Name: Pomiar globalnej metaloproteinazy macierzy komórkowej i aktywności metabolicznej w hydrożelach 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności metaloproteinaz macierzy komórkowej i metabolicznej w 3D przy użyciu hydrożeli PEG z fluorescencyjnym czujnikiem. Protokół umożliwia badania przesiewowe leków w wysokiej przepustowości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Ohio Cancer Research (OCR), OH, USA za sfinansowanie tej pracy, a także Uniwersytetowi Króla Sauda (KSU), Rijad, KSA za sponsorowanie pierwszego autora. Masa cząsteczkowa czujnika peptydów fluorescencyjnych została zmierzona za pomocą spektrometrii mas wspomaganej matrycą, laserowej desorpcji-jonizacji, czasu przelotu (MALDI-TOF) z pomocą Campus Chemical Instrument Center Mass Spectrometry and Proteomics Facility na Uniwersytecie Stanowym Ohio.

1. Przygotowanie składników hydrożelu
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj fluorescencyjne peptydy degradowalne przez proteazę, jak opisano w innym miejscu8, wykorzystując fluoresceinę jako cząsteczkę fluorescencyjną i dabcyl jako środek wygaszający. Rozpuść peptyd w DMSO do stężenia 10 mM i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C w małych (~30 μL) porcjach, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. 
	UWAGA: Peptydy te można również kupić komercyjnie. Protokół ten wymaga C-końcowej cysteiny w sekwencji peptydowej, aby umożliwić kowalencyjne włączenie do sieci polimerowej hydrożelu.</li>
	<li>Przygotuj 8 ramion 40 kDa poli(glikol etylenowy) amina (PEG)-norbornen (NB) zgodnie z opisem17. Sprawdź funkcjonalizację grupy końcowej większą niż 90% przy użyciu 1H NMR. Rozpuścić PEG-NB w sterylnym buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) o stężeniu 25% w/v i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C w (~300 μL) podwielokrotnościach. 
	UWAGA: PEG funkcjonalizowany norbornenem można również kupić komercyjnie.</li>
	<li>Zsyntetyzuj fotoinicjator 2,4,6 trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP), jak opisano w innym miejscu18. Rozpuścić LAP w sterylnej wodzie do stężenia 68 mM i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C w (~300 μL) podwielokrotnościach. 
	UWAGA: Alternatywnie jako fotoinicjator można zastosować Irgacure (2-hydroksy-4′-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon). LAP i Irgacure można kupić w sprzedaży.</li>
	<li>Rozpuść ulegający degradacji MMP peptyd sieciujący (KCGPQG↓IWGQCK) i peptyd adhezyjny komórek (CRGDS) w sterylnej wodzie do stężenia odpowiednio 200 mM i 100 mM i przechowuj je w zamrażarce o temperaturze -80 °C odpowiednio w podwielokrotnościach (~300 μL i ~30 μL).</li>
</ol>
2. Przygotowanie podłoża testowego
<ol>
	<li>Przygotować inaktywowaną termicznie, pozbawioną węgla drzewnego płodową surowicę bydlęcą (FBS) do testu MMP: 
	UWAGA: Proteazy w FBS mogą wytwarzać wysoki sygnał tła za pomocą testu MMP; dlatego zaleca się inaktywację termiczną i usuwanie FBS węglem drzewnym na pożywkę testową.
	<ol>
		<li>Dezaktywować 100 ml FBS przez ogrzewanie przez 30 minut w temperaturze 55 °C. 
		UWAGA: Wykorzystano tutaj 100 ml FBS do porcjowania i przechowywania w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości. W razie potrzeby można użyć mniejszych objętości.</li>
