Name: Fluorescencyjna wizualizacja RNA znakowanego mango w żelach poliakrylamidowych metodą poststainingu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Poznaj metodę poststainingu do fluorescencyjnej wizualizacji RNA znakowanego aptamerami Mango w żelach poliakrylamidowych. Technika ta umożliwia szybkie i czułe śledzenie biologicznie ważnych cząsteczek RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Razvanowi Cojocaru i Amirowi Abdolahdehowi za pomoc techniczną oraz Lenie Dolgosheina za korektę rękopisu. Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez grant operacyjny Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) dla P.J.U.

<ol><li>Dolgosheina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Mango+Aptamer-Fluorophore%3A+A+Bright%2C+High-Affinity+Complex+for+RNA+Labeling+and+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking.</a> ACS Chemical Biology. , (2014).</li>
<li>Autour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+RNA+Mango+aptamers+for+imaging+small+non-coding+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells.</a> Nature Communications. 9, 656(2018).</li>
<li>Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore-binding+RNA+aptamers+and+their+applications%3A+Fluorophore-binding+RNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).</li>
<li>Panchapakesan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleoprotein+Purification+and+Characterization+using+RNA+Mango%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango.</a> RNA. , 1592-1599 (2017).</li>
<li>Trachman, R. J. III, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+high-affinity+fluorophore+binding+and+activation+by+RNA+Mango%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango.</a> Nature Chemical Biology. 13, 807(2017).</li>
<li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structures+of+the+Mango-II+RNA+Aptamer+Reveal+Heterogeneous+Fluorophore+Binding+and+Guide+Engineering+of+Variants+with+Improved+Selectivity+and+Brightness%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness.</a> Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).</li>
<li>Trachman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mango-III+is+a+compact+fluorogenic+RNA+aptamer+of+unusual+structural+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity.</a> Nature Chemical Biology. , in review (2018).</li>
<li>Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+complex+purification+using+high-affinity+fluorescent+RNA+aptamer+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).</li>
<li>Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+imaging+of+RNA+processing+using+Broccoli+reveals+optimal+aptamer+expression+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies.</a> Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).</li>
<li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li>
<li>A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303">https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303</a> (2018).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol%3AChloroform%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).</li>
<li>Tuma, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+SYBR+Gold+Nucleic+Acid+Gel+Stain%3A+A+Dye+Optimized+for+Use+with+300-nm+Ultraviolet+Transilluminators%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators.</a> Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).</li>
<li>Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+multiple+exogenous+and+endogenous+small+RNA+populations+in+parallel+with+subfemtomolar+sensitivity+using+a+streptavidin+gel-shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay.</a> RNA. 15, 724-731 (2009).</li>
</ol>

Zgłoszono patent na system fluorogeniczny Mango.

Istotną zaletą znacznika fluorescencyjnego Mango jest to, że pojedynczy znacznik może być używany na wiele sposobów. Wysoka jasność i powinowactwo tych aptamerów sprawiają, że są one przydatne nie tylko do wizualizacjikomórki2 , ale także do oczyszczania RNA lub RNP in vitro4. Dlatego obrazowanie żelowe w prosty sposób rozszerza wszechstronność znacznika Mango. Czułość obrazowania w żelu mango jest nieco mniejsza niż w przypadku northern blot14 , ale...

