Name: Test ATAC-seq z niskim zanieczyszczeniem mitochondrialnym DNA z pierwotnych ludzkich limfocytów T CD4 + (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Poznaj zmodyfikowany protokół ATAC-seq z nowym buforem lizy, który zmniejsza zanieczyszczenie DNA mitochondrialnego z 50% do poniżej 3%. Ta metoda obniża koszty sekwencjonowania o 50% i została zweryfikowana w ludzkich limfocytach T CD4+, komórkach dendrytycznych myszy oraz liniach komórkowych czerniaka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Atsede Siba za wsparcie techniczne. C.S.C. jest wspierany przez grant NIH 1R61DA047032.

Ten ulepszony protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania sekwencji ATAC limfocytów CD4+, od materiału wyjściowego krwi pełnej poprzez analizę danych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
1. Izolacja limfocytów T CD4+ z krwi pełnej
UWAGA: Materiałem wyjściowym dla tego protokołu jest 15 ml świeżej krwi pełnej pobranej przy użyciu standardowych procedur, co pozwala na wybór źródła materiału wyjściowego na podstawie wymagań badawczych. Skaluj protokół zgodnie z potrzebami. Wstępnie podgrzej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) + 2% płodową surowicę cielęcą (FCS) do temperatury pokojowej (RT) i dostosuj wirówkę do RT przed rozpoczęciem procedury wzbogacania limfocytów T CD4 +.
<ol>
	<li>Dodaj 750 μl ludzkiego koktajlu wzbogacającego limfocyty T CD4 + do 15 ml krwi pełnej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i delikatnie wymieszaj przez odwrócenie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji dodać 15 ml PBS + 2% FCS do probówki i delikatnie wymieszać przez odwrócenie.</li>
	<li>Przygotować świeżą stożkową probówkę o pojemności 50 ml z 15 ml pożywki o dużej gęstości. Ostrożnie ułóż rozcieńczoną próbkę krwi na wierzchu pożywki gęstościowej, uważając, aby nie zakłócić tworzącego się interfejsu pożywki gęstości/krwi. Wirować przez 20 minut przy 1 200 x g i RT z przyspieszeniem ustawionym na 1 i hamulcem opadającym WYŁĄCZONY. 
	nuta: Bardzo ważne jest, aby ustawić przyspieszenie na 1 i wyłączyć hamulec opadający w wirówce, aby uniknąć przerwania warstwy komórkowej w ośrodku gęstościowym.</li>
	<li>Pobrać wzbogacone limfocyty T CD4 + z granicy faz pożywka gęstości/osocza za pomocą wąskiej pipety do transferu łodygi. Przenieś zebrane komórki do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować zebrane limfocyty T CD4+ przez 8 minut przy 423 x g i RT. 
	nuta: Upewnij się, że przyspieszenie wirówki zostało ustawione w pozycji 9, a hamulec opadający w pozycji ON dla kroku 1.3 i wszystkich kolejnych kroków.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć osad komórkowy 50 ml PBS + 2% FCS, odwirowując przez 8 minut przy 423 x g i RT. Odrzucić końcowe płukanie supernatantem i zawiesić przemyte osady komórkowe w 2 ml PBS + 2% FCS.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Aby kontynuować pracę z sekwencją ATAC, przejdź do kroku 2.3. Aby zamrozić komórki do późniejszego przetworzenia, przejdź do kroku 1.6.</li>
	<li>Dodać 1 ml świeżej pożywki do zamrażania (90% FCS + 10% sultlenku dimetylu) na 1 milion komórek. Podwielokrotność 1 ml komórek w pożywce zamrażającej w bezpiecznych probówkach kriogenicznych. Umieścić probówki w temperaturze -80 °C na noc w pojemniku do powolnego zamrażania. Następnego dnia przenieś probówki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. 
	UWAGA: 1 milion limfocytów T CD4 + zostanie wyizolowany na 2 ml pierwotnej objętości krwi pełnej. Zamrozić 500 000 komórek w 1 ml podwielokrotności pożywki do zamrażania. Przygotuj świeżą pożywkę do zamrażania przy każdym użyciu.</li>
</ol>
2. Aktywacja i oczyszczanie limfocytów T CD4+
UWAGA: Ten szybki protokół aktywacji i oczyszczania limfocytów T CD4+ wymaga tylko 48 godzin, a daje 95% żywotnych, aktywowanych limfocytów T CD4+. Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C przed rozpoczęciem protokołu.
<ol>
	<li>Rozmrozić 1 fiolkę (500 000) limfocytów T CD4 + w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż lód się rozpuści. Delikatnie przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml wstępnie podgrzanej pożywki Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) uzupełnionej 10% FCS, zwanej dalej kompletnym RPMI. 
	UWAGA: Nie pozwól, aby komórki całkowicie się rozmroziły, aby uniknąć narażenia na DMSO.</li>
	<li>Wirować przez 6 minut w temperaturze 1500 x g i temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad w 2 ml pełnej prędkości obrotowej. Powtórz wirowanie w dół, odrzuć supernatant i delikatnie zawieś komórki w 0,5 ml pełnego RPMI.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Dostosuj gęstość zawiesiny komórek za pomocą pełnego RPMI, aby pokryć 50 000 komórek w 200 μl na dołek 96-dołkowej okrągłej płytki dennej. 
	nuta: Z jednej zamrożonej probówki z 500 tys. limfocytów T CD4 + umieść 10 dołków po 50 000 limfocytów T CD4 + w 200 μl na studzienkę.</li>
	<li>Przygotować kulki magnetyczne sprzężone z ludzkimi przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 aktywatorem T.
	<ol>