		<li>Dodaj 0,25% w/v węgla aktywnego i 0,025% w/v dekstranu do niewielkiej ilości FBS (około 5 ml) i mieszaj, aż powstanie zawiesina. Następnie dodać resztę FBS i mieszać przez 30 minut w temperaturze 55 °C.</li>
		<li>Wirować przy 1,962 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Następnie przenieść supernatant do innego naczynia.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.1.2, ale w temperaturze 37 °C, a następnie krok 2.1.3. Wysterylizuj supernatant za pomocą filtra 0,45 μm, a następnie filtra 0,2 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować pożywkę testową, używając pożywki uzupełnionej 1% FBS pozbawionym węgla drzewnego, 2 mM L-glutaminy, 10 U/ml penicyliny, 10 μg/ml streptomycyny. 
	UWAGA: Zalecane są podłoża bez czerwieni fenolowej, ponieważ mają one mniejsze zakłócenia fluorescencji. Inne dodatki do pożywki testowej, takie jak insulina, czynniki wzrostu itp., mogą być dodawane, o ile piki widma absorbancji i fluorescencji nie nakładają się na czujnik (494 nm/521 nm).</li>
	<li>Rozcieńczyć bakteryjny enzym kolagenazy typu I w stężeniach 10 i 1 000 μg/ml w pożywce testowej jako kontrolę pozytywną.</li>
</ol>
3. Przygotowanie hydrożelu i enkapsulacja komórek
<ol>
	<li>Przygotować roztwór prekursora hydrożelu.
	<ol>
		<li>Dodaj odczynniki do probówki o pojemności 1,5 ml w następującej kolejności, wirując po dodaniu każdego składnika: 20 mM 8 arm 40 kDa PEG-NB, 12,75 mM peptyd sieciujący MMP, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM LAP i 0,25 mM fluorogeniczny peptyd degradowalny MMP. 
		UWAGA: Tabela 1 przedstawia zawartość roztworu prekursora hydrożelu, stężenia podstawowe, stężenia robocze, wzory obliczania objętości oraz wymagane objętości potrzebne do wytworzenia 120 μl roztworu prekursora hydrożelu, co jest wystarczające do przeprowadzenia doświadczenia z 10 hydrożelami. Aby uwzględnić utratę roztworu hydrożelu w wyniku pipetowania, należy zwiększyć całkowitą objętość o 20%. Dostępne w handlu peptydy są często dostarczane w postaci kwaśnego roztworu chlorowodoru; w związku z tym dodaje się NaOH w celu uzyskania końcowego pH 7. pH roztworu końcowego powinno zostać potwierdzone przez użytkownika.</li>
		<li>Podziel roztwór prekursora hydrożelu na wiele probówek o pojemności 1,5 ml, po jednej probówce na badany stan. 
		UWAGA: Sugerowanych jest kilka warunków kontrolnych, w których hydrożele są przygotowywane bez dodatku komórek. W przypadku kontroli ujemnej, w celu uwzględnienia niespecyficznej degradacji czujnika fluorogenicznego, jeżeli nie występują warunki poddania działaniu substancji, można inkubować jeden warunek hydrożelu z samą kontrolą nośnika lub pożywką doświadczalną. W celu kontroli pozytywnej i kalibracji między eksperymentami, hydrożele mogą być inkubowane z proteazą, o której wiadomo, że rozszczepia czujnik fluorogeniczny. Na przykład zastosowano tutaj dwa stężenia kolagenazy bakteryjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kapsułkuj komórki w hydrożelach.
	<ol>
		<li>Przygotować zawiesinę jednokomórkową odpowiednią dla rodzaju używanej komórki. Na przykład umyj 10-centymetrowe naczynie z komórkami czerniaka A375 za pomocą 10 ml PBS. Trypsynizować komórki za pomocą 0,05% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 minuty. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić całkowitą liczbę komórek.</li>