Mango to system znakowania RNA składający się z zestawu czterech małych fluorescencyjnych aptamerów RNA, które ściśle wiążą się (wiązanie nanomolowe) z prostymi pochodnymi oranżu tiazolowego (TO1-Biotyna, <silna klasa="xfig">Rysunek 1A)1,2,3. Po związaniu fluorescencja tego liganda zwiększa się od 1000 do 4000 razy w zależności od konkretnego aptameru. Wysoka jasność systemu Mango, która w przypadku Mango III przewyższa jasność wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP), w połączeniu z powinowactwem do wiązania nanomolowego aptamerów RNA Mango, pozwala na wykorzystanie go zarówno w obrazowaniu, jak i oczyszczaniu kompleksów RNA2,4.
Struktury rentgenowskie Mango I5, II6, oraz III7 zostały określone w wysokiej rozdzielczości, a wszystkie trzy aptamery wykorzystują kwadrupleks RNA do wiązania TO1-Biotyny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B–D). Zwarte rdzenie wszystkich trzech aptamerów są izolowane od zewnętrznej sekwencji RNA za pomocą kompaktowych motywów adaptacyjnych. Zarówno Mango I, jak i II wykorzystują elastyczny adapter pętli podobny do GNRA, aby połączyć swoje rdzenie Mango z dowolnym dupleksem RNA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B, C). W przeciwieństwie do tego, Mango III wykorzystuje sztywny motyw triplex do połączenia swojego rdzenia z dowolną helisą RNA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D, fioletowe reszty ), podczas gdy struktura Mango IV nie jest obecnie znana. Ponieważ rdzeń wiążący ligand każdego z tych aptamerów jest oddzielony od zewnętrznej sekwencji RNA przez te spiralne adaptory, wydaje się prawdopodobne, że wszystkie one mogą być po prostu włączone do różnych RNA. Bakteryjne regulatorowe RNA 6S (Mango I), składniki spliceosomu drożdży (Mango I) oraz ludzkie RNA 5S, U6 RNA i C/D scaRNA (Mango II i IV) zostały pomyślnie oznaczone w ten sposób2,8, co sugeruje, że wiele biologicznych RNA można oznaczyć za pomocą systemu aptamerowego RNA Mango.
Denaturing i natywne żele są powszechnie używane do badania RNA. Żele denaturacyjne są często używane do oceny wielkości RNA lub przetwarzania RNA, ale zazwyczaj, na przykład w przypadku northern blot, wymagają kilku powolnych i sekwencyjnych kroków w celu wygenerowania obrazu. Podczas gdy inne aptamery fluorogenne RNA, takie jak RNA Szpinak i Brokuły, były z powodzeniem stosowane do obrazowania żelowego9, żaden fluorogenny system aptamerowy do tej pory nie posiada tak wysokiej jasności i powinowactwa jak system Mango, co czyni go bardzo interesującym do zbadania zdolności obrazowania żelu Mango. W tym badaniu zastanawialiśmy się, czy system RNA Mango można po prostu rozszerzyć na obrazowanie żelowe, ponieważ długości fal wzbudzenia i emisji TO1-biotyny (odpowiednio 510 nm i 535 nm) są odpowiednie do obrazowania w kanale eGFP wspólnym dla większości fluorescencyjnych oprzyrządowań do skanowania żelowego.
Przedstawiony tutaj protokół barwienia po żelu zapewnia szybki sposób na specyficzne wykrywanie cząsteczek RNA znakowanych mango w natywnych i denaturujących żelach do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Ta metoda barwienia polega na moczeniu żeli w buforze zawierającym potas i TO1-Biotynę. APTAMERY RNA Mango są oparte na G-quadruplex, a do stabilizacji takich struktur potrzebny jest potas. Używając RNA transkrybowanego z minimalnych matryc DNA kodujących Mango (patrz sekcja protokołu), możemy po prostu wykryć zaledwie 62,5 fmol RNA w natywnych żelach i 125 fmol RNA w żelach denaturujących, używając prostego protokołu barwienia. W przeciwieństwie do zwykłych niespecyficznych barwień kwasami nukleinowymi (patrz Tabela materiałów, odniesiona do SG dalej), możemy wyraźnie zidentyfikować RNA znakowane mango, nawet jeśli w próbce obecne są wysokie stężenia całkowitego nieoznakowanego RNA.