		<li>Porcję 12,5 μl ludzkich kulek aktywatora T CD3/CD28 na próbkę sekwencyjną ATAC do probówki o pojemności 1,5 ml. Umyj koraliki 1 ml 1x PBS i umieść probówkę na magnesie na 1 minutę.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij i wyrzuć przezroczysty supernatant, wyjmij probówkę z magnesu i zawieś kulki w 13 μl pełnych obr./min na próbkę ATAC-seq. 
		UWAGA: Oblicz ilość potrzebnych kulek na podstawie liczby przetwarzanych próbek ATAC-seq. Protokół ten wymaga 12,5 μl kulek CD3/CD28 na 500 000 komórek, co stanowi jedną próbkę sekwencyjną ATAC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywuj limfocyty T CD4 +. Zbierz 500 000 komórek w 2,1 ml kompletnej pożywki RPMI w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i dodaj 12,5 μl wstępnie umytych ludzkich kulek aktywatora T. Delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę.</li>
	<li>Delikatnie przenieś komórki z kulkami do sterylnego zbiornika i umieść 200 μl komórek z kulkami w dołku 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować przez 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Po inkubacji odwirować 96-dołkową płytkę przez 8 minut przy 423 x g i RT. Usunąć 100 μl pożywki na basenik z płytki 96-dołkowej, zbierając ją do stożkowej probówki przed wyrzuceniem, aby upewnić się, że nie ma utraty kulek. Ponownie zawiesić osad komórek w pozostałych 100 μl i zebrać wszystko w probówce o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: 10 dołków aktywowanych limfocytów T zostanie zebranych w objętości 1 ml.</li>
	<li>Wykonaj izolację CD4+. Dodaj 50 μl wstępnie umytych sprzężonych kulek CD4 do 500 000 komórek w 1 ml pełnego RPMI. Połącz koraliki i komórki za pomocą pipety. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w lodówce. Mieszaj kulki i mieszaninę komórek co 6 min. 
	nuta: Protokół ten ma być stosowany dla jednej próbki 500 000 komórek. W razie potrzeby dostosować dla dwóch lub więcej próbek po 500 000.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji umieścić probówkę na magnesie na 2 minuty. Usunąć i wyrzucić supernatant, gdy jest czysty. Umyj komórki związane kulkami, wyjmując probówkę z magnesu, zawieszając komórki związane z kulkami w 1 ml PBS + 2% FCS, wymieniając probówkę na magnesie na 1 minutę i wyrzucając przezroczysty supernatant. Powtórz ten proces, w sumie 3 prania. 
	nuta: Uważaj, aby nie wyrzucić żadnych koralików podczas prania.</li>
	<li>Po ostatnim umyciu umieść probówkę na magnesie na 1 minutę. Wyjmij i wyrzuć supernatant i umieść granulat na lodzie. Przejdź do sekcji 3 (ATAC-seq).</li>
</ol>
3. ATAC-seq
UWAGA: W tym kroku, jądra są izolowane z aktywowanych limfocytów T CD4+ dla sekwencji ATAC. Bufor do lizy stosowany w tym protokole został ulepszony, aby był łagodniejszy dla jąder, co skutkuje bardziej wydajnym trawieniem i wyższą jakością wyników. Wszystkie etapy wirowania w sekcji 3 są wykonywane za pomocą wirówki o stałym kącie nachylenia utrzymywanej w temperaturze 4 °C. Schłodzić wirówkę przed rozpoczęciem protokołu.
<ol>
	<li>Wykonać izolację jąder. Ponownie zawiesić kulki i komórki za pomocą buforu do lizy na zimno (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,03% polisorbat 20). Natychmiast odwirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Przeprowadź reakcję transpozazy. Zawiesić izolowany osad jądrowy za pomocą 50 μl mieszaniny transpozazy Tn5 (tabela 1). Inkubować w termocyklerze przez 30 minut w temperaturze 37 °C z pokrywką o temperaturze 40 °C, po zakończeniu utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po poddaniu działaniu opon termicznych należy natychmiast wykonać szybkie wirówkę stołową, odwirować w dół i umieścić probówkę na magnesie na 1 minutę, aby usunąć kulki z produktu.</li>
	<li>Przenieś przezroczysty supernatant z probówki na magnesie do kolumny oczyszczającej DNA. Przemyć kolumnę raz 250 μl buforu PB i dwukrotnie 750 μl buforu PE. Eluować próbkę w 10 μl buforu elucyjnego. Przejdź bezpośrednio do kroku 3.5. 
	nuta: Ten etap amplifikuje fragmenty DNA za pomocą ligowanych adapterów, zwanych tutaj biblioteką ATAC-seq. W celu multipleksowania kilku bibliotek ATAC-seq do uruchomienia na jednym torze NGS, należy użyć nieindeksowanego Primera 1 dla wszystkich próbek i innego indeksowanego Primera 2 dla poszczególnych próbek (Tabela 2). Podkłady stosuje się w stężeniach roboczych 1,25 μM.</li>
	<li>Ustawić początkową reakcję amplifikacji PCR w probówce PCR bez nukleazy, łącząc składniki w kolejności i objętości określonej w tabeli 3. Umieść probówkę PCR w termocyklerze i uruchom program amplifikacji PCR w warunkach cyklicznych, jak określono w tabeli 4.</li>
	<li>Monitorować reakcję metodą qPCR. Ustawić reakcję qPCR w probówce PCR bez nukleazy, łącząc składniki w kolejności i ilości określonej w tabeli 5. Umieścić w maszynie qPCR i cykl zgodnie z tabelą 6.
	<ol>
		<li>Aby określić optymalną liczbę dodatkowych cykli amplifikacji dla pozostałych 45 μl reakcji, należy utworzyć wykres z numerem cyklu na osi x i fluorescencją względną (RFU) na osi y. Optymalna liczba dodatkowych cykli amplifikacji to jedna trzecia liczby cykli potrzebnych do osiągnięcia przez reakcję qPCR plateau. 