		<li>Odwirować roztwór komórkowy przy 314 x g przez 3 minuty, odessać pożywkę hodowlaną, a następnie ponownie zawiesić komórki w PBS przy około trzykrotnie wyższej gęstości wysiewu wymaganej dla eksperymentu. Na przykład zastosowano tutaj zawiesinę komórek o gęstości 21 x 106 komórek, aby uzyskać końcową gęstość kapsułkowaną 7 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Policz komórki ponownie, aby zapewnić dokładne stężenie komórek.</li>
		<li>Dodaj zawieszone komórki i PBS do każdej probówki roztworu prekursora hydrożelu zgodnie z wymaganą gęstością wysiewu (0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 i 7 x 106 komórek/ml w tym przykładzie). Dodaj PBS do warunków, w których nie ma żadnych komórek, zamiast zawieszonych komórek. 
		UWAGA: Wszystkie warunki powinny mieć taką samą końcową objętość roztworu prekursora hydrożelu, aby zapewnić stały stosunek między składnikami hydrożelu a PBS. Nie należy wirować probówek, w których znajdują się komórki, energicznie pipetować w górę iw dół, nie tworząc pęcherzyków w celu wymieszania roztworu prekursora.</li>
		<li>Dozować 10 μl roztworu prekursora hydrożelu do sterylnej czarnej 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem, upewniając się, że końcówka jest wyśrodkowana na środku każdej studzienki podczas dozowania.</li>
		<li>Polimeryzować roztwór prekursora hydrożelu, wystawiając płytkę na działanie światła ultrafioletowego (UV) o mocy 4 mW/cm2 przez 3 min. 
		UWAGA: Lampa UV (ręczna lampa UVL-56, UVP, Upland, CA) wytwarza światło UV-A o długiej długości fali UV (365 nm), które nie wpływa na żywotność komórek.</li>
		<li>Dodać 150 μl pożywki do oznaczania do wszystkich studzienek, z wyjątkiem warunków kontroli dodatniej bez zamkniętych komórek. Do kontroli pozytywnych dodać 150 μl roztworu enzymu kolagenazy.</li>
		<li>Dodać 150 μl PBS do zewnętrznych studzienek płytki, aby zmniejszyć parowanie podczas inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. MMP i pomiar aktywności metabolicznej
<ol>
	<li>Zmierz fluorescencję natychmiast po enkapsulacji, aby ustalić podstawowy pomiar fluorescencji i zapewnić jednorodność polimeryzacji hydrożelowej. Odczytać płytkę za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych z wykorzystaniem nieprzezroczystego protokołu 96-dołkowej płytki z ustawieniem skanowania obszaru na 494 nm/521 nm (wzbudzenie/emisja). Będzie to odczyt 0 godzin.</li>
	<li>Inkubować płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 18 godzin.</li>
	<li>Dodać odczynnik aktywności metabolicznej (rezazurynę) w stosunku 1:10 (v/v) dla każdego dołka.</li>
	<li>Inkubować płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dodatkowe 6 godzin 
	UWAGA: Ten czas inkubacji może się różnić w zależności od typu komórki.</li>
	<li>Zmierz fluorescencję po 24 godzinach od enkapsulacji. Odczytaj płytkę za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych wykorzystującego nieprzezroczysty protokół 96-dołkowej płytki z ustawieniem skanowania obszaru na 494 nm/521 nm (wzbudzenie/emisja) dla aktywności MMP i 560 nm/590 nm (wzbudzenie/emisja) dla aktywności metabolicznej.</li>
</ol>