<table><tbody><tr><td>Grzebień o grubości 0,8 mm 14 dołków na 30 ml żele PAGE</td><td>LabRepCo</td><td>11956042</td><td></td></tr><tr><td>101-1000 &micro; L&nbsp; końcówki</td><td>Fisher</td><td>02-707-511</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &mikro; L niska retencja&nbsp; wskazówki</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-717-143</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid: N,N'-metylenobisakryloamid (40% 19:1)</td><td>Bioodczynniki</td><td>BP1406-1</td><td>Ostra toksyczność</td></tr><tr><td>Akrylamid:N,N'-metylenobisakryloamid (40% 29:1)</td><td>Fisher</td><td>BP1408-1</td><td>Ostra toksyczność</td></tr><tr><td>Anachemia</td><td>agarowa</td><td>02116-380</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa płyta TLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>1164840001</tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>29083461</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Biorad</td><td>161-0700</td><td>Szkodliwe</td></tr><tr><td>komórki BL21</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>ACP</td><td>B-2940</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Niebieska sól sodowa</td><td>Sigma</td><td>B8026-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chloloform</td><td>ACP</td><td>C3300</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich Alkohole</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sól disodowa</td><td>ACP</td><td>E-4320</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Handlowy&nbsp;</td><td></td><td></td>P016EAAN</tr><tr><td>Płaski żel Końcówki obciążające</td><td>Costar</td><td>CS004854</td><td></td></tr><tr><td>Formamid 99%</td><td>Alfa</td><td>Aesar A11076</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw aparatów żelowych z przekładkami i grzebieniami</td><td>LabRepCo</td><td>41077017</td><td></td></tr><tr><td>Szklane naczynie z plastikową pokrywką</td><td>Pyrex</td><td>1122963</td><td>Powinien być wystarczająco duży, aby zmieścić się w kawałku żelu</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Anachemia</td><td>43567-540</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Anachemia</td><td>464140468</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuanTL</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>29000605</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Invitrogen</td><td>15529-019</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ACP</td><td>P-2940</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Caledron</td><td>4903-01</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ACP</td><td>S-2830</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BDH</td><td>BDH9292</td><td></td></tr><tr><td>Rotator orbitalny</td><td>Lab-Line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Invitrogen</td><td>15513-039</td><td></td></tr><tr><td>Okrągły żel Końcówki ładujące</td><td>Costar</td><td>CS004853</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Caledron</td><td>8120-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Caledron</td><td>8180-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBRGold</td><td>ThermoFisher</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T7 Polimeraza RNA</td><td>ABM</td><td>E041</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7024-50 ml</td><td></td></tr><tr><td>TO1-3PEG-Biotyna Fluorofor</td><td>ABM</td><td>G955</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9496-100</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Fisher</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen Cyanol</td><td>Sigma</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Bioshop</td><td>YEX401.500</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescencyjna wizualizacja rna znakowanego mango w żelach poliakrylamidowych metodą poststainingu

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Natywne i denaturujące żele poliakrylamidowe są rutynowo używane odpowiednio do charakteryzowania mobilności kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) i do pomiaru wielkości RNA. Ponieważ wiele technik obrazowania żelowego wykorzystuje niespecyficzne barwienia lub drogie sondy fluoroforowe, bardzo pożądane są czułe, dyskryminujące i ekonomiczne metodologie obrazowania żelowego. Sekwencje rdzenia RNA Mango to małe (19-22 nt) motywy sekwencji, które po zamknięciu przez dowolną łodygę RNA można łatwo i niedrogo dołączyć do interesującego RNA. Te znaczniki mango wiążą się z wysokim powinowactwem i specyficznością z tiazolowo-pomarańczowym ligandem fluoroforowym zwanym TO1-Biotyną, który po związaniu staje się tysiące razy bardziej fluorescencyjny. Tutaj pokazujemy, że Mango I, II, III i IV mogą być używane do specyficznego obrazowania RNA w żelach o wysokiej czułości. Zaledwie 62,5 fmol RNA w natywnych żelach i 125 fmol RNA w żelach denaturujących można wykryć, mocząc żele w buforze obrazowania zawierającym potas i 20 nM TO1-biotynę przez 30 minut. Wykazujemy specyficzność systemu znakowanego mango, obrazując bakteryjne RNA 6S znakowane mango w kontekście złożonej mieszaniny całkowitego bakteryjnego RNA.

Krótkie RNA znakowane Mango przygotowano zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Zakładając, że fluorescencję w warunkach denaturujących najtrudniej będzie zaobserwować ze względu na obecność mocznika w żelach, w pierwszej kolejności zbadano odporność aptamerów Mango na mocznik, który działa jako denaturator kwasów nukleinowych. Stwierdzono, że aptamery Mango są w znacznym stopniu odporne na denaturację do stężenia mocznika wynoszącego około 1 M (Rysunek 2A). Przed dodaniem ...

Tutaj prezentujemy czułą, szybką i dyskryminującą metodę barwienia po żelu do obrazowania RNA oznaczonych aptamerami RNA Mango I, II, III lub IV, przy użyciu natywnych lub denaturujących żeli do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Po uruchomieniu standardowych żeli PAGE, RNA znakowane mango można łatwo wybarwić TO1-Biotyną, a następnie przeanalizować za pomocą powszechnie dostępnych czytników fluorescencji.

