Budowa i zastosowanie komory do stymulacji elektrycznej w celu zwiększenia różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych/zrębowych in vitro
31 stycznia 2019
Tutaj prezentujemy protokół budowy komory do hodowli komórek, przeznaczonej do wystawiania komórek na różne rodzaje stymulacji elektrycznej, oraz jej zastosowanie w leczeniu mezenchymalnych komórek macierzystych w celu zwiększenia różnicowania osteogennego.
W tym miejscu pokazujemy, jak zbudować komorę do stymulacji elektrycznej przy użyciu zwykłych sześciościennych płytek hodowlanych i jak ją wykorzystać w celu stymulacji różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych. Ta komora jest łatwa i niedroga w budowie i może być ponownie wykorzystana w wielu eksperymentach. Po wstępnym poddaniu działaniu stymulacji elektrycznej w naszej komorze, mezenchymalne komórki macierzyste mogą być wykorzystane do poprawy wyników leczenia inżynierii tkanki kostnej.
Komora ta może być również używana do badania innych typów komórek i zachowań komórek wrażliwych elektroalergicznie, takich jak migracja, proliferacja, zmiany potencjału błonowego, apoptoza i ostrożne przyczepianie. W pokrywie z sześciodołkową płytką zaznacz a następnie wywierć dwa otwory o średnicy jednego milimetra, oddalone od siebie o 25 milimetrów, w pobliżu zewnętrznej krawędzi każdego z sześciu dołków. Następnie pokrój drut platynowy na 12 odcinków o długości pięciu centymetrów.
Ręcznie zegnij każdą pięciocentymetrową sekcję w kształt litery L, pozostawiając jeden koniec o długości trzech centymetrów, a drugi o długości dwóch centymetrów. Następnie przetnij drut pokryty srebrem na dwie 35-centymetrowe długości. Włóż dłuższy zagięty koniec drutu platynowego do wywierconego otworu, pozostawiając jeden do dwóch milimetrów wystających z zewnętrznej strony pokrywy.
Zegnij go za pomocą kleszczy. Następnie zabezpiecz platynowe druty w otworach pokrywy za pomocą kleju nadprzewodzącego i pozostaw je do wyschnięcia na około sześć godzin. Aby przygotować katody, końcówki wszystkich sześciu platynowych drutów wystających z pokrywy do jednego z drutów pokrytych srebrem.
Aby przygotować anody, pozostałe sześć drutów platynowych do innych drutów pokrytych srebrem. Następnie dodaj diody LED w obwodzie między każdą z sześciu par anoda-katoda platynowo-elektroda-elektroda, aby potwierdzić funkcjonalność. Umieść kawałek czarnej taśmy izolacyjnej pod każdą diodą LED, aby zapobiec wystawieniu komórek na płytkach hodowlanych na działanie światła LED.
Następnie przyklej złącze listwy zaciskowej przewodów do lewego górnego rogu pokrywy z sześciodołkową płytką i podłącz oba posrebrzane przewody do zacisków wejściowych. Następnie wytnij kwadratowy przekrój o wymiarach 20 milimetrów na 20 milimetrów od lewego górnego rogu drugiej pokrywy z sześciodołkową płytką, aby pomieścić złącze listwy zaciskowej na pierwszej pokrywie. Przykryj pierwszą pokrywę, wyposażoną w elektrody, drugą pokrywą i sklej je taśmą klejącą.
Podłącz jeden koniec dwóch standardowych izolowanych przewodów miedzianych do zacisków wyjściowych złącza przewodu, a drugi koniec do męskich złączy bananowych. Włącz zasilanie, naciskając przycisk ON-OFF na panelu przednim. Aktywuj kanał pierwszy, naciskając przycisk pierwszy.
Następnie naciśnij przycisk czwarty, aby ustawić napięcie. Ustaw wyjście obciążenia na 2.5 V. Następnie naciśnij Enter.
W dniu, w którym komórki są traktowane łodygą E, sterylizuj elektrody w 70% roztworze etanolu przez 30 minut. Następnie wysusz je pod światłem UV w komorze bezpieczeństwa przez dodatkowe 30 minut. W okapie z przepływem laminarnym przykryj sześciodołkową płytkę zawierającą hodowane MSCs pokrywką wyposażoną w elektrody, upewniając się, że elektrody są całkowicie zanurzone w pożywce.
Następnie przenieś zakrytą sześciodołkową płytkę z komórkami do inkubatora i podłącz jej przewody do zasilania. Następnie ustaw zasilacz na wyjście obciążenia 2,5 V i traktuj komórki łodygą E przez godzinę. Po stymulacji odłącz zasilanie i wyjmij komorę trzpienia E z inkubatora.
