Name: Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Poznaj metodę indukcji i oceny xenoGVHD w mysim modelu NSG z wykorzystaniem cyfrowego PCR do kwantyfikacji ludzkich limfocytów T. Protokół umożliwia badanie immunosupresji in vivo z zastosowaniem standaryzowanego scoringu klinicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować laboratorium Lane'a Christensona za dostarczenie cyfrowej maszyny do PCR używanej w tych eksperymentach oraz za udzielone wsparcie techniczne. Chcielibyśmy również podziękować dr Thomasowi Yankee za jego wskazówki i mentoring. Badania te były wspierane przez Tripp Family Foundation.

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie i za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Medycznego Uniwersytetu Kansas. Wszystkie zdrowe próbki krwi ludzkiej zostały pobrane za świadomą zgodą i za zgodą Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej w Centrum Medycznym Uniwersytetu Kansas.
1. Napromienianie myszy NSG
<ol>
	<li>Na dzień przed wstrzyknięciem PBMC należy napromienić 8-12-tygodniowe myszy NSG (można użyć dowolnej płci). W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego umieść myszy w wysterylizowanej klatce do ciasta lub mikroizolatorze. Napromieniać myszy w źródle Cs137 lub promienniku dla małych zwierząt (np. RS 2000) całkowitą dawką 150 cGy z powolną rotacją, aby zapewnić równomierne napromieniowanie.</li>
	<li>Umieść myszy w czystych klatkach w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ludzkiego PBMC do wstrzyknięcia
<ol>
	<li>Zbierz wystarczającą ilość zdrowej krwi ludzkiej, aby wyizolować 1,1 x 107 PBMC na mysz. Rozcieńczyć heparynizowaną krew w równej objętości 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). 
	UWAGA: W przypadku tego protokołu wydajność PMBC wynosi zwykle 0,5–1 x 107 na 10 ml krwi pełnej. Każda mysz otrzyma 107 PBMC w 100 μL PBS. Dodatkowe 1 x 106 w 10 μL na mysz zapewnia, że każda mysz otrzyma pełną dawkę PBMC, w przypadku jakichkolwiek problemów z napełnianiem strzykawek.</li>
	<li>Dodaj 15 ml pożywki o gradiencie gęstości separacji limfocytów (np. Ficoll) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, a następnie ostrożnie nałóż do 25 ml rozcieńczonej krwi na gradient gęstości. Odwirować probówkę zawierającą gradient gęstości i rozcieńczoną krew o sile 400 x g przez 40 minut w temperaturze pokojowej bez hamulca.</li>
	<li>Zbierz granicę faz PBMC do 10 ml PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Poluzować osad, przesuwając probówkę i ponownie zawiesić w 10 ml PBS, aby umyć PBMC. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Odrzucić supernatant i lizować krwinki czerwone (RBC) w osadzie komórkowym, dodając objętość buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) równą objętości osadu. Delikatnie zawiesić granulkę i obracać rurkę przez 30–60 s. Napełnij probówkę pożywką RPMI bez surowicy i odwiruj probówkę o sile 400 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml PBS. Policz komórki za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru i mikroskopu.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1 x 108 komórek/ml w PBS.</li>
</ol>
3. Retro-orbitalne wstrzyknięcie ludzkiego PBMC myszom21
<ol>
	<li>Umieść komorę anestezjologiczną w okapie z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność. Napełnij komorę anestezjoterapeutyczną 5% izofluranem i natężeniem przepływu tlenu 1 l/min przez 5 minut.</li>
	<li>Zmniejsz izofluran do 2% i umieść myszy z tej samej klatki w komorze anestezjologicznej. Gdy myszy stracą prawowodność, znieczulaj myszy przez 5 minut w komorze. W tym czasie należy wstępnie napełnić strzykawkę 100 μl (1 x 107 komórek) zawiesiny komórek.</li>
	<li>Umieść mysz na poduszce grzewczej z nosem w stożku nosowym, aby utrzymać znieczulenie. Sprawdź, czy nie masz utraty przytomności, ściskając opuszkę stopy i sprawdzając, czy nie ma odruchu.</li>
	<li>Przytrzymaj mysz kciukiem i środkowym palcem. Wbić igłę 28 G 1/2 cala skosem w dół bocznie do kantu przyśrodkowego, przez błonę spojówkową, aż do tylnej części oka. Lekko wycofać igłę i powoli wstrzyknąć 100 μl komórek (1 x 10,7 komórek).</li>
	<li>Całkowicie wycofać igłę i właściwie usunąć strzykawkę i igłę. Zamknąć powiekę i delikatnie ucisknąć miejsce wstrzyknięcia gąbką z gazy.</li>
	<li>Należy zbadać miejsce wstrzyknięcia pod kątem obrzęku lub innego widocznego urazu. Pozwól myszy odzyskać przytomność w sterylnej klatce wyłożonej ręcznikami papierowymi, aby zapobiec aspiracji ściółki przed przeniesieniem do klatki domowej. Po ustaniu krwawienia nałóż jedną kroplę proparakainy na oko w celu znieczulenia. 
