Hodowla zielonych mikroalg w fotobioreaktorach z kolumnami bąbelkowymi i test na obecność obojętnych lipidów

Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące budowy i użytkowania systemu fotobioreaktora z kolumną bąbelkową do hodowli mikroalg i powinien być interesujący dla każdego, kto studiuje biopaliwa algelowe, oczyszczanie ścieków lub biologię algel. Odkryliśmy, że system reaktora iglicowego daje bardzo renomowane wyniki. System reaktora można również dostosować do szerokiej gamy glonów i kosztuje znacznie mniej niż wiele ofert komercyjnych.

Procedurę zademonstruje Qichen Wang, doktorant z mojego laboratorium. Aby rozpocząć konfigurację fotobioreaktorów z kolumną bąbelkową, skonstruuj zestaw wentylowanych pokrywek z plastikowych pokrywek litrowych szklanych butelek i probówek hybrydyzacyjnych, jak opisano w protokole tekstowym. Wsuń O-ring 1/4 cala na bieżniki złączki przynęty do montażu panelowego 1/8 cala i wsuń go do otworu 1/4 cala wywierconego w pokrywie.

Wsuń drugie 1/4 cala na gwinty, tak aby pokrywka była umieszczona między dwoma O-ringami. Następnie wsuń nakrętkę zabezpieczającą na gwinty i dokręć ją, aby zamocować przynętę do montażu panelowego na miejscu. Teraz zatrzaśnij, aby zablokować pierścienie na odsłoniętej męskiej przynęcie, wystającej z pokrywy.

Powtórz tę procedurę dla każdego otworu w pokrywie. W przypadku pokrywek, które będą używane w kolumnie bąbelkowej i reaktorach butelkowych, przymocuj żeńską przynętę 1/8 cala do złączek kolczastych do 1 1/2 cala kawałków rurki PVC o średnicy wewnętrznej 1/8 cala. Przymocuj je do każdego z odsłoniętych elementów przynęty męskiej na pokrywie.

Podłącz zawór zwrotny do wolnego końca jednego z elementów 1/8 cala. Następnie podłącz męską przynętę do zadzioru do drugiego elementu rurki 1/8 cala wystającej z pokrywy. Zatrzaśnij obrotowy pierścień blokujący na miejscu i przymocuj do niego filtr powietrza o średnicy 0.2 mikrona.

Kompletny montaż systemu dostarczania powietrza, zbiorników na ryby, płyt mieszających i świateł zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zagęścić osiadły wywar z mikroalg, usuwając supernatent za pomocą pompy próżniowej. Pozostaw mniej niż 100 mililitrów podłoża w każdej butelce, ale unikaj usuwania osiadłych glonów.

Zawieś i przenieś gnojowicę glonów do sterylnych 50-mililitrowych probówek wirówkowych. Odwirować 1 000 razy G przez pięć minut, aby jeszcze bardziej zagęścić glony. W komorze bezpieczeństwa biologicznego usuń wystarczającą ilość supernatentu, aby uzyskać całkowitą objętość około 80 mililitrów koncentratów glonów dla 12 fotobioreaktorów.

Unikaj odkurzania granulek. Przenieś koncentrat z alg do sterylnego pojemnika. Teraz dodaj sześć mililitrów zawiesiny glonów do każdego fotobioreaktora za pomocą sterylnej 10-mililitrowej pipety serologicznej.

Zakręć bioreaktorami, aby wymieszać glony z podłożem. Pobrać dwumililitrową próbkę z każdego bioreaktora za pomocą pipety serologicznej i przenieść do dwumililitrowej probówki. Pobieraj próbkę o wielkości dwóch mililitrów co 24 godziny, aby monitorować postęp hodowli.

Sprawdź próbkę pod kątem ph za pomocą pasków testowych i dostosuj reaktor w razie potrzeby. Dokręć pokrywy bioreaktora i umieść wszystkie bioreaktory w kąpieli wodnej w akwarium. Dostosuj napowietrzanie, dwutlenek węgla i oświetlenie do poziomów odpowiednich dla gatunku.

Obracaj pozycję bioreaktora każdego dnia po pobraniu próbki. Nałożyć 200 mikrolitrów każdej próbki kultury w trzech powtórzeniach do studzienek 96-dołkowej mikropłytki. Następnie zmierz gęstość optyczną przy 550 nanometrach i 680 nanometrach.

Zmierzyć ustaloną objętość hodowli glonów z każdego bioreaktora za pomocą cylindra z podziałką i przenieść do butelek wirówkowych. Odwirować kulturę 4 696 razy G przez pięć minut. Wyrzuć supernatent, ostrożnie go odkurzając.

Przenieś granulki do oznaczonych 50-mililitrowych probówek. Wypłucz butelki wirówkowe wodą destylowaną i przenieś zawartość do 50-mililitrowych probówek. Upewnij się, że całkowita objętość nie przekracza 45 mililitrów.

Po umyciu granulek glonów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wyrzuć supernatent. Następnie dodaj 7,5 mililitra wody destylowanej do każdej 50-mililitrowej probówki. Teraz wywiruj 50-mililitrowe rurki i przenieś zawiesiny glonów do wstępnie zważonych 15-mililitrowych probówek.

Przepłucz 50-mililitrowe probówki dodatkową wodą destylowaną i przenieś płyn do 15-mililitrowych probówek, utrzymując całkowitą objętość w tych probówkach na mniej niż 12 mililitrów. Po odwirowaniu 15-mililitrowych probówek i odrzuceniu supernatentu jak poprzednio, zamrozić probówki z granulkami w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut w ramach przygotowań do liofilizacji. Dodaj 1,5 mililitra rozpuszczalnika folch do każdej dwumililitrowej probówki zawierającej 20 miligramów liofilizowanych alg.