W sterylnych warunkach zastąp pokrywkę wyposażoną w elektrody standardową pokrywką z sześciodołkową płytką. Następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora i pozostaw je na noc. Oczyść elektrody, najpierw PBS, a następnie 70% roztworem etanolu.
Następnie oczyść nagromadzone produkty korozji z powierzchni elektrody drobnym papierem ściernym. Powtarzaj zabieg z łodygą E przez sześć kolejnych dni. W czwartym dniu, przed zastosowaniem stymulacji elektrycznej i w sterylnych warunkach, zmień pożywkę hodowlaną, odsysając 1,5 mililitra pożywki i zastępując ją 1,5 mililitra wstępnie podgrzanej, świeżej pożywki do różnicowania osteogennego.
Po zastosowaniu stymulacji elektrycznej przez siedem kolejnych dni, utrzymuj komórki w hodowli przez dodatkowe siedem dni, wymieniając pożywkę co trzy do czterech dni. Po zakończeniu leczenia przeanalizuj zmiany morfologii komórek pod mikroskopem. Aby ocenić wpływ stymulacji elektrycznej na różnicowanie osteogenne MSC, należy zmierzyć odkładanie się wapnia, aktywność fosfatazy alkalicznej i ekspresję genów markerów osteogennych, jak opisano w innym miejscu.
Aby ocenić wpływ stymulacji elektrycznej 100 miliwoltów na milimetr na różnicowanie osteogenne MSC, komórki poddawane stymulacji elektrycznej przez trzy, siedem i 14 dni oraz komórki nieleczone analizowano w 14. dniu hodowli, oceniając zmiany morfologiczne i odkładanie się wapnia. Znaczące zmiany w morfologii komórek i złogach wapnia były widoczne w komórkach poddanych stymulacji elektrycznej przez siedem i 14 dni. Szczegółową analizę zmian ekspresji genów markerów osteogennych przeprowadzono w trzecim, siódmym i czternastym dniu hodowli.
W siódmym dniu hodowli ekspresja RunX2 była znacznie wyższa w komórkach poddanych stymulacji elektrycznej przez siedem dni. Podczas gdy ekspresja Colla1 była znacznie wyższa w komórkach traktowanych przez siedem dni, mierzona w 14 dniu hodowli. Ekspresja osteopontyny była znacznie zwiększona w komórkach stymulowanych elektrycznie w trzecim, siódmym i czternastym dniu hodowli.
Ekspresja Osterix była nieobecna w komórkach kontrolnych we wszystkich punktach czasowych i była obserwowana tylko po siedmiu i 14 dniach hodowli w komórkach wystawionych na stymulację elektryczną. Komora do stymulacji elektrycznej jest stosunkowo łatwa do zbudowania. Należy jednak zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z drutami platynowymi, a także podczas czyszczenia i sterylizacji elektrod.
Komórki wstępnie poddane elektryczności w naszej komorze, samodzielnie lub osadzone na materiale rusztowania, mogą być wszczepione do modeli zwierzęcych, aby zbadać, jak pozytywny efekt stymulacji elektrycznej utrzymuje się in vitro. Technika ta zapewnia proste, ale potężne narzędzie do badania mechanizmu, za pomocą którego stymulacja elektryczna reguluje funkcje komórek. Wiedza ta może być dostępna w komórkach medycyny regeneracyjnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół konstrukcji komory do stymulacji elektrycznej w hodowlach komórkowych, zaprojektowanej specjalnie w celu zwiększenia różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych. Komora jest ekonomiczna, wielorazowa i może być wykorzystywana w różnych eksperymentach dotyczących zachowań komórek wrażliwych na impulsy elektryczne.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Hodowla komórkowa
- Stymulacja elektryczna
- Różnicowanie komórek macierzystych
Wstęp
- Mesenchymalne komórki macierzyste mogą podlegać wpływowi stymulacji elektrycznej.
- Różnicowanie osteogenne jest kluczowe dla inżynierii tkanki kostnej.
- Istniejące metody stymulacji mogą być złożone lub kosztowne.
- Niniejszy protokół ma na celu uproszczenie procesu stosowania stymulacji elektrycznej.
Cel badania
- Budowa prostej i wielokrotnego użytku komory do stymulacji elektrycznej.
- Zwiększenie różnicowania osteogenicznego w mezenchymalnych komórkach macierzystych.
- Zapewnienie narzędzia do badania różnych zachowań komórek wrażliwych na bodźce elektryczne.