<ol><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Physiological+Events+in+2D+vs.+3D+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halfway+between+2D+and+Animal+Models%3A+Are+3D+Cultures+the+Ideal+Tool+to+Study+Cancer-Microenvironment+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).</li>
<li>Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytically+Degradable+Hydrogels+with+a+Fluorogenic+Substrate+for+Studies+of+Cellular+Proteolytic+Activity+and+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration.</a> Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).</li>
<li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li>
<li>Chalasani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+of+Protease+Activity%3A+Assays+to+Screen+Therapeutic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches.</a> Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).</li>
<li>Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Protease+Activity+in+Living+Cells%3A+From+Two+Dimensions+to+Four+Dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions.</a> Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).</li>
<li>Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+matrix+metalloproteinase+activity+in+3D+cellular+microenvironments+using+a+fluorogenic+peptide+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate.</a> Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).</li>
<li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li>
<li>Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Metalloproteinases+in+Non-Neoplastic+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178(2016).</li>
<li>Visse, R., Nagase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases%3A+structure%2C+function%2C+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry.</a> Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).</li>
<li>Vihinen, P., Kähäri, V. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+in+cancer%3A+Prognostic+markers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets.</a> International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).</li>
<li>Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrahydrocurcumin+inhibits+HT1080+cell+migration+and+invasion+via.+downregulation+of+MMPs+and+uPA1%5BTitle%5D)+AND+%22APHS+Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1.</a> APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).</li>
<li>Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin%2C+demethoxycurcumin+and+bisdemethoxycurcumin+differentially+inhibit+cancer+cell+invasion+through+the+down-regulation+of+MMPs+and+uPA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutritional+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA.</a> The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).</li>
<li>Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+High-Throughput+Cell+Encapsulation+Platform+to+Study+Changes+in+Cell-Matrix+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).</li>
<li>Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+tethered+TGF-%CE%B21+with+encapsulated+chondrocytes+in+a+PEG+hydrogel+system+enhances+extracellular+matrix+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).</li>
<li>Sridhar, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cellularly+degradable+PEG+hydrogel+to+promote+articular+cartilage+extracellular+matrix+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2%2C4%2C6-trimethylbenzoylphosphinate%3A+polymerization+rate+and+cytocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li>
<li>Mucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Type-1+Matrix+Metalloprotease+and+Stromelysin-3+Cleave+More+Efficiently+Synthetic+Substrates+Containing+Unusual+Amino+Acids+in+Their+P1%27+Positions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).</li>
<li>Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+Validation+in+High+Throughput+Screening+-+from+Concept+to+Application%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+and+Development%22%5BJournal%5D)">Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application.</a> Drug Discovery and Development. , (2015).</li>
<li>Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIversen%2C+PW+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).</li>
<li>Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+bioscaffolds+for+3D+culture+of+melanoma+cells+reveal+increased+MMP+activity+and+migration+with+BRAF+kinase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).</li>
<li>Patterson, J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+proteolytic+degradation+of+molecularly+engineered+PEG+hydrogels+in+response+to+MMP-1+and+MMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2.</a> Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hodowla komórkowa 3D in vitro podsumowuje wiele ważnych aspektów środowiska in vivo. Jednak hodowla 3D sprawia również, że ocena funkcji komórek i sygnalizacji jest trudna, ponieważ wiele testów biologicznych wymaga pobrania komórek i dużej liczby komórek. W związku z tym opracowanie prostego systemu hodowli 3D, który umożliwia pomiar funkcji komórek bez dalszego przetwarzania próbek, znacznie zwiększyłoby użyteczność systemów hodowli 3D. Opisany tutaj system 3D można dostosować do wielu różnych zastosowań. Sekwencja czu...

Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli często bardziej odwzorowują odpowiedzi komórkowe in vivo niż tradycyjne dwuwymiarowe (2D) systemy hodowlane, zobacz kilka doskonałych publikacji1,2,3. Jednak wykorzystanie systemów hodowli 3D do pomiaru funkcji komórek było wyzwaniem ze względu na trudności w pobieraniu komórek i dalszym przetwarzaniu próbek. Ta trudność ogranicza pomiar wielu funkcji komórkowych w systemach hodowli 3D. Aby przezwyciężyć tę trudność, potrzebne są nowe techniki, które umożliwią łatwy pomiar funkcji komórek w środowiskach 3D. Jednym ze sposobów zaspokojenia tej potrzeby jest opracowanie materiałów, które nie tylko wspierają hodowlę komórek 3D, ale także zawierają czujniki do pomiaru funkcji komórek. Na przykład kilka systemów hydrożelowych zawiera frakcje rozszczepialne proteazy fluorogennej, aby umożliwić wizualizację aktywności proteazy w środowiskach 3D4,5,6,7. Podczas gdy systemy te były pierwotnie wykorzystywane do obrazowania mikroskopowego, systemy te można również dostosować do użycia w globalnym teście aktywności metaloproteinazy macierzy (MMP) przy użyciu standardowego czytnika płytek, umożliwiając łatwy pomiar funkcji komórki w środowisku 3D8.
MMPs, nadrodzina proteaz cynkowych, odgrywa kluczową rolę w normalnej homeostazie tkanek i w wielu chorobach. MMP degradują i przebudowują macierz zewnątrzkomórkową (ECM), rozszczepiają receptory i cytokiny na powierzchni komórek oraz aktywują inne MMP9,10. MMP odgrywają kluczową rolę w procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran oraz w chorobach takich jak zapalenie stawów, miażdżyca, choroba Alzheimera i rak (zobacz recenzje w 9,10,11). W przypadku nowotworów wysoki poziom ekspresji MMP jest silnie skorelowany z przerzutami raka i złym rokowaniem12. Co więcej, MMP przyczyniają się do progresji nowotworu, promując inwazję i migrację komórek rakowych, procesy komórkowe, które są z natury zjawiskami 3D13,14. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie możliwością pomiaru aktywności MMP w kulturze 3D w wielu kontekstach, w tym w podstawowych badaniach biologicznych i testach przesiewowych leków.
Hydrożele PEG są szeroko stosowane do hodowli komórkowych 3D ze względu na ich wysoką zawartość wody, odporność na adsorpcję białek i przestrajalny charakter. Hydrożele PEG zostały sfunkcjonalizowane wieloma ugrupowaniami w celu kierowania funkcją komórki, takich jak peptydy mimetyczne ECM, takie jak RGD, RLD i IKVAV w celu ułatwienia adhezji komórek lub bezpośredniego wiązania czynników wzrostu, takich jak transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β)15,16. Ostatnio hydrożele PEG zostały sfunkcjonalizowane peptydami czujnikowymi, które umożliwiają również pomiar funkcji komórek5,8. W szczególności zastosowanie systemu hydrożelowego PEG funkcjonalizowanego fluorogennym peptydem degradowalnym MMP umożliwiło pomiar aktywności komórkowej MMP w kulturach 3D za pomocą standardowego czytnika płytek i nie wymagało dalszego przetwarzania. Systemy te są również kompatybilne z innymi pomiarami funkcji komórkowych, w tym aktywności metabolicznej. W tym miejscu opisano protokół pomiaru aktywności MMP komórek hodowanych w hydrożelu 3D PEG funkcjonalizowanym fluorogennym peptydem degradowalnym MMP, a także przedstawiono wyniki demonstrujące wstępne eksperymenty optymalizacyjne potrzebne do zastosowania tego testu. Ludzkie komórki czerniaka (A375) zostały zamknięte w hydrożelach fluorogennych w zakresie gęstości wysiewu w celu określenia odpowiednich gęstości wysiewu, które mieszczą się w zakresie roboczym testu. Po 24 godzinach enkapsulacji zmierzono MMP i aktywność metaboliczną za pomocą standardowego czytnika mikropłytek. Następnie aktywność MMP znormalizowano do aktywności metabolicznej w celu określenia gęstości wysiewu w liniowym zakresie testu. Na koniec obliczono procentowy współczynnik zmienności wewnątrzpłytkowej (% CV) między trzema powtórzeniami, aby odzwierciedlić odtwarzalność uzyskanych wyników. Metoda ta umożliwia prostą i szybką hodowlę komórkową 3D oraz łatwy pomiar aktywności proteazy przy minimalnym przetwarzaniu próbki.

