Name: Izolacja i transfer adoptywny komórek dendrytycznych prezentujących antygen traktowany wysoką solą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj izolację komórek dendrytycznych CD11c+ z śledziony myszy metodą sortowania magnetycznego oraz transfer adoptywny do myszy biorczych. Technika umożliwia badanie roli immunologicznej w nadciśnieniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty American Heart Association POST290900 dla N.R.B., 17SDG33670829 dla L.X. oraz granty National Institutes of Health K01HL130497 dla A.K.

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Vanderbilt zatwierdził procedury opisane w niniejszym dokumencie. Myszy są trzymane i opiekowane zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych (National Academies Press. Revised 2010).
1. Izolacja śledziony od myszy
<ol>
	<li>Przygotuj 1640 RPMI: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μM β-merkaptoetanolu i 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Poddaj eutanazji 10-12 tygodniowe samce myszy C57bl/6 przez wdychanie CO2 . Spryskaj klatkę piersiową i boki myszy 70% etanolem. Po lewej stronie ostrożnie otwórz skórę i jamę otrzewnej, aby odsłonić śledzionę.</li>
	<li>Za pomocą małych kleszczy ostrożnie przesuń jelita i wątrobę na lewą stronę myszy i za pomocą cienkich nożyczek delikatnie wytnij śledzionę. 
	nuta: Ten krok należy wykonać bardzo ostrożnie, ponieważ uszkodzenie przewodu pokarmowego może wywołać zanieczyszczenie.</li>
	<li>Umieść każdą wyciętą śledzionę w oznakowanej stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml pożywki RPMI 1640.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie zawiesin jednokomórkowych ze śledziony
UWAGA: Śledziona może zostać zdysocjowana na jednokomórkową zawiesinę poprzez połączenie mechanicznej dysocjacji z trawieniem enzymatycznym.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do trawienia śledziony, dodając kolagenazę D (1 mg/ml; 0,29 j./mg liofilizowaną) i DNazę I (0,1 mg/ml) do przygotowanej pożywki RPMI 1640 (patrz krok 1.1)</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś śledzionę do rurki C (rurki dysocjacyjnej) zawierającej 3 ml roztworu do trawienia śledziony.</li>
	<li>Przeprowadzić dysocjację mechaniczną za pomocą półautomatycznego homogenizatora zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Umieść rurkę C na półautomatycznym homogenizatorze, upewniając się, że rurka C jest szczelnie umieszczona na obracającym się ramieniu. Po umieszczeniu rurki C naciśnij przycisk start na półautomatycznym homogenizatorze, aby uruchomić protokół Spleen 04.01 przez 60 s. 
		nuta: Dysocjację mechaniczną można również przeprowadzić, umieszczając filtr 40 μm na stożkowej rurce o pojemności 50 ml i delikatnie przecierając śledzionę przez filtr. Po zmieleniu śledziony przepłukać filtr 40 μm 10 ml pożywki RPMI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po dysocjacji mechanicznej należy odłączyć probówkę od homogenizatora i przeprowadzić trawienie enzymatyczne. Inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 37 °C przy ciągłej rotacji (20 obr./min).</li>
	<li>Przenieść roztwór, pipetując do stożkowej probówki o pojemności 50 ml po przefiltrowaniu przez sitko o średnicy 40 μm. Umyj sitko 40 μm 10 ml PBS (dPBS) firmy Dulbecco. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu całkowicie odessać supernatant i przemyć osad przez ponowne wymieszanie w 10 ml dPBS. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Izolacja CD11c+ DC z zawiesiny pojedynczej komórki śledziony
<ol>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 5 ml dPBS i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru i wykluczenia błękitu trypanowego.</li>
	<li>Granulować komórki, odwirowując w temperaturze 300 x g, przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 400 μl magnetycznie aktywowanego buforu do sortowania komórek (MAC).</li>
	<li>Dodać 100 μl mikrogranulek CD11c (patrz tabela materiałów) na 1 x 108 komórek.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową należy zwirować i inkubować przez 10 minut w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 10 ml buforu MACs, aby umyć komórki. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić w 500 μl buforu MAC.</li>
</ol>
4. Separacja magnetyczna DCs CD11c+
UWAGA: Separacja magnetyczna odbywa się ręcznie za pomocą separatora magnetycznego (patrz Tabela materiałów) wyposażonego w kolumny LS. Separacja magnetyczna może być również wykonywana automatycznie za pomocą automatycznego separatora magnetycznego. (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Umieść kolumnę LS w polu magnetycznym separatora MAC i stożkową rurkę o pojemności 15 ml pod każdą kolumną, aby zebrać przepływ.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę LS 3 ml buforu.</li>
