Test ATAC-seq z niskim zanieczyszczeniem mitochondrialnym DNA z pierwotnych ludzkich limfocytów T CD4 +
22 marca 2019
Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia testu sekwencjonowania chromatyny dostępnego dla transpozazy (ATAC-seq) na aktywowanych ludzkich limfocytach CD4+. Protokół został zmodyfikowany w celu zminimalizowania zanieczyszczających odczytów mitochondrialnego DNA z 50% do 3% poprzez wprowadzenie nowego buforu do lizy.
Ten zmodyfikowany protokół ATAC-seq wprowadza nowy bufor do lizy, który zmniejsza zanieczyszczenie odczytów mitochondriów z 50% do mniej niż 3%Zmniejszone zanieczyszczenie mitochondriów pozwoli naukowcom na bardziej efektywne sekwencjonowanie ATAC przy 50% spadku kosztów sekwencjonowania. Przeprowadziliśmy walidację tego nowego protokołu sekwencyjnego ATAC w ludzkich pierwotnych PBMC, ludzkich pierwotnych monocytach, mysich komórkach dendrytycznych i liniach komórkowych czerniaka. Wierzymy, że będzie skuteczny w szerokim zakresie typów komórek.
Minimalizacja strat próbki podczas procesu aktywacji i selekcji komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości wyników dzięki ATAC-seq. Pokażemy, jak obchodzić się z niewielką liczbą komórek z cennych próbek przy użyciu podstawowego sprzętu laboratoryjnego. Na początek rozmrozić jedną fiolkę wcześniej wyizolowanych limfocytów T CD4 + w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż lód się rozpuści.
Następnie delikatnie przenieś ogniwa do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej dziewięć mililitrów wstępnie podgrzanego pełnego RPMI. Odwiruj komórki w temperaturze 1 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez sześć minut. Następnie wyrzuć supernatant i delikatnie ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach pełnego RPMI.
Po powtórzeniu wirowania wyrzuć supernatant i delikatnie ponownie zawieś komórki w 0,5 mililitra pełnego RPMI. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki. Używając pełnego RPMI, dostosuj gęstość zawiesiny komórek do płytki 50 000 komórek CD4 + w 200 mikrolitrach na dołek 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie.
Następnie, aby przygotować kulki magnetyczne, podajcie 12,5 mikrolitra ludzkich kulek T-Activator CD3 / CD28 na próbkę ATAC-seq do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj jeden mililitr 1x PBS do probówki i umieść ją na magnesie na jedną minutę, aby umyć koraliki. Ostrożnie wyjmij i wyrzuć przezroczysty supernatant i wyjmij rurkę z magnesu.
Ponownie zawiesić kulki w 13 mikrolitrach pełnego RPMI na próbkę sekwencyjną ATAC. Aby aktywować komórki T CD4 + o dostosowanym stężeniu, zbierz 500 000 komórek w 2,1 mililitra kompletnego podłoża RPMI w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Dodaj 12,5 mikrolitra kulek Human T-Activator, przygotowanych i umytych w poprzednich krokach, i delikatnie wymieszaj, odwracając tubkę.
Następnie delikatnie przenieś komórki z koralikami do sterylnego zbiornika. Za pomocą pipety wielokanałowej umieść 200 mikrolitrów komórek z kulkami na dołku 96-dołkowej płytki okrągłodennej i inkubuj w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 48 godzin. Po pełnej inkubacji odwirować płytkę w temperaturze 423 razy G i temperaturze pokojowej przez osiem minut.
Usuń 100 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i zbierz ją w stożkowej tubie przed wyrzuceniem, aby potwierdzić, że nie ma ubytków kulek. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w pozostałych 100 mikrolitrach podłoża i zbierz wszystko w 1,5-mililitrowej probówce. Aby wyizolować komórki CD4 +, dodaj 50 mikrolitrów wstępnie umytych sprzężonych kulek CD4 do 500 000 komórek w jednym mililitrze pełnego RPMI i odwróć, aby wymieszać.
Inkubować przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ręcznie przesuwając co sześć minut, aby wymieszać. Umieść probówkę na magnesie na dwie minuty, aż supernatant będzie czysty, a następnie wyjmij i wyrzuć. Wyjmij rurkę z magnesu.
Umyj komórki związane z kulkami, umieszczając je ponownie w jednym mililitrze PBS plus 2% FCS i umieść rurkę z powrotem na magnesie na jedną minutę. Wyrzuć klarowny supernatant i powtórz ten proces, w sumie trzy prania. Po ostatnim umyciu umieść rurkę na magnesie na jedną minutę.
Usuń go, wyrzuć supernatant i umieść osad na lodzie. Następnie, aby przeprowadzić izolację jąder, ponownie zawieś kulki i komórki w 50 mikrolitrach zimnego buforu do lizy i natychmiast odwiruj w temperaturze 500 G, cztery stopnie Celsjusza, przez 10 minut. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
Aby przeprowadzić reakcję transpozazy, należy ponownie zawiesić izolowaną osadę jądrową za pomocą 50 mikrolitrów mieszaniny transpozazy Tn5. Inkubować w termocyklerze przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z pokrywką ustawioną na 40 stopni Celsjusza, a następnie trzymać w temperaturze czterech stopni Celsjusza po zakończeniu. Natychmiast po termocyklingu wykonaj szybkie odwirowanie wirówki stołowej.
