Zastosowanie technologii jednołańcuchowej MHC do badania koagonizmu w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8 +
February 28th, 2019
Ten protokół opisuje użycie jednołańcuchowych kompleksów MHC klasy I do badania interakcji molekularnych w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8+: generowanie zmodyfikowanych komórek prezentujących antygen wyrażających konstrukty jednołańcuchowe, hodowla klonu ludzkich komórek T CD8+ i eksperymenty z aktywacją limfocytów T.
Niestymulujące peptydowe kompleksy MHC nie aktywują limfocytów T, ale mogą wzmacniać odpowiedzi limfocytów T na agonistyczny peptyd MHC. Protokół ten opisuje eksperymentalny system do badania koagonizmu podczas aktywacji ludzkich limfocytów T CD8. Cząsteczki MHC wyrażamy jako jednołańcuchowe kompleksy z kowalencyjnie połączonym łańcuchem ciężkim, beta-2-mikroglobuliną i peptydem.
Pozwala to na wprowadzanie mutacji do cząsteczek MHC prezentujących z góry określone peptydy. Protokół ten wykorzystuje ludzki klon CTN, specyficzny dla epitopu wirusa zapalenia wątroby typu B. Zrozumienie mechanizmu koagonizmu podczas odpowiedzi limfocytów T przeciwko zapaleniu wątroby może przyczynić się do opracowania leków immunotropowych przeciwko tej infekcji wirusowej.
Przedstawione metody mogą być wykorzystane w badaniach i innych fundamentalnych aspektach aktywacji limfocytów T w układach ludzkich limfocytów T o znanej swoistości peptydowej MHC. Protokół ten wykorzystuje jednołańcuchowe ludzkie cząsteczki MHC klasy I, składające się z sekwencji sygnałowej, peptydu będącego przedmiotem zainteresowania, łącznika, ludzkiego łącznika beta-2-mikroglobuliny i łańcucha ciężkiego MHC. Peptyd E1A3 z wirusowego zapalenia wątroby typu B jest stosowany jako peptyd agonistyczny.
Knebel z HIV jest stosowany jako peptyd niestymulujący. Jednołańcuchowe ludzkie cząsteczki MHC ulegają ekspresji w linii komórkowej chomika zawierającej represor tetracykliny. Agonista jednołańcuchowego MHC ulega ekspresji za pomocą plazmidu indukowanego tetracykliną, co skutkuje bardzo niskimi poziomami ekspresji przy braku tetracykliny i wysokimi poziomami ekspresji w obecności tetracykliny.
Komórki CHO wykazujące niską ekspresję peptydu agonistycznego MHC są transfekowane konstytutywnie eksprymowanym peptydem niestymulującym MHC. Zastosowanie tego eksperymentalnego systemu pozwala na porównanie odpowiedzi limfocytów T na agonistyczny peptyd MHC w obecności lub braku niestymulującego peptydu MHC. Aby rozpocząć tę procedurę, hoduj komórki CHO w kolbie T-75, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
W dniu poprzedzającym eksperyment z aktywacją limfocytów T umyj komórki w kolbie PBS. Dodaj roztwór zawierający 05% trypsyny i 2% EDTA w PBS i inkubuj przez pięć do dziesięciu minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą mikroskopu świetlnego obserwuj komórki, aby upewnić się, że się odłączyły.
Następnie dodaj cały F12 do kolby, aby zatrzymać trypsynizację. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Wirować w temperaturze 400G przez pięć minut i usunąć supernatant przez pipetowanie lub dekantację.
Ponownie zawiesić osad ogniwa w pięciu mililitrach pełnego F12. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki i dostosuj stężenie komórek do 200 000 komórek na mililitr w CF12. Dodać od 50 do 60 nanogramów na mililitr tetracykliny do próbek zawierających tylko agonistów, aby indukować duże ilości agonistycznej ekspresji pMHC klasy I jako kontroli pozytywnej.