<table><tbody><tr><td>1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>Węgiel aktywowany&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3345</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka z okrągłym dnem</td><td>Brand-Tech</td><td>89093-600</td><td></td></tr><tr><td>Peptyd adhezyjny komórek (CRGDS)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td>na zamówienie enzym</td><td></td></tr><tr><td>kolagenazy typu I&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4876</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Pożywka o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)&nbsp;</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych&nbsp;</td><td>Hemocytometr BioTek</td><td>Cytation 3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Usieciowanie peptydowe degradowalne MMP (KCGPQG&darr; IWGQCK)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td>na</td><td></td>zamówienie</tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318500</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin (Alamar Blue)</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1100</td><td></td></tr><tr><td>światło UV&nbsp;</td><td>UVP</td><td>95-0006-02</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar globalnej metaloproteinazy macierzy komórkowej i aktywności metabolicznej w hydrożelach 3d

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli komórkowej często bardziej odwzorowują in vivo odpowiedzi i funkcje komórkowe niż tradycyjne dwuwymiarowe (2D) systemy hodowlane. Jednak pomiar funkcji komórek w hodowli 3D jest często trudniejszy. Wiele testów biologicznych wymaga pobrania materiału komórkowego, co może być trudne w hodowlach 3D. Jednym ze sposobów sprostania temu wyzwaniu jest opracowanie nowych materiałów, które umożliwią pomiar funkcji komórek w materiale. W artykule przedstawiono metodę pomiaru aktywności metaloproteinazy macierzy komórkowej (MMP) w hydrożelach 3D w formacie 96-dołkowym. W tym systemie hydrożel z poli(glikolu etylenowego) (PEG) jest funkcjonalizowany fluorogennym czujnikiem rozszczepialnym MMP. Komórkowa aktywność MMP jest proporcjonalna do intensywności fluorescencji i może być mierzona za pomocą standardowego czytnika mikropłytek. Miniaturyzacja tego testu do formatu 96-dołkowego skróciła czas potrzebny na przygotowanie eksperymentu o 50%, a użycie odczynnika o 80% na warunek w porównaniu z poprzednią 24-dołkową wersją testu. Ten test jest również kompatybilny z innymi pomiarami funkcji komórkowych. Na przykład zademonstrowano tutaj test aktywności metabolicznej, który można przeprowadzić jednocześnie z pomiarami aktywności MMP w tym samym hydrożelu. Test jest demonstrowany z ludzkimi komórkami czerniaka zamkniętymi w szerokim zakresie gęstości wysiewu komórek w celu określenia odpowiedniej gęstości enkapsulacji dla zakresu roboczego testu. Po 24 godzinach enkapsulacji komórek odczyty MMP i aktywności metabolicznej były proporcjonalne do gęstości wysiewu komórek. Chociaż test jest tutaj demonstrowany z jednym degradowalnym substratem fluorogenicznym, test i metodologia mogą być dostosowane do szerokiej gamy systemów hydrożelowych i innych czujników fluorescencyjnych. Taki test zapewnia praktyczną, wydajną i łatwo dostępną platformę do hodowli 3D do szerokiej gamy zastosowań.

Obecny test został zaadaptowany z wcześniej opracowanego i scharakteryzowanego systemu hodowli w hydrożelu 3D, funkcjonalizowanego fluorogenicznym sensorem podatnym na cięcie przez MMP8. Zastosowany tutaj fluorogeniczny sensor MMP składa się z sekwencji peptydowej GPLAC(pMeOBzl)↓WARKDDK(AdOO)C (↓ oznacza miejsce cięcia), która została wcześniej zoptymalizowana pod kątem cięcia przez MMP-14 i MMP-1119. Peptyd jest znakowany cząsteczką fluores...

Tutaj przedstawiono protokół hermetyzacji i hodowli komórek w hydrożelach z poli(glikolu etylenowego) (PEG) funkcjonalizowanych peptydem degradowalnym przez metaloproteinazę o matrycy fluorogennej (MMP). Komórkowy MMP i aktywność metaboliczną mierzy się bezpośrednio z kultur hydrożelowych za pomocą standardowego czytnika mikropłytek.