Zastosowane metody
- Konstrukcja komory stymulacyjnej przy użyciu sześciodołkowych płytek hodowlanych.
- Zaznaczenie i wywiercenie otworów w pokrywie płytki hodowlanej w celu uzyskania dostępu elektrycznego.
- Wykorzystanie drucików platynowych do stymulacji elektrycznej.
- Zastosowanie stymulacji elektrycznej w odniesieniu do mezenchymalnych komórek macierzystych.
Główne wyniki
- Skuteczna konstrukcja niskokosztowej komory do stymulacji elektrycznej.
- Zwiększone różnicowanie osteogeniczne zaobserwowane w traktowanych mezenchymalnych komórkach macierzystych.
- Potencjał do ponownego wykorzystania w wielu eksperymentach.
- Możliwość zastosowania w przypadku innych typów komórek i procesów komórkowych.
Wnioski
- Komora do stymulacji elektrycznej jest skutecznym narzędziem badawczym.
- Może ona poprawić wyniki w inżynierii tkanki kostnej.
- Dalsze badania mogą zgłębić jej zastosowanie w odniesieniu do różnych typów komórek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Komory do stymulacji elektrycznej mezenchymalnych komórek macierzystych/stromalnych (MSCs) stanowią skalowalną i powtarzalną platformę do badania mechanizmów różnicowania osteogenicznego istotnych dla inżynierii tkanki kostnej. Możliwość ta pozwala na wczesne ograniczanie ryzyka w strategiach regeneracyjnych opartych na komórkach i zwiększa pewność prognostyczną w procesach translacyjnych. Takie podejście ułatwia podejmowanie decyzji portfelowych poprzez dostarczenie zestandaryzowanych, ilościowych odczytów potencjału osteogenicznego MSC w określonych warunkach stymulacji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną ocenę wpływu sygnałów elektrycznych na szlaki różnicowania MSC.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację wpływu stymulacji elektrycznej na ekspresję markerów osteogennych.
- Zapewnia funkcjonalną walidację MSC jako źródła komórek do zastosowań w regeneracji kości.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Umożliwia przygotowanie powtarzalnych, elektrycznie prekondycjonowanych populacji MSC do dalszych analiz.
- Standaryzuje parametry stymulacji, aby zapewnić porównywalność testów i mierzalne wyniki.
- Umożliwia skalowalne przesiewanie materiałów rusztowaniowych lub związków chemicznych w połączeniu ze stymulacją elektryczną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica wyniki różnicowania in vitro z przedklinicznymi modelami gojenia kości poprzez naśladowanie fizjologicznego środowiska elektrycznego.
- Zapewnia ciągłość od etapu kondycjonowania komórek w fazie odkrycia po przedkliniczne badania implantacyjne.
- Stanowi platformę do oceny trwałości efektów pro-osteogennych po stymulacji.
Integracja potoków przetwarzania i przepływu pracy
Ta komora do stymulacji elektrycznej integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących różnicowania osteogenicznego MSC oraz wspierając wybór wiodących kandydatów dla programów medycyny regeneracyjnej.
- Biologia odkryć: Umożliwia kontrolowane testowanie hipotezy zerowej w zakresie wpływu stymulacji elektrycznej na decyzje o losach MSC.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary odkładania wapnia i ekspresji genów osteogennych.
- Analityka: Wspiera porównanie statystyczne grup traktowanych z grupami kontrolnymi w celu rzetelnej interpretacji danych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z modelami naprawy kości in vivo poprzez wstępne kondycjonowanie komórek przed implantacją.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Konstrukcja komory jest kosztowo efektywna, wielorazowa i adaptowalna do różnorodnych badań nad komórkami elektrowrażliwymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną strategii regeneracji kości opartych na MSC.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane, skalowalne i reprodukowalne przepływy pracy w zakresie kondycjonowania komórek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go dla kandydatów do terapii komórkowej poprzez dostarczanie rzetelnych danych funkcjonalnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację zasobów medycyny regeneracyjnej z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli komórkowych, protokołów stymulacji elektrycznej oraz analizy ilościowych testów analitycznych.
- Niezbędny jest dostęp do standardowej infrastruktury do hodowli komórkowych i podstawowej aparatury elektrycznej.
- Wymagane jest rygorystyczne czyszczenie i sterylizacja elektrod w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych źródeł MSC oraz materiałów rusztowań po optymalizacji protokołu.
- Staranne obchodzenie się z platynowymi drutami oraz walidacja parametrów stymulacji są niezbędne dla uzyskania spójnych wyników.