Następnie wymieszać komórki CHO przez wirowanie lub pipetowanie. Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.
Dzień przed eksperymentem odwiruj komórki CTLS w temperaturze 400 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki i ponownie zawiesić je z gęstością miliona komórek na mililitr w kompletnej pożywce ludzkich komórek T bez cytokin lub PHA. Inkubuj CTL przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.
Następnego dnia odwiruj limfocyty T w temperaturze 400 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 2 mililitrach kompletnej pożywki bez surowicy. Użyj hemocytometru, aby policzyć limfocyty T i dostosuj ich gęstość do miliona żywych komórek na mililitr w kompletnej pożywce dla ludzkich komórek T.
Dodać przeciwciało anty-ludzkie CD107a w rozcieńczeniu jeden do 100 i Brefeldin A w rozcieńczeniu jeden do 1000. Następnie wyjmij 96-dołkową płytkę zawierającą komórki CHO. Za pomocą szklanej pipety Pasteura odessać pożywkę z komórek CHO.
Dodaj 200 mikrolitrów zawiesiny limfocytów T do każdej studzienki. Jednoczesna hodowla limfocytów T z komórkami CHO w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy do czterech godzin. Pod koniec kohodowli odwirować 96-dołkową płytkę w temperaturze 400 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.
Usunąć supernatant przez zasysanie lub przesuwanie. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra przeciwciał CD3 i 2,5 mikrolitra przeciwciał CD8 w 50 mikrolitrach 5% BSA w PBS do każdej studzienki w celu barwienia antygenu na powierzchni komórki i wymieszaj przez pipetowanie. Próbki należy inkubować w ciemności, na lodzie przez 30 minut.
Następnie dodaj 150 mikrolitrów buforu do płukania do każdej studzienki, aby umyć próbki. Odwirować próbki w temperaturze 400 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Usunąć supernatant przez zasysanie lub przesuwanie.
Przygotuj zestaw do utrwalania/przepuszczalności i dodaj 100 mikrolitrów roztworu do utrwalania/przepuszczalności do każdej studzienki i pipetę do wymieszania. Inkubować na lodzie przez 20 minut. Następnie odwiruj płytkę w temperaturze 400 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.
Wyrzuć supernatant i dodaj 200 mikrolitrów 1X buforu do trwałej ondulacji/płukania do każdej studzienki. Powtórz ten proces od odwirowania do jednokrotnego dodania buforu do trwałej ondulacji/płukania. Następnie ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach buforu do trwałej ondulacji/płukania zawierającego anty-interferon-gamma w stężeniu 3 mikrogramów na mililitr.
Inkubować na lodzie w ciemności przez 30 minut. Następnie dodaj 150 mikrolitrów 1X buforu do trwałej ondulacji/prania. Wirować w temperaturze 400G, cztery stopnie Celsjusza, przez pięć minut.
Usuń supernatant i dodaj 200 mikrolitrów 1X buforu do trwałej ondulacji/płukania. Ponownie odwirować płytkę w temperaturze 400 razy G, cztery stopnie Celsjusza, przez pięć minut i usunąć supernatant przez zasysanie lub trzepanie. Ponownie zawiesić próbkę w 200 mikrolitrach buforu do przemywania i przystąpić do analizy cytometrycznej.
Na dzień przed eksperymentem wymieszaj komórki CHO przez wirowanie lub pipetowanie. Następnie dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdego dołka 12-dołkowej płytki. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.
W dniu eksperymentu użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć komórki CHO od dna każdej studzienki. Przenieś jeden mililitr pożywki zawierającej komórki z każdej studzienki do probówek FACS. Wirować w temperaturze 400 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.
Ponownie zawiesić w 100 mikrolitrach przeciwciała anty-HLA rozcieńczonego w buforze do płukania. Inkubować na lodzie przez 30 minut. Następnie dodaj jeden mililitr buforu do przemywania do każdej próbki CHO.
