Name: Analiza wychwytu endocytarnego i transportu wstecznego do sieci trans-Golgiego z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Poznaj metodę analizy transportu wstecznego białek do sieci trans-Golgiego w komórkach HeLa przy użyciu funkcjonalizowanych nanociał. Technika ta umożliwia badanie dynamiki błon komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Grant 31003A-162643 przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki. Dziękujemy Nicole Beuret i Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) za wsparcie.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nanociała reprezentują nową klasę rusztowań wiążących białka, które mają wiele zalet w porównaniu z konwencjonalnymi przeciwciałami: są małe, stabilne, monomeryczne, mogą być wybrane pod kątem wysokiego powinowactwa i nie mają wiązań dwusiarczkowych 33,35,44,45. Są one wykorzystywane w wielu zastosowaniach, takich jak systemy hodowli komórkowych i organizmy w biologii rozwoju 46,47,48,49, jako ...

Ruch wsteczny białek i lipidów z powierzchni komórki do różnych przedziałów wewnątrzkomórkowych jest kluczowy dla utrzymania homeostazy błony, aby zrównoważyć wydzielanie i recykling składników następczych maszyn transportowych1,2. Po internalizacji poprzez endocytozę zależną lub niezależną od klatryny, ładunek białkowy i lipidowy najpierw zasiedla wczesne endosomy, skąd są dalej przekierowywane wzdłuż układu endo-lizosomalnego, zawracane do błony plazmatycznej lub kierowane do sieci trans-Golgiego (TGN). Recykling z endosomów i/lub powierzchni komórki do TGN jest częścią cyklu funkcjonalnego wielu następczych transbłonowych receptorów ładunkowych, takich jak zależne od kationów i niezależne od kationów receptory mannozo-6-fosforanu (CDMPR i CIMPR) dostarczające nowo zsyntetyzowane hydrolazy lizosomalne z TGN do późnych endosomów i lizosomów3,4,5, sortilin i SorLA6,7, a Wntless (WLS) transportuje ligandy Wnt na powierzchnię komórki8,9,10,11. Inne białka odzyskane z powrotem do TGN to TGN46 i pokrewne z nim izoformy12,13,14, SNAREs (rozpuszczalne receptory przyłączeniowe czynnika fuzji wrażliwe na N-etylomaleimid)15,16,17, białko prekursorowe amyloidu (APP)18,19, białko progresywnej ankylozy (ANK)20, transportery metali, takie jak ATP7A/B lub DMT121,22, oraz enzymy przetwarzania transbłonowego, w tym karboksypeptydaza D, furyna lub BACE123,24,25. Oprócz tych endogennych białek, toksyny bakteryjne i roślinne (np. toksyna Shiga i, rycyna i abryna) porywają wsteczne mechanizmy transportowe, aby dotrzeć do ER w celu retrotranslokacji do cytozolu26,27,28,29.
Aby bezpośrednio analizować ruch wsteczny, wcześniej opracowaliśmy zestaw narzędzi oparty na nanociałach do oznaczania i śledzenia białek ładunkowych od powierzchni komórki do przedziałów wewnątrzkomórkowych30. Nanociała reprezentują nową rodzinę spoiw białkowych pochodzących z homodimerycznych przeciwciał opartych wyłącznie na łańcuchach ciężkich (hcAb), które naturalnie występują u wielbłądowatych i ryb chrzęstnych31,32. Stanowią one zmienną domenę łańcucha ciężkiego (VHH) hcAb i mają wiele zalet w porównaniu z konwencjonalnymi przeciwciałami (np. IgG): Są monomeryczne, małe (~15 kDa), wysoce rozpuszczalne, pozbawione wiązań dwusiarczkowych, mogą ulegać ekspresji bakteryjnej i są wybierane pod kątem wysokiego powinowactwa wiązania33,34,35,36. Aby nasze narzędzie do nanowirusa było wszechstronne i miało szerokie zastosowanie, zastosowaliśmy funkcjonalizowane nanociała anty-GFP do znakowania powierzchniowego i śledzenia białek znakowanych GFP w ich domenie zewnątrzkomórkowej/świetlnej. Poprzez funkcjonalizację nanociał za pomocą mCherry, peroksydazy askorbinianowej 2 (APEX2)37 lub sekwencji siarczanowania tyrozyny (TS), wsteczny transport prawdziwych transbłonowych białek ładunkowych można analizować za pomocą obrazowania stałych i żywych komórek, mikroskopii elektronowej lub biochemicznie. Ponieważ siarczanowanie tyrozyny, w którym pośredniczą sulfotransferazy tyrozyloproteinowe (TPST1 i TPST2) jest modyfikacją potranslacyjną ograniczoną do trans-Golgiego/TGN, możemy bezpośrednio badać transport i kinetykę interesujących białek z powierzchni komórki do tego wewnątrzkomórkowego przedziału Golgiego38,39,40.
