Name: Budowa i zastosowanie komory do stymulacji elektrycznej w celu zwiększenia różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych/zrębowych in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj budowę komory do stymulacji elektrycznej w celu zwiększenia różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych. Ta metoda poprawia wyniki w inżynierii tkanki kostnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez AO Foundation Start-Up Grant (S-14-03H) oraz Fundację Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) z siedzibą we Frankfurcie nad Menem, Niemcy.

1. Konstrukcja komory do hodowli komórkowej z elektrostymulacją
<ol>
	<li>Aby zbudować komorę do EStim, należy zebrać dwie pokrywki standardowych płytek hodowlanych 6-dołkowych; drut platynowy o czystości 99,99%, o długości 60 cm i średnicy 0,5–1 mm; miedź powlekaną srebrem, o długości 70 cm i średnicy 0,6 mm; szczypce tnące; zestaw z lutownicą; jedną tubkę kleju nadprzewodzącego; jedną kostkę zaciskową do przewodów, sześć małych diod LED 2,2 V (opcjonalnie); jedną tubkę niekorozyjnego silikonowego spoiwa (opcjonalnie); jedną rolkę czarnej izolacyjnej taśmy elektrycznej; standardowy, elastyczny, izolowany miedziany przewód elektryczny (0,14 mm2), o długości 2 m (Tabela materiałów).</li>
	<li>W pokrywce płytki 6-dołkowej wyznaczyć i wywiercić dwa otwory (o średnicy ~1 mm), w odstępie 25 mm, blisko krawędzi zewnętrznej każdego z sześciu dołków (łącznie 12 otworów), jak pokazano na Rysunku 1A,B.</li>
	<li>Za pomocą szczypiec tnących odciąć dwanaście odcinków drutu platynowego o długości 5 cm. Każdy z drutów zgiąć ręcznie w kształt litery L, tak aby jeden koniec miał 3 cm, a drugi 2 cm. Odciąć drut powlekany srebrem na dwa odcinki po 35 cm.</li>
	<li>W każdy wywiercony otwór włożyć dłuższy (3 cm) zgięty koniec drutu platynowego (od wewnątrz na zewnątrz), pozostawiając 1–2 mm wystające na zewnątrz pokrywki, a następnie zgiąć go pęsetą. Przymocować druty platynowe w otworach pokrywki za pomocą kleju nadprzewodzącego i pozostawić do wyschnięcia na około 6 h.</li>
	<li>Przylutować końcówki wszystkich sześciu drutów platynowych (które później będą służyć jako katody, patrz Rysunek 1A) wystające z pokrywek do jednego z przewodów powlekanych srebrem. Powtórzyć tę procedurę, przylutowując pozostałe sześć drutów platynowych (które będą służyć jako anody) do drugiego przewodu powlekanego srebrem.
	<ol>
		<li>W obwodzie pomiędzy każdą z sześciu par elektrod platynowych anoda-katoda można dodać diody LED, aby potwierdzić funkcjonalność podczas eksperymentów (opcjonalnie). Pod każdą diodą LED umieścić kawałek czarnej taśmy izolacyjnej, aby zapobiec wystawieniu komórek w płytkach hodowlanych na światło LED (Rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykleić kostkę zaciskową do lewego górnego rogu pokrywki płytki 6-dołkowej i podłączyć oba przewody powlekane srebrem do terminali wejściowych, jak pokazano na Rysunku 1C.</li>
	<li>Wyciąć fragment o wymiarach 20 mm x 20 mm z lewego górnego rogu drugiej pokrywki płytki 6-dołkowej (Rysunek 1B, Pokrywka Nr 2), aby zrobić miejsce dla kostki zaciskowej na pierwszej pokrywce. Przykryć pierwszą pokrywkę, wyposażoną w elektrody, drugą pokrywką i skleić je taśmą klejącą.
	<ol>
		<li>Aby poprawić wiązanie obu pokrywek, można użyć silikonowego spoiwa (opcjonalnie). W tym celu pokryć pokrywkę z elektrodami srebrowymi warstwą spoiwa silikonowego o grubości 3–5 mm i przykryć ją drugą pokrywką, pozostawiając spoiwo do wyschnięcia przez 12 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłączyć jeden koniec dwóch standardowych izolowanych przewodów miedzianych do terminali wyjściowych złączki przewodów, a drugie końce do wtyków typu banan (4 mm). 
	UWAGA: Długość tych przewodów zależy od odległości między półką w inkubatorze, na której będą przechowywane komórki, a zasilaczem znajdującym się poza inkubatorem (Rysunek 1D).</li>
	<li>Dozę (napięcie) i schemat podawania EStim do komórek dostosować poprzez regulację zasilacza DC.
	<ol>
		<li>Włączyć zasilacz, naciskając przycisk ON/OFF na przednim panelu. Aktywować kanał 1, naciskając przycisk 1.</li>
		<li>Nacisnąć przycisk Nr 4 (V-set), aby ustawić napięcie. Nacisnąć przyciski 2, . i 5, aby ustawić wyjście obciążenia na 2,5 V. Nacisnąć Enter.</li>
		<li>Upewnić się, że wyjście obciążenia 2,5 V (2 500 mV) odpowiada EStim wynoszącemu 100 mV/mm, zgodnie z następującym uproszczonym równaniem: 
		VEStim = <img alt="Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, zawierający równania V/d dla analizy badań edukacyjnych." src="/files/ftp_upload/59127/59127eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie">; lub 
		V = VEStim × d 
		Gdzie V = napięcie wyjściowe zasilacza w miliwoltach; d = odległość między elektrodami w milimetrach; VEStim = napięcie stymulacji w miliwoltach na milimetr. 
		UWAGA: To uproszczenie ma zastosowanie tylko w przypadku stałego napięcia DC. Opór między medium a komórkami jest pomijalny, ponieważ elektrody nie mają bezpośredniego kontaktu z komórkami; zamiast tego EStim jest dostarczany do komórek poprzez medium.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych w medium osteogennym
<ol>
