną gęstość punktów wzorcowych z ilością załadowanego białka i uzyskaj linię kalibracyjną (wartości R2 dla krzywych kalibracyjnych powinny przekraczać 0,95).</li>
		<li>Użyj krzywej kalibracyjnej, aby ekstrapolować stężenie mRFP w każdej kropce próbki.</li>
		<li>Obliczyć stężenie mRFP pozostającego we frakcjach niezwiązanych. 
		UWAGA: Aby zapewnić prawidłowe zamknięcie aparatu do igrania, a tym samym poddać membranę równomiernemu ciśnieniu, dokręć zgodnie ze schematem skrzyżowanym po przekątnej, a następnie otwórz pompę próżniową, aby mocniej dokręcić.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zbieranie i ponowne wykorzystanie zarodników
<ol>
	<li>W celu recyklingu zaadsorbowanych zarodników należy przeprowadzić dwie reakcje adsorpcji 2,0 x 109 oczyszczonych zarodników z 10 μg oczyszczonej ksylanazy GH10-XA lub 10 μg oczyszczonej β-ksylozydazy GH3-XT, jak opisano w krokach 1.1-1.3 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6A).</li>
	<li>Zebrać granulki zawierające zaadsorbowane przez enzym zarodniki, zawiesić je ponownie w 50 μl optymalnego buforu do testu reakcji enzymatycznej (50 mM bufor fosforanu sodu o pH 6,5; 2,48689 g/L Na2HPO4, 4,88991 g/L NaH2PO4) i wymieszać je ze sobą w celu uzyskania 100 μl mieszaniny zarodników adsorbujących GH10-XA lub GH3-XT.</li>
	<li>Dodać substrat (5 mg/ml 4-O-metylo-d-glukuronod-ksylanu [MGX]) i pozostawić reakcje enzymatyczne na 16 godzin w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną należy odwirować (przez 15 minut przy 13 000 x g) i przechowywać supernatant zawierający produkt reakcji enzymatycznej.</li>
	<li>Zawiesić osad w 100 μl świeżego 50 mM buforu fosforanu sodu o pH 6,5 w obecności nowego podłoża (MGX) (<klasa silna = "xfig">Rysunek 6B). 
	UWAGA: Aby adsorpować więcej niż jeden enzym, możliwe jest adsorpowanie obu razem lub pojedynczo niezależnie. Ta ostatnia możliwość ułatwia ilościową analizę wydajności adsorpcji i aktywności każdego enzymu, umożliwiając równowagę stechiometryczną każdego enzymu potrzebnego do reakcji.</li>
</ol>

<ol><li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li>
<li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li>
<li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li>
<li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li>
<li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li>
<li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li>
<li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li>
<li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+surface+display%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li>
<li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115(2014).</li>
<li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li>
<li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li>
<li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E. Display of molecules on the spore surface. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIsticato%2C+R+%22Bacterial+Spore+Formers%3A+Probiotics+and+Emerging+Applications%22">Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications</a>. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. , Horizon Bionsciences. Norfolk, UK. 193-200 (2004).</li>
<li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+%CE%B2-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100(2012).</li>
<li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li>
<li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaccigalupi%2C+L+%22Probiotics+and+Prebiotics%3A+Current+Research+and+Future+Trends%22">Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends</a>. Venema, K., Do Carmo, A. P. , Caister Academic Press. 93-103 (2014).</li>
<li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Reviews+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li>
<li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+cell-surface+display%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li>
<li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li>
<li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li>
<li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98(2013).</li>
<li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218(2017).</li>
<li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li>
<li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153(2016).</li>
<li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li>
<li>Cutting, S., Vander Horn, P. B. Genetic analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCutting%2C+S+%22Molecular+Biological+Methods+for+Bacillus%22">Molecular Biological Methods for Bacillus</a>. Harwood, C., Cutting, S. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. (1990).</li>
<li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten protokół adsorpcji zarodników jest bardzo prosty i nieskomplikowany. Reakcja jest ściśle zależna od pH buforu reakcyjnego, a wydajność adsorpcji jest optymalna przy kwaśnych wartościach pH (pH 5,0 lub niższym). W neutralnych warunkach pH skuteczność adsorpcji jest niska, a przy zasadowych wartościach pH adsorpcja może nie wystąpić. Optymalna adsorpcja uzyskuje się przy użyciu objętości 200 μl w probówkach o pojemności 1,5 ml (lub przy zachowaniu podobnych proporcji) na wytrząsarce kołyszącej.
<p class="jove_conte...