	<li>Umieścić zawiesinę komórek na każdej kolumnie LS i zebrać przepływowy przepływ zawierający nieoznakowane komórki.</li>
	<li>Przemyć kolumnę LS 3 ml buforu MAC zbierającego nieznakowane komórki, które przez nią przechodzą. Umyj kolumnę LS jeszcze 2 razy.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę LS z separatora magnetycznego. Dodaj 5 ml buforu MAC do każdej kolumny i natychmiast wypłucz magnetycznie znakowane komórki, mocno zanurzając kolumnę LS w czystej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. 
	nuta: Ważne jest, aby wykonać podwójną izolację komórek CD11c w celu uzyskania zawiesiny komórek o wysokiej czystości. Dlatego powtórz kroki od 3.1 do 4.5. i odniesienie <silna klasa="xfig">Rysunek 4 dla standardów czystości. Ten etap poprawia czystość komórek CD11c+ do 90–95%.</li>
	<li>Określ liczbę DC CD11c+ na hemocytometrze za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego. Rozcieńczyć próbkę komórkową w rozcieńczeniu 1:1 w 0,4% roztworze błękitu trypanowego. 
	UWAGA: Komórki niezdolne do życia zostaną zabarwione na niebiesko, podczas gdy żywe komórki pozostaną niewybarwione.
	<ol>
		<li>Aby to zrobić, ostrożnie napełnij hemocytometr 10 μl rozcieńczenia próbki komórki i inkubuj przez 1 minutę.</li>
		<li>Policz komórki w 4 kwadratach o wymiarach 1 x 1 mm2 w komorze, która została załadowana, aby określić liczbę żywotnych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Obróbka in vitro o wysokiej zawartości soli w CD11c+ DC
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną DC, dodając 10% FBS, 0,1 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μM β-merkaptoetanolu i 1% penicyliny/streptomycyny do 500 ml 1640 RPMI.</li>
	<li>Przygotuj 10 pożywek do hodowli komórek o wysokiej zawartości soli (400 mM), ważąc 1,17 g NaCl i umieszczając go w sterylnej probówce sokoła o pojemności 50 ml. Dodać 50 ml sterylnej pożywki do hodowli komórek prądu stałego (przygotowanej w kroku 5.1) do probówki Falcona o pojemności 50 ml i wirować, aż NaCl znajdzie się w roztworze.</li>
	<li>Natychmiast przefiltruj pożywkę hodowlaną DC o wysokiej zawartości soli za pomocą filtracji próżniowej przez filtr 0,2 μm w okapie do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Odwirować każdą zawiesinę komórkową ze śledziony przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4ºC. Zawiesić każdą osadkę komórkową w pożywce hodowlanej prądu stałego o stężeniu 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Odpipetować 900 μl (około 1 x 106 komórek) zawiesiny DC w 24-dołkowej płytce Falcon z płaskim dnem. Dodać 100 μl pożywki hodowlanej prądu stałego o wysokiej zawartości soli do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie sodu 190 mM. Oznaczyć płytkę i umieścić w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C na 48 godzin.</li>
</ol>
6. Adoptywny transfer CD11c+ DC o wysokiej zawartości soli
<ol>
	<li>Po stymulacji in vitro przez 48 godzin wyjąć płytkę z inkubatora z humififikowanym CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odpipetować pożywkę do hodowli komórkowych w górę i w dół, aby ponownie zawiesić CD11c+ DC. Odpipetować całą zawiesinę CD11c+ DC do odpowiedniej oznaczonej probówki o pojemności 1,6 ml. Powtórz ten krok dla każdej studni z osobna.</li>
	<li>Odwirować każdą zawiesinę CD11c+ DC o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant. Zawiesić osad DC w 100 μl sterylnego dPBS.</li>
	<li>Narysować zawiesinę DC do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 27 G 1/2 cala.</li>
	<li>Umieść naiwnego samca 10-tygodniowego myszy C57bl/6 pod 2% izofluranem, aby uzyskać stabilną płaszczyznę chirurgiczną. Sprawdź poziom znieczulenia przy braku odruchu pedałowania. Po uzyskaniu stabilnej płaszczyzny operacyjnej powoli i ostrożnie wprowadzić igłę do przestrzeni zadoczodołowej pod kątem około 30°. 
	nuta: Skos igły 27 G powinien być skierowany w dół, z dala od oka, aby zapobiec uszkodzeniu oka.</li>
	<li>Powoli i płynnie wstrzykiwaj zawiesinę DC CD11c+ (około 1 x 106 ogniw). Po zakończeniu wstrzyknięcia należy ostrożnie wyjąć igłę w przestrzeń zadoczodołową, mając świadomość, że nie uszkodzić oka. 
	nuta: Po wstrzyknięciu krwawienie powinno być niewielkie lub nie powinno być go wcale. Adoptywny transfer DC CD11c+ można również przeprowadzić przy użyciu metody iniekcji dożylnej (np. Żyła ogonowa). Myszy kontrolne otrzymują CD11c + DC, które były hodowane w normalnych pożywkach solnych.</li>
	<li>Usuń myszy ze stożka nosowego i monitoruj je przez około 30 minut podczas rekonwalescencji po znieczuleniu.</li>