Fluorescencyjna wizualizacja RNA znakowanego mango w żelach poliakrylamidowych metodą poststainingu

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Zademonstrowana tutaj metodologia obrazowania żelu znakowanego mango jest solidna i oczekuje się, że będzie można ją łatwo rozszerzyć pod względem czułości i swoistości. To jeszcze bardziej uprościłoby rutynowe oczyszczanie biologicznie ważnych RNA i kompleksów RNA poprzez proste rozwiązanie polegające na dodaniu znacznika mango do interesującego RNA. RNA są zaangażowane w coraz więcej chorób, dlatego ta metoda po datowaniu jest łatwym i szybkim sposobem na śledzenie i wizualizację RNA.Dodatkowa ostrożność będzie wymagana przy przenoszeniu żelu z miejsca na miejsce, ponieważ żele są kruche i podatne na pękanie. Aby przygotować 30-mililitrowy żel denaturujący, najpierw wybierz procent poliakrylamidu z odpowiednimi barwnikami błękitu bromofenolowego i cyjanolu ksylenowego w porównaniu z interesującym RNA, aby zapewnić wysoką separację pasm. Następnie wymieszaj roztwory A, B i C zgodnie z tabelą pierwszą i dodaj APS i tymun.Natychmiast wlać roztwór żelu do odpowiedniego aparatu do odlewania żelu. Włóż żądany stożek i pozostaw żel do polimerazy na około 30 minut. Uzupełnić zbiornik żelu za pomocą 1 roztworu XTBE i ostrożnie usunąć stożek.Ostrożnie podnieś żel i zamontuj na aparacie żelowym i zabezpiecz za pomocą spinaczy do segregatorów. Za pomocą strzykawki odessać studzienki bezpośrednio przed załadowaniem próbki. Przygotuj 1X próbki RNA, dodając 2X roztwór ładujący żel denaturujący do interesujących próbek RNA.Użyj termocyklera, aby podgrzać próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie załaduj schłodzone próbki na dno każdej studzienki za pomocą końcówek do ładowania żelem. I cóż, żel w temperaturze pokojowej, zapewniając, że moc jest skutecznie niska, aby nie pękła szklana płytka aparatu żelowego.Przygotuj 1X roztwór do barwienia żelu zgodnie z rękopisem w czystym szklanym pojemniku, który jest wystarczająco szeroki, aby wygodnie pasował do żelu. Dodaj wystarczającą ilość roztworu barwiącego 1X żel do pojemnika, aby żel był całkowicie pokryty roztworem po umieszczeniu na rotatorze orbitalnym. Gdy żel zakończy działanie, wyjmij żel z aparatu, odetnij jego dołki i róg żelu, aby pomóc określić orientację.Następnie ostrożnie przenieś żel do roztworu barwiącego 1X żelu. Aby wykonać obrazowanie, ostrożnie zdekantuj roztwór barwiący i szybko spłucz żel wodą. Na koniec ostrożnie przenieś żel na tackę, która ma zostać umieszczona w imagerze.Przetocz szklaną pipetę po żelu, aby usunąć uwięzione pęcherzyki i nadmiar płynu. I przystąp do robienia zdjęcia żelu. Aptamery mango jeden, dwa, trzy, cztery były zasadniczo odporne na denaturację do około jednego molowego stężenia mocznika.Czas barwienia od 20 do 40 minut był wystarczający do maksymalnego rozkwitu żelu. Dłuższy czas nie był odpowiedni dla małych RNA użytych w tym badaniu, ponieważ zaczęły one dyfundować z żelu. Analiza fluorometryczna wykazała, że aptamery mango jeden, drugi i trzeci w obecności mocznika mogą fałdować się szybciej niż aptamery czwarte.Przy braku mocznika fałdowanie było znacznie szybsze, niż się spodziewano. Czułość metody po barwieniu wykazano za pomocą pojedynczych prążków odpowiadających dobrze pofałdowanym RNA dla każdego z wariantów Mango w żelach natywnych i denaturujących z nieco mniejszą czułością dla późniejszego. Kwantyfikacja natywnych żeli była logarytmicznie liniowa na około jednym szczeblu wielkości, przy czym Mango jeden, dwa i cztery zachowywały się w bardziej liniowy sposób niż Mango trzy.Kwantyfikacja żeli denaturujących była bardziej liniowa, co sugeruje, że obecność mocznika w żelu denaturującym może zapewnić bardziej jednorodny sposób składania aptamerów po umieszczeniu ich w roztworze barwiącym biotynę TO1. RNA znakowane mango można wykryć w obecności całkowitego RNA za pomocą barwienia biotyną TO1 w porównaniu z barwieniem SG. Pamiętaj, aby upewnić się, że pojemnik na żel do barwienia jest wystarczająco duży, aby zmieścił się w żelu, w przeciwnym razie żel może się złożyć do siebie.Próbki RNA przenoszą się z jednego miejsca na drugie. Podobnie jak w przypadku żeli denaturujących, metodę tę można wykonać w przypadku żelu natywnego. Uruchom żel w chłodni o niższej mocy, aby utrzymać natywne warunki.

