Fluorescencyjna wizualizacja RNA znakowanego mango w żelach poliakrylamidowych metodą poststainingu
21 czerwca 2019
Tutaj prezentujemy czułą, szybką i dyskryminującą metodę barwienia po żelu do obrazowania RNA oznaczonych aptamerami RNA Mango I, II, III lub IV, przy użyciu natywnych lub denaturujących żeli do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Po uruchomieniu standardowych żeli PAGE, RNA znakowane mango można łatwo wybarwić TO1-Biotyną, a następnie przeanalizować za pomocą powszechnie dostępnych czytników fluorescencji.
Zademonstrowana tutaj metodologia obrazowania żelu znakowanego mango jest solidna i oczekuje się, że będzie można ją łatwo rozszerzyć pod względem czułości i swoistości. To jeszcze bardziej uprościłoby rutynowe oczyszczanie biologicznie ważnych RNA i kompleksów RNA poprzez proste rozwiązanie polegające na dodaniu znacznika mango do interesującego RNA. RNA są zaangażowane w coraz więcej chorób, dlatego ta metoda po datowaniu jest łatwym i szybkim sposobem na śledzenie i wizualizację RNA.
Dodatkowa ostrożność będzie wymagana przy przenoszeniu żelu z miejsca na miejsce, ponieważ żele są kruche i podatne na pękanie. Aby przygotować 30-mililitrowy żel denaturujący, najpierw wybierz procent poliakrylamidu z odpowiednimi barwnikami błękitu bromofenolowego i cyjanolu ksylenowego w porównaniu z interesującym RNA, aby zapewnić wysoką separację pasm. Następnie wymieszaj roztwory A, B i C zgodnie z tabelą pierwszą i dodaj APS i tymun.
Natychmiast wlać roztwór żelu do odpowiedniego aparatu do odlewania żelu. Włóż żądany stożek i pozostaw żel do polimerazy na około 30 minut. Uzupełnić zbiornik żelu za pomocą 1 roztworu XTBE i ostrożnie usunąć stożek.
Ostrożnie podnieś żel i zamontuj na aparacie żelowym i zabezpiecz za pomocą spinaczy do segregatorów. Za pomocą strzykawki odessać studzienki bezpośrednio przed załadowaniem próbki. Przygotuj 1X próbki RNA, dodając 2X roztwór ładujący żel denaturujący do interesujących próbek RNA.
Użyj termocyklera, aby podgrzać próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie załaduj schłodzone próbki na dno każdej studzienki za pomocą końcówek do ładowania żelem. I cóż, żel w temperaturze pokojowej, zapewniając, że moc jest skutecznie niska, aby nie pękła szklana płytka aparatu żelowego.
Przygotuj 1X roztwór do barwienia żelu zgodnie z rękopisem w czystym szklanym pojemniku, który jest wystarczająco szeroki, aby wygodnie pasował do żelu. Dodaj wystarczającą ilość roztworu barwiącego 1X żel do pojemnika, aby żel był całkowicie pokryty roztworem po umieszczeniu na rotatorze orbitalnym. Gdy żel zakończy działanie, wyjmij żel z aparatu, odetnij jego dołki i róg żelu, aby pomóc określić orientację.
Następnie ostrożnie przenieś żel do roztworu barwiącego 1X żelu. Aby wykonać obrazowanie, ostrożnie zdekantuj roztwór barwiący i szybko spłucz żel wodą. Na koniec ostrożnie przenieś żel na tackę, która ma zostać umieszczona w imagerze.
Przetocz szklaną pipetę po żelu, aby usunąć uwięzione pęcherzyki i nadmiar płynu. I przystąp do robienia zdjęcia żelu. Aptamery mango jeden, dwa, trzy, cztery były zasadniczo odporne na denaturację do około jednego molowego stężenia mocznika.
Czas barwienia od 20 do 40 minut był wystarczający do maksymalnego rozkwitu żelu. Dłuższy czas nie był odpowiedni dla małych RNA użytych w tym badaniu, ponieważ zaczęły one dyfundować z żelu. Analiza fluorometryczna wykazała, że aptamery mango jeden, drugi i trzeci w obecności mocznika mogą fałdować się szybciej niż aptamery czwarte.
Przy braku mocznika fałdowanie było znacznie szybsze, niż się spodziewano. Czułość metody po barwieniu wykazano za pomocą pojedynczych prążków odpowiadających dobrze pofałdowanym RNA dla każdego z wariantów Mango w żelach natywnych i denaturujących z nieco mniejszą czułością dla późniejszego. Kwantyfikacja natywnych żeli była logarytmicznie liniowa na około jednym szczeblu wielkości, przy czym Mango jeden, dwa i cztery zachowywały się w bardziej liniowy sposób niż Mango trzy.
Kwantyfikacja żeli denaturujących była bardziej liniowa, co sugeruje, że obecność mocznika w żelu denaturującym może zapewnić bardziej jednorodny sposób składania aptamerów po umieszczeniu ich w roztworze barwiącym biotynę TO1. RNA znakowane mango można wykryć w obecności całkowitego RNA za pomocą barwienia biotyną TO1 w porównaniu z barwieniem SG. Pamiętaj, aby upewnić się, że pojemnik na żel do barwienia jest wystarczająco duży, aby zmieścił się w żelu, w przeciwnym razie żel może się złożyć do siebie.