Systemy wyświetlania mają na celu prezentację biologicznie aktywnych cząsteczek na powierzchni mikroorganizmów i znajdowanie zastosowań w różnych dziedzinach, od przemysłowych po medyczne i środowiskowe biotechnologie. Oprócz fagów1,2 oraz komórek różnych gatunków Gram-ujemnych i -dodatnich3,4,5,6,7, zarodniki bakterii zostały również zaproponowane jako systemy wyświetlania na dwa sposoby8,9.
Ze względu na swoją specyficzną strukturę, a mianowicie odwodnioną cytoplazmę otoczoną szeregiem warstw ochronnych10, zarodnik ma kilka zalet w porównaniu z systemami wyświetlania opartymi na fagach i komórkach8,9. Pierwszą zaletą jest wyjątkowa wytrzymałość i stabilność zarodników w warunkach, które byłyby szkodliwe dla wszystkich innych komórek10,11. Antygeny i enzymy wykazywane przez przetrwalniki są stabilne po długotrwałym przechowywaniu w temperaturze pokojowej12 i chronione przed degradacją przy niskim pH i wysokich temperaturach13. Drugą zaletą zarodników jest bezpieczeństwo wielu gatunków tworzących przetrwalniki. B. subtilis, B. clausii, B. coagulans i kilka innych gatunków są stosowane na całym świecie jako probiotyki i są dostępne na rynku do stosowania u ludzi lub zwierząt od dziesięcioleci14,15. Ten wyjątkowy rekord bezpieczeństwa jest oczywistym ogólnym wymogiem dla systemu wyświetlania powierzchniowego i ma szczególne znaczenie, gdy system jest przeznaczony do użytku przez ludzi lub zwierzęta16. Trzecią, ważną zaletą systemu wyświetlania opartego na zarodnikach jest to, że nie ma ograniczeń co do wielkości cząsteczki, która musi być wystawiona. W systemach opartych na fagach duże białko heterologiczne może wpływać na strukturę kapsydu, podczas gdy w systemach opartych na komórkach może wpływać na strukturę błony lub może ograniczać/upośledzać etap translokacji błony17. Warstwy ochronne otaczające zarodnik składają się z ponad 70 różnych białek10 i są wystarczająco elastyczne, aby przyjąć duże obce białka bez żadnych widocznych wad strukturalnych lub upośledzenia funkcjonalnego8. Ponadto, w przypadku obu systemów wyświetlania opartych na przetrwalnikach, translokacja błonowa białka heterologicznego nie jest wymagana8,9. Rzeczywiście, białka heterologiczne są albo wytwarzane w cytoplazmie komórki macierzystej i składane na zarodniku, który tworzy się w tej samej cytoplazmie, albo adsorbowane na dojrzałym zarodniku 8,9.
Wyświetlanie zarodników zostało początkowo uzyskane poprzez opracowanie systemu genetycznego do inżynierii powierzchni zarodników18. Ten system genetyczny opierał się na i) budowie fuzji genów między genem kodującym białko płaszcza przetrwalnikowego (używanym jako nośnik) a genem kodującym białko, które ma być wyświetlane - obecność sygnałów transkrypcyjnych i translacyjnych genu endogennego będzie kontrolować ekspresję fuzji, oraz ii) integracji genu chimerycznego z B. subtilis chromosomu, aby zapewnić stabilność genetyczną. To podejście rekombinacyjne wykazało różnorodność antygenów i enzymów, wykorzystując różne białka powierzchniowe zarodników jako nośniki i dążąc do różnych potencjalnych zastosowań, od szczepionki śluzówkowej po biokatalizator, bioczujnik, bioremediację lub narzędzie bioanalityczne8,13.
Ostatnio opracowano inne podejście do wyświetlania zarodników19. Ten drugi system jest nierekombinowany i opiera się na spontanicznej i niezwykle ścisłej adsorpcji cząsteczek na powierzchni zarodników9. Antygeny19,20 i enzymy13,21 zostały skutecznie wyświetlone i wykazały, że ta metoda jest znacznie bardziej efektywna niż metoda rekombinowana. To nierekombinowane podejście pozwala na wyświetlanie białek w formie natywnej20 i może być również używane z autoklawowanymi zarodnikami śmierci19. Molekularny mechanizm adsorpcji nie został jeszcze w pełni wyjaśniony. Ładunek ujemny i hydrofobowość zarodnika zostały zaproponowane jako właściwości istotne dla adsorpcji13,19,22. Ostatnio wykazano, że białko modelowe, czerwone białko autofluorescencyjne (mRFP) koralowca Discosoma, po adsorpcji do zarodnika, było w stanie przeniknąć przez warstwy powierzchniowe zlokalizowane w powłoce wewnętrznej23. Jeśli okaże się to prawdą w przypadku innych białek, wewnętrzna lokalizacja heterologicznych białek może wyjaśnić ich zwiększoną stabilność po adsorpcji do zarodników23.
W niedawnym badaniu, dwa enzymy katalizujące dwa kolejne etapy szlaku degradacji ksylanu były niezależnie wyświetlane na zarodnikach B. subtilis i, gdy były inkubowane razem, były w stanie przeprowadzić oba etapy degradacji21. Zarodniki zebrane po reakcji były nadal aktywne i zdolne do kontynuowania degradacji ksylanu po dodaniu świeżego substratu21. Nawet jeśli w drugim procesie reaction21 zaobserwowano utratę około 15% produktu końcowego, to dodatkowym ważnym atutem systemu wyświetlania zarodników jest możliwość ponownego wykorzystania zaadsorbowanych enzymów w reakcjach jedno- jak i wieloetapowych.
Pan et al.24 opisali dodatkowe podejście do wyświetlania heterologicznych białek na powierzchni zarodników: heterologiczne białka (białko endoglukanazy i białko beta-galaktozydazy) wytwarzane w komórce macierzystej podczas zarodnikowania były spontanicznie zamknięte w tworzącej się otoczce zarodników, bez potrzeby stosowania nośnika. Ten dodatkowy system wyświetlania zarodników jest połączeniem dwóch opisanych do tej pory podejść. Rzeczywiście, jest rekombinowany, ponieważ heterologiczne białka zostały zaprojektowane tak, aby ulegały ekspresji w komórce macierzystej podczas zarodnikowania, podczas gdy ich składanie w płaszczu było spontaniczne, a zatem nierekombinowane24. Jednak skuteczność wyświetlania tego dodatkowego podejścia musi zostać przetestowana i porównana z pozostałymi dwoma podejściami przy użyciu tych samych białek heterologicznych.
Obecny protokół wyklucza procesy produkcji i oczyszczania zarodników, które zostały szczegółowo opisane gdzie indziej24. Obejmuje ona reakcję adsorpcji, ocenę skuteczności adsorpcji za pomocą mikroskopii punktowej i fluorescencyjnej oraz recykling zaadsorbowanych enzymów do dodatkowych rund reakcyjnych.