</ol>
7. Przygotowanie 14-dniowej niskiej dawki angiotensyny II (140 ng/kg/min)
<ol>
	<li>Przygotować bufor angiotensyny II, dodając 500 μl 5 M NaCl i 300 μl kwasu octowego. Quantum Satis (QS) do 30 ml dejonizowanego H20.</li>
	<li>Rozpuścić angiotensynę II w roztworze podstawowym o stężeniu 5 mg/ml w buforze angiotensyny II. Rozcieńczyć roztwór podstawowy angiotensyny II dodatkowym buforem, aby osiągnąć końcowe stężenie takie, aby minipompa osmotyczna dostarczała angiotensynę II w ilości 140 ng/kg/min, w zależności od masy ciała każdej myszy. 
	nuta: Niezbędna angiotensyna II (mg) = (masa myszy (g) x 0,2 mg/dzień x 14 dni)/1,000 
	Przygotowana angiotensyna II (mg) = (niezbędna angiotensyna II x 260 μL) / szybkość pompowania (0,25 μL/godz.) 
	Objętość zapasowa angiotensyny II (μL) = Gotowa angiotensyna II / stężenie podstawowe (5 mg / ml) x 1 000 
	Objętość rozcieńczonego (μL) = 270 - objętość podstawowa angiotensyny II</li>
	<li>Dodać objętość podstawową angiotensyny II do rozcieńczalnika (buforu angiotensyny II) w oparciu o objętości obliczone w kroku 7.2.</li>
	<li>Pod sterylnym kapturem do hodowli komórkowych otwarta minipompa osmotyczna.</li>
	<li>Dodać rozcieńczony roztwór angiotensyny II i usunąć powietrze ze strzykawki i igły. Wprowadzić dołączoną igłę do dna minipompy osmotycznej i powoli wstrzykiwać roztwór angiotensyny II, jednocześnie powoli i ostrożnie wycofując igłę z pęcherza.</li>
	<li>Włóż całkowicie głowicę minipompy osmotycznej do pęcherza osmotycznego, uważając, aby powietrze nie dostało się do pęcherza.</li>
</ol>
8. Implantacja 14-dniowych minipomp osmotycznych Angiotensyna II o niskiej dawce
<ol>
	<li>Dziesięć dni po adoptyjnym przeniesieniu CD11c+ DC, umieść myszy w komorze izofluranu, aby rozpocząć znieczulenie, a następnie przenieś myszy do stożka nosa, aby stale otrzymywać 2% izofluranu w celu uzyskania i utrzymania odpowiedniej płaszczyzny operacyjnej.</li>
	<li>Usuń sierść wzdłuż grzbietowej strony szyi za pomocą maszynki do strzyżenia, aby przygotować miejsce operacji. Przed rozpoczęciem zabiegu oczyść ogolony obszar 70% etanolem, a następnie 7,5% betadyną.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie (około 1,5 cm) w skórze. Wprowadzić hemostatyki do nacięcia, aby utworzyć podskórną kieszeń do umieszczenia minipompy osmotycznej.</li>
	<li>Włożyć minipompkę do kieszonki podskórnej. Zamknij ranę skóry 2-3 zszywkami chirurgicznymi i nałóż kolejną aplikację 7,5% betadyny na ranę i zszywki, aby zapobiec infekcji.</li>
	<li>Monitoruj myszy przez 30–60 minut podczas rekonwalescencji po znieczuleniu przed powrotem do klatek. 
	nuta: Myszy należy monitorować do 3–4 dni po wszczepieniu minipompy osmotycznej.</li>
</ol>
9. Izolacja śledziony myszy biorców do analizy cytometrycznej przepływowej
<ol>
	<li>Po 14 dniach infuzji angiotensyny II w małej dawce należy wyizolować śledziony od myszy otrzymujących in vitro DC o wysokiej zawartości soli poprzez transfer adoptywny. Postępuj zgodnie z instrukcjami wymienionymi powyżej (kroki 1 i 2).</li>
</ol>
10. Barwienie powierzchni
<ol>
	<li>Przenieść splenocyty, które są ponownie zawieszone w 1x PBS, do probówki FACS z polistyrenu i odwirować przy 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant po odwirowaniu. Przemyć dwukrotnie 1 ml buforu MAC i odwirować (350 x g, 8 min, 4 °C).
	<ol>
		<li>Podziel splenocyty równo na różne probówki FACS z polistyrenu w zależności od pożądanej liczby paneli cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przeprowadzić barwienie żywotności żywych/martwych komórek, umyj komórki 1x PBS i odwiruj (350 x g, 8 min, 4 °C). Zawiesić w 1 ml 1x PBS i dodać 1 μl barwnika żywotności komórek (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C (w lodówce lub na lodzie) przykryć folią w celu ochrony przed światłem.</li>
	<li>Podczas inkubacji barwienia żywotności komórek należy przygotować koktajl przeciwciał do barwienia powierzchni komórki w odpowiedniej objętości buforu MACS.</li>
	<li>Umyć komórki 1 ml buforu MACS, odwirować (350 x g, 8 min, 4 °C) i ponownie zawiesić każdą komórkę z 100 μl koktajlu przeciwciał. Inkubować chronić przed światłem przez 30 min w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Każde przeciwciało cytometrii przepływowej jest unikalne i jest bardzo przydatne i zalecane w celu określenia optymalnej ilości potrzebnego przeciwciała poprzez wykonanie krzywej miareczkowania dawki dla każdego specyficznego przeciwciała.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml buforu MACS i ponownie zawiesić splenocyty w odpowiedniej ilości buforu MACS do analizy cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