	<li>Należy zakupić i przechowywać dostępne komercyjnie MSC szczura (patrz Tabela Materiałów) w ciekłym azocie do dnia przeprowadzenia eksperymentu. Alternatywnie można wyizolować MSC z innych zwierząt zgodnie z protokołami opublikowanymi w innych źródłach7,8, zgodnie z lokalnymi regulacjami instytucjonalnymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych.</li>
	<li>W dniu eksperymentu należy wyjąć z przechowywania w ciekłym azocie jedną fiolkę (1 x 106 komórek) MSC i szybko (w ciągu 1 min) rozmrozić komórki w łaźni wodnej podgrzanej do 37 °C.
	<ol>
		<li>W warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza należy przenieść zawartość fiolki do probówki typu Falcon 50 mL i dodać 9 mL podgrzanego do 37 °C pożywki podstawowej (NM), składającej się z modyfikowanej pożywki Eagle'a Dulbecco (DMEM; 1x) z 10% inaktywowanym ciepłem płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem penicyliny/streptomycyny. Komórki należy osadzić przez 5 min w wirówce przy 300 x g.</li>
		<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy usunąć nadsącz i ostrożnie resuspendować osad komórkowy w 12 mL podgrzanej do 37 °C pożywki NM. Resuspendowane komórki należy przenieść do butelki hodowlanej T-75.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki należy hodować w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 5% O2 do momentu osiągnięcia konfluencji 80%–90% (po około 3–5 dniach).</li>
	<li>Należy przeprowadzić pasażowanie komórek. 
	UWAGA: Wszystkie operacje, z wyjątkiem wirowania i inkubacji, należy wykonywać w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
	<ol>
		<li>Po osiągnięciu konfluencji 80%–90% należy odzyskać komórki za pomocą roztworu do odrywania komórek. Należy odessać pożywkę hodowlaną, przemyć 2x 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), dodać 5 mL 1x roztworu do odrywania komórek i zwrócić komórki do inkubatora na 5 min.</li>
		<li>Po ododerwaniu komórek należy dodać taką samą ilość pożywki hodowlanej, aby zneutralizować roztwór do odrywania. Komórki należy zebrać do probówki typu Falcon 50 mL i wirować przy 300 x g przez 5 min.</li>
		<li>Należy usunąć pożywkę i resuspendować komórki w 1 mL świeżej pożywki podstawowej. Liczbę żywych komórek należy ocenić za pomocą barwienia błękitem trypanu.</li>
		<li>Należy zasiać 1 x 106 komórek w nowej butelce T-75 z 12 mL podgrzanej pożywki NM. Komórki należy hodować w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 5% O2 do momentu osiągnięcia konfluencji 80%–90%. 
		UWAGA: Pasażowanie komórek (kroki 2.4.1–2.4.4) można powtórzyć kilka razy, aż do uzyskania wymaganej liczby komórek. Nie należy używać komórek powyżej 8 pasażu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy zasiać 9 x 104 komórek w 3 mL NM (10% inaktywowana ciepłem płodowa surowica bydlęca, 1% penicylina/streptomycyna, DMEM) w każdym dołku 6-dołkowej płytki hodowlanej. Komórki należy inkubować przez 1 dzień w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 5% O2.</li>
	<li>Następnego dnia należy odessać pożywkę hodowlaną i nanieść 3 mL pożywki do różnicowania osteogenicznego (OM; pożywka podstawowa uzupełniona o 10-7 M dekzametazon, 10 mM β-glicerynofosforan i 0,05 mM askorbinian-2-fosforan).</li>
	<li>Płytkę 6-dołkową z komórkami należy umieścić w inkubatorze i inkubować w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 5% O2 przez noc.</li>
</ol>
3. Poddawanie MSC stymulacji elektrycznej (EStim)
<ol>
	<li>W dniu poddania komórek stymulacji elektrycznej (EStim), należy wysterylizować elektrody w 70% roztworze etanolu przez 30 min, a następnie suszyć je pod światłem UV w komorze bezpieczeństwa przez kolejne 30 min.</li>
	<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy przykryć płytkę 6-dołkową z hodowanymi MSC pokrywką wyposażoną w elektrody, upewniając się, że elektrody są całkowicie zanurzone w medium (w razie potrzeby należy dodać medium). Przenieść przykrytą płytkę 6-dołkową (komorę EStim) z komórkami do inkubatora i podłączyć przewody do zasilacza.</li>
	<li>Ustawić zasilacz na wyjściowe napięcie obciążenia 2,5 V i poddać komórki stymulacji EStim przez 1 h3,9.</li>
	<li>Po stymulacji należy odłączyć zasilacz i wyjąć komorę EStim z inkubatora. W warunkach sterylnych zamienić pokrywkę z elektrodami na standardową pokrywkę do płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Przenieść komórki z powrotem do inkubatora i pozostawić je na noc. Oczyścić elektrody, najpierw za pomocą PBS, a następnie w 70% roztworze etanolu. Nagromadzone produkty korozji z powierzchni elektrod usunąć za pomocą drobnoziarnistego papieru ściernego.</li>
	<li>Powtarzać kroki 3.1–3.5 przez 6 kolejnych dni. W 4. dniu, przed zastosowaniem EStim i w warunkach sterylnych, należy wymienić medium hodowlane, odsysając 1,5 mL medium i zastępując je 1,5 mL uprzednio ogrzanego świeżego OM.</li>
	<li>Po zastosowaniu EStim przez 7 kolejnych dni, utrzymywać komórki w hodowli przez dodatkowe 7 dni, wymieniając medium co 3–4 dni.</li>
</ol>
4. Pomiary różnicowania osteogenicznego
<ol>
	<li>Przeanalizuj zmiany morfologii komórek pod mikroskopem.</li>
	<li>Aby ocenić wpływ EStim na różnicowanie osteogenne MSC, zmierzyć poziom odkładania wapnia, aktywność fosfatazy alkalicznej oraz ekspresję genów markerów osteogennych, zgodnie z opisem w innych opracowaniach3,9.</li>
</ol>