Odwirować w temperaturze 400 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić każdą próbkę w 3 mililitrach buforu do przemywania i przystąpić do analizy cytometrii przepływowej. W tym badaniu przedstawiono solidne narzędzie do badania interakcji molekularnych podczas aktywacji ludzkich limfocytów T CD8-dodatnich.
Generowany jest zmodyfikowany system ksenogenny, który wykazuje niski poziom agonistycznego pMHC w obecności lub braku koagonisty pMHC. Te zmodyfikowane APC są następnie wykorzystywane do stymulacji klonu ludzkich limfocytów T CD8-dodatnich specyficznych dla E183. Nietransfekowane komórki CHO i komórki CHO, które wyrażają niestymulujący jednołańcuchowy kompleks Gag-MHC, nie indukują aktywacji.
Ekspresja wysokich poziomów agonistycznego jednołańcuchowego kompleksu E183-MHC, który jest kontrolą pozytywną, jest postrzegana jako indukująca bardzo wydajną produkcję interferonu-gamma i degranulację, co pokazuje, że jednołańcuchowy konstrukt E183 może być rozpoznany przez specyficzny TCR w celu aktywacji funkcji efektorowych limfocytów T. Ekspresja niskich poziomów jednołańcuchowego kompleksu E183-MHC indukuje niższe poziomy produkcji interferonu gamma i degranulacji, co zostało wzmocnione przez obecność niestymulującego kompleksu Gag-MHC. Należy zauważyć, że bardzo wysoki odsetek limfocytów T CD107a+ obserwuje się nawet w odpowiedzi na niskie poziomy antygenowego pMHC, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami.
Jednak obecność niestymulującego kompleksu Gag-MHC zwiększa CD107a MFI. Podczas tej procedury bardzo ważne jest kontrolowanie ekspresji peptydu agonistycznego MHC, aby zapewnić równą prezentację agonisty z peptydem niestymulującym lub bez niego. Kluczowe znaczenie ma ilościowe określenie ekspresji MHC peptydu agonistycznego przy użyciu przeciwciał podobnych do TCR w każdym eksperymencie.
Alternatywnym podejściem jest użycie podpartych dwuwarstw lipidowych lub kulek, prezentujących stałą ilość peptydu agonistycznego MHC w obecności peptydu niestymulującego MHC. Te eksperymentalne systemy powinny umożliwiać testowanie wielu niestymulujących sekwencji peptydowych pod kątem koagonizmu. Technologia jednołańcuchowego MHC może być wykorzystywana do badania interakcji molekularnych w aktywacji limfocytów T CD4, a także do badania nieklasycznych cząsteczek MHC.
W protokole tym wykorzystuje się ludzką krew i ludzkie komórki. Przestrzegaj wszystkich niezbędnych środków ostrożności podczas pracy z ludzką krwią, aby zmniejszyć ryzyko przeniesienia chorób przenoszonych przez krew.
Przegląd
Ten protokół opisuje zastosowanie pojedynczych kompleksów MHC klasy I do badania interakcji molekularnych w aktywacji ludzkich komórek T CD8+. Obejmuje on generowanie inżynieryjnych komórek prezentujących antygen oraz eksperymenty dotyczące aktywacji komórek T.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Immunologia
- Biologia komórek T
- Infekcje wirusowe
Tło
- Niestymulujące kompleksy peptydu MHC mogą zwiększyć odpowiedzi komórek T.
- To badanie koncentruje się na ko-agonizmie podczas aktywacji ludzkich komórek T CD8.
- Rozumienie tych mechanizmów może pomóc w opracowaniu immunotropów przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu B.
- Protokół wykorzystuje ludzką klonę CTN specyficzną dla epitope wirusa zapalenia wątroby typu B.
Cel badania
- Zbadanie roli pojedynczych cząstek MHC klasy I w aktywacji komórek T.
- Zbadanie wpływu agonistycznego i niestymulującego peptydu MHC na odpowiedzi komórek T.