	UWAGA: Wstrzyknięcie do żyły ogonowej jest alternatywną metodą dożylnego wstrzyknięcia PBMC dla tego protokołu, zgodnie z opisem Macholz et al.22.</li>
</ol>
4. Ocena kliniczna ostrej GVHD u myszy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)23
<ol>
	<li>Mierz wynik GVHD co drugi dzień, aż myszy osiągną wynik 2, a następnie codziennie aż do dnia ofiary.
	<ol>
		<li>Umieść klatkę w okapie z przepływem laminarnym, wyjmij jedzenie i wodę, a następnie ponownie załóż pokrywę. Oceń aktywność, obserwując myszy przez 5 minut i przypisz punkty w następujący sposób: 0 = mysz zaczyna chodzić w ciągu kilku minut i nadal chodzi wokół klatki, 1 = mysz potrzebuje więcej niż kilka minut, aby wstać i chodzi powoli wokół klatki, 2 = mysz nie wstaje w ciągu 5 minut i chodzi tylko po dotknięciu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zważ każdą mysz w szklanej zlewce i podaj wynik utraty wagi: 0 = <10% zmiany, 1 = 10–25% zmiany i 2 = >25% zmiany.</li>
	<li>Gdy mysz jest jeszcze w zlewce, sprawdź postawę: 0 = normalna, 1 = garbienie się w spoczynku, 2 = garbienie się upośledza ruch; Tekstura futra: 0 = normalna, 1 = łagodne do umiarkowanego marszczenia, 2 = silne marszczenie i integralność skóry: 0 = normalna, 1 = łuszczenie łap/ogona, 2 = widoczne obszary ogołoconej skóry (spójrz na uszy, ogon i łapy pod kątem łusek).</li>
	<li>Z pięcioma kategoriami i wynikiem 0-2 dla każdej kategorii, mysz może osiągnąć maksymalny wynik 10. Gdy mysz osiągnie wynik 7 lub wyższy lub osiągnie 42 dni po wstrzyknięciu, należy poddać ją eutanazji za pomocą eutanazji CO2 lub innej metody zatwierdzonej przez lokalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt. 
	UWAGA: Aby zapewnić dokładność wyników, punktacja jest wykonywana przez badacza, który jest ślepy na grupy terapeutyczne24. Ponadto, mimo że >20% utraty masy ciała jest zalecanym humanitarnym punktem końcowym dla wielu protokołów IACUC, z dodatkowym uzasadnieniem można uzyskać zgodę IACUC na ten protokół.</li>
</ol>
5. Pobieranie tkanek do genomowego DNA od myszy poddanych eutanazji i izolowanie genomowego DNA
<ol>
	<li>Wypreparuj myszy za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych. Wytnij mały kawałek tkanki o wymiarach około 3 mm x 0,5 mm z interesującego Cię narządu, np. płuca, wątroby lub śledziony. Zważyć próbkę tkanki i umieścić fragment tkanki w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml. W przypadku pobierania wielu tkanek umyj narzędzia etanolem między cięciem każdego narządu.</li>
	<li>Zamrozić tkanki, zanurzając probówki zawierające tkankę w ciekłym azocie, aż przestanie bulgotać i przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc. Rozmrozić próbki tkanek i poddać je lizie zgodnie z zestawem do izolacji genomowego DNA (gDNA).</li>
	<li>Wyizoluj genomowe DNA zgodnie z instrukcjami producenta, zgodnie z opisem w zestawie. Należy zwrócić uwagę na ilość tkanki, która została przetworzona na mikrolitr eluowanego gDNA (mg/μL). 
	UWAGA: Zamrożone tkanki można przechowywać w temperaturze -80 °C w celu późniejszego przetworzenia.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja ludzkich limfocytów T za pomocą cyfrowego PCR (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Przygotować cyfrowe reakcje PCR zgodnie z protokołem dla barwników wiążących DNA dla używanej cyfrowej maszyny do PCR. Należy użyć następujących starterów specyficznych dla ludzkiego genomowego DNA epsilon CD3 (sekwencja referencyjna NCBI: NG_007383.1); Podkład do przodu: AGGCTGCCTTAACTCCCAAG, Podkład odwrotny: GCCCTACCAGCTGTGGAAAC. Te startery dadzą pojedyncze pasmo 105 bp. 
	UWAGA: Dodaj 0,5 μl enzymu restrykcyjnego, takiego jak HindIII, do każdej reakcji, aby strawić genomowe DNA. Pamiętaj, aby przetestować różne rozcieńczenia gDNA, aby zoptymalizować separację dodatnich i ujemnych kropel. Ponadto podzbiór naciekających limfocytów T może być niepatogennymi limfocytami T regulatorowymi. Komórki te można określić ilościowo za pomocą dodatkowych starterów dla markerów regulatorowych limfocytów T.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję digital PCR w następujących warunkach: Pokrywka w temperaturze 105 °C, 95 °C przez 10 minut (1 cykl); 95 °C przez 30 s, rampa 2 °C/s i 55 °C przez 1 minutę, rampa 2 °C/s (40 cykli); 72 °C przez 10 min, 12 °C przytrzymać. 
	UWAGA: Parametry te mogą wymagać dostosowania w zależności od sprzętu do cyfrowego PCR.</li>
	<li>Pozyskiwanie cyfrowych danych PCR za pomocą oprogramowania analitycznego. Należy podać dane jako liczbę kopii na mg tkanki, stosując następujące równanie: (liczba kopii/μl) x (μl gDNA w reakcji) x (współczynnik rozcieńczenia)/(mg tkanki/μl całkowitego gDNA)</li>
</ol>