<table><tbody><tr><td>0,1% roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mikro; m Nitceluloza Blotting Membrane</td><td>Sartorius</td><td>M_Blotting_Membranes</td><td></td></tr><tr><td>100 razy; obiektywny UPlanF1&nbsp;</td><td>Sprzęt</td><td></td> <td>mikroskopowy Olympus</td></tr><tr><td>Bacillus subtilis&nbsp; szczep NCIB3610</td><td>Bacillus Genetic Stock Center</td><td>3A1</td><td></td></tr><tr><td>BD ACCURI C6 PLUS</td><td>BD</td><td>cytometr</td><td></td>przepływowy</tr><tr><td>BX51</td><td>Olympus</td><td>Mikroskop</td><td></td>fluorescencyjny</tr><tr><td>Clarity</td><td>Biorad</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>DP70 aparat cyfrowy a</td><td>sprzęt</td><td></td><td>mikroskopowy Olympus</td></tr><tr><td>Kozioł anty-królik IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, FITC</td><td>Thermo fisher</td><td>F-2754</td><td></td></tr><tr><td>Kozia IgG Przeciw Królikowi H& L (HRP)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalna anty-polihistydyna&minus; Przeciwciało przeciwko peroksydazie</td><td>Sigma</td><td>A7058-1VL</td><td>służy do wykrywania zaadsorbowanych białek prezentujących znacznik 6xhistydyny na końcu C lub N&nbsp;</td></tr><tr><td>Bezpieczny poślizg&nbsp; szkiełko nakrywkowe</td><td>szklane Sigma</td><td>S1815-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Superbiałe nienaładowane szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>75836-190</td><td></td></tr><tr><td>U-CA Zmieniacz powiększenia&nbsp;</td><td>Sprzęt</td><td></td> <td>do mikroskopów Olympus</td></tr></tbody></table>