<ol><li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine%3A+What+Is+the+Evidence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li>
<li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications%3A+Current+Status+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li>
<li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821(2017).</li>
<li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1(2018).</li>
<li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li>
<li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Translation%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC%2FEPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li>
<li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959(2018).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, CA. 402-408 (2001).</li>
<li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61(2010).</li>
<li>Wang, L., Li, Z. -y, Wang, Y. -p, Wu, Z. -h, Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Sciences+Journal+%28Chung-kuo+i+hsueh+k%27o+hsueh+tsa+chih%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li>
<li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy%3A+biomedical+implications+for+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), Oxford, UK. 747-753 (2007).</li>
<li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077(2018).</li>
<li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Burns+%26+Trauma%22%5BJournal%5D)">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns & Trauma. 6, 20(2018).</li>
<li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li>
<li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li>
<li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+%26+Engineering.+C%2C+Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li>
<li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisano budowę komory oraz metodę leczenia mezenchymalnych komórek macierzystych EStim, która skutkuje zwiększonym różnicowaniem osteogennym.
Przedstawiona konfiguracja EStim nie wymaga specjalnego sprzętu/wiedzy i może być wykonywana w standardowym laboratorium biologii/biochemii komórek macierzystych przez młodszych badaczy. Jednak podczas budowy i użytkowania studzienki EStim należy zachować szczególną ostrożność w kilku krytycznych krokach. Podczas obchodzenia się z elektrod...