<ol><li>Kearney, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+hypertension%3A+analysis+of+worldwide+data%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of hypertension: analysis of worldwide data.</a> Lancet. 365, 217-223 (2005).</li>
<li>Murray, C. J., Lopez, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+global+burden+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Measuring the global burden of disease.</a> N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).</li>
<li>Lev-Ran, A., Porta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+and+hypertension%3A+a+phylogenetic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2Fmetabolism+research+and+reviews%22%5BJournal%5D)">Salt and hypertension: a phylogenetic perspective.</a> Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).</li>
<li>Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+and+hypertension%3A+is+salt+dietary+reduction+worth+the+effort%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort.</a> The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).</li>
<li>He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+longer-term+modest+salt+reduction+on+blood+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+Syst+Rev%22%5BJournal%5D)">Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure.</a> Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937(2013).</li>
<li>Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitions+and+characteristics+of+sodium+sensitivity+and+blood+pressure+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance.</a> Hypertension. 8, 127-134 (1986).</li>
<li>Morimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+sensitivity+and+cardiovascular+events+in+patients+with+essential+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension.</a> Lancet. 350, 1734-1737 (1997).</li>
<li>Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+sensitivity%2C+pulse+pressure%2C+and+death+in+normal+and+hypertensive+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans.</a> Hypertension. 37, 429-432 (2001).</li>
<li>Barbaro, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cell+Amiloride-Sensitive+Channels+Mediate+Sodium-Induced+Inflammation+and+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension.</a> Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).</li>
<li>Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+paradigm+of+sodium+regulation+in+inflammation+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Regulatory%2C+integrative+and+comparative+physiology%22%5BJournal%5D)">A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension.</a> American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).</li>
<li>Machnik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+regulate+salt-dependent+volume+and+blood+pressure+by+a+vascular+endothelial+growth+factor-C-dependent+buffering+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism.</a> Nat Med. 15, 545-552 (2009).</li>
<li>Kopp, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((23Na+magnetic+resonance+imaging-determined+tissue+sodium+in+healthy+subjects+and+hypertensive+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients.</a> Hypertension. 61, 635-640 (2013).</li>
<li>Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+isolevuglandins+in+immunity%2C+inflammation%2C+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).</li>
<li>Kirabo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC+isoketal-modified+proteins+activate+T+cells+and+promote+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension.</a> J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).</li>
<li>McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+immunity%2C+and+hypertensive+end-organ+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage.</a> Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).</li>
<li>Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+adaptive+immune+system+in+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of the adaptive immune system in hypertension.</a> Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).</li>
<li>Madhur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+17+promotes+angiotensin+II-induced+hypertension+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction.</a> Hypertension. 55, 500-507 (2010).</li>
<li>Harrison, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+immunity%2C+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Inflammation, immunity, and hypertension.</a> Hypertension. 57, 132-140 (2011).</li>
<li>Crowley, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+lymphocyte+responses+by+angiotensin+II+promotes+kidney+injury+in+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Renal+physiology%22%5BJournal%5D)">Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension.</a> American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).</li>
<li>Zhang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+type+1+angiotensin+receptors+on+T+lymphocytes+to+limit+target+organ+damage+in+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension.</a> Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W obecnym protokole zoptymalizowaliśmy procedury izolowania DC CD11c + ze śledziony myszy i adoptywnego przenoszenia ich do naiwnych zwierząt w celu zbadania roli DC w nadciśnieniu wywołanym solą. Protokół ten można dostosować do izolowania i adoptywnego przenoszenia innych podzbiorów komórek odpornościowych, w tym makrofagów, monocytów i adaptacyjnych komórek odpornościowych, w tym limfocytów T i B. Zoptymalizowaliśmy proces trawienia śledziony, aby osiągnąć odpowiednią przeżywalność komórek i stabilność mark...