		UWAGA: Monitorowanie reakcji za pomocą qPCR pozwala na określenie optymalnej liczby cykli PCR pożądanych w celu uzyskania optymalnej amplifikacji fragmentu biblioteki przy jednoczesnej minimalizacji odchylenia zawartości i rozmiaru GC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakończyć końcową amplifikację PCR pozostałych 45 μl reakcji PCR. Umieść probówkę PCR z reakcją amplifikacji z kroku 3.5 z powrotem w termocyklerze i uruchom program zgodnie z opisem w tabeli 7. 
	nuta: Dla próbek przetworzonych w sposób opisany w niniejszym protokole optymalna łączna liczba cykli amplifikacji PCR została określona na 12.</li>
	<li>Po zakończeniu amplifikacji należy oczyścić biblioteki za pomocą zestawu do czyszczenia PCR zgodnie z protokołem producenta, eluując 25 μl buforu elucyjnego. 
	nuta: Wzmocnione biblioteki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do 48 godzin lub zamrażane w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
4. Analiza jakości biblioteki ATAC-seq
UWAGA: Ważne jest, aby sprawdzić jakość i ilość bibliotek ATAC-seq przed sekwencjonowaniem nowej generacji. Jakość i ilość bibliotek powinna być oceniana przy użyciu dostępnych na rynku zestawów (patrz Spis materiałów).
<ol>
	<li>Oceń jakość i ilość bibliotek ATAC-seq za pomocą platformy opartej na mikrofluidyce do wymiarowania, kwantyfikacji i kontroli jakości DNA. Zobacz Rysunek 2 dla reprezentatywnych wyników oceny jakości. 
	nuta: Stężenie bibliotek ATAC-seq musi wynosić >1 ng/μl, aby uzyskać wysokiej jakości wyniki sekwencjonowania. Średnio uzyskano 30 nM w 25 μL.</li>
</ol>
5. Sekwencjonowanie i analiza danych
UWAGA: Ten potok analizy pozwala użytkownikom kontrolować jakość procedury mapowania odczytów, dostosowywać współrzędne do projektu eksperymentalnego i wywoływać piki dla dalszej analizy. Poniżej znajdują się wiersze poleceń i wyjaśnienie wykonywania. Pakiet do analizy danych jest dostępny pod adresem (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
<ol>
	<li>Sekwencjonowanie przygotowanych bibliotek na sekwenatorze nowej generacji do średniej głębokości odczytu wynoszącej 42 miliony odczytów na próbkę.</li>
	<li>Oszacuj jakość odczytów sekwencjonowania, sprawdzając pliki wygenerowane przez pakiet oprogramowania FastQC12 za pomocą polecenia: 
	fastqc -o <output_directory> <fastq_file></li>
	<li>W razie potrzeby przytnij podstawy odczytów przez oprogramowanie Trimmomatic13, zgodnie z kontrolą jakości FastQC, za pomocą polecenia (dla końcówki parą): 
	java -jar <ścieżka do pliku trimmomatic jar> PE <wejście1> <wejście2> <sparowane wyjście1> <niesparowane wyjście1> <sparowane wyjście2> <niesparowane wyjście2> HEADCROP:<podstawy upraw></li>
	<li>Wyrównaj odczyty do ludzkiego genomu referencyjnego (hg38) przez Bowtie214 oprogramowanie: 
	bowtie2 -x <genom referencyjny> -1 <para wejściowa 1> <para wejściowa 2> -S <wyjście plik SAM> 
	nuta: Argument -x służy nazwie podstawowej indeksu genomu referencyjnego, a -S służy wynikom formatu SAM.</li>
	<li>Sprawdź jakość zmapowanych odczytów za pomocą Samtools15 flagstat package: 
	samtools flagstat <plik BAM></li>
	<li>Posortuj zmapowany plik odczytów i usuń duplikaty za pomocą Picard16 tool: 
	java -jar picard.jar SortSam INPUT=<nazwa pliku wejściowego SAM> OUTPUT=<wyjście posortowane nazwa pliku BAM> SORT_ORDER=współrzędne" i "java -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT=<posortowany plik BAM> OUTPUT=<wyjściowy plik BAM bez duplikatów> REMOVE_DUPLICATES=PRAWDA</li>
	<li>Indeksuj plik BAM, przytnij nieużywane odczyty chromosomów i przesuń współrzędne dla eksperymentalnego powodu ATAC-seq17: 
	java -jar picard.jar BuildBamIndex INPUT=<BAM plik> 
	samtools idxstats <Wejściowy plik BAM> | cięcie -f 1 | grep -v chrY | grep -v chrM | grep -v chrUn | xargs samtools view -b <Wejściowy plik BAM> > <Wyjściowy przycięty plik BAM> 
	bedtools bamtobed -i <Wejście przycięty plik BAM> > <Wyjście przycięty plik BED> 
	awk 'BEGIN {OFS = "\t"} ; {if ($6 == "+") drukuj $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6; w przeciwnym razie drukuj $1, $2 - 5, $3 - 5, $4, $5, $6}' <Wejściowy przycięty plik BED> <Przycięty przesunięty plik BED></li>
	<li>Usuń odczyty, które są przesunięte na koordynację ujemną: 
	awk '{if ($2 > 0) print $1 "\t" $2 "\t" $3 "\t" $4 "\t" $5 "\t" $6 }' <Wprowadź plik BED> <Wyjście pliku BED o nieujemnej koordynacji>.</li>
	<li>Przekonwertuj plik BED na plik BAM dla następującej analizy DiffBind18: 
	bedtools bedtobam -i <Wprowadź plik BED> -g <genom referencyjny> <Wyjściowy plik BAM></li>
	<li>Wykonaj wywołanie szczytowe przez DiffBind18 pakiet oprogramowania: 
	macs2 callpeak -t <Wprowadź plik BAM> -f BAM -g hs -nomodel --nolambda --keep-dup all --call-summits --outdir <Ścieżka do katalogu wyjściowego> -n <Nazwa wyjściowa> -B -q 0.01 --bdg --shift -100 --extsize 200 
	nuta: Po przefiltrowaniu spodziewaj się mediany 37 milionów odczytów na próbkę. Zanieczyszczenie mitochondrialnego DNA będzie mieścić się w przedziale od 0,30% do 5,39% (średnio 1,96%). Wskaźnik wielokrotnych odczytów zmapowanych będzie niski (6,7%-56%, średnio 19%) i stosunkowo wysoki odsetek użytecznych odczytów jądrowych (60%-92%, średnio 79%).</li>
</ol>