adsorpcja zarodników jako nierekombinowany system wyświetlania enzymów i antygenów

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Zarodnik bakteryjny to metabolicznie spokojna komórka, utworzona przez szereg warstw ochronnych otaczających odwodnioną cytoplazmę. Ta osobliwa struktura sprawia, że zarodnik jest niezwykle stabilny i odporny, co sugeruje użycie zarodnika jako platformy do wyświetlania heterologicznych cząsteczek. Do tej pory na przetrwalnikach Bacillus subtilis i kilku innych gatunków wykazano różne antygeny i enzymy, początkowo metodą rekombinacyjną, a następnie prostą i skuteczną metodą nierekombinowaną. Nierekombinowany system wyświetlania opiera się na bezpośredniej adsorpcji heterologicznych cząsteczek na powierzchni zarodników, unikając budowy rekombinowanych szczepów i uwalniania genetycznie zmodyfikowanych bakterii do środowiska. Zaadsorbowane cząsteczki są stabilizowane i chronione przez oddziaływanie z zarodnikami, co ogranicza szybką degradację antygenów i utratę aktywności enzymu w niesprzyjających warunkach. Po użyciu, enzymy zaadsorbowane przez zarodniki mogą być łatwo zebrane przy minimalnym zmniejszeniu aktywności i ponownie wykorzystane do dodatkowych rund reakcyjnych. W artykule pokazano, jak adsorbować cząsteczki modelowe do oczyszczonych zarodników B. subtilis, jak oceniać skuteczność adsorpcji oraz jak zbierać zużyte zarodniki w celu recyklingu ich do nowych reakcji.

Prawidłowość adsorpcji można ocenić za pomocą western blotu. Po zakończeniu reakcji mieszaninę frakcjonuje się poprzez wirowanie i przemywa, a frakcję osadu (Rysunek 1) wykorzystuje się do ekstrakcji białek powierzchniowych. Ekstrakt jest frakcjonowany za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS (PAGE), przenoszony elektrycznie na membranę z polifluorurenu poliwinyldenu (PVDF), a następnie poddawany reakcji z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi. ...

Ten protokół skupia się na wykorzystaniu zarodników bakteryjnych jako "żywego" narzędzia nanobiotechnologicznego do adsorpcji heterologicznych cząsteczek o różnych aktywnościach biologicznych. Przedstawiono również metody pomiaru wydajności adsorpcji.

