Izolacja i transfer adoptywny komórek dendrytycznych prezentujących antygen traktowany wysoką solą

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nadciśnienia tętniczego i chorób sercowo-naczyniowych, w tym badania komórek dendrytycznych CD11c dodatnich i tego, jak zwiększają one rolę uszkodzenia nadciśnieniowego. Główną zaletą tej techniki jest izolacja komórek dendrytycznych CD11c dodatnich z narządów litych oraz badanie ich fizjologicznej roli w różnych stanach chorobowych. Tak więc proces ten można zastosować do wielu typów komórek odpornościowych, w tym limfocytów B, limfocytów T, monocytów i makrofagów.

Wizualizacja techniki ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia izolacji komórek dendrytycznych, a w szczególności procesu transferu adoptywnego do myszy biorców. Na początek spryskaj klatkę piersiową i boki uśpionej myszy 70% etanolem. Po lewej stronie ostrożnie otwórz skórę i jamę otrzewnej, aby odsłonić śledzionę.

Za pomocą małych kleszczy ostrożnie przesuń jelita i wątrobę na lewą stronę myszy. Następnie za pomocą małych nożyczek delikatnie wyciąć śledzionę. Umieść każdą wyciętą śledzionę w oznakowanej rurce C zawierającej trzy mililitry pożywki RPMI 1640.

Najpierw dodaj kolagenazę D i DNazę do przygotowanej pożywki RPMI 1640, aby przygotować roztwór do trawienia śledziony. Umieść probówkę C na półautomatycznym homogenizatorze i upewnij się, że probówka jest szczelnie umieszczona na obracającym się ramieniu. Naciśnij przycisk start na homogenizatorze, aby uruchomić protokół śledziony 04.01 na 60 sekund.

Następnie odłączyć probówkę od homogenizatora i inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w trybie ciągłym z prędkością 20 obr./min przez 15 minut. Następnie za pomocą pipety przenieś roztwór do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów po przefiltrowaniu go przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Umyj sitko 10 mililitrami dPBS.

Odwirować komórki w temperaturze 300 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie całkowicie odessać supernatant i umyć osad, ponownie zawieszając go w 10 mililitrach dPBS. Odwirować zawiesinę w temperaturze 300 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach dPBS. Użyj hemocytometru i wykluczenia błękitu trypanowego, aby policzyć liczbę komórek. Następnie odwirować w temperaturze 300 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, aby granulować komórki.

Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 400 mililitrach magnetycznie aktywowanego buforu do sortowania komórek. Następnie dodaj 100 mililitrów mikrogranulek CD11c na 100 milionów komórek. Zwiruj zawiesinę komórkową i inkubuj przez 10 minut w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie dodaj 10 mililitrów buforu MAC, aby umyć komórki i odwirować w temperaturze 300 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mililitrach buforu MAC. Umieść kolumnę LS w polu magnetycznym separatora magnetycznego i umieść stożkową rurkę o pojemności 15 mililitrów pod każdą kolumną, aby zebrać przepływ.

Następnie przepłukać kolumny trzema mililitrami buforu. Umieść zawiesinę komórek na każdej kolumnie i zbierz przepływ, przez który zawiera nieoznakowane komórki. Umyj kolumny trzema mililitrami buforu MAC i zbierz nieoznakowane komórki, które przez nie przechodzą.

Umyj kolumny LS jeszcze dwa razy, używając trzech mililitrów buforu MAC na mycie. Następnie wyjmij kolumny LS z separatora magnetycznego. Dodaj pięć mililitrów bufora MAC do każdej kolumny i natychmiast zanurz każdą kolumnę w przezroczystej stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów, aby wypłukać magnetycznie oznakowane komórki.

Użyj hemocytometru i wykluczenia błękitu trypanowego, aby określić dodatnią liczbę DC CD11c, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie rozcieńczyć próbkę komórki w rozcieńczeniu jeden do jednego w 0,4% roztworze błękitu trypanowego. Najpierw przygotuj osady komórkowe w pożywce hodowlanej DC, jak opisano w protokole tekstowym.