<ol><li>Jagasia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+acute+GVHD+and+survival+after+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 119 (1), 296-307 (2012).</li>
<li>Bolanos-Meade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+3+clinical+trial+of+steroids%2Fmycophenolate+mofetil+vs+steroids%2Fplacebo+as+therapy+for+acute+GVHD%3A+BMT+CTN+0802%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802.</a> Blood. 124 (22), quiz 3335 3221-3227 (2014).</li>
<li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mortality+after+allogeneic+hematopoietic-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li>
<li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+improvement+in+survival+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation+during+a+period+of+significantly+increased+use%2C+older+recipient+age%2C+and+use+of+unrelated+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors.</a> Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).</li>
<li>Khoury, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+after+acute+graft-versus-host+disease+diagnosis+in+the+modern+era%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era.</a> Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).</li>
<li>King, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+leucocyte+non-obese+diabetic-severe+combined+immunodeficiency+interleukin-2+receptor+gamma+chain+gene+mouse+model+of+xenogeneic+graft-versus-host-like+disease+and+the+role+of+host+major+histocompatibility+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex.</a> Clinical & Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).</li>
<li>Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+antimurine+xenogeneic+cytotoxic+response.+I.+Dependence+on+responder+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells.</a> Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).</li>
<li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+model+for+xenogenic+GVHD+using+severe+immunodeficient+NOG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice.</a> Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).</li>
<li>Kawasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Analysis+of+the+Activation+and+Proliferation+Kinetics+and+Effector+Functions+of+Human+Lymphocytes%2C+and+Antigen+Presentation+Capacity+of+Antigen-Presenting+Cells+in+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).</li>
<li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease+Model+for+Investigating+the+Pathological+Role+of+Human+CD4%28%2B%29+or+CD8%5BTitle%5D)+AND+%22T+Cells+Using+Immunodeficient+NOG+Mice.+American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8.</a> T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).</li>
<li>Trotta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+anti-IL-2+antibody+that+potentiates+regulatory+T+cells+by+a+structure-based+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism.</a> Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).</li>
<li>Dijke, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discarded+Human+Thymus+Is+a+Novel+Source+of+Stable+and+Long-Lived+Therapeutic+Regulatory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells.</a> American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).</li>
<li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Gingiva-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Inhibit+Xeno-Graft-versus-Host+Disease+via+CD39-CD73-Adenosine+and+IDO+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals.</a> Frontiers in Immunology. 8, 68(2017).</li>
<li>Stockis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+immunosuppression+by+human+Tregs+in+vivo+with+antibodies+targeting+integrin+alphaVbeta8%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dPCR%3A+A+Technology+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li>
<li>Sykes, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Bacterial+Contamination+in+Goat+Milk+Powder+Using+PacBio+Single+Molecule+Real-Time+Sequencing+and+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR.</a> Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).</li>
<li>Vitale, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+to+evaluate+estrogen+receptor+gene+mutations+in+small+amounts+of+cell-free+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA.</a> Journal of Molecular Diagnostics. , (2018).</li>
<li>Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+and+liquid+biopsy%3A+opportunities%2C+challenges%2C+and+recent+advances+in+detection+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies.</a> Lab Chip. 18 (8), 1174-1196 (2018).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22LabAnimal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> LabAnimal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation%3A+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).</li>
<li>Weisdorf, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+grading+of+graft-versus-host+disease+after+unrelated+donor+marrow+transplantation%3A+a+grading+algorithm+versus+blinded+expert+panel+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).</li>
<li>Nervi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+T+cell+engraftment%2C+trafficking%2C+and+associated+xenogeneic+graft-vs-host+disease+in+NOD%2FSCID+beta2mnull+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice.</a> Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).</li>
<li>Leon-Rico, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+haematopoietic+stem+cell+engraftment+through+the+retro-orbital+venous+sinus+and+the+lateral+vein%3A+alternative+routes+for+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22LabAnimal%22%5BJournal%5D)">Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice.</a> LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).</li>
<li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2Rgammanull+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype.</a> PLoS One. 7 (8), e44219(2012).</li>
<li>van Rijn, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+xenograft+model+for+graft-versus-host+disease+by+intravenous+transfer+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+RAG2-%2F-+gammac-%2F-+double-mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice.</a> Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).</li>
<li>Wunderlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OKT3+prevents+xenogeneic+GVHD+and+allows+reliable+xenograft+initiation+from+unfractionated+human+hematopoietic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues.</a> Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).</li>
<li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+graft-versus-host+disease%3A+advances+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).</li>
<li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease%3A+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation?</a> Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Progresja choroby jest na ogół spójna w modelu xenoGVHD, nawet przy wstrzyknięciu PBMC od różnych dawców, dzięki czemu można połączyć wiele eksperymentów. Kluczowymi krokami wymaganymi do utrzymania tej spójności są właściwa technika iniekcji dożylnej, zaślepianie i konsekwentna punktacja. Badanie przeprowadzone przez Nervi i wsp.25 wykazało, że w porównaniu z dożylnym wstrzyknięciem żyły ogonowej, zaoczodołowe wstrzyknięcia PBMC skutkowały bardziej spójnym wszczepieniem i cięższym GVHD. Leon-Rico...

Allogeniczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) stał się rutynowym leczeniem dla pacjentów cierpiących na nowotwory hematologiczne, takie jak białaczka ze złym rokowaniem. Istotnym powikłaniem HSCT jest ostra choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD). Badanie z 2012 r. wykazało, że ostra GVHD rozwinęła się u 39% pacjentów z HSCT otrzymujących przeszczepy od dawców rodzeństwa i 59% pacjentów otrzymujących przeszczepy od dawców niespokrewnionych1. Ostra GVHD występuje, gdy limfocyty T pochodzące od dawcy atakują narządy biorcy. Jedyną skuteczną terapią GVHD jest leczenie lekami o wysokim stopniu immunosupresji2, które są wysoce toksyczne i zwiększają ryzyko infekcji i nawrotu nowotworu. Tak więc, pomimo poprawy, która została osiągnięta w zakresie przeżywalności ostrej GVHD w ostatnich latach3,4,5, nadal istnieje pilna potrzeba ulepszonych terapii GVHD o minimalnej toksyczności, które sprzyjają długotrwałej remisji.
Ogólnym celem poniższych metod jest wywołanie i ocena ksenogenicznego GVHD (xenoGVHD). Model xenoGVHD został opracowany jako narzędzie do indukowania ostrej GVHD za pomocą komórek ludzkich, a nie mysich, co pozwala na bardziej bezpośrednie przełożenie badań przedklinicznych GVHD na badania kliniczne6. Model ten polega na dożylnym wstrzyknięciu ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) myszom NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG), które są subletalnie napromieniowane. Wstrzyknięte ludzkie limfocyty T są aktywowane przez ludzkie komórki prezentujące antygen (APC) prezentujące mysi antygen, a aktywowane limfocyty T migrują do odległych tkanek, powodując ogólnoustrojowy stan zapalny i ostatecznie śmierć6,7,8,9,10. Patologia i progresja choroby w modelu xenoGVHD ściśle naśladują ostrą GVHD u ludzi. W szczególności patogenne ludzkie limfocyty T reagują na mysie białka głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC), co jest podobne do alloreaktywności limfocytów T w ludzkiej GVHD6,9. Podstawową przewagą modelu xenoGVHD nad mysim modelem niedopasowania MHC, innym powszechnie stosowanym modelem GVHD, jest to, że pozwala on na testowanie terapii na komórkach ludzkich, a nie mysich. Pozwala to na testowanie produktów, które mogą być bezpośrednio przetłumaczone na klinikę bez żadnych modyfikacji, ponieważ są one przeznaczone do celowania w komórki ludzkie. Ostatnio model ten został wykorzystany do przetestowania ludzkiego przeciwciała anty-IL-211, ludzkich limfocytów T regulatorowych grasicy (Tregs)12 i ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych13 jako potencjalnych metod leczenia ostrej GVHD. W szerszym kontekście model ten może być stosowany jako test supresji in vivo dla dowolnego leku lub typu komórki, który może hamować aktywność ludzkich limfocytów T. Na przykład Stockis i wsp.14 wykorzystali model xenoGVHD do zbadania wpływu blokowania integryny αVβ8 na aktywność supresyjną Treg in vivo. W związku z tym model xenoGVHD może dostarczyć informacji na temat mechanizmu każdej terapii ukierunkowanej na limfocyty T w warunkach in vivo.
Dodatkową metodą opisaną w tym protokole jest sposób wykrywania ludzkich limfocytów T w tkankach myszy za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR). Celem tej metody jest zaoferowanie narzędzia do ilościowego określania migracji i proliferacji limfocytów T w tkankach docelowych, które mierzy skuteczność terapii immunosupresyjnych testowanych w tym modelu. dPCR to stosunkowo nowa metoda oznaczania ilościowego kwasów nukleinowych15. Krótko mówiąc, mieszanina reakcyjna PCR jest podzielona na partycje, które zawierają niewielką liczbę sekwencji docelowej lub w ogóle nie mają celu. Sekwencja docelowa jest następnie amplifikowana i wykrywana za pomocą barwników interkalacyjnych DNA lub fluorescencyjnych sond specyficznych dla celu. dPCR określa ilościowo liczbę kopii sekwencji docelowej na podstawie ułamka partycji dodatnich i statystyk Poissona15,16. Wykrywanie limfocytów T za pomocą dPCR wymaga znacznie mniej tkanki w porównaniu z innymi alternatywnymi metodami, w tym cytometrią przepływową i histologią, i może być wykonywane na zamrożonej lub utrwalonej tkance. dPCR nie wymaga standardowej krzywej do określenia liczby kopii, ani nie są wymagane kontrpróby techniczne. Zmniejsza to ilość odczynnika i matrycy DNA potrzebnej do dPCR w porównaniu z tradycyjnym ilościowym PCR (qPCR)16. Podział reakcji PCR na podreakcje w dPCR skutecznie koncentruje targets17. W związku z tym dPCR jest przede wszystkim narzędziem do wykrywania rzadkich celów w dużej ilości DNA niedocelowego. Na przykład dPCR jest używany do wykrywania skażenia bakteryjnego w milk18, identyfikacji rzadkich mutacji w genie receptora estrogenowego19 oraz wykrywania krążącego DNA guza we krwi pacjentów20. W tym protokole dPCR służy jako skuteczne narzędzie do wykrywania i ilościowego oznaczania ludzkich limfocytów T w tkankach myszy z xenoGVHD.