Wzrost urazów i/lub wad kostnych wywołanych chorobą jest leczony za pomocą różnych kombinacji terapii komórkowej i technologii medycyny regeneracyjnej. MSCs są komórkami z wyboru w takich zabiegach, ze względu na ich stosunkowo wysoką aktywność osteogenną, skuteczność izolacji i ekspansji oraz bezpieczeństwo1. Aby zmaksymalizować ich aktywność osteogenną, a tym samym zoptymalizować ich skuteczność terapeutyczną, wprowadzono kilka metod manipulowania MSCs przed ich zastosowaniem w tych terapiach (zgodnie z recenzją Mauney et al.2). Jedną z takich metod jest EStim, która, jak wykazano, zwiększa różnicowanie osteogenne MSC in vitro3 i wspomaga gojenie kości in vivo4. Pomimo rosnącej liczby badań koncentrujących się na leczeniu MSCs za pomocą EStim, optymalny schemat maksymalizacji proosteogennego efektu EStim nie został jeszcze zdefiniowany.
Inne metody in vitro wykorzystujące EStim wykorzystują mostki solne zanurzone w pożywce hodowlanej, która oddziela komórki od metalowych elektrod5. Zaletą tego rozwiązania jest to, że dostarczanie EStim przez mostki solne eliminuje wprowadzanie chemicznych produktów ubocznych (np. korozji elektrod metalowych), które mogą być cytotoksyczne. Pomimo tej zalety, mostki solne są kłopotliwe w obsłudze, a dostarczany przez nie EStim różni się od tego dostarczanego w modelach in vivo, co utrudnia skorelowanie wyników uzyskanych przy użyciu tych dwóch systemów. Konfiguracje, które dostarczają EStim za pośrednictwem metalowych lub węglowych elektrod zamocowanych w studzienkach hodowli komórkowych (jak recenzowali Hronik-Tupaj i Kaplan6) lepiej symulują urządzenia używane in vivo; Jednak urządzenia te są trudne do czyszczenia/sterylizacji między użyciami, a liczba komórek, które można badać w jednym eksperymencie, jest ograniczona. Zaprojektowaliśmy prezentowaną tutaj komorę EStim specjalnie po to, aby rozwiązać problemy z ograniczeniami tych innych konfiguracji. Podczas gdy większość naszego doświadczenia z korzystaniem z tej komory EStim dotyczyła hodowli 2D i 3D zawierających MSCs pochodzące ze szpiku kostnego i tkanki tłuszczowej3,4, główną zaletą tej komory jest to, że jest wszechstronna i przy stosunkowo niewielkich zmianach może być dostosowana do badania innych typów komórek w różnych warunkach.
Tutaj opisujemy budowę komory do hodowli komórek EStim; następnie demonstrujemy jej zastosowanie, traktując MSCs różnymi schematami EStim i mierząc wynikający z tego wpływ na różnicowanie osteogenne. Różnicowanie osteogenne MSC ocenia się na podstawie odkładania się wapnia, aktywności fosfatazy alkalicznej i ekspresji genów markerów osteogennych. Co ważne, w poprzednich eksperymentach, w których stosowano tę konfigurację, zaobserwowaliśmy, że te pro-osteogenne efekty utrzymują się długo po przerwaniu leczenia EStim.

