Name: Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych. Protokół umożliwia identyfikację markerów powierzchniowych CD9, CD63 i CD81 z wysoką powtarzalnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L.B. był wspierany przez granty badawcze Helmut Horten Stiftung i Velux Stiftung, Zurych (Szwajcaria). G.V. był wspierany przez granty badawcze Swiss National Science Foundation, Cecilia-Augusta Foundation, Lugano, oraz SHK Stiftung für Herz- und Kreislaufkrankheiten (Szwajcaria)

1. Gromadzenie i przetwarzanie kondycjonowanych mediów
<ol>
	<li>Pokryj 55 cm2 szalki Petriego 0,02% żelatyną ze skóry świń w PBS.</li>
	<li>Talerz CPC (8 000 / cm2) w wstępnie powlekanych naczyniach z 7 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM) uzupełnionego 20% FBS (płodowa surowica bydlęca) i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S). 
	nuta: Termin "CPC" odnosi się do ludzkich komórek pochodzących z eksplantacji, które zostały opisane gdzie indziej14. CM można pobrać z różnych typów komórek hodowanych w określonych warunkach hodowli. Nosić rękawice i pracować pod kapturem biologicznym.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, usuń pożywkę hodowlaną, umyj komórki dwukrotnie PBS (PBS) Dulbecco bez Ca i Mg i zastąp je 10 ml pożywki do egzoprodukcji bez surowicy (Dulbecco's Modified Eagle's Medium [DMEM] High Glucose, 4,5 g / ml). 
	nuta: Kontynuuj stopniowe zmniejszanie stężenia surowicy w pożywce hodowlanej, aby stopniowo przystosować komórki do stanu wolnego od surowicy (SF). W przypadku komórek, które są wrażliwe na pożywkę niezawierającą surowicy, należy przygotować pożywkę zawierającą FBS, ale pozbawioną EV. Przygotuj podłoże uzupełnione wszystkimi składnikami odżywczymi oraz 10%–20% (v/v) FBS. Odwirować pożywkę przez noc w temperaturze 100 000 × g, 4 °C. Należy pamiętać, że ta procedura nie gwarantuje 100% usunięcia EV pochodzącego z FBS.</li>
	<li>Po 7 dniach zbierz CM do probówek wirówkowych z polipropylenu. 
	nuta: Czas kondycjonowania pożywki zależy od typu ogniwa. W przypadku komórek, które są wrażliwe na pożywkę bezsurowicową, należy zwiększyć początkową objętość pożywki i skrócić czas pobierania pożywki do 24-48 godzin.</li>
	<li>Usunąć CM z resztek komórkowych za pomocą wirówki o sile 3 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4–10 °C. Zebrać supernatant w probówce filtracyjnej wirówki o stężeniu 100 kDa.</li>
	<li>Koncentrat oczyszczony CM poprzez obracanie probówki w temperaturze 2 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4–10 °C. 
	nuta: Ten etap zmniejszy początkową objętość CM, umożliwiając użycie probówek o małej objętości do etapów wirówki o dużej prędkości i przyczyni się do wyeliminowania małych agregatów białkowych.</li>
	<li>Zebrać koncentrat do probówki do mikrowirówki. Wirować przy 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4–10 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatant i przejść do sekcji 2 (Wzbogacanie EV). Jeśli ultrawirówka nie jest dostępna, przejdź bezpośrednio do sekcji 3 (Kwantyfikacja analizy śledzenia nanocząstek (NTA)). 
	nuta: Wstępne wzbogacenie frakcji EV poprawia końcowy odczyt intensywności fluorescencji (patrz reprezentatywne wyniki i <silna klasa="xfig">Rysunek 4). Oczyszczony CM (z punktu 1.8) może być przechowywany w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1-2 dni lub alternatywnie w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy. 5 CM powinno być wstępnie oczyszczone, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia komórkowe przed przechowywaniem w temperaturze -80°C, aby upewnić się, że w procesie zamrażania i rozmrażania nie powstają resztki wielkości egzosomu.</li>
</ol>
2. Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirówki (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Umieścić supernatant z kroku 1.8 w grubościennej probówce ultrawirówkowej z poliwęglanu. Napełnij probówkę 1x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), aż osiągnie maksymalną pojemność (3,2 ml).</li>
	<li>Załaduj próbki do tytanowego wirnika o stałym kącie nachylenia (8 x 3,2 ml, współczynnik k 13). Załaduj wirnik do ultrawirówki stołowej. Ultrawirować przy 100 000 x g przez 3 godziny w temperaturze 4–10 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl 1x PBS.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja analizy śledzenia nanocząstek (NTA)
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 1 μl próbki (z etapu 2.3 lub 1.8) w 999 μl 1x PBS. Załaduj próbkę do strzykawki o pojemności 1 ml, unikając tworzenia się pęcherzyków. Załadować strzykawkę do otworu wlotowego komory badawczej.</li>
	<li>Włącz laser. Otwórz aparat za pomocą przycisku Przechwyć. Dostosuj ostrość.</li>
	<li>Nagraj co najmniej 3 różne klatki po 60 s każda.</li>
	<li>Przeanalizuj 3 różne akwizycje za pomocą opcji Proces wsadowy w oprogramowaniu. 