<table><tbody><tr><td>Probówki eppendorfa 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>VWR International</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>10 ml BD Vacutainers - Zielona nasadka z heparyną sodową</td><td>Becton Dickinson</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>250 &micro; L Końcówki do pipet Ranin</td><td>Rainin</td><td>17001118</td><td>Nie używaj innych pipet ani końcówek do pipet do generowania kropel</td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 50 ml</td><td>VWR International</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka ddPCR</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ACK (chlorek amonu-potasu) Bufor lizujący</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Opcjonalne</td></tr><tr><td>chusteczki nasączone alkoholem</td><td>Fisher Scientific</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Komora anestezjologiczna</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>EZ-178</td><td>Dostarczone przez zakład dla zwierząt</td></tr><tr><td>Maszyna anestezjologiczna</td><td>Parkland</td><td>Scientific PM1002</td><td>Dostarczone przez zakład dla zwierząt</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok Zestaw do pobierania krwi</td><td>Becton Dickinson</td><td>367281</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Wkłady i uszczelki do generatora kropel QX100 / QX200</td><td>Bio-Rad</td><td>1864007</td><td></td></tr><tr><td>Wolne od DNAzy i RNAzy Molekularne technologie życia H2O</td><td></td><td>1811318</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy, czysty, 200 proof, do biologii molekularnej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>45001750</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>329424</tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS019936</td><td>Dostarczone przez zakład dla zwierząt</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Grzejnik myszy Klatka do ciasta</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC 1</td><td>Mieści do 11 myszy</td></tr><tr><td>Delikatna taśma papierowa Nexcare (znana również jako taśma chirurgiczna 3M Micropore / 3/4")</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027-761</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000 Pipetman</td><td>MidSci</td><td>A-1000</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipetman</td><td>MidSci</td><td>A-200</td><td></td></tr><tr><td>Folia do przekłuwania</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Pipetaid Gilson Macroman</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>F110756</tr><tr><td>Pipeta wielofunkcyjna Pipet-Lite L8-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td>Nie używaj innych pipet ani końcówek do pipet do generowania kropelek</td></tr><tr><td>Zestaw do krwi i tkanek Qiagen DNeasy Płytki</td> qPCR <td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>VWR</td><td>International</td><td>89218-292</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Cyfrowy system PCR kropelkowy</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td>Zawiera generator kropel, czytnik kropel, laptop, oprogramowanie, materiały eksploatacyjne do aplikacji EvaGreen lub cyfrowych PCR opartych na sondzie</td></tr><tr><td>QX200 Olej do wytwarzania kropel do EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864006</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864033</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka płytowa wolna od RNaz i DNaz</td><td>Thermo Scientific</td><td>12565491</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Advanced 1640</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne gaziki (2" x 2", 12-warstwowe)</td><td>Fisher Scientific</td><td>67522</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Fisher Scientific</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny zbiornik</td><td>VWR International</td><td>89094-662</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600393-4</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650914-4</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów t w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego pcr