<table><tbody><tr><td>Estim fabrication</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banana connector/Jack</td><td>adapter Poppstars</td><td>1008554</td><td>2 sztuki</td></tr><tr><td>Szczypce tnące</td><td>Knipex</td><td>78 03 125</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz DC (0-30V/0-3A)</td><td>B& K Precision</td><td>Model 9130B</td><td>Można użyć dowolnego modelu podobnego</td></tr><tr><td>Izolowane przewody elastyczne (0,14 mm2)</td><td>Conrad Electronic International</td><td>604794, 604093</td><td>2 sztuki</td></tr><tr><td>Niekorozyjna guma silikonowa</td><td>Dow Corning</td><td>3140 RTV</td><td>*można kupić w wielu sklepach</td></tr><tr><td>Drut platynowy (999,5/1000; 1mm &oslash;)</td><td>Junker Edelmetalle</td><td>00D-3010</td><td>0,6 m potrzebne do 1 komory Estim</td></tr><tr><td>70% roztwór etanolu</td><td>dowolny</td><td></td><td>Sterylizacja komory Estim</td></tr><tr><td>Drut miedziany pokryty srebrem (0,6 mm &oslash;)</td><td>Conrad Electronic International</td><td>409334 - 62</td><td>&asymp; 70 cm potrzebne na 1 urządzenie Estim</td></tr><tr><td>Zestaw lutowniczy</td><td>Conrad Electronic International</td><td>1611410 - 62</td><td>Można użyć dowolnego modelu podobnego</td></tr><tr><td>Pokrywka płytki TPP 6-dołkowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td><td>2 pokrywki do komory Estim</td></tr><tr><td>2,2V przewodowe okrągłe diody LED</td><td>Conrad Electronic International</td><td>599525 - 62</td><td>6 sztuk</td></tr><tr><td>UHU Super klej</td><td>UHU GmbH & Co. KG</td><td>n/a</td><td>*można kupić w wielu sklepach</td></tr><tr><td>Kultura MSC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glicerofosforan sól disodowa hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td>osteogenna hodowla</td></tr><tr><td>komórkowa DMEM, niska glukoza, suplement GlutaMAX, pirogronian</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>21885025</td><td>hodowla</td></tr><tr><td>komórkowa DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo-Fischer Hodowla</td><td>komórek</td><td>14190144</td> naukowych</tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>hodowla komórek osteogennych</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Thermo-Fischer Naukowa</td><td>hodowla komórkowa</td><td>10500064</td></tr><tr><td>50 ml Probówka Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62,547,004</td><td>hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>osteogenna hodowla komórek</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>15140122</td><td>hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Mezenchymalne komórki macierzyste szczura Sprague-Dawley (SD), pochodzenie szpiku kostnego</td><td>Cyagen</td><td>RASMX-01001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odwarstwiania komórek</td><td>Termo-Fischer Scientific</td><td>A1110501</td><td>hodowla komórkowa, odwarstwienie komórek</td></tr><tr><td>TC Flask, T75</td><td>Sarstedt</td><td>833911302</td><td>hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe TPP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Trypan Blue Dye, 0,4% roztwór</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>liczba komórek</td></tr></tbody></table>

budowa i zastosowanie komory do stymulacji elektrycznej w celu zwiększenia różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych/zrębowych in vitro

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) były szeroko stosowane w celu wspomagania gojenia kości w metodach inżynierii tkankowej. Wykazano, że stymulacja elektryczna (EStim) zwiększa różnicowanie osteogenne MSC in vitro i wspomaga gojenie kości w warunkach klinicznych. W tym artykule opisano budowę komory do hodowli komórek EStim i jej zastosowanie w leczeniu MSC pochodzącego ze szpiku kostnego szczurów w celu zwiększenia różnicowania osteogennego. Stwierdziliśmy, że leczenie MSCs EStim przez 7 dni powoduje znaczny wzrost różnicowania osteogennego i, co ważne, ten efekt proosteogenny utrzymuje się długo po (7 dniach) odstawieniu EStim. To podejście polegające na wstępnym traktowaniu MSCs za pomocą EStim w celu zwiększenia różnicowania osteogennego może być wykorzystane do optymalizacji wyników leczenia z zakresu inżynierii tkanki kostnej, a tym samym pomóc im w osiągnięciu pełnego potencjału terapeutycznego. Oprócz tej aplikacji, ta komora i protokół hodowli komórek EStim mogą być również używane do badania innych zachowań komórek wrażliwych na EStim, takich jak migracja, proliferacja, apoptoza i mocowanie rusztowania.