W tym artykule o metodach opisujemy łatwość produkcji funkcjonalizowanych nanociał (VHH-2xTS, -APEX2, -mCherry i pochodnych) nadających się do wielu zastosowań do analizy transportu wstecznego w komórkach ssaków30. Koncentrujemy się głównie na wykorzystaniu nanonika modyfikowanego w miejscu TS do analizy ruchu wewnątrzkomórkowego od powierzchni komórki do przedziału zasiarczenia.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-GFP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>Produkt jest dystrybuowany przez Sigma-Aldrich, ale wytwarzany przez Roche</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-His6</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A190-114A Przeciwciało</td><td></td></tr><tr><td>anty-aktynowe</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysz HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>rozpuszczony w 1x PBS/1%BSA</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Applichem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>D-biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>rozpuszczony w sterylnym 500 mM NaH2PO4 lub kwas</td></tr><tr><td>5-aminolewuilnowy DMSO (dALA) chlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>rozpuszczony w sterylnej wodzie</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td><td>rozpuszczony w sterylnej wodzie</td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>Produkt jest dystrybuowany przez Sigma-Aldrich, ale produkowany przez Roche</td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5936</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Bioconcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Applichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td></td></tr><tr><td>Siarka-35 jako siarczan sodu</td><td>Hartmann Analytics</td><td>ARS0105</td><td>Produkt zawiera 5 mCi</td></tr><tr><td>Zbilansowane sole Earle'a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6267</td><td></td></tr><tr><td>MEM roztwór aminokwasów (50x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>MEM roztwór witamin (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>Produkt jest dystrybuowany przez Sigma-Aldrich, ale produkowany przez Roche</td></tr><tr><td>Isopropyl-&beta;-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Applichem</td><td>A1008</td><td>rozpuszczony w sterylnej wodzie, zapas to 1 M</td></tr><tr><td>sól disodowa karbenicyliny</td><td>Applichem</td><td>A1491</td><td>rozpuszczony w sterylnej wodzie, zapas to 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>rozpuszczony w sterylnej wodzie, zapas to 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Coomassie-R (Brilliant Blue)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Applichem</td><td>A3813</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Ni Sepharose High Performance</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5268-01</td><td></td></tr><tr><td>Jego kolumny GraviTrap</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0033-99</td><td></td></tr><tr><td>Jego zestaw buforowy</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0034-00</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe kolumny odsalające PD10</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Żele Mini-Protean TGX, 4-20%, 15-dołkowy</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) bez Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Szalki 35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe</td><td>TPP</td><td>92406</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane (nr 1,5H)</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>Applichem</td><td>A0999.0025</td><td>rozpuszczony w 40% DMSO 60% izopropanolu, zapas 500 mM</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>rozpuszczony w sterylnej wodzie, zapas 1 M</td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Merck Millipore</td><td>102382</td><td>rozpuszczony w sterylnej wodzie, zapas wynosi 1 M</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td>rozpuszczony w sterylnej wodzie, zapas wynosi 5 M</td></tr></tbody></table>