Adsorpcja zarodników jako nierekombinowany system wyświetlania enzymów i antygenów

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Żywe zarodniki bakterii wykazujące antygen lub enzymy są funkcjonalnie aktywnymi nanocząstkami, które mogą być stosowane jako szczepionki błony śluzowej lub biokatalizatory. W zasadzie każde białko może być skutecznie adsorbowane przez zarodniki. Ta technika jest prosta i nie wymaga żadnych manipulacji genetycznych.W związku z tym nie dochodzi do uwalniania organizmów rekombinowanych do środowiska. Oprócz wakcynologii błon śluzowych dla ludzi i zwierząt, zarodniki wykazujące enzymy mogą być opracowywane jako biokatalizatory wielokrotnego użytku. Zacznij od dwukrotnego znakowania oczyszczonych zarodników typu dzikiego B.subtilis dwu-pięcio- lub 10-mikrogramowymi stężeniami modelowego RFP w 200 mikrolitrach buforu wiążącego uzupełnionego 50-milimolowym cytrynianem sodu przez jedną godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza na kołyszącym się shakerze.Pod koniec inkubacji mieszaniny wiążące należy zagnieździć przez odwirowanie i przenieść supernatanty do nowych stożkowych probówek w celu późniejszej analizy wydajności adsorpcji. Następnie przemyj granulki zarodników dwa razy 200 mikrolitrami buforu wiążącego na pranie, ponownie zawieszając granulki w 100 mikrolitrach świeżego buforu wiążącego po drugim myciu. W celu ekstrakcji białka powierzchniowego dodaj 50 mikrolitrów każdej zaadsorbowanej resuspension zarodników do 50 mikrolitrów 2X dodecylosiarczanu sodu-ditiotreitolu w celu rozpuszczenia powierzchniowych białek przetrwalnikowych.Po 45 minutach w temperaturze 65 stopni Celsjusza zebrać mieszaniny przez odwirowanie i uruchomić 10 mikrolitrów każdej objętości wyekstrahowanych białek supernatant na western blot, używając monoklonalnego przeciwciała anty-His rozpoznającego znacznik He obecny na N-końcu mRFP w celu identyfikacji znakowanych białek powierzchniowych. Aby zlokalizować i określić ilościowo zaadsorbowane cząsteczki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, dodaj pięć mikrolitrów zaadsorbowanej resuspension zarodników do 95 mikrolitrów PBS i dodaj pięć mikrolitrów każdej powstałej zawiesiny na indywidualne szkiełka mikroskopowe. Umieść szkiełko nakrywkowe nasączone poli-L-lizyną na każdym szkiełku podstawowym i umieść jedno szkiełko na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.Następnie, dla każdego pola, zapisz obrazy z mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji. Aby przeprowadzić analizę obrazu, otwórz obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej w programie ImageJ i wybierz opcję Obraz i Typ, aby potwierdzić, że wszystkie obrazy są w formacie ośmiobitowym. Z menu Analizuj wybierz opcję Ustaw pomiary i upewnij się, że wybrano opcje Obszar, Zintegrowana gęstość i Średnia wartość szarości.Użyj narzędzia do rysowania lub zaznaczania, aby narysować linię wokół interesującego nas zarodnika, a następnie wybierz opcję Zmierz z menu Analizuj. Pojawi się wyskakujące okienko ze stosem wartości dla wybranego zarodnika. Po wybraniu co najmniej 50 zarodników wybierz kilka regionów, w których nie ma żadnych zarodników i powtórz pomiar, aby uzyskać odczyt fluorescencji tła.Po uzyskaniu kilku pomiarów tła skopiuj wszystkie dane w oknie Wyniki do arkusza kalkulacyjnego i oblicz średnią zintegrowanej gęstości w obszarze wybranych zarodników oraz wartości