Aby ocenić wpływ stymulacji elektrycznej (EStim) o natężeniu 100 mV/mm na różnicowanie osteogenne MSC, komórki poddane EStim przez 3, 7 i 14 dni lub niepoddane stymulacji (grupa kontrolna) przeanalizowano w 14. dniu hodowli, oceniając zmiany morfologiczne oraz odkładanie wapnia (Rycina 2). Przeprowadzono to poprzez obrazowanie komórek z wykorzystaniem mikroskopii w polu jasnym (zmiany morfologiczne) lub poprzez utrwalenie komórek w 4% roztworze paraformaldehy...

Tutaj prezentujemy protokół budowy komory do hodowli komórek, przeznaczonej do wystawiania komórek na różne rodzaje stymulacji elektrycznej, oraz jej zastosowanie w leczeniu mezenchymalnych komórek macierzystych w celu zwiększenia różnicowania osteogennego.

Budowa i zastosowanie komory do stymulacji elektrycznej w celu zwiększenia różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych/zrębowych in vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

W tym miejscu pokazujemy, jak zbudować komorę do stymulacji elektrycznej przy użyciu zwykłych sześciościennych płytek hodowlanych i jak ją wykorzystać w celu stymulacji różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych. Ta komora jest łatwa i niedroga w budowie i może być ponownie wykorzystana w wielu eksperymentach. Po wstępnym poddaniu działaniu stymulacji elektrycznej w naszej komorze, mezenchymalne komórki macierzyste mogą być wykorzystane do poprawy wyników leczenia inżynierii tkanki kostnej.Komora ta może być również używana do badania innych typów komórek i zachowań komórek wrażliwych elektroalergicznie, takich jak migracja, proliferacja, zmiany potencjału błonowego, apoptoza i ostrożne przyczepianie. W pokrywie z sześciodołkową płytką zaznacz a następnie wywierć dwa otwory o średnicy jednego milimetra, oddalone od siebie o 25 milimetrów, w pobliżu zewnętrznej krawędzi każdego z sześciu dołków. Następnie pokrój drut platynowy na 12 odcinków o długości pięciu centymetrów.Ręcznie zegnij każdą pięciocentymetrową sekcję w kształt litery L, pozostawiając jeden koniec o długości trzech centymetrów, a drugi o długości dwóch centymetrów. Następnie przetnij drut pokryty srebrem na dwie 35-centymetrowe długości. Włóż dłuższy zagięty koniec drutu platynowego do wywierconego otworu, pozostawiając jeden do dwóch milimetrów wystających z zewnętrznej strony pokrywy.Zegnij go za pomocą kleszczy. Następnie zabezpiecz platynowe druty w otworach pokrywy za pomocą kleju nadprzewodzącego i pozostaw je do wyschnięcia na około sześć godzin. Aby przygotować katody, końcówki wszystkich sześciu platynowych drutów wystających z pokrywy do jednego z drutów pokrytych srebrem.Aby przygotować anody, pozostałe sześć drutów platynowych do innych drutów pokrytych srebrem. Następnie dodaj diody LED w obwodzie między każdą z sześciu par anoda-katoda platynowo-elektroda-elektroda, aby potwierdzić funkcjonalność. Umieść kawałek czarnej taśmy izolacyjnej pod każdą diodą LED, aby zapobiec wystawieniu komórek na płytkach hodowlanych na działanie światła LED.Następnie przyklej złącze listwy zaciskowej przewodów do lewego górnego rogu pokrywy z sześciodołkową płytką i podłącz oba posrebrzane przewody do zacisków wejściowych. Następnie wytnij kwadratowy przekrój o wymiarach 20 milimetrów na 20 milimetrów od lewego górnego rogu drugiej pokrywy z sześciodołkową płytką, aby pomieścić złącze listwy zaciskowej na pierwszej pokrywie. Przykryj pierwszą pokrywę, wyposażoną w elektrody, drugą pokrywą i sklej je taśmą klejącą.Podłącz jeden koniec dwóch standardowych izolowanych przewodów miedzianych do zacisków wyjściowych złącza przewodu, a drugi koniec do męskich złączy bananowych. Włącz zasilanie, naciskając przycisk ON-OFF na panelu przednim. Aktywuj kanał