Pomiar globalnej metaloproteinazy macierzy komórkowej i aktywności metabolicznej w hydrożelach 3D

Hodowla 3D utrudnia pomiar funkcji komórkowych przy użyciu standardowych testów biologicznych. Protokół ten umożliwia pomiar aktywności komórkowej i somatycznej bez dalszego przetwarzania próbki, przy użyciu czujnika fluorescencyjnego i standardowego czytnika mikropłytek. Protokół ten umożliwia szereg nowych zastosowań, w tym wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków.

Dodatkowo czujnik fluorescencyjny można wymienić na inny czujnik w celu pomiaru innych proteaz lub funkcji komórek. Ważne jest, aby dokładnie zaplanować eksperyment z wyprzedzeniem, wykonać wszystkie obliczenia dotyczące przygotowania hydrożelu i ustawić wszystkie urządzenia i odczynniki, aby zminimalizować czas przebywania komórek w zawiesinie. Na początek przygotuj pożywkę testową z 1% pozbawioną węgla drzewnego płodowej surowicy bydlęcej, dwoma mM L-glutaminą, 10 jednostkami na ml penicyliny i 10 mikrogramami na ml streptomycyny.

Nie używaj pożywek z czerwienią fenolową, które mają większą interferencję fluorescencji. Aby przeprowadzić kontrolę pozytywną, dodać bakteryjny enzym kolagenazę typu pierwszego do pożywki testowej w stężeniach 10 i 1000 mikrogramów na ml. Następnie przygotuj roztwór prekursora hydrożelu, dodając odczynniki do probówki o pojemności 1,5 ml.

Upewnij się, że wirujesz po dodaniu każdego składnika. Następnie podziel roztwór na wiele probówek o pojemności 1,5 ml dla różnych warunków. Aby zamknąć komórki w hydrożelach, najpierw przygotuj zawiesinę pojedynczej komórki, myjąc 10-centymetrowe naczynie komórek czerniaka A375 10 ml PBS.

Następnie dodaj 0,05% trypsyny do naczynia, aby trypsynizować komórki. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy minuty. Po inkubacji policz komórki za pomocą hemocytometru.

Następnie odwiruj roztwór komórkowy o stężeniu 314 razy G przez trzy minuty. Odessać pożywkę hodowlaną i ponownie zawiesić komórki w buforze PBS przy około trzykrotności końcowej gęstości kapsułkowanej. Policz komórki ponownie, aby zapewnić dokładne stężenie komórek.

Następnie dodać zawieszone komórki w PBS do każdej probówki roztworu prekursora hydrożelu zgodnie z wymaganą gęstością wysiewu i mieszać, pipetując w górę iw dół. W kontrolowanych warunkach należy dodawać tylko PBS i wir. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów roztworu prekursora hydrożelu do środka każdej studzienki sterylnej, czarnej, okrągłodennej płytki 96-dołkowej.

Sprawdź wzrokowo rozmieszczenie hydrożeli w studniach. Niecentrowane hydrożele można przestawiać za pomocą końcówki pipety przed polimeryzacją. Aby spolimeryzować roztwór prekursora hydrożelu, wystaw płytkę na działanie światła UV o mocy 4 miliwatów na centymetr kwadratowy przez trzy minuty.

Następnie dodać 150 mikrolitrów pożywki testowej do wszystkich studzienek zawierających zamknięte komórki i 150 mikrolitrów roztworu enzymu kolagenazy do studzienek kontroli pozytywnych. Dodać 150 mikrolitrów buforu PBS do zewnętrznych dołków płytki, aby zmniejszyć parowanie podczas inkubacji. Użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć intensywność fluorescencji płytki o godzinie zero, natychmiast po enkapsulacji.

Wybierz nieprzezroczysty protokół 96-dołkowej płytki ze wzbudzeniem 494 nanometrów i długościami fal emisji 521 nanometrów. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 18 godzin. Następnie dodać odczynniki aktywności metabolicznej w stosunku 1 do 10 objętości na studzienkę dla wszystkich warunków i kontroli.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, przez sześć godzin. Na koniec zmierz intensywność fluorescencji płytki po 24 godzinach, po enkapsulacji. Wybierz nieprzezroczysty protokół 96-dołkowej płytki z wzbudzeniem 494 nanometrów i długościami fal emisji 521 nanometrów, dla aktywności MMP.

Aby zmierzyć aktywność metaboliczną, wybierz długość fali wzbudzenia 560 nanometrów i długość fali emisji 590 nanometrów. W tym badaniu, po wystawieniu czujnika fluorogenicznego na odpowiednią proteazę, wygaszacz i fluorofor są oddzielane, a fluorescencja wzrasta. Pomiary fluorescencji inkubowanych hydrożeli z bakteryjnym enzymem kolagenazy typu pierwszego pokazują, że najniższy wykryty sygnał był wytwarzany przez kontrole ujemne, bez kolagenazy.

Podczas gdy najwyższy wykryty sygnał został wyprodukowany przez 1000 mikrogramów na ml kolagenazy lub więcej, gdy sygnał zaczyna się stabilizować. Obliczony zakres roboczy wynosił od około 0,16 do 474 mikrogramów na ml kolagenazy. Odczyty fluorescencji dla linii komórkowej czerniaka A375, zamkniętej w różnych gęstościach zaraz po enkapsulacji, były niskie we wszystkich gęstościach wysiewu i podobne do żeli kontrolnych bez komórek, zgodnie z oczekiwaniami.

24 godziny po enkapsulacji aktywność MMP była wprost proporcjonalna do gęstości wysiewu, a gęstości wysiewu na poziomie lub większym niż 1 milion komórek na ml mieszczą się w granicach zakresu roboczego. Pomiary aktywności metabolicznej linii komórkowej A375 były również wprost proporcjonalne do gęstości wysiewu komórek. Normalizując aktywność MMP do aktywności metabolicznej, nie stwierdzono znaczącej różnicy w aktywności MMP na komórkę przy gęstości wysiewu większej niż 2 miliony komórek na ml.

Ważne jest, aby stosować właściwe techniki pipetowania. Obejmuje to końcówki do wstępnego zwilżania w celu uzyskania dokładnych objętości lepkich roztworów. Ponadto centrowanie roztworu prekursora hydrożelu w studni ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych pomiarów za pomocą czytnika płytek.

Aby zidentyfikować konkretne MMP, które przyczyniają się do mierzonej tutaj aktywności MMP, można zastosować testy ekspresji, takie jak western blot lub PCR. Stosowanie żywych komórek wymaga odpowiedniej procedury bezpieczeństwa biologicznego, techniki aseptycznej i komory bezpieczeństwa biologicznego. Światło UV jest niebezpieczne, używaj osłony, aby chronić użytkownika i nie patrz bezpośrednio w światło.