<ol><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li>
<li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase-seq%3A+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li>
<li>Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq%3A+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li>
<li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAIRE+%28Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements%29+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li>
<li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li>
<li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41(2017).</li>
<li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li>
<li>Gate, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li>
<li>Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Broad Institute. Picard Tools. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://broadinstitute.github.io/picard/">http://broadinstitute.github.io/picard/</a> (2018).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf">http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf</a> (2018).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zmodyfikowany protokół ATAC-seq przedstawiony w tym artykule zapewnia powtarzalne wyniki przy minimalnym zanieczyszczeniu mitochondrialnego DNA. Protokół został wykorzystany do pomyślnego scharakteryzowania architektury chromatyny ludzkich pierwotnych PBMC10, ludzkich monocytów, mysich komórek dendrytycznych (niepublikowanych) i hodowanych linii komórkowych czerniaka11. Przewidujemy, że ten ulepszony stan lizy może potencjalnie działać również w przypadku innych typów komór...

Test do sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (ATAC-seq) szybko stał się wiodącą metodą badania architektury chromatyny. ATAC-seq może identyfikować regiony dostępnej chromatyny poprzez proces tagmentacji, fragmentacji i znakowania DNA przez ten sam enzym, w celu wytworzenia bibliotek, za pomocą których sekwencjonowanie może określić dostępność chromatyny w całym genomie. W tym procesie tagowania pośredniczy nadpoaktywna transpozaza Tn5, która przecina tylko otwarte regiony chromatyny z powodu nukleosomicznej przeszkody sterycznej. Podczas cięcia, transpozaza Tn5 wstawia również adaptery sekwencjonowania, które pozwalają na szybką budowę biblioteki przez PCR i sekwencjonowanie nowej generacji chromatyny dostępnej w całym genomie1,2.
ATAC-seq stało się preferowaną metodą do określania regionów dostępności chromatyny ze względu na stosunkowo prosty i szybki protokół, jakość i zakres informacji, które można określić na podstawie jego wyników, oraz niewielką ilość wymaganego materiału wyjściowego. W porównaniu do DNase-seq3 (który również mierzy dostępność chromatyny w całym genomie), MNase-seq4 (który określa pozycje nukleosomów w otwartych regionach genomu) i FAIRE-seq5, ATAC-seq jest szybszy, tańszy i bardziej powtarzalny1. Jest również bardziej czuły, pracując z materiałem wyjściowym składającym się z zaledwie 500 jąder, w porównaniu do 50 milionów jąder wymaganych dla DNase-seq3. ATAC-seq ma również możliwość dostarczania większej ilości informacji o architekturze chromatyny niż inne metody, w tym o regionach wiązania czynnika transkrypcyjnego, pozycjonowaniu nukleosomów i otwartych regionach chromatyny1. Sprawdzono skuteczne, jednokomórkowe protokoły sekwencyjne ATAC, które dostarczają informacji na temat architektury chromatyny na poziomie pojedynczej komórki6,7.
ATAC-seq został użyty do scharakteryzowania architektury chromatyny w szerokim spektrum badań i typów komórek, w tym roślin8, humans9, i wielu innych organizmów. Miało to również kluczowe znaczenie w identyfikacji epigenetycznej regulacji stanów chorobowych7. Jednak najczęściej stosowany protokół ATAC-seq ma główną wadę sekwencjonowania zanieczyszczeń z mitochondrialnego DNA. W niektórych zestawach danych ten poziom zanieczyszczenia może sięgać nawet 60% wyników sekwencjonowania1. W terenie podejmowane są wspólne wysiłki w celu zmniejszenia tych zanieczyszczających odczytów mitochondrialnych, aby umożliwić bardziej efektywne zastosowanie ATAC-seq7,10,11. Tutaj prezentujemy ulepszony protokół ATAC-seq, który zmniejsza wskaźnik zanieczyszczenia mitochondrialnego DNA do zaledwie 3%, co pozwala na zmniejszenie kosztów sekwencjonowania o około 50%10. Jest to możliwe dzięki usprawnionemu procesowi izolacji i aktywacji limfocytów CD4+ oraz ulepszonemu buforowi do lizy, który ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania zanieczyszczenia mitochondrialnego DNA.
Ten zmodyfikowany protokół ATAC-seq został zweryfikowany z szerokim zakresem komórek pierwotnych, w tym ludzkimi pierwotnymi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMCs)10, ludzkimi pierwotnymi monocytami i mysimi komórkami dendrytycznymi (niepublikowane). Został również z powodzeniem wykorzystany do badania linii komórkowych czerniaka w zgrupowanym, regularnie rozmieszczonym ekranie krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) elementów niekodujących11. Dodatkowo pakiet do analizy danych opisany w tym protokole i udostępniony na GitHub zapewnia nowym i doświadczonym badaczom narzędzia do analizy danych ATAC-seq. ATAC-seq jest najskuteczniejszym testem do mapowania dostępności chromatyny w całym genomie, a modyfikacje istniejącego protokołu, które zostały tutaj wprowadzone, pozwolą naukowcom uzyskać wysokiej jakości dane o niskim zanieczyszczeniu mitochondrialnego DNA, zmniejszając koszty sekwencjonowania i poprawiając przepustowość ATAC-seq.