pierwszy, naciskając przycisk pierwszy.Następnie naciśnij przycisk czwarty, aby ustawić napięcie. Ustaw wyjście obciążenia na 2.5 V. Następnie naciśnij Enter.W dniu, w którym komórki są traktowane łodygą E, sterylizuj elektrody w 70% roztworze etanolu przez 30 minut. Następnie wysusz je pod światłem UV w komorze bezpieczeństwa przez dodatkowe 30 minut. W okapie z przepływem laminarnym przykryj sześciodołkową płytkę zawierającą hodowane MSCs pokrywką wyposażoną w elektrody, upewniając się, że elektrody są całkowicie zanurzone w pożywce.Następnie przenieś zakrytą sześciodołkową płytkę z komórkami do inkubatora i podłącz jej przewody do zasilania. Następnie ustaw zasilacz na wyjście obciążenia 2,5 V i traktuj komórki łodygą E przez godzinę. Po stymulacji odłącz zasilanie i wyjmij komorę trzpienia E z inkubatora.W sterylnych warunkach zastąp pokrywkę wyposażoną w elektrody standardową pokrywką z sześciodołkową płytką. Następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora i pozostaw je na noc. Oczyść elektrody, najpierw PBS, a następnie 70% roztworem etanolu.Następnie oczyść nagromadzone produkty korozji z powierzchni elektrody drobnym papierem ściernym. Powtarzaj zabieg z łodygą E przez sześć kolejnych dni. W czwartym dniu, przed zastosowaniem stymulacji elektrycznej i w sterylnych warunkach, zmień pożywkę hodowlaną, odsysając 1,5 mililitra pożywki i zastępując ją 1,5 mililitra wstępnie podgrzanej, świeżej pożywki do różnicowania osteogennego.Po zastosowaniu stymulacji elektrycznej przez siedem kolejnych dni, utrzymuj komórki w hodowli przez dodatkowe siedem dni, wymieniając pożywkę co trzy do czterech dni. Po zakończeniu leczenia przeanalizuj zmiany morfologii komórek pod mikroskopem. Aby ocenić wpływ stymulacji elektrycznej na różnicowanie osteogenne MSC, należy zmierzyć odkładanie się wapnia, aktywność fosfatazy alkalicznej i ekspresję genów markerów osteogennych, jak opisano w innym miejscu.Aby ocenić wpływ stymulacji elektrycznej 100 miliwoltów na milimetr na różnicowanie osteogenne MSC, komórki poddawane stymulacji elektrycznej przez trzy, siedem i 14 dni oraz komórki nieleczone analizowano w 14. dniu hodowli, oceniając zmiany morfologiczne i odkładanie się wapnia. Znaczące zmiany w morfologii komórek i złogach wapnia były widoczne w komórkach poddanych stymulacji elektrycznej przez siedem i 14 dni. Szczegółową analizę zmian ekspresji genów markerów osteogennych przeprowadzono w trzecim, siódmym i czternastym dniu hodowli.W siódmym dniu hodowli ekspresja RunX2 była znacznie wyższa w komórkach poddanych stymulacji elektrycznej przez siedem dni. Podczas gdy ekspresja Colla1 była znacznie wyższa w komórkach traktowanych przez siedem dni, mierzona w 14 dniu hodowli. Ekspresja osteopontyny była znacznie zwiększona w komórkach stymulowanych elektrycznie w trzecim, siódmym i czternastym dniu hodowli.Ekspresja Osterix była nieobecna w komórkach kontrolnych we wszystkich punktach czasowych i była obserwowana tylko po siedmiu i 14 dniach hodowli w komórkach wystawionych na stymulację elektryczną. Komora do stymulacji elektrycznej jest stosunkowo łatwa do zbudowania. Należy jednak zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z drutami platynowymi, a także podczas czyszczenia i sterylizacji elektrod.Komórki wstępnie poddane elektryczności w naszej komorze, samodzielnie lub osadzone na materiale rusztowania, mogą być wszczepione do modeli zwierzęcych, aby zbadać, jak pozytywny efekt stymulacji elektrycznej utrzymuje się in vitro. Technika ta zapewnia proste, ale potężne narzędzie do badania mechanizmu, za pomocą którego stymulacja elektryczna reguluje funkcje komórek. Wiedza ta może być dostępna w komórkach medycyny regeneracyjnej.