	nuta: Jeżeli technologia NTA nie jest dostępna, należy przeprowadzić kwantyfikację białka za pomocą testu Bradforda (1 x 108 cząstek odpowiada 1–2 μg całkowitego białka po ultrawirowaniu lub 50–60 μg białka całkowitego, jeśli oznaczanie ilościowe jest przeprowadzane bezpośrednio dla CM, ponieważ obejmuje ono zanieczyszczenia białkami inne niż EV; patrz Tabela 1)5.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Przygotuj pulę 3 rodzajów koralików wychwytujących (koraliki CD9, koraliki CD63 i koraliki CD81 w stosunku 1:1:1; patrz Tabela materiałów) i vortex. 
	nuta: Basen został przetestowany pod kątem stabilności przez 1 miesiąc. Można zastosować pojedynczy rodzaj kulki wychwytującej, co pozwoli na wykrycie subpopulacji EV, które nie są rozróżniane za pomocą puli kulek. Dzięki zastosowaniu pojedynczych kulek wychwytujących antygen możliwe będzie współczesne wykazanie obecności białek tetraspaniny, takich jak CD9, CD81 lub CD63, oraz antygenu będącego przedmiotem zainteresowania wykrywanego przez przeciwciało fluorescencyjne. W handlu dostępne są również alternatywne kulki lateksowe aldehydo-siarczanowe. Kulki te mają hydrofobową powierzchnię do adsorpcji MV i EV.</li>
	<li>Do probówki z okrągłym dnem dodać objętość odpowiadającą 1 x 108 cząstek plus 1 μl puli kulek, co odpowiada łącznie 1,2 x 105 kulek (dla każdego badania).</li>
	<li>Przygotować probówkę zawierającą 1 μl kulek bez EV, które będą służyć jako kontrola ujemna, zwanych dalej "kulkami".</li>
	<li>Dostosuj objętość do 100 μl za pomocą 1x PBS. Umieść probówkę w termomikserze i wstrząsaj z prędkością 400 obr./min przez noc w temperaturze 4–10 °C.</li>
	<li>Następnego dnia przenieś próbki na 96-dołkową płytkę z okrągłym dnem (lub probówki FC).</li>
	<li>Dodać przeciwciało (10 μg/ml CD9_FITC, 10 μg/ml CD63_PE i 5 μg/ml CD81_PE).</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4–10 °C.</li>
	<li>Dodaj 100 μl 1x PBS do każdej studzienki.</li>
	<li>Przejdź do przejęcia.</li>
</ol>
5. Akwizycja
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do akwizycji i uruchom instrument (Cytometer > System Startup Program). Otwórz nowy eksperyment.</li>
	<li>Utwórz szablon eksperymentalny, a następnie wybierz opcję Blacha, a następnie Dodaj blachę. Wybierz położenie próbek na płycie, a następnie naciśnij przycisk Ustaw jako studnię próbki.</li>
	<li>Wprowadź przykładową nazwę (np. CPC#1_CD9FITC) w polu Reguły nazewnictwa. Otwórz zakładkę Kanał i włącz kanały FITC i PE.</li>
	<li>Załaduj płytkę do instrumentu.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Wykres punktowy i utwórz nowy wykres punktowy (P1). Ustaw przedni obszar rozproszenia (FSC-A) i boczny obszar rozproszenia (SSC-A).</li>
	<li>Wybierz opcję Inicjalizuj, aby uruchomić laser i fluidykę. Naciśnij przycisk Pobierz, aby rozpocząć pobieranie.</li>
	<li>Dostosuj skalę, aby pokazać populację w środku P1. W P1 narysuj bramę "KORALIKI" wokół całej populacji (bez gruzu) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Naciśnij przycisk Stop.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Wykres punktowy i utwórz nowy wykres punktowy (P2). Ustaw wysokość rozproszenia do przodu (FSC-H) w stosunku do FSC-A. Bramka na nowym wykresie kropkowym na "KORALIKACH". W P2 narysuj nową bramę wokół większej populacji i nazwij ją "SINGLETS" (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
	nuta: Strategia ta została opracowana w celu uniknięcia w jak największym stopniu uwzględniania agregacji koralików zarówno na etapie pozyskiwania, jak i analizy.</li>
	<li>Naciśnij Dot Plot i utwórz dwa różne wykresy kropkowe: jeden FITC kontra SSC-A i jeden PE kontra SSC-A. Bramka nowego wykresu kropkowego na "SINGLETS".</li>
	<li>Wybierz liczbę zdarzeń do nagrania (np. 20 000). Wybierz pozycję Nagraj i rozpocznij eksperyment.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Załaduj pliki akwizycji do oprogramowania analitycznego. 