analiza wychwytu endocytarnego i transportu wstecznego do sieci trans-golgiego z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport białek i błon z powierzchni komórki do Golgiego i dalej jest niezbędny dla homeostazy, tożsamości organelli i fizjologii. Aby zbadać ruch białek wstecznych, opracowaliśmy niedawno wszechstronny zestaw narzędzi oparty na nanociałach do analizy transportu z powierzchni komórki do kompleksu Golgiego, za pomocą obrazowania stałych i żywych komórek, mikroskopii elektronowej lub biochemicznie. Zaprojektowaliśmy funkcjonalizowane nanociała białka anty-zielonej fluorescencji (GFP) - małe, monomeryczne spoiwa białkowe o wysokim powinowactwie - które można zastosować do linii komórkowych wyrażających interesujące białka błonowe z zewnątrzkomórkową grupą GFP. Derywatyzowane nanociała związane z reporterami GFP są specjalnie internalizowane i transportowane na barana wzdłuż tras sortowania reporterów. Nanociała funkcjonalizowano za pomocą fluoroforów w celu śledzenia transportu wstecznego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i obrazowania na żywo, za pomocą peroksydazy askorbinianowej 2 (APEX2) w celu zbadania ultrastrukturalnej lokalizacji kompleksów reporter-nano za pomocą mikroskopii elektronowej oraz za pomocą motywów siarczanowania tyrozyny (TS) w celu oceny kinetyki nadejścia sieci trans-Golgiego (TGN). W tym artykule metodologicznym przedstawiamy ogólną procedurę bakteryjnej ekspresji i oczyszczania funkcjonalizowanych nanociał. Ilustrujemy potężne zastosowanie naszego narzędzia za pomocą nanociał modyfikowanych mCherry i TS do analizy wychwytu endocytarnego i przybycia TGN białek ładunkowych.

W celu zbadania wstecznego transportu białek do różnych komórkowych miejsc docelowych, opracowaliśmy niedawno narzędzie oparte na nanoprzeciwciałach przeciwko GFP, służące do znakowania i śledzenia rekombinowanych białek fuzyjnych z powierzchni komórki30. W niniejszym materiale przedstawiamy bakteryjną produkcję takich zmodyfikowanych nanoprzeciwciał oraz demonstrujemy ich zastosowanie w badaniu pobierania endocytycznego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i imm...

Wsteczny transport białek z powierzchni komórki do Golgiego jest niezbędny do utrzymania homeostazy błony. W tym miejscu opisujemy metodę biochemicznej analizy transportu białek rekombinowanych z powierzchni komórki do Golgiego przy użyciu funkcjonalizowanych nanociał w komórkach HeLa.

Analiza wychwytu endocytarnego i transportu wstecznego do sieci trans-Golgiego z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Metoda ta umożliwia produkcję i zastosowanie funkcjonalizowanych nanociał ulegających ekspresji bakteryjnej do analizy wstecznego transportu białek z powierzchni komórki do przedziałów międzykomórkowych. W szczególności sieć Trans-Golgi. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie zasiarczenia. Wysoce specyficzna, podzielona na przedziały i czuła modyfikacja po translacji w celu oceny przybycia kompleksu nanociał reporterowych do przedziału DTN. Metoda ta, w połączeniu z innymi derywatyzowanymi nanociałami do obrazowania żywych komórek i mikroskopii elektronowej, może być również stosowana do badania procesów endokitycznych receptorów powierzchniowych komórek związanych z chorobą. Nasz repertuar funkcjonalizowanych nanociał został opracowany w celu badania transportu wstecznego w hodowanych komórkach. Jednak narzędzia te mogą być również stosowane w organizmach wielokomórkowych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pobrać z płytki kolonię bakteryjną zawierającą interesujący nas wektor i zaszczepić kolbę zawierającą 20 mililitrów pożywki LB uzupełnionej antybiotykami. Inkubować przez noc w temperaturze 37

analysis-endocytic-uptake-retrograde-transport-to-trans-golgi-network

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje metodę badania absorpcji i transportu wstecznego funkcjonalizowanych nanociał w celu zrozumienia ich wewnątrzkomórkowych szlaków transportowych. Dzięki wprowadzeniu znakowanego radioaktywnie siarczanu oraz wykorzystaniu technik izolacji i wykrywania, metoda ta umożliwia badanie wychwytu endocytarnego i docierania białek ładunkowych do sieci trans-Golgiego.