fluorescencji tła, aby uzyskać skorygowaną fluorescencję całkowitą na komórkę. W celu oceny skuteczności adsorpcji pośredniej należy przeprowadzić sześć dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń oczyszczonego mRFP w stężeniu 0,5 nanograma na mikrolitr do końcowej objętości 250 mikrolitrów na rozcieńczenie w buforze wiążącym i odpowiednią liczbę doświadczalną dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń 100 mikrolitrów każdej zarezerwowanej próbki supernatantu zawierającej niezwiązaną frakcję mRFP reakcji adsorpcji ze 100 mikrolitrami buforu wiążącego na rozcieńczenie. Następnie należy przeciąć membranę nitrocelulozową z odcięciem 0,45 mikrometra do rozmiaru dziewięć na 10 centymetrów, aby pokryć obszar rozcieńczenia o wymiarach pięć na sześć kropek rozcieńczenia, nie wychodząc poza krawędź uszczelki aparatu do plam punktowych.Umieść wstępnie zwilżoną membranę w aparacie do plam punktowych. Sprawdź prawidłowy rozmiar membrany i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione między membraną a uszczelką. Zmontuj aparat do igrania w kropki zgodnie z opisem producenta i przykryj nieużywaną część aparatu, aby zapobiec przepływowi powietrza przez te studzienki.Gdy aparatura jest gotowa, załadować wzorzec na dwa najbardziej zewnętrzne tory, a próbki na środkowych pasach 100 mikrolitrów każdego odpowiedniego rozcieńczenia na studzienkę. Po załadowaniu wszystkich próbek włącz pompę próżniową na dwie minuty, a następnie zatrzymaj próżnię i pozwól próbkom przefiltrować się grawitacyjnie przez membranę. Po 10 minutach umyj każdą studzienkę 100 mikrolitrami PBS.Uruchom pompę próżniową na kolejne pięć minut. Gdy bufor myjący całkowicie opróżni się z aparatu, gdy próżnia jest włączona, poluzuj i ostrożnie otwórz aparat do igłówek. Następnie przetworzyć membranę zgodnie ze standardowymi protokołami western blot.W przypadku analizy densytometrycznej filtru otwórz ImageJ i obrysuj każdą kropkę, aby zmierzyć gęstość zintegrowaną za pomocą polecenia Analizuj, Zmierz, jak pokazano. Aby dokonać korekcji tła obrazu, narysuj okrąg w pustym obszarze i zmierz jego zintegrowaną gęstość, jak pokazano. Skoreluj zintegrowaną gęstość standardowych kropek z ilością załadowanego białka, aby uzyskać linię kalibracyjną i użyj krzywej kalibracyjnej do ekstrapolacji stężenia mRFP w każdej kropce próbki.Następnie można obliczyć stężenie mRFP pozostającego we frakcjach niezwiązanych. Obecność białek o oczekiwanej wielkości tylko w pasach obciążonych ekstraktem zaadsorbowanych zarodników wskazuje na udaną reakcję adsorpcji. Bezpośrednia ocena skuteczności adsorpcji zależy od zastosowanego białka heterologicznego i może być przeprowadzona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytofluorymetrii frakcji osadu po frakcjonowaniu reakcji adsorpcji.Kwantyfikacja sygnałów fluorescencyjnych obecnych na zarodnikach może być następnie przeprowadzona za pomocą ImageJ, jak pokazano. Pośrednią analizę skuteczności adsorpcji można przeprowadzić za pomocą analizy punktowej frakcji supernatantu zawierającej białko niezwiązane, a późniejsza analiza densytometryczna białka niezwiązanego pozwala na pośrednie obliczenie ilości białka zaadsorbowanego na zarodnikach. Chociaż w zasadzie każde białko może być adsorbowane do stosowania jako szczepionki śluzówkowe lub biokatalizatory, w praktyce skuteczność adsorpcji zależy od miejsc białkowych i właściwości chemicznych.