Wlej około 0,5 mililitra kulek krzemionki cyrkonu do każdej probówki, aż poziom cieczy osiągnie dwa mililitry. Homogenizuj próbki glonów w młynie perełkowym przez 20 sekund z prędkością 6,5 metra na sekundę. Przenieść probówki do lodu na 30 sekund w celu schłodzenia próbek.

Następnie powtórz jeszcze pięć razy, aby w pełni wyekstrahować lipidy. Przefiltrować homogenat przez pięciomililitrową strzykawkę zawierającą krążek z siatki drucianej ze stali nierdzewnej, aby odcedzić kulki, zbierając filtrat w 15-mililitrowej probówce. Umyj kulki 1,5 mililitra rozpuszczalnika folch, przepychając płyn strzykawką, jeśli to konieczne.

Powtórz to płukanie jeszcze 2 razy i zbierz cały filtrat w 15-mililitrowej probówce, uzyskując końcową objętość około sześciu mililitrów. Dodaj 1,2 mililitra 0,9% roztworu chlorku sodu do ekstraktu folch w 15-mililitrowej probówce i wiruj, aby dobrze wymieszać. Odwirować 15-mililitrowe probówki o temperaturze 6 000 razy G przez pięć minut.

Zapisz objętość dolnej fazy chloroformu z dokładnością do 0,1 mililitra za pomocą linii z boku 15-mililitrowej probówki. Następnie przenieś dolną fazę do szklanego naczynia za pomocą szklanej pipety pastwiskowej. Aby wykonać test neutralnych lipidów, należy trzykrotnie rozcieńczyć ekstrakty lipidowe i wzorzec oleju roślinnego metanolem.

Do każdej rozcieńczonej próbki dodać 80 mikrolitrów do 96-dołkowej mikropłytki polipropylenowej w czworworze. W przypadku ślepej próby rozpuszczalnika nałóż 80 mikrolitrów rozpuszczalnika folch w czterokrotnym powiększeniu. W przypadku wzorców dodaj 10, 30, 60, 90 i 120 mikrolitrów rozcieńczonego wzorca oleju roślinnego również w poczwórnym powiększeniu.

Umieścić mikropłytkę w dygestorium na nagrzanym suchym bloku grzewczym o temperaturze 55 stopni Celsjusza na 20 do 30 minut, aż cały rozpuszczalnik wyparuje. Wyjmij mikropłytkę z bloku grzewczego i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Następnie dodaj 30 mikrolitrów alkoholu izopropylowego do każdej studzienki i mieszaj, pipetując w górę iw dół.

Upewnij się, że wszystkie kanały pipet mieszają roztwór i ponownie zawieszają lipidy, uzyskując jednorodną zieloną ciecz. Teraz dodaj 200 mikrolitrów jednego mikrograma na mililitr roztworu czerwieni nilowej do każdej studzienki i przetrzyj go 10 razy w górę iw dół, aby wymieszać. Po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodaj 20 mikrolitrów 50% roztworu wybielacza do każdej studzienki i pięć razy w górę iw dół, aby dobrze wymieszać.

Pozostaw płytkę do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach odczytuj kwiatostan w próbkach co pięć do 10 minut przy wzbudzeniu 530 nanometrów, emisji 575 nanometrów, z automatycznymi odcięciami ustawionymi na 570 nanometrów, aż sygnał z próbek glonów ustabilizuje się. Ta procedura daje przebieg czasowy danych o gęstości optycznej algelu przy OD 550 nanometrach.

Kultury kontrolne hodowano na świeżym pożywce NH4 anate. Pierwszym zabiegiem są kokultury auxenochlorella protothecoides i azospirillum brasiliense uprawiane na świeżym wrodzonym pożywce NH4. Zabieg drugi, to azynowy A.Protothecoides wyhodowany na wrodzonym pożywce NH4 uzupełnionej 50 miligramami na mililitr IAA, który całkowicie zahamował wzrost glonów.

Zabieg trzeci, to azynowy A.Protothecoides, wyhodowany na zużytym podłożu z A.Brasilienes. Krzywe wzrostu pokazują, że kultury auksenochlorelli protothecoides wchodzą w późny wzrost logarytmiczny po 120 godzinach. Przedstawiono tutaj krzywe korelacji między gęstością optyczną przy 550 nanometrach a końcowym stężeniem suchej masy, przy użyciu dopasowania wielomianowego drugiego rzędu.

Na koniec zabarwienie można zastosować do danych o gęstości optycznej przebiegu czasu, aby uzyskać krzywą wzrostu suchej masy. Stosuje się tutaj te same zabiegi, z wyjątkiem tego, że chlorella sorokiniana jest hodowana zamiast protothecoides auksenochlorelli. Procent obojętnego lipidu w suchej masie uzyskany w obojętnym teście lipidowym dobrze koreluje z zawartością triozy glicerolu na odpowiedniej płytce do chromatografii cienkowarstwowej.

W przeciwieństwie do A.Protothecoides, leczenie IAA nie hamowało wzrostu C.Sorkinana. Po ekstrakcji lipidów z alg, pozostała paleta komórkowa może być analizowana pod kątem zawartości skrobi i ściany komórkowej, zapewniając bardziej szczegółowy obraz produktów magazynowania energii w komórce. Opisane tu metody umożliwiły nowe odkrycia w dziedzinie biopaliw algowych i oczyszczania ścieków.

W szczególności system ten został wykorzystany do lepszego zrozumienia, w jaki sposób bakterie wpływają na wzrost glu.