Monitorowanie przybycia białek powierzchniowych znakowanych GFP do sieci trans-Golgiego przy użyciu funkcjonalizowanych nanociał

Transportowanie błony polega na transporcie białek z błony plazmatycznej do wnętrza komórki (np. endocytoza), a następnie transporcie do lizosomów w celu degradacji lub do błony plazmatycznej w celu recyklingu. Metody opisane w tym artykule mają na celu badanie endocytozy i recyklingu białek błony komórkowej.

Komórkowe testy ochrony L-glutationu do badania endocytozy i recyklingu białek błony komórkowej

Opisujemy metodę znakowania białka na powierzchni żywych neuronów za pomocą specyficznego poliklonalnego przeciwciała przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym. Białko związane przez przeciwciało na powierzchni komórki, a następnie internalizowane przez endocytozę, można odróżnić od białka pozostającego na powierzchni lub transportowanego na powierzchnię podczas inkubacji.

Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Ten artykuł opisuje metody syntezy i fluorescencyjnego znakowania nanocząstek (NP). Nanocząsteczki zastosowano w eksperymentach z pogonią za impulsami w celu oznaczenia układu endolizosomalnego komórek eukariotycznych. Manipulację układu endo-lizosomalnego przez aktywność wewnątrzkomórkowego patogenu Salmonella enterica przeprowadzono następnie za pomocą obrazowania żywych komórek i określono ilościowo.

Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe

Ruch receptorów moduluje sygnalizację i reakcję komórki na ligandy i sam reaguje na warunki komórkowe, w tym sygnalizację indukowaną przez ligand. W tym miejscu opisujemy potężną i elastyczną technikę ilościowej oceny transportu receptorów indukowanego przez lek za pomocą znakowania immunologicznego i analizy kolokalizacyjnej.

Śledzenie zmian wywołanych przez leki w transporcie receptorów po internalizacji za pomocą analizy kolokalizacyjnej

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

W tym raporcie przedstawiono dwie metody oparte na biotynylacji, przeznaczone do określania ekspresji na powierzchni komórki i szybkości endocytarnej białek wyrażanych na błonie plazmatycznej.

Określanie ekspresji białek na powierzchni komórki i szybkości endocytów w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji

Opisujemy optyczny test do recyklingu pęcherzyków synaptycznych (SV) w hodowanych neuronach. Połączenie tego protokołu z podwójną transfekcją w celu ekspresji markera presynaptycznego i białka będącego przedmiotem zainteresowania pozwala nam zlokalizować miejsca presynaptyczne, ich zdolność do recyklingu pęcherzyków synaptycznych i określić rolę białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Test optyczny do recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach z nadekspresją białek presynaptycznych

Endosomy recyklingowe są częścią endosomalnej sieci kanalikowej. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania dynamiki recyklingu endosomów przy użyciu GFP-STX13 jako markera organelli.

Test oparty na mikroskopii do badania i analizy endosomów recyklingu przy użyciu transportu SNARE

Endocytowy i retrogradacyjny transport białek z błony plazmatycznej do sieci trans-Golgiego jest niezbędny do utrzymania homeostazy błony i regulacji sygnalizacji. Tutaj opisujemy metodę obrazowania i ilościowego transportu endocytarnego białek transbłonowych za pomocą mikroskopii komórek żywych, wykorzystując deriwatyzowane nanociała anty-GFP w komórkach HeLa.

Obrazowanie transportu endocytarnego na żywych komórkach z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Poznaj metodę analizy transportu wstecznego białek do sieci trans-Golgiego w komórkach HeLa przy użyciu funkcjonalizowanych nanociał. Technika ta umożliwia badanie dynamiki błon komórkowych.

Analiza wychwytu endocytarnego i transportu wstecznego do sieci trans-Golgiego z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach (Wideo) | JoVE Journal

Analiza wychwytu endocytarnego i transportu wstecznego do sieci trans-Golgiego z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Przeglądaj więcej filmów