spore-adsorption-as-nonrecombinant-display-system-for-enzymes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wyświetlanie fagów to potężna technika do wychwytywania białek lub ugrupowań białkowych, które oddziałują z unieruchomioną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Po podjęciu decyzji o rodzaju biblioteki cDNA fagów, którą należy utworzyć i przebadać, opisany tutaj protokół pozwala na skuteczną selekcję powinowactwa prowadzącą do identyfikacji interaktorów.

Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

Przyczepienie się bakterii do komórek gospodarza jest kluczowym krokiem podczas kolonizacji i infekcji gospodarza. Protokół ten opisuje wytwarzanie rekombinowanych adhezyn sprzężonych z polimerami jako materiałów biomimetycznych, które umożliwiają analizę udziału poszczególnych adhezyn w tych procesach, niezależnie od innych czynników bakteryjnych.

Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz

Oferujemy metodę jednoczesnego badania biblioteki fragmentów przeciwciał pod kątem powinowactwa wiązania i rozpuszczalności cytoplazmatycznej za pomocą szlaku translokacji podwójnej argininy Escherichia coli, który ma nieodłączny mechanizm kontroli jakości dla wewnątrzkomórkowego fałdowania białek, w celu wyświetlenia fragmentów przeciwciała na wewnętrznej błonie.

Bakteryjny wyświetlacz błony wewnętrznej do badania przesiewowego biblioteki fragmentów przeciwciał

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Prezentowana jest nowatorska technika szybkiego wyświetlania antygenu na powierzchni bakteryjnej, która polega na powierzchniowej biotynylacji, a następnie ekspozycji na interesujące białka podczas fuzji z monomeryczną awidyną. Ładowanie BCG wybranymi antygenami skutecznie poprawia jego immunogenność, co sugeruje, że dekoracja powierzchni może zastąpić tradycyjne podejścia genetyczne.

Ekspresja antygenów egzogennych w szczepionce BCG przeciwko Mycobacterium bovis poprzez niegenetyczne zdobienie powierzchni za pomocą systemu Avidin-biotyna

Tutaj prezentujemy metodę selekcji nowych wariantów ligazy białkowej biotyny E. coli BirA, która biotynyluje określony peptyd docelowy. Protokół opisuje budowę plazmidu do bakteryjnego wyświetlania docelowego peptydu, generowanie biblioteki BirA, selekcję i charakterystykę wariantów BirA.

Wyświetlacz peptydów bakteryjnych do wyboru nowych enzymów biotynylujących

Obecny protokół opisuje bioinżynierię pęcherzyków błony zewnętrznej jako platformę szczepionki typu "Plug-and-Display", obejmującą produkcję, oczyszczanie, biokoniugację i charakterystykę.

Platforma szczepionkowa nanocząsteczkowa typu "plug-and-display" oparta na pęcherzykach błony zewnętrznej wykazujących domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2

Ten protokół skupia się na wykorzystaniu cytometrii przepływowej i liczenia koralików do ilościowego oznaczania zarodników bakterii znakowanych bromkiem etydyny. Metoda ta jest również skuteczna w analizie kowalencyjnego sprzężenia białek na powierzchni nienaruszonych zarodników.

Poprawa liczenia zarodników Bacillus subtilis i analizy znaczników w cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje podstawowe kroki do przeprowadzenia kampanii selekcji powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiążących się z interesującym nas antygenem.

Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Tutaj wprowadzamy protokół do używania substratów z powierzchni drożdży do testów modyfikacji enzymatycznej. Platformę zademonstrowano, wykorzystując analizę aktywności defosforylacji fosfatazy tyrozynowej SHP-2 w stosunku do jednego z jej substratów jako reprezentatywny test modyfikacji enzymatycznej.

Modyfikacja enzymatyczna i cytometria przepływowa oceny białek powierzchniowych drożdży

Poznaj metodę adsorpcji białek na zarodnikach bakteryjnych Bacillus subtilis do tworzenia szczepionek śluzowych i biokatalizatorów. Technika jest prosta, nie wymaga modyfikacji genetycznych i jest bezpieczna dla środowiska.

Adsorpcja zarodników jako nierekombinowany system wyświetlania enzymów i antygenów

Przeglądaj więcej filmów