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Ostra choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) jest znaczącym ograniczeniem dla pacjentów otrzymujących przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych jako terapię niedoborów hematologicznych i nowotworów złośliwych. Ostra GVHD występuje, gdy limfocyty T dawcy rozpoznają tkanki gospodarza jako obcy antygen i wywołują odpowiedź immunologiczną na gospodarza. Obecne metody leczenia obejmują toksyczne leki immunosupresyjne, które sprawiają, że pacjenci są podatni na infekcje i nawroty. W związku z tym trwają badania mające na celu zapewnienie ostrej terapii GVHD, która może skutecznie celować w limfocyty T dawcy i zmniejszać skutki uboczne. Wiele z tych prac przedklinicznych wykorzystuje ksenogenny model mysi GVHD (xenoGVHD), który pozwala na testowanie terapii immunosupresyjnych na komórkach ludzkich, a nie mysich komórkach w systemie in vivo. Protokół ten określa, w jaki sposób indukować xenoGVHD oraz jak zaślepić i ustandaryzować ocenę kliniczną, aby zapewnić spójne wyniki. Ponadto protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać cyfrową reakcję PCR do wykrywania ludzkich limfocytów T w tkankach myszy, które można następnie wykorzystać do ilościowego określenia skuteczności badanych terapii. Model xenoGVHD nie tylko stanowi model do testowania terapii GVHD, ale także każdej terapii, która może hamować ludzkie limfocyty T, co może być następnie stosowane w wielu chorobach zapalnych.

U myszy NSG w wieku 8–12 tygodni obu płci, które zostały poddane subletalnemu napromieniowaniu i otrzymały ludzkie PBMC, objawy kliniczne GVHD zaczęły pojawiać się około 10. dnia po iniekcji w porównaniu z myszami z grupy kontrolnej, które otrzymały wyłącznie PBS (Rycina 1A). Mediana przeżycia myszy z XenoGVHD wyniosła 23,5 dnia (Rycina 1B). Za pomocą cyfrowego PCR w próbkach płuc i wątroby myszy, którym podano ludzkie PBMC, wykr...

Tutaj prezentujemy protokół do wywoływania i oceniania choroby w modelu xenoGVHD (xenoGVHD) ksenogenicznej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. xenoGVHD dostarcza model in vivo do badania immunosupresji ludzkich limfocytów T. Dodatkowo opisujemy, jak wykrywać ludzkie limfocyty T w tkankach za pomocą cyfrowego PCR jako narzędzia do ilościowego określania immunosupresji.

Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Protokół ten określa, w jaki sposób wywołać chorobę ksenoprzeszczep przeciwko gospodarzowi lub xenoGVHD oraz jak zaślepić i ustandaryzować ocenę kliniczną, aby zapewnić spójne wyniki. Model xenoGVHD zapewnia metodę in vivo do testowania terapii immunosupresyjnych przeciwko ludzkim, a nie mysim limfocytom T, poprawiając przełożenie tych badań na praktykę kliniczną. Procedurę zademonstruje Amara Seng, doktorantka z mojego laboratorium.Na dzień przed wstrzyknięciem umieść od 8 do 12 tygodni, nieotyłych myszy z cukrzycą scid gamma lub NSG w wysterylizowanej klatce do ciasta i napromieniuj myszy w źródle cezu-137 całkowitą dawką 150 centygrajów, z powolną rotacją, aby zapewnić równomierne napromieniowanie. Następnie umieść myszy w czystych klatkach w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego na noc. Następnego ranka zbierz wystarczającą ilość zdrowej krwi ludzkiej, aby wyizolować 1,1 razy 10 do siedmiu komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub PBMC na mysz i rozcieńczyć heparynizowaną krew w równej objętości 2% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS w PBS.Ostrożnie nałóż do 25 mililitrów rozcieńczonej krwi na 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości separacji limfocytów w 50-mililitrowej stożkowej probówce do wirowania w gradiacji gęstości. Pod koniec separacji zbierz PBMC na granicy faz i umyj komórki w 10 mililitrach PBS w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Zassać supernatant i przesunąć rurkę, aby poluzować osad.Ponownie zawiesić PBMC w 10 mililitrach świeżego PBS do kolejnego odwirowania, a następnie ponownie zawiesić w pięciu mililitrach świeżego PBS w celu policzenia. Następnie zbierz komórki za pomocą końcowego odwirowania i ponownie zawieś osad w stężeniu od jednego razy 10 do ośmiu PBMC na mililitr PBS. W celu retroorbitalnego dostarczenia izolowanego ludzkiego PBMC do oka myszy, należy załadować jedną strzykawkę o pojemności jednego mililitra wyposażoną w igłę o rozmiarze 28 ze 100 mikrolitrami komórek.Potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i delikatnie przytrzymaj mysz kciukiem i środkowym palcem. Wprowadzić igłę skośną stroną do dołu, bocznie do kantu przyśrodkowego, przez błonę spojówkową, aż do tylnej części oka. Lekko wycofaj igłę i powoli wstrzyknij całą objętość komórek.Następnie należy całkowicie wycofać igłę, aby prawidłowo usunąć strzykawkę i igłę. Zamknąć powiekę i delikatnie ucisknąć miejsce wstrzyknięcia gąbką z gazy. Następnie należy zbadać miejsce wstrzyknięcia pod kątem obrzęku lub innego widocznego urazu i pozwolić myszy odzyskać przytomność w sterylnej klatce wyłożonej ręcznikami papierowymi i monitorowaniem przed przeniesieniem zwierzęcia do klatki domowej.Aby zmierzyć wynik GVHD, umieść klatkę w okapie z przepływem laminarnym i wyjmij z klatki jedzenie i wodę. Aby ocenić aktywność, obserwuj zachowanie myszy przez pięć minut. Aby uzyskać wynik utraty wagi, zważ każdą mysz w szklanej zlewce.Gdy mysz jest jeszcze w zlewce, sprawdź zwierzę pod kątem postawy, tekstury futra i integralności skóry. Po pobraniu interesujących tkanek wytnij z narządu kawałek tkanki o wymiarach około 3 na 0,5 milimetra i zważyć próbkę na wadze. Przenieś zważoną tkankę do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra i zamroź próbkę w ciekłym azocie do przechowywania przez noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Następnego ranka rozmrozić próbki przed lizą, zgodnie z instrukcjami z zestawu do izolacji genomowego DNA. W celu ilościowego oznaczania ludzkich limfocytów T za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub PCR, należy przygotować cyfrowe reakcje PCR zgodnie z protokołem barwników wiążących DNA dla używanej cyfrowej maszyny do PCR i przy użyciu odpowiednich starterów dla ludzkiego DNA genomowego epsilon CD3. Następnie należy przeprowadzić reakcję digital PCR w odpowiednich warunkach reakcji.Subletalnie napromieniowane myszy NSG w wieku od 8 do 12 tygodni obojga płci, które otrzymują ludzki PBMC, zaczynają wykazywać kliniczne objawy GVHD około 10 dnia po wstrzyknięciu, w porównaniu z myszami z kontrolą ujemną leczoną tylko PBS. Myszy XenoGVHD mają medianę przeżycia wynoszącą 23,5 dnia. Za pomocą cyfrowego PCR można wykryć ludzkie limfocyty T CD3 epsilon-dodatnie w próbkach płuc i wątroby myszy, które otrzymują ludzkie PBMC.Bardzo ważne jest, aby ocena punktowa była wykonywana konsekwentnie i aby badacz oceniający myszy był ślepy na ich leczenie. Po tej procedurze można pobrać surowicę od myszy poddanych eutanazji w celu analizy ekspresji cytokin obwodowych, a komórki odpornościowe można pobrać ze śledziony do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

induction-scoring-graft-versus-host-disease-xenogeneic-murine-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Ten film demonstruje indukcję choroby jelitowej przeszczep przeciwko gospodarzowi, GvHD, u śmiertelnie napromieniowanej myszy biorcy przy użyciu allogenicznych hematopoetycznych komórek macierzystych i indukujących GvHD alloreaktywnych limfocytów T indukujących śledzionę. Protokół ten pomaga w ustaleniu modelu ciężkiej ostrej choroby jelitowej GvHD, aby zrozumieć mechanizm choroby i opracować innowacyjne opcje terapeutyczne.