Nadmiar soli w diecie jest głównym czynnikiem ryzyka nadciśnienia. 1,2 Amerykańskie Towarzystwo Kardiologiczne zaleca jednak maksymalne spożycie 2 300 miligramów (mg) sodu (Na+) dziennie; mniej niż 10% populacji USA przestrzega tego zalecenia. 3,4 Niewielkie zmniejszenie spożycia Na+ obniża ciśnienie krwi i zmniejsza roczną liczbę nowych przypadków choroby niedokrwiennej serca i udaru mózgu w USA o 20%. 5 Głównym problemem związanym z nadmiernym spożyciem soli jest to, że 50% populacji z nadciśnieniem tętniczym wykazuje wrażliwość na sól, zdefiniowaną jako wzrost ciśnienia krwi o 10 mmHg po obciążeniu Na+ lub podobny spadek ciśnienia krwi po ograniczeniu Na+ i diurezie. 6 Wrażliwość na sól występuje również u 25% osób z prawidłowym ciśnieniem i jest niezależnym predyktorem zgonów i zdarzeń sercowo-naczyniowych. 7,8 Mechanizmy wykrywania soli w nadciśnieniu obejmującym nerki zostały dobrze zbadane; jednak ostatnie badania sugerują, że komórki odpornościowe mogą wyczuwać Na+. 9,10
Ostatnie dowody sugerują, że zmiany w obchodzeniu się z Na+ przez nerki mogą powodować akumulację Na+ w śródmiąższu i sprzyjać stanom zapalnym. 11,12 Nasze laboratorium i inne wykazały, że komórki zarówno wrodzonego, jak i nabytego układu odpornościowego przyczyniają się do zaostrzenia nadciśnienia. 9,13,14,15 Różne bodźce nadciśnieniowe, w tym angiotensyna II, noradrenalina i sól, powodują, że makrofagi, monocyty i limfocyty T przenikają do nerek i naczyń krwionośnych oraz sprzyjają zatrzymywaniu Na+, zwężeniu naczyń krwionośnych, podwyższeniu ciśnienia krwi i uszkodzeniu narządów końcowych. 9,16,17,18,19,20 We wcześniejszych badaniach odkryliśmy, że DC gromadzą addukty białka izolewukleryny (IsoLG) w odpowiedzi na różne bodźce nadciśnieniowe, w tym angiotensynę II i nadciśnienie solne DOCA. 14 IsoLGs są wysoce reaktywnymi produktami peroksydacji lipidów, które szybko i kowalencyjnie przekształcają się w lizyny na białkach, a ich akumulacja jest związana z aktywacją DC. 14 Niedawno ustaliliśmy, że podwyższony poziom Na+ jest silnym bodźcem do tworzenia adduktów białka IsoLG w mysich DCs.9 Wejście Na+ do DC odbywa się za pośrednictwem transporterów wrażliwych na amilorydy. Na+ jest następnie wymieniany na wapń (Ca2+) przez wymiennik Na+/Ca2+. Ca2+ aktywuje kinazę białkową C (PKC), która aktywuje oksydazę NADPH, prowadząc do zwiększonego tworzenia ponadtlenków (O2·-) i białka IsoLG. 9 Adoptywny transfer DC narażonych na sól powoduje nadciśnienie w odpowiedzi na subpresorową dawkę angiotensyny II. 9
Identyfikacja DC11c+ z tkanek była wcześniej ograniczona do immunohistochemii i RT-PCR, a izolacja DC była ograniczona do sortowania komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Chociaż sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej jest potężną metodą izolacji komórek odpornościowych, jest kosztowne, czasochłonne i prowadzi do niskiej wydajności żywych komórek. Dlatego zoptymalizowaliśmy krok po kroku protokół trawienia tkanek, stymulacji in vitro i adoptywnego transferu CD11c+ DC w celu zbadania nadciśnienia.