	nuta: Poniższe kroki należy zastosować do każdej próbki, w tym samych kulek, i każdej nieznanej próbki.</li>
	<li>Otwórz nowy protokół i utwórz wykresy kropkowe, postępując zgodnie z tą samą strategią opisaną w kroku 5.</li>
	<li>Ustaw wszystkie osie rozproszenia na skalę liniową, a wszystkie osie fluorescencji na skalę logarytmiczną.</li>
	<li>Pokaż średnią geometryczną fluorescencji (X-Gmean-MFI) w kanałach FITC i PE.</li>
	<li>Obliczyćstosunek średniej X-G próbek /średniej X-G kulek barwionych przeciwciałem bez egzosomu.</li>
	<li>Porównaj MFI zmiany składania w różnych przygotowaniach do EV.</li>
</ol>
7. Miareczkowanie liczby pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
UWAGA: Sekcje od 7 do 10 mogą być wykonane w celu ustawienia liczby cząstek, stężenia przeciwciał i swoistości, ale można je pominąć, jeśli typ komórki, z której pochodzą EV, oraz przeciwciała pozostają takie same.
<ol>
	<li>Rozcieńczone cząstki, otrzymane z kroku 2.3, w 1x PBS w celu otrzymania serii zawiesin w zakresie od 5 x 105 do 2,5 x 108 cząstek.</li>
	<li>Do każdej zawiesiny dodać rurkę z okrągłym dnem 1 μl puli kulek wychwytujących.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z protokołem z kroku 4.3.</li>
</ol>
8. Miareczkowanie przeciwciał
UWAGA: Miareczkowanie przeciwciał jest zwykle wykonywane przez dodanie pojedynczego przeciwciała do każdej probówki.
<ol>
	<li>Utrzymuj stałą liczbę EV (całkowita zawartość cząstek lub białek) we wszystkich próbkach. 
	nuta: Odpowiednią liczbę określa się empirycznie, jak opisano powyżej w sekcji 7.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z protokołem z kroków od 4.1 do 4.5.</li>
	<li>Przetestuj zakres stężeń przeciwciał powyżej i poniżej ilości zalecanej przez dostawcę. Na przykład dla przeciwciała o sugerowanym stężeniu 10 μg/ml na test, test 1, 2, 5, 10, 20 i 50 μg/ml. Dołączyć próbkę z "samymi kulkami", dodając najwyższe stężenie przeciwciała.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4–10 °C.</li>
	<li>Dodać 100 μl 1x PBS do każdej próbki.</li>
	<li>Zdobądź próbki.</li>
</ol>
9. Czas inkubacji
<ol>
	<li>Sprawdź czas inkubacji, wykonując akwizycje w różnych punktach czasowych (np. 1 godzina, 2 godziny i 5 godzina).</li>
	<li>Postępuj zgodnie z protokołem, zaczynając od sekcji 4.</li>
	<li>Próbki należy inkubować w temperaturze 4–10 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Pobieranie próbek.</li>
	<li>Próbki inkubować w temperaturze 4–10 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Pobieranie próbek.</li>
</ol>
10. Walidacja protokołu
<ol>
	<li>Wiązanie EV
	<ol>
		<li>W probówce z okrągłym dnem dodać ilość objętości odpowiadającą cząstkom 1 x 108 lub odpowiednią ilość białka ogółem.</li>
		<li>Dostosuj objętość do 100 μl za pomocą 1x PBS.</li>
		<li>Przerwać membranę EV za pomocą sonikacji (alternatywnie można zastosować etap szoku termicznego) zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw częstotliwość i intensywność. Okres sonikacji można ustalić empirycznie, ustalając eksperyment z kursem czasowym (tj. 0 s, 30 s, 1 min, 5 min itd.).</li>
		<li>Dodać 1 μl puli kulek.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z protokołem, zaczynając od kroku 4.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Swoistość przeciwciał
	<ol>
		<li>Przygotować jedną probówkę dla każdej IgG sprzężonej z fluorochromem i dodać kompleks kulek-EV zgodnie z opisem w kroku 4.6. 