Indukcja choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w modelach mysich za pomocą allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego i komórek śledziony

Ten film demonstruje test do generowania humanizowanego modelu myszy ksenoprzeszczepu. Myszom z obniżoną odpornością wstrzykuje się cyklofosfamid, aby spowodować wyczerpanie komórek odpornościowych. Komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta zmieszane z ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) w hydrożelu są wstrzykiwane podskórnie myszy, tworząc guz z naciekającymi limfocytami T.

Technika generowania ludzkiego, humanizowanego modelu myszy ksenoprzeszczepu wszczepionego w PBMC

Określenie wszczepienia komórek dawcy stanowi wyzwanie w modelach przeszczepu szpiku kostnego u myszy, które nie mają dobrze zdefiniowanych markerów fenotypowych. Opisaliśmy metodologię ilościowego oznaczania wszczepienia męskich komórek dawcy u samic myszy biorców przeszczepu. Metoda ta może być stosowana u wszystkich szczepów myszy do badania funkcji HSC.

Wykorzystanie ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym do określenia wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu mysiego szpiku kostnego

Ksenografty ludzkich nowotworów u myszy z niedoborem odporności są cennymi narzędziami do badania biologii raka.  Opisano specyficzne protokoły generowania ksenoprzeszczepów podskórnych i wewnątrzwątrobowych z ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego lub fragmentów guza.  Regeneracja wątroby wywołana częściową hepatektomią u myszy biorców jest przedstawiana jako strategia ułatwiająca wszczepienie wewnątrzwątrobowe.

Wytwarzanie podskórnych i wewnątrzwątrobowych ksenoprzeszczepów ludzkiego raka wątrobowokomórkowego u myszy z niedoborem odporności

Opisana tutaj jest metoda wytwarzania egzogennej cytokiny u myszy z ksenoprzeszczepem pochodzącym od pacjenta (PDX) poprzez cotygodniowe dootrzewnowe wstrzykiwanie linii komórek zrębu transdukowanej cytokinami. Metoda ta rozszerza użyteczność PDX i zapewnia opcję przejściowego lub trwałego dostarczania cytokin egzogennych w wielu modelach PDX.

Ekspresja cytokin egzogennych w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjentów poprzez wstrzyknięcie linii komórek zrębu transdukowanej cytokiną

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje allogeniczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych i umożliwia powtarzalne mini-endoskopowe oceny dystalnej części jelita grubego in situ pod kątem obecności, cech i ciężkości zapalenia jelita grubego u żywych myszy cierpiących na chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi jelit.

Indukcja choroby przeszczep jelitowy przeciwko gospodarzowi i jej miniendoskopowa ocena u żywych myszy

Opisujemy ludzką komórkę jednojądrzastą krwi obwodowej (PBMC) — humanizowany model myszy ksenoprzeszczepu do translacyjnych badań immunoonkologicznych. Protokół ten może służyć jako ogólna wskazówka do ustanawiania i charakteryzowania podobnych modeli oceny terapii I-O.

Humanizowany model ksenoprzeszczepu z ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) do badań immunoonkologicznych translacyjnych (I-O)

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi jest poważnym powikłaniem po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w patogenezie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. W niniejszym artykule opisano nowatorską platformę przeszczepu szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w rozwoju choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i efektowi przeszczep przeciwko białaczce.

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu guza do charakterystyki limfocytów naciekanych nowotworem w modelu guza myszy w intruzie naturalnym i pochodzącym z obwodu limfocytach. Specyficzne śledzenie napływu komórek odpornościowych pochodzących od biorcy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia dynamikę zmian fenotypowych i funkcjonalnych tych komórek podczas przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych.

Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy

Obecny protokół opisuje, jak przeszczepić ludzką skórę nieotyłym myszom z cukrzycą (NOD)-scid z receptorem łańcucha gamma interleukiny-2 (NSG). W raporcie zawarto szczegółowy opis przygotowania skóry ludzkiej do przeszczepu, przygotowania myszy do przeszczepu, przeszczepu skóry ludzkiej o podzielonej grubości oraz procedury rekonwalescencji po przeszczepie.

Model skóry ksenoprzeszczepu do manipulowania ludzkimi odpowiedziami immunologicznymi in vivo

Poznaj metodę indukcji i oceny xenoGVHD w mysim modelu NSG z wykorzystaniem cyfrowego PCR do kwantyfikacji ludzkich limfocytów T. Protokół umożliwia badanie immunosupresji in vivo z zastosowaniem standaryzowanego scoringu klinicznego.

Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR (Wideo) | JoVE Journal

Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR

Przeglądaj więcej filmów