<table><tbody><tr><td>APC/Cy7 Anti-Mouse CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117324</td><td></td></tr><tr><td>bufor uruchomiony autoMACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>CD11c Mikrokulki Ultrapure&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-108-338</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS bez wapnia i magnezu</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>&nbsp; 130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-mysz CD45</td><td>Biolegend</td><td>103108</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C rurka</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>Dysocjator GentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Protokół użytkowania: Śledziona 04.01</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD zestaw do naprawy fioletowych barwników martwych komórek</td><td>Invitrogen</td><td>L34964</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolumny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separator QuadroMAC&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 średni&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

izolacja i transfer adoptywny komórek dendrytycznych prezentujących antygen traktowany wysoką solą

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Nadmierne spożycie soli w diecie przyczynia się do stanu zapalnego i odgrywa istotną rolę w rozwoju nadciśnienia. Wcześniej odkryliśmy, że komórki dendrytyczne (DC) prezentujące antygen mogą wyczuwać podwyższony poziom sodu zewnątrzkomórkowego, co prowadzi do aktywacji oksydazy NADPH i tworzenia adduktów białka izolewuglandyny (IsoLG). Te addukty białka IsoLG reagują z własnymi białkami i promują stan podobny do autoimmunologicznego i nadciśnienia. Opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy najnowocześniejsze metody badania funkcji DC w nadciśnieniu tętniczym. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji, leczenia in vitro z podwyższonym poziomem sodu i adoptywnego transferu mysich komórek CD11c + śledziony do myszy biorców w celu zbadania ich roli w nadciśnieniu.

Rysunek 1 przedstawia schemat opisanych powyżej kroków. Izolowane śledziony mysie są poddawane sortowaniu komórek CD11c+ DCs za pomocą magnetycznego sortowania komórek, a następnie wysiewane w pożywce z normalnym stężeniem soli (NS; 150 mmol NaCl) lub pożywce z wysokim stężeniem soli (HS; 190 mmol NaCl) na 48 h. Następnie komórki CD11c+ DCs są adoptywnie przenoszone poprzez wstrzyknięcie do żyły ocznej do naiwnych myszy biorców. Dziesięć...

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek dendrytycznych z mysich śledzion, poprzez magnetyczne sortowanie komórek, a następnie transfer adoptywny do naiwnych myszy. Model komórek dendrytycznych aktywowanych solą został wybrany, aby wyjaśnić krok po kroku procedury adoptywnej cytometrii transferowej i przepływowej.

Izolacja i transfer adoptywny komórek dendrytycznych prezentujących antygen traktowany wysoką solą