Odpipetować 900 mikrolitrów zawiesiny DC do 24-dołkowej płytki sokoła z płaskim dnem. Dodać 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej prądu stałego o wysokiej zawartości soli do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie sodu 190 milimolów. Oznacz płytkę i umieść ją w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 48 godzin.

Po 48 godzinach wyjąć płytkę z inkubatora. Odpipetować pożywkę do hodowli komórkowych w jednym dołku w górę iw dół, aby ponownie zawiesić dodatnie DC CD11c. Przenieś całą tę zawiesinę do odpowiednio oznakowanej probówki o pojemności 1,6 mililitra.

Powtórz to dla każdej pojedynczej studzienki, która została platerowana. Odwirować wszystkie probówki w temperaturze 300 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad prądu stałego za pomocą 100 mikrolitrów sterylnego dPBS.

Następnie pobierz roztwór prądu stałego z jednej z probówek do jednomililitrowej strzykawki, wyposażonej w półcalową igłę o rozmiarze 27. Umieść naiwnego 10-tygodniowego samca myszy C57-black-6 pod 2% izofluranem, aby uzyskać stabilną płaszczyznę chirurgiczną. Sprawdź poziom znieczulenia przy braku odruchu pedałowania.

Po uzyskaniu stabilnej płaszczyzny operacyjnej powoli i ostrożnie wprowadź igłę do przestrzeni zadoczodołowej pod kątem około 30 stopni. Powoli i płynnie wstrzykuj dodatnie zawieszenie DC CD11c. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy ostrożnie wyjąć igłę z miejsca zadoczodołowego, uważając, aby nie uszkodzić oka.

Następnie wyjmij myszy ze stożka nosowego i monitoruj je przez około 30 minut podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Typowa analiza ciśnienia krwi jest pokazana tutaj po adoptywnym przeniesieniu DC i mini pomp osmotycznych, które zostały wszczepione do infuzji małych dawek angiotensyny II. Należy zauważyć, że ta niska dawka angiotensyny II jest dawką supresorową, która nie zwiększa ciśnienia krwi u normalnej myszy.

Myszy, które otrzymują normalne DC CD11c leczone solą, utrzymują normalne ciśnienie krwi podczas infuzji, podczas gdy myszy, które otrzymują CD11c dodatnie DC leczone solą, wykazują wzrost skurczowego ciśnienia krwi. Następnie przeprowadza się analizę cytometrii przepływowej przy użyciu pokazanej tutaj strategii bramkowania w celu określenia czystości izolowanych komórek CD11c dodatnich. Obserwuje się zwiększone wzbogacenie komórek CD11c dodatnich w porównaniu z całkowitymi splenocytami.

Różne stężenia mikrokulek CD11c są wykorzystywane do rozwiązywania problemów z protokołem producenta. Magnetyczne oddzielenie splenocytów za pomocą 100 mikrolitrów mikrogranulek daje około 65% komórek CD11c dodatnich, podczas gdy użycie 200 mikrolitrów daje 55%, a użycie 300 mikrolitrów daje 50%Bloker FcR jest dołączony wraz ze 100 mikrolitrami mikrogranulek. Po separacji magnetycznej blokada FcR daje około 65% komórek CD11c dodatnich.

Niektóre splenocyty są następnie inkubowane ze 100 mikrolitrami mikrogranulek i magnetycznie rozdzielane przez kolumnę LS. Oddzielone komórki inkubuje się z dodatkowymi 100 mikrolitrami CD11c i ponownie rozdziela przez kolumnę LS. Ten proces podwójnej izolacji dał 92% komórek CD11c dodatnich.

Podczas próby tej procedury ważne jest, aby potwierdzić czystość wyizolowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Po izolacji magnetycznej komórek dendrytycznych można je hodować w celu określenia ich stanu aktywacji za pomocą technik molekularnych, w tym proteomiki i sekwencjonowania pojedynczych komórek. Od czasu jego opracowania możliwe jest obecnie badanie funkcji i specyficznej roli komórek dendrytycznych w nadciśnieniu.

Naukowcy badają obecnie specyficzne antygeny w nadciśnieniu.