<table><tbody><tr><td>1x PBS, sterylne</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Można używać innych porównywalnych produktów.</td></tr><tr><td>5810/5810&nbsp; Wirówka z chłodzeniem R Swing Bucket z wiadrami probówkowymi 50 mL, 15 ml i 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td>Można używać innych porównywalnych produktów.</td></tr><tr><td>96 Well Round Bottom Plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>163320</td><td>Można używać innych porównywalnych produktów.</td></tr><tr><td>System stacji taśmowych Agilent 4200</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>Sugerowany do oceny jakości.</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>374081</td><td>Może korzystać z innych porównywalnych produktów.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Może korzystać z innych porównywalnych produktów.</td></tr><tr><td>Dynabeads Ludzki aktywator T CD3/CD28</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11131D</td><td>Krytyczny składnik</td></tr><tr><td>Dynabeads Zestaw nietkniętych ludzkich komórek T CD4</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11346D</td><td>Krytyczny składnik</td></tr><tr><td>Dynamagnet</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>12321D</td><td>Krytyczny składnik</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-500</td><td>Może używać innych porównywalnych Produktów.</td></tr><tr><td>Zestaw DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>50674626</td><td>Sugerowany do oceny jakości.</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu, sześciowodny, klasa biologii molekularnej</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Można używać innych porównywalnych produktów.</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania MinElute PCR (bufor PB, bufor PE, bufor elucyjny)</td> <td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Składnik krytyczny</td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Może używać innych porównywalnych produktów.</td></tr><tr><td>NaCl, klasa biologii molekularnej</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>Może używać innych porównywalnych produktów.</td></tr><tr><td>NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541</td> Zestaw do przygotowania biblioteki DNA z <td>komponentem krytycznym</td></tr><tr><td>Nextera (2x bufor TD, enzym Tn5)</td><td>Illumina</td><td>FC1211030</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>Zero Nuclease Sterylne dH20</td><td>Gibco</td><td>10977015</td><td>Może korzystać z innych porównywalnych produktów.</td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (Tween20)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Może korzystać z innych porównywalnych produktów.</td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25780</td><td>Precyzyjny składnik o krytycznym elemencie</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>TSGP02</td><td>Może korzystać z innych porównywalnych produktów.</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Zestaw</td></tr><tr><td>do oznaczania kubitów o</td> krytycznym składniku dsDNA HS <td>Invitrogen Life Technologies</td><td>Q32851</td><td>Sugerowany do oceny jakości.</td></tr><tr><td>Qubit FlouroMeter</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>Q33226</td><td>Sugerowany do oceny jakości.</td></tr><tr><td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15022</td><td>Komponent krytyczny</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Może korzystać z innych porównywalnych produktów.</td></tr><tr><td>Sterylny Resevoir</td><td>Thermo Scientific</td><td>8096-11</td><td>Może używać innych porównywalnych produktów.</td></tr><tr><td>Termocykler T100 z podgrzewaną pokrywą</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>Może korzystać z innych porównywalnych produktów.</td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Może korzystać z innych porównywalnych produktów.</td></tr></tbody></table>

test atac-seq z niskim zanieczyszczeniem mitochondrialnym dna z pierwotnych ludzkich limfocytów t cd4 +