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nadciśnienia tętniczego i chorób sercowo-naczyniowych, w tym badania komórek dendrytycznych CD11c dodatnich i tego, jak zwiększają one rolę uszkodzenia nadciśnieniowego. Główną zaletą tej techniki jest izolacja komórek dendrytycznych CD11c dodatnich z narządów litych oraz badanie ich fizjologicznej roli w różnych stanach chorobowych. Tak więc proces ten można zastosować do wielu typów komórek odpornościowych, w tym limfocytów B, limfocytów T, monocytów i makrofagów.Wizualizacja techniki ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia izolacji komórek dendrytycznych, a w szczególności procesu transferu adoptywnego do myszy biorców. Na początek spryskaj klatkę piersiową i boki uśpionej myszy 70% etanolem. Po lewej stronie ostrożnie otwórz skórę i jamę otrzewnej, aby odsłonić śledzionę.Za pomocą małych kleszczy ostrożnie przesuń jelita i wątrobę na lewą stronę myszy. Następnie za pomocą małych nożyczek delikatnie wyciąć śledzionę. Umieść każdą wyciętą śledzionę w oznakowanej rurce C zawierającej trzy mililitry pożywki RPMI 1640.Najpierw dodaj kolagenazę D i DNazę do przygotowanej pożywki RPMI 1640, aby przygotować roztwór do trawienia śledziony. Umieść probówkę C na półautomatycznym homogenizatorze i upewnij się, że probówka jest szczelnie umieszczona na obracającym się ramieniu. Naciśnij przycisk start na homogenizatorze, aby uruchomić protokół śledziony 04.01 na 60 sekund.Następnie odłączyć probówkę od homogenizatora i inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w trybie ciągłym z prędkością 20 obr./min przez 15 minut. Następnie za pomocą pipety przenieś roztwór do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów po przefiltrowaniu go przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Umyj sitko 10 mililitrami dPBS.Odwirować komórki w temperaturze 300 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie całkowicie odessać supernatant i umyć osad, ponownie zawieszając go w 10 mililitrach dPBS. Odwirować zawiesinę w temperaturze 300 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach dPBS. Użyj hemocytometru i wykluczenia błękitu trypanowego, aby policzyć liczbę komórek. Następnie odwirować w temperaturze 300 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, aby granulować komórki.Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 400 mililitrach magnetycznie aktywowanego buforu do sortowania komórek. Następnie dodaj 100 mililitrów mikrogranulek CD11c na 100 milionów komórek. Zwiruj zawiesinę komórkową i inkubuj przez 10 minut w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie dodaj 10 mililitrów buforu MAC, aby umyć komórki i odwirować w temperaturze 300 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mililitrach buforu MAC. Umieść kolumnę LS w polu magnetycznym separatora magnetycznego i umieść stożkową rurkę o pojemności 15 mililitrów pod każdą kolumną, aby zebrać przepływ.Następnie przepłukać kolumny trzema mililitrami buforu. Umieść zawiesinę komórek na każdej kolumnie i zbierz przepływ, przez który zawiera nieoznakowane komórki. Umyj kolumny trzema mililitrami buforu MAC i zbierz nieoznakowane komórki, które przez nie przechodzą.Umyj kolumny LS jeszcze dwa razy, używając trzech mililitrów buforu MAC na mycie. Następnie wyjmij kolumny LS z separatora magnetycznego. Dodaj pięć mililitrów bufora MAC do każdej kolumny i natychmiast zanurz każdą kolumnę w przezroczystej stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów, aby wypłukać magnetycznie oznakowane komórki.Użyj hemocytometru i wykluczenia błękitu trypanowego, aby określić dodatnią liczbę DC CD11c, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie rozcieńczyć próbkę komórki w rozcieńczeniu jeden do jednego w 0,4% roztworze błękitu trypanowego. Najpierw przygotuj osady komórkowe w pożywce hodowlanej DC, jak opisano w protokole tekstowym.Odpipetować 900 mikrolitrów zawiesiny DC do 24-dołkowej płytki sokoła z płaskim dnem. Dodać 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej prądu stałego o wysokiej zawartości soli do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie sodu 190 milimolów. Oznacz płytkę i umieść ją w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 48 godzin.Po 48 godzinach wyjąć płytkę z inkubatora. Odpipetować pożywkę do hodowli komórkowych w jednym dołku w górę iw dół, aby ponownie zawiesić dodatnie DC CD11c. Przenieś całą tę zawiesinę do odpowiednio oznakowanej probówki o pojemności 1,6 mililitra.Powtórz to dla każdej pojedynczej studzienki, która została platerowana. Odwirować wszystkie probówki w temperaturze 300 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad prądu stałego za pomocą 100 mikrolitrów sterylnego dPBS.Następnie pobierz roztwór prądu stałego z jednej z probówek do jednomililitrowej strzykawki, wyposażonej w półcalową igłę o rozmiarze 27. Umieść naiwnego 10-tygodniowego samca myszy C57-black-6 pod 2% izofluranem, aby uzyskać stabilną płaszczyznę chirurgiczną. Sprawdź poziom znieczulenia przy braku odruchu pedałowania.Po uzyskaniu stabilnej płaszczyzny operacyjnej powoli i ostrożnie wprowadź igłę do przestrzeni zadoczodołowej pod kątem około 30 stopni. Powoli i płynnie wstrzykuj dodatnie zawieszenie DC CD11c. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy ostrożnie wyjąć igłę z miejsca zadoczodołowego, uważając, aby nie uszkodzić oka.Następnie wyjmij myszy ze stożka nosowego i monitoruj je przez około 30 minut podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Typowa analiza ciśnienia krwi jest pokazana tutaj po adoptywnym przeniesieniu DC i mini pomp osmotycznych, które zostały wszczepione do infuzji małych dawek angiotensyny II. Należy zauważyć, że ta niska dawka angiotensyny II jest dawką supresorową, która nie zwiększa ciśnienia krwi u normalnej myszy.Myszy, które otrzymują normalne DC CD11c leczone solą, utrzymują normalne ciśnienie krwi podczas infuzji, podczas gdy myszy, które otrzymują CD11c dodatnie DC leczone solą, wykazują wzrost skurczowego ciśnienia krwi. Następnie przeprowadza się analizę cytometrii przepływowej przy użyciu pokazanej tutaj strategii bramkowania w celu określenia czystości izolowanych komórek CD11c dodatnich. Obserwuje się zwiększone wzbogacenie komórek CD11c dodatnich w porównaniu z całkowitymi splenocytami.Różne stężenia mikrokulek CD11c są wykorzystywane do rozwiązywania problemów z protokołem producenta. Magnetyczne oddzielenie splenocytów za pomocą 100 mikrolitrów mikrogranulek daje około 65% komórek CD11c dodatnich, podczas gdy użycie 200 mikrolitrów daje 55%, a użycie 300 mikrolitrów daje 50%Bloker FcR jest dołączony wraz ze 100 mikrolitrami mikrogranulek. Po separacji magnetycznej blokada FcR daje około 65% komórek CD11c dodatnich.Niektóre splenocyty są następnie inkubowane ze 100 mikrolitrami mikrogranulek i magnetycznie rozdzielane przez kolumnę LS. Oddzielone komórki inkubuje się z dodatkowymi 100 mikrolitrami CD11c i ponownie rozdziela przez kolumnę LS. Ten proces podwójnej izolacji dał 92% komórek CD11c dodatnich.Podczas próby tej procedury ważne jest, aby potwierdzić czystość wyizolowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Po izolacji magnetycznej komórek dendrytycznych można je hodować w celu określenia ich stanu aktywacji za pomocą technik molekularnych, w tym proteomiki i sekwencjonowania pojedynczych komórek. Od czasu jego opracowania możliwe jest obecnie badanie funkcji i specyficznej roli komórek dendrytycznych w nadciśnieniu.Naukowcy badają obecnie specyficzne antygeny w nadciśnieniu.

