Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR

Protokół ten określa, w jaki sposób wywołać chorobę ksenoprzeszczep przeciwko gospodarzowi lub xenoGVHD oraz jak zaślepić i ustandaryzować ocenę kliniczną, aby zapewnić spójne wyniki. Model xenoGVHD zapewnia metodę in vivo do testowania terapii immunosupresyjnych przeciwko ludzkim, a nie mysim limfocytom T, poprawiając przełożenie tych badań na praktykę kliniczną. Procedurę zademonstruje Amara Seng, doktorantka z mojego laboratorium.

Na dzień przed wstrzyknięciem umieść od 8 do 12 tygodni, nieotyłych myszy z cukrzycą scid gamma lub NSG w wysterylizowanej klatce do ciasta i napromieniuj myszy w źródle cezu-137 całkowitą dawką 150 centygrajów, z powolną rotacją, aby zapewnić równomierne napromieniowanie. Następnie umieść myszy w czystych klatkach w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego na noc. Następnego ranka zbierz wystarczającą ilość zdrowej krwi ludzkiej, aby wyizolować 1,1 razy 10 do siedmiu komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub PBMC na mysz i rozcieńczyć heparynizowaną krew w równej objętości 2% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS w PBS.

Ostrożnie nałóż do 25 mililitrów rozcieńczonej krwi na 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości separacji limfocytów w 50-mililitrowej stożkowej probówce do wirowania w gradiacji gęstości. Pod koniec separacji zbierz PBMC na granicy faz i umyj komórki w 10 mililitrach PBS w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Zassać supernatant i przesunąć rurkę, aby poluzować osad.

Ponownie zawiesić PBMC w 10 mililitrach świeżego PBS do kolejnego odwirowania, a następnie ponownie zawiesić w pięciu mililitrach świeżego PBS w celu policzenia. Następnie zbierz komórki za pomocą końcowego odwirowania i ponownie zawieś osad w stężeniu od jednego razy 10 do ośmiu PBMC na mililitr PBS. W celu retroorbitalnego dostarczenia izolowanego ludzkiego PBMC do oka myszy, należy załadować jedną strzykawkę o pojemności jednego mililitra wyposażoną w igłę o rozmiarze 28 ze 100 mikrolitrami komórek.

Potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i delikatnie przytrzymaj mysz kciukiem i środkowym palcem. Wprowadzić igłę skośną stroną do dołu, bocznie do kantu przyśrodkowego, przez błonę spojówkową, aż do tylnej części oka. Lekko wycofaj igłę i powoli wstrzyknij całą objętość komórek.

Następnie należy całkowicie wycofać igłę, aby prawidłowo usunąć strzykawkę i igłę. Zamknąć powiekę i delikatnie ucisknąć miejsce wstrzyknięcia gąbką z gazy. Następnie należy zbadać miejsce wstrzyknięcia pod kątem obrzęku lub innego widocznego urazu i pozwolić myszy odzyskać przytomność w sterylnej klatce wyłożonej ręcznikami papierowymi i monitorowaniem przed przeniesieniem zwierzęcia do klatki domowej.

Aby zmierzyć wynik GVHD, umieść klatkę w okapie z przepływem laminarnym i wyjmij z klatki jedzenie i wodę. Aby ocenić aktywność, obserwuj zachowanie myszy przez pięć minut. Aby uzyskać wynik utraty wagi, zważ każdą mysz w szklanej zlewce.

Gdy mysz jest jeszcze w zlewce, sprawdź zwierzę pod kątem postawy, tekstury futra i integralności skóry. Po pobraniu interesujących tkanek wytnij z narządu kawałek tkanki o wymiarach około 3 na 0,5 milimetra i zważyć próbkę na wadze. Przenieś zważoną tkankę do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra i zamroź próbkę w ciekłym azocie do przechowywania przez noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Następnego ranka rozmrozić próbki przed lizą, zgodnie z instrukcjami z zestawu do izolacji genomowego DNA. W celu ilościowego oznaczania ludzkich limfocytów T za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub PCR, należy przygotować cyfrowe reakcje PCR zgodnie z protokołem barwników wiążących DNA dla używanej cyfrowej maszyny do PCR i przy użyciu odpowiednich starterów dla ludzkiego DNA genomowego epsilon CD3. Następnie należy przeprowadzić reakcję digital PCR w odpowiednich warunkach reakcji.

Subletalnie napromieniowane myszy NSG w wieku od 8 do 12 tygodni obojga płci, które otrzymują ludzki PBMC, zaczynają wykazywać kliniczne objawy GVHD około 10 dnia po wstrzyknięciu, w porównaniu z myszami z kontrolą ujemną leczoną tylko PBS. Myszy XenoGVHD mają medianę przeżycia wynoszącą 23,5 dnia. Za pomocą cyfrowego PCR można wykryć ludzkie limfocyty T CD3 epsilon-dodatnie w próbkach płuc i wątroby myszy, które otrzymują ludzkie PBMC.

Bardzo ważne jest, aby ocena punktowa była wykonywana konsekwentnie i aby badacz oceniający myszy był ślepy na ich leczenie. Po tej procedurze można pobrać surowicę od myszy poddanych eutanazji w celu analizy ekspresji cytokin obwodowych, a komórki odpornościowe można pobrać ze śledziony do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.