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq stał się powszechnie stosowaną metodologią w badaniach epigenetyki ze względu na szybkie i proste podejście do mapowania chromatyny dostępnej w całym genomie. W tym artykule przedstawiamy ulepszony protokół ATAC-seq, który zmniejsza zanieczyszczenie odczytów mitochondrialnego DNA. Podczas gdy poprzednie protokoły ATAC-seq zmagały się ze średnio 50% zanieczyszczeniem odczytów mitochondrialnego DNA, zoptymalizowany bufor lizy wprowadzony w tym protokole zmniejsza zanieczyszczenie mitochondrialnego DNA średnio o 3%. Ten ulepszony protokół ATAC-seq pozwala na prawie 50% redukcję kosztów sekwencjonowania. Pokazujemy, w jaki sposób można przygotować te wysokiej jakości biblioteki sekwencyjne ATAC z aktywowanych limfocytów CD4 +, dostarczając instrukcje krok po kroku od izolacji limfocytów CD4 + z krwi pełnej poprzez analizę danych. Ten ulepszony protokół ATAC-seq został zwalidowany w szerokim zakresie typów komórek i będzie natychmiast przydatny dla naukowców badających dostępność chromatyny.

Z 15 mL świeżej krwi całkowitej niniejszy protokół pozwala uzyskać średnio 1 milion komórek T CD4+. Komórki te mogą być zamrożone w celu późniejszego przetwarzania lub użyte natychmiast. Żywotność komórek T CD4+, świeżych lub rozmrożonych, była konsekwentnie &gt;95%. Ta metoda izolacji komórek T CD4+ zapewnia elastyczność w zakresie materiału wyjściowego i czasu pobrania. Ulepszony protokół ATAC-seq generuje ostateczną bibliotekę o stężeniu większym niż 1 ng/µL, przeznaczoną do sekwencjon...

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia testu sekwencjonowania chromatyny dostępnego dla transpozazy (ATAC-seq) na aktywowanych ludzkich limfocytach CD4+. Protokół został zmodyfikowany w celu zminimalizowania zanieczyszczających odczytów mitochondrialnego DNA z 50% do 3% poprzez wprowadzenie nowego buforu do lizy.

Test ATAC-seq z niskim zanieczyszczeniem mitochondrialnym DNA z pierwotnych ludzkich limfocytów T CD4 +