Pomiar globalnej metaloproteinazy macierzy komórkowej i aktywności metabolicznej w hydrożelach 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Hodowla 3D utrudnia pomiar funkcji komórkowych przy użyciu standardowych testów biologicznych. Protokół ten umożliwia pomiar aktywności komórkowej i somatycznej bez dalszego przetwarzania próbki, przy użyciu czujnika fluorescencyjnego i standardowego czytnika mikropłytek. Protokół ten umożliwia szereg nowych zastosowań, w tym wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków.Dodatkowo czujnik fluorescencyjny można wymienić na inny czujnik w celu pomiaru innych proteaz lub funkcji komórek. Ważne jest, aby dokładnie zaplanować eksperyment z wyprzedzeniem, wykonać wszystkie obliczenia dotyczące przygotowania hydrożelu i ustawić wszystkie urządzenia i odczynniki, aby zminimalizować czas przebywania komórek w zawiesinie. Na początek przygotuj pożywkę testową z 1% pozbawioną węgla drzewnego płodowej surowicy bydlęcej, dwoma mM L-glutaminą, 10 jednostkami na ml penicyliny i 10 mikrogramami na ml streptomycyny.Nie używaj pożywek z czerwienią fenolową, które mają większą interferencję fluorescencji. Aby przeprowadzić kontrolę pozytywną, dodać bakteryjny enzym kolagenazę typu pierwszego do pożywki testowej w stężeniach 10 i 1000 mikrogramów na ml. Następnie przygotuj roztwór prekursora hydrożelu, dodając odczynniki do probówki o pojemności 1,5 ml.Upewnij się, że wirujesz po dodaniu każdego składnika. Następnie podziel roztwór na wiele probówek o pojemności 1,5 ml dla różnych warunków. Aby zamknąć komórki w hydrożelach, najpierw przygotuj zawiesinę pojedynczej komórki, myjąc 10-centymetrowe naczynie komórek czerniaka A375 10 ml PBS.Następnie dodaj 0,05% trypsyny do naczynia, aby trypsynizować komórki. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy minuty. Po inkubacji policz komórki za pomocą hemocytometru.Następnie odwiruj roztwór komórkowy o stężeniu 314 razy G przez trzy minuty. Odessać pożywkę hodowlaną i ponownie zawiesić komórki w buforze PBS przy około trzykrotności końcowej gęstości kapsułkowanej. Policz komórki ponownie, aby zapewnić dokładne stężenie komórek.Następnie dodać zawieszone komórki w PBS do każdej probówki roztworu prekursora hydrożelu zgodnie z wymaganą gęstością wysiewu i mieszać, pipetując w górę iw dół. W kontrolowanych warunkach należy dodawać tylko PBS i wir. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów roztworu prekursora hydrożelu do środka każdej studzienki sterylnej, czarnej, okrągłodennej płytki 96-dołkowej.Sprawdź wzrokowo rozmieszczenie hydrożeli w studniach. Niecentrowane hydrożele można przestawiać za pomocą końcówki pipety przed polimeryzacją. Aby spolimeryzować roztwór prekursora hydrożelu, wystaw płytkę na działanie światła UV o mocy 4 miliwatów na centymetr kwadratowy przez trzy minuty.Następnie dodać 150 mikrolitrów pożywki testowej do wszystkich studzienek zawierających zamknięte komórki i 150 mikrolitrów roztworu enzymu kolagenazy do studzienek kontroli pozytywnych. Dodać 150 mikrolitrów buforu PBS do zewnętrznych dołków płytki, aby zmniejszyć parowanie podczas inkubacji. Użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć intensywność fluorescencji płytki o godzinie zero, natychmiast po enkapsulacji.Wybierz nieprzezroczysty protokół 96-dołkowej płytki ze wzbudzeniem 494 nanometrów i długościami fal emisji 521 nanometrów. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 18 godzin. Następnie dodać odczynniki aktywności metabolicznej w stosunku 1 do 10 objętości na studzienkę dla wszystkich warunków i kontroli.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, przez sześć godzin. Na koniec zmierz intensywność fluorescencji płytki po 24 godzinach, po enkapsulacji. Wybierz nieprzezroczysty protokół 96-dołkowej płytki z wzbudzeniem 494 nanometrów i długościami fal emisji 521 nanometrów, dla aktywności MMP.Aby zmierzyć aktywność metaboliczną, wybierz długość fali wzbudzenia 560 nanometrów i długość fali emisji 590 nanometrów. W tym badaniu, po wystawieniu czujnika fluorogenicznego na odpowiednią proteazę, wygaszacz i fluorofor są oddzielane, a fluorescencja wzrasta. Pomiary fluorescencji inkubowanych hydrożeli z bakteryjnym enzymem kolagenazy typu pierwszego pokazują, że najniższy wykryty sygnał był wytwarzany przez kontrole ujemne, bez kolagenazy.Podczas gdy najwyższy wykryty sygnał został wyprodukowany przez 1000 mikrogramów na ml kolagenazy lub więcej, gdy sygnał zaczyna się stabilizować. Obliczony zakres roboczy wynosił od około 0,16 do 474 mikrogramów na ml kolagenazy. Odczyty fluorescencji dla linii komórkowej czerniaka A375, zamkniętej w różnych gęstościach zaraz po enkapsulacji, były niskie we wszystkich gęstościach wysiewu i podobne do żeli kontrolnych bez komórek, zgodnie z oczekiwaniami.24 godziny po enkapsulacji aktywność MMP była wprost proporcjonalna do gęstości wysiewu, a gęstości wysiewu na poziomie lub większym niż 1 milion komórek na ml mieszczą się w granicach zakresu roboczego. Pomiary aktywności metabolicznej linii komórkowej A375 były również wprost proporcjonalne do gęstości wysiewu komórek. Normalizując aktywność MMP do aktywności metabolicznej, nie stwierdzono znaczącej różnicy w aktywności MMP na komórkę przy gęstości wysiewu większej niż 2 miliony komórek na ml.Ważne jest, aby stosować właściwe techniki pipetowania. Obejmuje to końcówki do wstępnego zwilżania w celu uzyskania dokładnych objętości lepkich roztworów. Ponadto centrowanie roztworu prekursora hydrożelu w studni ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych pomiarów za pomocą czytnika płytek.Aby zidentyfikować konkretne MMP, które przyczyniają się do mierzonej tutaj aktywności MMP, można zastosować testy ekspresji, takie jak western blot lub PCR. Stosowanie żywych komórek wymaga odpowiedniej procedury bezpieczeństwa biologicznego, techniki aseptycznej i komory bezpieczeństwa biologicznego. Światło UV jest niebezpieczne, używaj osłony, aby chronić użytkownika i nie patrz bezpośrednio w światło.