isolation-adoptive-transfer-high-salt-treated-antigen-presenting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Opisano nową metodę indukcji i ekspansji antygenowo swoistych limfocytów T, niezależną od komórek dendrytycznych (DC). Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) oparte na HLA A2-Ig są ładowane peptydami ograniczonymi przez HLA-A2 w celu efektywnej ekspansji CTL o różnej swoistości antygenowej. Technologia ta wykazuje duży potencjał w zastosowaniu w immunoterapii adoptywnej opartej na CTL.

Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo

Ten film demonstruje metodę przekształcania komórek dendrytycznych (DC) w tolerogenne DC (TolDCs) za pomocą immunomodulującego środka farmakologicznego. Konwersja ta jest potwierdzana przez ocenę funkcji TolDC poprzez ich immunosupresyjne działanie na limfocyty T CD4 +.

Wpływ immunomodulującego środka farmakologicznego na interakcję między komórkami dendrytycznymi a limfocytami T CD4+

Ten film demonstruje procedurę adoptywnego transferu komórek dendrytycznych (DC) o wysokiej zawartości soli do myszy. Mysie komórki dendrytyczne CD11c+ (DC) są wystawione na działanie pożywki zawierającej duże ilości sodu, tworząc w komórkach addukty białka izolewuglandyny (IsoLG). Te addukty służą jako neoantygeny i są prezentowane na powierzchni DC. Komórki potraktowane wysoką solą są wstrzykiwane myszom poprzez adoptywny transfer komórek.

Metoda leczenia komórek dendrytycznych o wysokiej zawartości soli i ich adoptywnego transferu do myszy

Opisano najczęściej używaną metodę generowania dużej liczby autologicznych komórek dendrytycznych (DC) do wykorzystania w immunoterapii nowotworów.  Metoda wykorzystuje IL-4 i GM-CSF do różnicowania DC od monocytów.  Niedojrzałe DC są stymulowane do dojrzewania, a następnie ładowane antygenami przed wstrzyknięciem z powrotem pacjentowi.

Przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem nowotworowym do immunoterapii

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Tutaj prezentujemy protokół do indukcji indukcji regulatorowych limfocytów T in vivo. W tym protokole komórki dendrytyczne są modyfikowane tak, aby lokalnie wytwarzały wysokie stężenia aktywnej witaminy D (1,25-dihydroksywitaminy D lub 1,25[OH]2D) i aktywnej witaminy A (kwas retinowy lub RA) de novo.

Augmentacja in vivo indukcji regulatorowych limfocytów T naprowadzających się na jelita

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Poznaj izolację komórek dendrytycznych CD11c+ z śledziony myszy metodą sortowania magnetycznego oraz transfer adoptywny do myszy biorczych. Technika umożliwia badanie roli immunologicznej w nadciśnieniu.

Izolacja i transfer adoptywny komórek dendrytycznych prezentujących antygen traktowany wysoką solą

Przeglądaj więcej filmów