- Przedstawienie szczegółowej metodologii badania mechanizmów aktywacji komórek T.
Zastosowane metody
- Ekspresja cząstek MHC jako pojedynczych kompleksów łańcuchowych.
- Hodowla komórek CHO i ludzkich kloni CTL.
- Współhodowla komórek T z inżynieryjnymi komórkami prezentującymi antygen.
- Analiza cytometryczna do oceny aktywacji komórek T.
Główne wyniki
- Udana ekspresja pojedynczych cząstek MHC w komórkach CHO.
- Wykazano efekty ko-agonizmu na aktywacji komórek T.
- Dostarczono wglądu w odpowiedzi komórek T na wirus zapalenia wątroby typu B.
- Ustanowiono niezawodny system eksperymentalny do dalszych badań.
Konkluzje
- Protokół skutecznie wyjaśnia mechanizmy aktywacji komórek T.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia odpowiedzi komórek T w infekcjach wirusowych.
- Potencjalne zastosowania w rozwoju immunoterapii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Investigating co-agonism in human CD8+ T cell activation provides mechanistic insights into how non-stimulatory peptide MHC complexes modulate immune responses, supporting target validation in immunotherapy development. This approach enables de-risking of T cell–engaging biologics by clarifying how antigen presentation dynamics influence effector functions such as cytokine production and degranulation. The system supports predictive confidence in early discovery by modeling physiological antigen presentation conditions relevant to antiviral and cancer immunotherapies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of T cell receptor signaling thresholds and co-stimulatory influences in a defined antigen presentation system.
- Operational Value: Uses inducible expression systems to titrate agonist pMHC levels, allowing controlled assessment of T cell activation potency.
- Predictive Value: Supports functional validation of TCR specificity and antigen sensitivity in human CD8+ T cell clones.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates quantitative measurement of T cell activation via intracellular cytokine staining (IFN-γ) and degranulation (CD107a) as orthogonal readouts.
- Operational Value: Employs standardized co-culture protocols in 96-well formats compatible with flow cytometry for reproducible, high-content analysis.
- Assay Readiness: Generates engineered antigen-presenting cells with defined pMHC density, enabling screening of immunomodulatory compounds or biologics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human-specific T cell responses using HLA-restricted epitopes, improving translatability from in vitro to preclinical models.
- Operational Value: Utilizes xenogeneic CHO cells to avoid endogenous MHC interference, ensuring precise control over presented antigens.
- Translational Continuity: Supports mechanistic de-risking of immunotherapies targeting viral antigens (e.g., HBV) or tumor-associated antigens.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, informing lead identification by validating target engagement and functional avidity of T cell–based therapeutics prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Tests how varying ratios of agonist to non-stimulatory pMHC affect T cell activation, clarifying immunological synapse dynamics.
- Screening: Enables standardized assessment of T cell responses under controlled antigen presentation, supporting hit validation in immunomodulator campaigns.
- Analytics: Delivers multiparametric flow cytometry data (cytokine production, degranulation) to quantify functional T cell responses across conditions.
- Translational Research: Uses human HBV-specific CTL clones to model antigen-specific responses relevant to immunotherapeutic development.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted to other peptide-MHC specificities, supporting reuse across multiple target validation projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in T cell activation by isolating variables in antigen presentation and co-agonist effects.
- Operational Value: Standardizes antigen-presenting cell generation and T cell co-culture, improving inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by predicting T cell responsiveness based on antigen density and co-agonist presence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of T cell–targeted candidates through quantitative functional profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, mammalian cell transfection, and flow cytometry.
- Dependent on inducible expression systems and antigen-specific T cell clones.
- Necessitates validation of pMHC surface expression using TCR-like antibodies to ensure consistent agonist presentation.
- Adaptable to other peptide sequences and MHC alleles, though re-optimization may be needed for new specificities.
- Limited by the need for primary or cloned human T cells with known specificity, which may constrain scalability.