Umieść rurkę na magnesie na jedną minutę, aby usunąć koraliki z produktu. Nie wyjmując rurki z magnesu, przenieś przezroczysty supernatant do kolumny oczyszczającej DNA. Przemyć kolumnę raz 250 mikrolitrami buforu PB i dwukrotnie 750 mikrolitrami buforu PE.
Następnie dodaj 10 mikrolitrów buforu elucyjnego, aby wymyć próbkę. Ustawić początkową reakcję amplifikacji PCR w probówce PCR bez nukleazy. Umieść probówkę PCR w termocyklerze i uruchom program amplifikacji PCR.
Następnie zakończ końcową amplifikację PCR pozostałych 45 mikrolitrów reakcji PCR, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Umieść probówkę PCR w termocyklerze i uruchom program. Po całkowitej amplifikacji należy oczyścić biblioteki za pomocą zestawu do czyszczenia PCR, zgodnie z protokołem producenta, eluując 25 mikrolitrów buforu elucyjnego.
Sekwencjonowanie przygotowanych bibliotek na sekwencerze nowej generacji do średniej głębokości odczytu 42 milionów odczytów na próbkę. Ten ulepszony protokół ATAC-seq pozwolił na stworzenie końcowej biblioteki większej niż jeden nanogram na mikrolitr do sekwencjonowania. Kontrola jakości wykazała fragmenty DNA od 200 do 1000 par zasad, a dalsze sekwencjonowanie przeprowadzono przy użyciu tych wysokiej jakości bibliotek.
Biblioteki przygotowane zgodnie z tym protokołem wykazały tylko 3% zanieczyszczenie mitochondriów. Wysoki odsetek użytecznych odczytów jest wystarczająco stały we wszystkich powtórzeniach biologicznych. Protokół ten zapewnił wysoce powtarzalne wyniki w przypadku kontrprób technicznych, a także biologicznych.
Ponadto protokół ten trwał 48 godzin, a nie tydzień lub dłużej, jak opisano wcześniej, co skutkowało konsekwentną i wydajną aktywacją, jak wykazano w powtarzalnych wynikach sekwencjonowania. Co więcej, przewidywane piki ATAC-seq zostały dokładnie wywołane przez potok analizy. Analiza wyników sekwencjonowania ujawniła wyraźne zmiany w stanie chromatyny podczas aktywacji ludzkich limfocytów T.
Różnorodnie dostępne regiony otwartej chromatyny zidentyfikowano między sześcioma próbkami przed aktywacją i 48 godzin po niej. Upewnij się, że reakcja lizy jąder jest przeprowadzana przy użyciu schłodzonych odczynników i materiałów, aby zmaksymalizować odzysk nienaruszonych jąder. Nasz zmodyfikowany bufor do lizy jąder jest łagodniejszy dla komórek i minimalizuje zanieczyszczenie mitochondrialnego DNA.
Z niecierpliwością czekamy na zastosowanie tego zmodyfikowanego buforu do lizy również w jednojądrowym sekwencjonowaniu ATAC. Wiemy, że ten protokół pozwoli naukowcom na uzyskanie wyższej jakości danych ATAC-seq przy niższych kosztach, pomagając w rozwoju pola epigenetycznego. Protokół jest prosty, szybki i nie wymaga żadnych niebezpiecznych odczynników ani instrumentów, dzięki czemu jest łatwo dostępny dla tych, którzy dopiero zaczynają przygodę z ATAC-seq.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zmodyfikowany protokół przeprowadzania ATAC-seq w aktywowanych ludzkich limfocytach CD4+. Nowy bufor lizujący znacząco redukuje zanieczyszczenie mtDNA, co zwiększa wydajność analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Genomika
Wstęp
- ATAC-seq to technika wykorzystywana do badania dostępności chromatyny.
- Zanieczyszczenie mitochondrialnym DNA może zafałszować wyniki sekwencjonowania.
- Aktywowane limfocyty T CD4+ są kluczowe dla badań nad odpowiedzią immunologiczną.
- Minimalizacja strat próbki jest niezbędna dla uzyskania wysokiej jakości wyników ATAC-seq.
Cel badania
- Przedstawienie udoskonalonego protokołu ATAC-seq dla ludzkich limfocytów.
- Ograniczenie zanieczyszczeń mitochondrialnych w danych sekwencyjnych.
- Walidacja protokołu na różnych typach komórek.
Zastosowane metody
- Wprowadzenie nowego buforu lizującego w celu zminimalizowania kontaminacji.
- Walidacja protokołu na ludzkich pierwotnych PBMC i monocytach.
- Zastosowanie metody w komórkach dendrytycznych myszy oraz liniach komórkowych czerniaka.
- Prezentacja sposobu postępowania z niewielką liczbą komórek pochodzących z cennych próbek.
Główne wyniki
- Udział odczytów mitochondrialnego DNA został zredukowany z 50% do poziomu poniżej 3%.