measuring-global-cellular-matrix-metalloproteinase-metabolic-activity

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Ten film prezentuje ilościową mikroskopię poklatkową do oceny zależnej od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej rozprzestrzeniania się Listeria monocytogenes przez komórki śródbłonka. Bardziej miękki hydrożel ułatwia szybsze rozprzestrzenianie się bakterii przez komórki śródbłonka w porównaniu ze sztywniejszymi odpowiednikami, co podkreśla wpływ sztywności matrycy na rozprzestrzenianie się bakterii.

Ilościowa mikroskopia poklatkowa do oceny rozsiewu bakterii zależnego od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej

Mikroreologia śledząca cząstki może być wykorzystana do nieniszczącego ilościowego i przestrzennego mapowania zmian właściwości mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D nowotworów.

Podłużny pomiar sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D guzów przy użyciu mikroreologii śledzenia cząstek

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

Kolagen jest kluczowym składnikiem ECM i dostarcza niezbędnych wskazówek dla kilku procesów komórkowych, począwszy od migracji, a skończywszy na różnicowaniu i proliferacji. Poniżej przedstawiono protokół osadzania komórek w hydrożelach kolagenowych 3D oraz bardziej zaawansowaną technikę generowania losowych lub wyrównanych matryc kolagenowych przy użyciu mikrokanałów PDMS.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Rekombinowane hydrożele modyfikowane białkami są korzystne dla hodowli komórkowych 3D, ponieważ pozwalają na pełne dostrojenie szkieletu polimerowego, a tym samym mikrośrodowiska komórki. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania rekombinowanego białka podobnego do elastyny i jego zastosowanie w enkapsulacji komórek hydrożelowych 3D.

Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Ten artykuł opisuje, jak drukować biożele 3D fototostrajalne hydrożele do badania usztywnienia macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywacji fibroblastów.

Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów

Poznaj metodę pomiaru aktywności metaloproteinaz macierzy komórkowej i metabolicznej w 3D przy użyciu hydrożeli PEG z fluorescencyjnym czujnikiem. Protokół umożliwia badania przesiewowe leków w wysokiej przepustowości.

Pomiar globalnej metaloproteinazy macierzy komórkowej i aktywności metabolicznej w hydrożelach 3D

Przeglądaj więcej filmów