fluorescent-visualization-mango-tagged-rna-polyacrylamide-gels-via

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

W tym filmie demonstrujemy metodę barwienia srebrem żeli poliakrylamidowych do wizualizacji całkowitego białka za pomocą sond fluorogenicznych.

Barwienie srebrem fluorescencyjnym: technika wizualizacji białka całkowitego w żelach poliakrylamidowych

W tym filmie demonstrujemy elektroforezę w żelu poliakrylamidowym do denaturacji w celu oddzielenia fosforylowanych gatunków RNA od ich niefosforylowanych odpowiedników. Gatunki RNA są znakowane fluorescencyjnie w celu detekcji laserowej na żelu.

Denaturacja elektroforezy w żelu poliakryloamidowym mocznika do analizy RNA: technika oddzielania fluorescencyjnie znakowanych fosforylowanych oligonukleotydów RNA od ich niefosforylowanych odpowiedników

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do liczenia mRNA w pojedynczych komórkach w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.

Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

Ta metoda pozwala na selektywne barwienie i kwantyfikację DNA w żelach poprzez nasączenie żelu w roztworze SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium, a następnie wystawienie go na działanie światła słonecznego lub źródła niebieskiego światła. Powoduje to powstanie widocznego osadu i nie wymaga prawie żadnego sprzętu, dzięki czemu idealnie nadaje się do użytku w terenie.

Metoda barwienia DNA oparta na wytrącaniu się formazanu wywołanym ekspozycją na światło niebieskie

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół opisujący nową technikę barwienia fluorescencyjnego do całkowitego wykrywania białek w żelach poliakrylamidowych. Protokół wykorzystuje specyficzną dla jonów srebra sondę fluorescencyjną, która wykrywa kompleksy białkowe Ag + i eliminuje pewne ograniczenia tradycyjnych chromogennych barwników srebra.

Fluorescencyjne barwienie srebrem białek w żelach poliakryloamidowych

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Protokół przedstawia dwie metody określania kinetyki aptamerów fluorogennego RNA: Szpinak2 i Brokuły. Pierwsza metoda opisuje, w jaki sposób mierzyć kinetykę aptamerów fluorogennych in vitro za pomocą czytnika płytkowego, podczas gdy druga metoda szczegółowo opisuje pomiar kinetyki aptamerów fluorogennych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej.

Wyznaczanie kinetyki in vitro i komórkowej inkinety włączania fluorogenicznych aptamerów RNA

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Ten artykuł opisuje dwukolorowe znakowanie długich RNA na końcach i ich unieruchomienie powierzchni poprzez enkapsulację w pęcherzykach fosfolipidowych dla zastosowań mikroskopii pojedynczej cząsteczki FRET TIRF. Połączenie tych technik umożliwia precyzyjną wizualizację i analizę dynamiki RNA na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Fluorescencyjne znakowanie końcowe i enkapsulacja długich RNA w mikroskopii jednocząsteczkowej FRET-TIRF

Poznaj metodę poststainingu do fluorescencyjnej wizualizacji RNA znakowanego aptamerami Mango w żelach poliakrylamidowych. Technika ta umożliwia szybkie i czułe śledzenie biologicznie ważnych cząsteczek RNA.

Fluorescencyjna wizualizacja RNA znakowanego mango w żelach poliakrylamidowych metodą poststainingu

Przeglądaj więcej filmów