Próbki RNA przenoszą się z jednego miejsca na drugie. Podobnie jak w przypadku żeli denaturujących, metodę tę można wykonać w przypadku żelu natywnego. Uruchom żel w chłodni o niższej mocy, aby utrzymać natywne warunki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szybką i czułą metodę barwienia poelektroforetycznego do obrazowania cząsteczek RNA oznakowanych aptamerami RNA Mango z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Metodologia ta zwiększa możliwość śledzenia i wizualizacji biologicznie istotnych RNA oraz kompleksów RNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia molekularna
- Obrazowanie RNA
Wstęp
- RNA odgrywa kluczową rolę w różnych procesach biologicznych.
- Śledzenie RNA jest niezbędne do zrozumienia jego udziału w chorobach.
- Istniejące metody wizualizacji RNA mogą być złożone i czasochłonne.
- Metoda znakowania Mango stanowi prostszą alternatywę.
Cel badania
- Opracowanie skutecznej metody barwienia do wizualizacji RNA.
- Zwiększenie czułości i specyficzności śledzenia RNA.
- Ułatwienie oczyszczania kompleksów RNA.
Zastosowane Metody
- Barwienie żelu po elektroforezie przy użyciu TO1-Biotyny.
- Zastosowanie żeli PAGE w warunkach natywnych lub denaturujących.
- Przygotowanie żeli o określonym stężeniu poliakryloamidu.
- Analiza z wykorzystaniem czytników fluorescencyjnych.
Główne wyniki
- Metoda obrazowania z użyciem znacznika Mango jest czuła i szybka.
- Umożliwia ona łatwą wizualizację prążków RNA.
- Ze względu na kruchość żelu, podczas pracy z nim należy zachować szczególną ostrożność.
- Metodę tę można dostosować do różnych typów RNA.
Wnioski
- Opracowana metoda upraszcza śledzenie i wizualizację RNA.
- Posiada ona potencjalne zastosowania w badaniu chorób związanych z RNA.
- Przyszłe prace mogą zwiększyć czułość i swoistość tej metody.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Fluorescencyjna wizualizacja RNA znakowanego aptamerem Mango w żelach poliakrylamidowych umożliwia czułą, specyficzną i kosztowo efektywną detekcję gatunków RNA w złożonych mieszaninach. Możliwość ta odpowiada na krytyczną potrzebę niezawodnego śledzenia i ilościowego oznaczania RNA podczas wczesnych etapów odkryć oraz opracowywania testów, wspierając pewność prognostyczną w badaniach ukierunkowanych na RNA. Wysoka czułość i specyficzność tej metody ułatwiają selekcję projektów oraz dostosowanie rozwoju zasobów opartych na RNA do poziomu ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę gatunków i kompleksów RNA w próbkach heterogenicznych.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów RNA poprzez bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację.
- Ułatwia ograniczanie ryzyk mechanistycznych poprzez odróżnianie specyficznych oddziaływań RNA od tła.
- Zwiększa pewność prognostyczną w programach odkrywania leków opartych na RNA.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia ustandaryzowany, powtarzalny schemat detekcji RNA w żelach natywnych i denaturujących.
- Dostarcza ilościowe wyniki odpowiednie do kalibracji i optymalizacji testu.
- Umożliwia wiarygodną ocenę integralności i zwijania RNA w wielu różnych warunkach.
- Wspiera skalowalny screening wariantów lub kompleksów RNA do dalszych zastosowań.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z badaniami nad biomarkerami RNA istotnymi dla chorób, umożliwiając czułą detekcję w złożonych środowiskach.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki wspieraniu niezawodnego śledzenia RNA.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne, dostarczając ilościowe i powtarzalne dane z wizualizacji RNA.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda barwienia po hybrydyzacji płynnie integruje się z procesem od wczesnego odkrywania, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po badania przedkliniczne, zapewniając możliwość wielokrotnego wykorzystania w wizualizacji i kwantyfikacji RNA.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie bezpośredniej obserwacji celów RNA.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy ilościowe wyniki, pozwalające na wiarygodne porównywanie próbek RNA.
- Analityka: Zapewnia kwantyfikację log-liniową i wysoką czułość, umożliwiając rzetelną analizę danych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dostrojenie biomarkerów i zachowanie ciągłości między etapami badań.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje kosztowo efektywną, adaptacyjną platformę do powtarzalnych potrzeb detekcji RNA.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność w walidacji celu RNA.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy wizualizacji RNA i zwiększa powtarzalność.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową w programach skoncentrowanych na RNA.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów RNA z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o solidne dane detekcyjne.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z RNA oraz w przeprowadzaniu elektroforezy w żelach poliakrylamidowych.
- Wymaga dostępu do aparatury do obrazowania fluorescencyjnego oraz odpowiednich odczynników barwiących.
- Wymaga ostrożnego obchodzenia się z żelem ze względu na jego kruchość i ryzyko uszkodzenia podczas transferu.
- Wymaga dostosowania czasu i warunków barwienia do różnych rozmiarów RNA oraz rodzajów żeli.
- Ograniczone przez potencjalną dyfuzję małych cząsteczek RNA podczas przedłużonych okresów barwienia.