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Ten zmodyfikowany protokół ATAC-seq wprowadza nowy bufor do lizy, który zmniejsza zanieczyszczenie odczytów mitochondriów z 50% do mniej niż 3%Zmniejszone zanieczyszczenie mitochondriów pozwoli naukowcom na bardziej efektywne sekwencjonowanie ATAC przy 50% spadku kosztów sekwencjonowania. Przeprowadziliśmy walidację tego nowego protokołu sekwencyjnego ATAC w ludzkich pierwotnych PBMC, ludzkich pierwotnych monocytach, mysich komórkach dendrytycznych i liniach komórkowych czerniaka. Wierzymy, że będzie skuteczny w szerokim zakresie typów komórek.Minimalizacja strat próbki podczas procesu aktywacji i selekcji komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości wyników dzięki ATAC-seq. Pokażemy, jak obchodzić się z niewielką liczbą komórek z cennych próbek przy użyciu podstawowego sprzętu laboratoryjnego. Na początek rozmrozić jedną fiolkę wcześniej wyizolowanych limfocytów T CD4 + w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż lód się rozpuści.Następnie delikatnie przenieś ogniwa do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej dziewięć mililitrów wstępnie podgrzanego pełnego RPMI. Odwiruj komórki w temperaturze 1 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez sześć minut. Następnie wyrzuć supernatant i delikatnie ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach pełnego RPMI.Po powtórzeniu wirowania wyrzuć supernatant i delikatnie ponownie zawieś komórki w 0,5 mililitra pełnego RPMI. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki. Używając pełnego RPMI, dostosuj gęstość zawiesiny komórek do płytki 50 000 komórek CD4 + w 200 mikrolitrach na dołek 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie.Następnie, aby przygotować kulki magnetyczne, podajcie 12,5 mikrolitra ludzkich kulek T-Activator CD3 / CD28 na próbkę ATAC-seq do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj jeden mililitr 1x PBS do probówki i umieść ją na magnesie na jedną minutę, aby umyć koraliki. Ostrożnie wyjmij i wyrzuć przezroczysty supernatant i wyjmij rurkę z magnesu.Ponownie zawiesić kulki w 13 mikrolitrach pełnego RPMI na próbkę sekwencyjną ATAC. Aby aktywować komórki T CD4 + o dostosowanym stężeniu, zbierz 500 000 komórek w 2,1 mililitra kompletnego podłoża RPMI w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Dodaj 12,5 mikrolitra kulek Human T-Activator, przygotowanych i umytych w poprzednich krokach, i delikatnie wymieszaj, odwracając tubkę.Następnie delikatnie przenieś komórki z koralikami do sterylnego zbiornika. Za pomocą pipety wielokanałowej umieść 200 mikrolitrów komórek z kulkami na dołku 96-dołkowej płytki okrągłodennej i inkubuj w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 48 godzin. Po pełnej inkubacji odwirować płytkę w temperaturze 423 razy G i temperaturze pokojowej przez osiem minut.Usuń 100 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i zbierz ją w stożkowej tubie przed wyrzuceniem, aby potwierdzić, że nie ma ubytków kulek. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w pozostałych 100 mikrolitrach podłoża i zbierz wszystko w 1,5-mililitrowej probówce. Aby wyizolować komórki CD4 +, dodaj 50 mikrolitrów wstępnie umytych sprzężonych kulek CD4 do 500 000 komórek w jednym mililitrze pełnego RPMI i odwróć, aby wymieszać.Inkubować przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ręcznie przesuwając co sześć minut, aby wymieszać. Umieść probówkę na magnesie na dwie minuty, aż supernatant będzie czysty, a następnie wyjmij i wyrzuć. Wyjmij rurkę z magnesu.Umyj komórki związane z kulkami, umieszczając je ponownie w jednym mililitrze PBS plus 2% FCS i umieść rurkę z powrotem na magnesie na jedną minutę. Wyrzuć klarowny supernatant i powtórz ten proces, w sumie trzy prania. Po ostatnim umyciu umieść rurkę na magnesie na jedną minutę.Usuń go, wyrzuć supernatant i umieść osad na lodzie. Następnie, aby przeprowadzić izolację jąder, ponownie zawieś kulki i komórki w 50 mikrolitrach zimnego buforu do lizy i natychmiast odwiruj w temperaturze 500 G, cztery stopnie Celsjusza, przez 10 minut. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.Aby przeprowadzić reakcję transpozazy, należy ponownie zawiesić izolowaną osadę jądrową za pomocą 50 mikrolitrów mieszaniny transpozazy Tn5. Inkubować w termocyklerze przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z pokrywką ustawioną na 40 stopni Celsjusza, a następnie trzymać w temperaturze czterech stopni Celsjusza po zakończeniu. Natychmiast po termocyklingu wykonaj szybkie odwirowanie wirówki stołowej.Umieść rurkę na magnesie na jedną minutę, aby usunąć koraliki z produktu. Nie wyjmując rurki z magnesu, przenieś przezroczysty supernatant do kolumny oczyszczającej DNA. Przemyć kolumnę raz 250 mikrolitrami buforu PB i dwukrotnie 750 mikrolitrami buforu PE.Następnie dodaj 10 mikrolitrów buforu elucyjnego, aby wymyć próbkę. Ustawić początkową reakcję amplifikacji PCR w probówce PCR bez nukleazy. Umieść probówkę PCR w termocyklerze i uruchom program amplifikacji PCR.Następnie zakończ końcową amplifikację PCR pozostałych 45 mikrolitrów reakcji PCR, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Umieść probówkę PCR w termocyklerze i uruchom program. Po całkowitej amplifikacji należy oczyścić biblioteki za pomocą zestawu do czyszczenia PCR, zgodnie z protokołem producenta, eluując 25 mikrolitrów buforu elucyjnego.Sekwencjonowanie przygotowanych bibliotek na sekwencerze nowej generacji do średniej głębokości odczytu 42 milionów odczytów na próbkę. Ten ulepszony protokół ATAC-seq pozwolił na stworzenie końcowej biblioteki większej niż jeden nanogram na mikrolitr do sekwencjonowania. Kontrola jakości wykazała fragmenty DNA od 200 do 1000 par zasad, a dalsze sekwencjonowanie przeprowadzono przy użyciu tych wysokiej jakości bibliotek.Biblioteki przygotowane zgodnie z tym protokołem wykazały tylko 3% zanieczyszczenie mitochondriów. Wysoki odsetek użytecznych odczytów jest wystarczająco stały we wszystkich powtórzeniach biologicznych. Protokół ten zapewnił wysoce powtarzalne wyniki w przypadku kontrprób technicznych, a także biologicznych.Ponadto protokół ten trwał 48 godzin, a nie tydzień lub dłużej, jak opisano wcześniej, co skutkowało konsekwentną i wydajną aktywacją, jak wykazano w powtarzalnych wynikach sekwencjonowania. Co więcej, przewidywane piki ATAC-seq zostały dokładnie wywołane przez potok analizy. Analiza wyników sekwencjonowania ujawniła wyraźne zmiany w stanie chromatyny podczas aktywacji ludzkich limfocytów T.Różnorodnie dostępne regiony otwartej chromatyny zidentyfikowano między sześcioma próbkami przed aktywacją i 48 godzin po niej. Upewnij się, że reakcja lizy jąder jest przeprowadzana przy użyciu schłodzonych odczynników i materiałów, aby zmaksymalizować odzysk nienaruszonych jąder. Nasz zmodyfikowany bufor do lizy jąder jest łagodniejszy dla komórek i minimalizuje zanieczyszczenie mitochondrialnego DNA.Z niecierpliwością czekamy na zastosowanie tego zmodyfikowanego buforu do lizy również w jednojądrowym sekwencjonowaniu ATAC. Wiemy, że ten protokół pozwoli naukowcom na uzyskanie wyższej jakości danych ATAC-seq przy niższych kosztach, pomagając w rozwoju pola epigenetycznego. Protokół jest prosty, szybki i nie wymaga żadnych niebezpiecznych odczynników ani instrumentów, dzięki czemu jest łatwo dostępny dla tych, którzy dopiero zaczynają przygodę z ATAC-seq.

atac-seq-assay-with-low-mitochondrial-dna-contamination-from-primary

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Test chromatyny dostępnej dla transpozy w połączeniu z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ATAC-seq) to metoda odkrywania dostępnej chromatyny obejmująca cały genom. Jest to protokół sekwencyjny ATAC-seq krok po kroku, od analizy molekularnej do końcowej analizy obliczeniowej, zoptymalizowany pod kątem ludzkich limfocytów (Th1/Th2). Protokół ten może zostać przyjęty przez badaczy bez wcześniejszego doświadczenia w metodach sekwencjonowania nowej generacji.