- Protokół pozwala na obniżenie kosztów sekwencjonowania o 50%.
- Potwierdzona skuteczność w wielu typach komórek.
- Wykazano możliwość obróbki małych próbek komórkowych przy użyciu podstawowego sprzętu.
Wnioski
- Zmodyfikowany protokół ATAC-seq poprawia jakość danych.
- Jest on możliwy do zastosowania w szerokim zakresie typów komórek.
- Podejście to może ułatwić bardziej efektywne badania dostępności chromatyny.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ograniczenie zanieczyszczeń mitochondrialnym DNA w ATAC-seq bezpośrednio poprawia jakość danych i efektywność kosztową w badaniach nad epigenetyką. To udoskonalenie wspiera walidację celów oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć, zapewniając czystsze profile dostępności chromatyny. Protokół ten umożliwia uzyskanie powtarzalnych wyników z ograniczonej liczby próbek pierwotnych komórek, usprawniając podejmowanie decyzji dotyczących selekcji projektów w programach immunologicznych i onkologicznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wysokowiernego mapowania dostępności chromatyny w pierwotnych ludzkich limfocytach T CD4+.
- Wartość operacyjna: Redukuje odczyty mtDNA z ~50% do 3%, zwiększając ilość użytecznych danych sekwencyjnych i obniżając koszty w przeliczeniu na próbkę.
- Wartość prognostyczna: Wspiera biologiczną minimalizację ryzyka w doborze celów w chorobach immunologicznych poprzez dostarczanie powtarzalnych profili epigenomicznych w powtórzeniach biologicznych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na wytwarzanie standaryzowanych, wysokiej jakości bibliotek ATAC-seq, odpowiednich do późniejszych zastosowań przesiewowych w pierwotnych komórkach odpornościowych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje podstawowe wyposażenie laboratoryjne i usprawniony, 48-godzinny schemat pracy, co poprawia gotowość do analiz oraz skalowalność testu.
- Wartość prognostyczna: Umożliwia wiarygodne badanie przesiewowe związków poprzez zapewnienie spójnych odczytów stanu chromatyny przy minimalnym poziomie szumu technicznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje użyteczność w aktywowanych limfocytach T CD4+, które stanowią istotny w kontekście chorobowym układ do badania aktywacji immunologicznej oraz szlaków zapalnych.
- Wartość operacyjna: Zachowuje wysoką powtarzalność między powtórzeniami technicznymi i biologicznymi, co wspiera transfer metody badawczej między zespołami zajmującymi się odkrywaniem leków a zespołami przedklinicznymi.
- Wartość prognostyczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, dostarczając mierzalnych, opartych na epigenetyce biomarkerów stanu aktywacji limfocytów T.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając testowanie hipotez w walidacji celu oraz umożliwiając skalowalne wdrażanie testów w ramach działań mających na celu identyfikację związków wiodących w immunologii.
- Biologia odkrywcza: Wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie ścieżek epigenetycznych w pierwotnych ludzkich limfocytach T po aktywacji.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych danych o dostępności chromatyny w rozdzielczości nukleosomowej z niską interferencją mitochondrialną, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
- Analityka: Generuje wysokopoziomowe wyniki wyznaczenia pików oraz metryki różnicowej dostępności, które informują o zaangażowaniu celu i modulacji ścieżek.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany epigenomiczne w aktywowanych limfocytach T CD4+ z przedklinicznymi modelami odpowiedzi immunologicznej i stanu zapalnego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku, kosztowo efektywny przepływ pracy ATAC-seq, który można zastosować w różnych typach pierwotnych komórek odpornościowych i nowotworowych w ramach trwałych programów odkrywczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję szumu epigenomicznego wynikającego z kontaminacji mitochondrialnej.
- Wartość operacyjna: Obniża koszty sekwencjonowania o ok. 50% dzięki poprawie liczby odczytów docelowych, co zwiększa przepustowość w badaniach przesiewowych epigenetyki.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie wysokiej jakości, powtarzalnych danych o dostępności chromatyny z ograniczonych próbek pierwotnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów immunomodulacyjnych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o solidne, epigenetycznie uzasadnione wglądy mechanistyczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie izolacji i aktywacji pierwotnych komórek odpornościowych oraz przeprowadzania analiz epigenetycznych.
- Metoda opiera się na standardowym wyposażeniu laboratoryjnym, w tym na wirówkach, magnesach, termocyklerach i sekwenatorach nowej generacji.
- Konieczne jest znormalizowane przygotowanie odczynników oraz zachowanie łańcucha chłodniczego przy obchodzeniu się z buforem lizującym w celu maksymalizacji odzysku jąder komórkowych.
- Adaptacja do innych typów komórek pierwotnych może wymagać optymalizacji etapów aktywacji i izolacji przy jednoczesnym zachowaniu niskiego poziomu zanieczyszczenia mitochondrialnego.
- Ograniczenie praktyczne: Wydajność protokołu zależy od starannego obchodzenia się z próbkami podczas aktywacji i selekcji, aby zminimalizować utratę cennych komórek pierwotnych.