construction-use-an-electrical-stimulation-chamber-for-enhancing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Powszechnie wiadomo, że siły mechaniczne w organizmie mogą wpływać na różnicowanie i proliferację komórek. Przedstawiamy protokół wideo demonstrujący zastosowanie bioreaktora zbudowanego na zamówienie do przykładania jednowymiarowego cyklicznego odkształcenia rozciągającego do komórek macierzystych hodowanych na elastycznych podłożach z mikrowzorami.

Mechaniczna stymulacja komórek macierzystych z wykorzystaniem cyklicznego odkształcenia jednowymiarowego

Ten film demonstruje użycie mikroprzepływowego chipa pokrytego macierzą zewnątrzkomórkową do różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych lub NPC za pomocą stymulacji elektrycznej. Po wysianiu i przyleganiu do pokrytego obszaru NPC rosną, a zastosowanie prądu stałego wyzwala ich różnicowanie w neurony, astrocyty i oligodendrocyty.

Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych wywołane stymulacją elektryczną

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ich hodowla na porowatej macierzy kostnej

Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych (hMSC) za pomocą autologicznej surowicy, zmniejsza ryzyko odrzucenia przez materiał ksenogeniczny i inne negatywne skutki. Pozwala również na odzyskanie podzbioru mezodermalnych komórek progenitorowych, które mogą dostarczać świeże hMSC. Osadzenie hMSC w autologicznym skrzepie fibrynowym umożliwia łatwą obsługę i skuteczną implantację chirurgiczną.

Mezenchymalna hodowla komórek zrębowych i dostarczanie w warunkach autologicznych: inteligentne podejście do zastosowań ortopedycznych

Chondrogeneza z komórek macierzystych wymaga precyzyjnego dostrojenia warunków hodowli. W tym miejscu przedstawiamy magnetyczne podejście do kondensacji komórek, które jest niezbędnym krokiem do zainicjowania chondrogenezy. Ponadto wykazaliśmy, że dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze stosuje mechaniczną stymulację konstruktów komórkowych i zwiększa produkcję chrzęstnej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

Ten protokół opisuje wytwarzanie systemu hodowli komórek, który umożliwia wysiewanie komórek macierzystych na przewodzącym rusztowaniu polimerowym do stymulacji elektrycznej in vitro, a następnie implantację in vivo rusztowania z komórek macierzystych przy użyciu techniki minimalnie inwazyjnej.

Rusztowanie przewodzące prąd elektryczny do modulacji i dostarczania komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

Ten protokół opisuje krok po kroku proces budowy zarówno elektrycznych, jak i magnetycznych stymulatorów używanych do stymulacji tkanek biologicznych. Protokół zawiera wytyczne dotyczące obliczeniowej symulacji pól elektrycznych i magnetycznych oraz produkcji urządzeń stymulujących.

Urządzenia do stymulacji tkanek biologicznych i pola magnetycznego

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

Opracowaliśmy test podrażnienia oczu, który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE). Test jest w stanie odróżnić materiały drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od tych, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS).

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

Poznaj budowę komory do stymulacji elektrycznej w celu zwiększenia różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych. Ta metoda poprawia wyniki w inżynierii tkanki kostnej.

Budowa i zastosowanie komory do stymulacji elektrycznej w celu zwiększenia różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych/zrębowych in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Budowa i zastosowanie komory do stymulacji elektrycznej w celu zwiększenia różnicowania osteogennego w mezenchymalnych komórkach macierzystych/zrębowych in vitro

Przeglądaj więcej filmów