Mapowanie chromatyny dostępnej w całym genomie w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pomocą ATAC-Seq

Tutaj opisujemy metodę umożliwiającą jednoczesne ilościowe oznaczanie i mapowanie całego genomu rybonukleotydów w wysoce nienaruszonym DNA w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu, łącząc enzymatyczne rozszczepienie genomowego DNA z jego alkaliczną hydrolizą i późniejszym sekwencjonowaniem 5'-końca.

Jednoczesne mapowanie i oznaczanie ilościowe rybonukleotydów w ludzkim mitochondrialnym DNA

Adaptacja metaboliczna jest fundamentalna dla limfocytów T, ponieważ decyduje o różnicowaniu, trwałości i cytotoksyczności. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół monitorowania oddychania mitochondrialnego w ludzkich pierwotnych limfocytach T różnicowanych ex vivo cytokinami.

Monitorowanie oddychania mitochondrialnego w ludzkich pierwotnych limfocytach T różnicowanych cytokinami

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

ATAC-seq to metoda sekwencjonowania DNA, która wykorzystuje nadpobudliwą zmutowaną transpozazę, Tn5, do mapowania zmian w dostępności chromatyny, w których pośredniczą czynniki transkrypcyjne. ATAC-seq umożliwia odkrycie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zmian fenotypowych w komórkach nowotworowych. Protokół ten określa procedury optymalizacyjne dla sekwencji ATAC w typach komórek nabłonkowych, w tym komórkach nowotworowych.

Optymalizacja ATAC-Seq do badań epigenetycznych nowotworów

Testy pirosekwencjonowania umożliwiają solidne i szybkie genotypowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu mitochondrialnego DNA w heteroplazmatycznych komórkach lub tkankach.

Genotypowanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genomie mitochondrialnym metodą pirosekwencjonowania

Ten protokół opisuje technikę generowania cybrydów z komórek nowotworowych rosnących w zawiesinie jako narzędzie do badania roli mitochondriów w procesie nowotworowym.

Wytwarzanie cybridów transmiscyjnych przy użyciu linii komórek rakowych

Opisano procedurę badania dynamiki metabolizmu mitochondrialnego DNA (mtDNA) w komórkach przy użyciu formatu wielodołkowej płytki i automatycznego obrazowania immunofluorescencyjnego w celu wykrycia i ilościowego określenia syntezy i dystrybucji mtDNA. Można to dalej wykorzystać do zbadania wpływu różnych inhibitorów, stresów komórkowych i wyciszania genów na metabolizm mtDNA.

Wysokoprzepustowa, obrazowa kwantyfikacja syntezy i dystrybucji mitochondrialnego DNA

Bioenergetyka limfocytów T CD8 może być badana za pomocą testu stresu Mito. Metodologia ta może być wykorzystana do badania ostrego i przewlekłego programowania metabolicznego. Protokół ten opisuje podejścia do badania relacji między biologią receptora komórek T a analizą bioenergetyczną.

Pomiar funkcji mitochondrialnej naiwnych i efektorowych limfocytów T CD8

Metody badania bioenergetyki mitochondriów pod fizjologicznie istotnymi stężeniami substratów w komórkach odpornościowych są ograniczone. Zapewniamy szczegółowy protokół, który wykorzystuje fluorespirometrię o wysokiej rozdzielczości do oceny zmian w odpowiedzi potencjału błony mitochondrialnej na zapotrzebowanie na energię w ludzkich limfocytach T, monocytach i obwodowych komórkach jednojądrzastych.

Fluorespirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny dynamicznych zmian potencjału błony mitochondrialnej w ludzkich komórkach odpornościowych

Ten manuskrypt przedstawia protokół przygotowania biblioteki ATAC-seq neutrofili z mysiego szpiku kostnego, mający na celu zagwarantowanie optymalnej żywotności neutrofili i wysokiej jakości biblioteki. Oferuje instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania BMC, sortowania immunomagnetycznego i budowy biblioteki, służąc jako cenny przewodnik, szczególnie dla nowicjuszy w badaniu neutrofili.

Przygotowanie biblioteki ATAC-Seq mysich neutrofili pochodzących ze szpiku kostnego

Poznaj zmodyfikowany protokół ATAC-seq z nowym buforem lizy, który zmniejsza zanieczyszczenie DNA mitochondrialnego z 50% do poniżej 3%. Ta metoda obniża koszty sekwencjonowania o 50% i została zweryfikowana w ludzkich limfocytach T CD4+, komórkach dendrytycznych myszy oraz liniach komórkowych czerniaka.

Test ATAC-seq z niskim zanieczyszczeniem mitochondrialnym DNA z pierwotnych ludzkich limfocytów T CD4 +

Przeglądaj więcej filmów