		nuta: Izotyp sprzężony z fluorochromem musi być zgodny z IgG zastosowanego przeciwciała.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology & Therapeutics. , (2017).</li>
<li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+secreted+vesicles+and+intercellular+communications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15(2011).</li>
<li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer%3A+the+beginning+of+a+new+era%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li>
<li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li>
<li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications%3A+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li>
<li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li>
<li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li>
<li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-derived+exosomes%3A+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li>
<li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li>
<li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li>
<li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li>
<li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem%2Fprogenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li>
<li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li>
<li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530(2015).</li>
<li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy%2C+flow+cytometry%2C+nanoparticle+tracking+analysis%2C+and+resistive+pulse+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies%3A+building+bridges+to+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823(2017).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).</li>
<li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271(2017).</li>
<li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316(2016).</li>
<li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart%3A+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li>
</ol>

Nie ma nic do zadeklarowania.

Konwencjonalna technika FC pozostaje najprostszą metodą analityczną do charakteryzowania markerów wyrażonych na powierzchni EV. W związku z tym wybór najodpowiedniejszego protokołu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania użytecznych informacji na temat poszczególnych frakcji cząstek będących przedmiotem zainteresowania poprzez uniknięcie ograniczeń wynikających z czułości instrumentu. Opisaliśmy metodę wykorzystującą cząstki magnetyczne sprzężone z przeciwciałami, które rozpoznają antygeny powierzchniowe Exo i małe EV, które...

Komórki wydzielają pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) o różnych rozmiarach, w tym mikropęcherzyki (MV) i egzosomy (Exo). Te ostatnie można odróżnić od MV zarówno pod względem wielkości, jak i subkomórkowego przedziału, z którego pochodzą. MV (o wielkości 200–1000 nm) są uwalniane z komórek rodzicielskich poprzez wydalanie z błony komórkowej. I odwrotnie, egzo (30–150 nm) pochodzą z błon endosomalnych i są uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, gdy ciała wielopęcherzykowe (MVB) łączą się z błoną komórkową1,2.
EV są coraz częściej używane jako biomarkery diagnostyczne, a także, potencjalnie, narzędzia terapeutyczne w wielu dziedzinach, w tym onkologii, neurologii, kardiologii i chorobach układu mięśniowo-szkieletowego3,4,5. Zdecydowana większość trwających badań z wykorzystaniem EV jako środków terapeutycznych wykorzystuje izolację pęcherzyków z pożywki kondycjonowanej komórkowo (CM) komórek hodowanych in vitro. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wywierają korzystne działanie w kilku kontekstach, a EV pochodzące z MSC wykazały korzyści w modelach uszkodzenia niedokrwiennego mięśnia sercowego/reperfuzyjnego6 i uszkodzenia mózgu7. EV pochodzące z MSC wykazują również aktywność immunomodulacyjną, którą można wykorzystać w leczeniu odrzucenia immunologicznego, jak wykazano w modelu opornej na terapię choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi8. Komórki macierzyste płynu owodniowego (hAFS) aktywnie wzbogacają CM w MV i Exo, niejednorodnie rozmieszczone pod względem wielkości (50–1000 nm), które pośredniczą w kilku efektach biologicznych, takich jak proliferacja zróżnicowanych komórek, angiogeneza, hamowanie zwłóknienia i kardioprotekcja4. Niedawno wykazaliśmy, że EV, a w szczególności Exo, wydzielane przez ludzkie komórki progenitorowe pochodzące z serca (Exo-CPC), zmniejszają rozmiar zawału mięśnia sercowego u szczurów5,9.
Exo mają wspólny zestaw białek na swojej powierzchni, w tym tetraspaniny (CD63, CD81, CD9) i główny kompleks zgodności tkankowej klasy I (MHC-I). Oprócz tego wspólnego zestawu białek, Exo zawiera również białka specyficzne dla podzbioru EV typu komórki producenta. Markery egzologiczne zyskują na znaczeniu, ponieważ odgrywają kluczową rolę w komunikacji międzykomórkowej, regulując w ten sposób wiele procesów biologicznych5,10. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, znalezienie łatwego sposobu analizy EV za pomocą klasycznej cytometrii przepływowej (FC) pozostaje trudnym zadaniem.
Tutaj prezentujemy uproszczony protokół analizy EV za pomocą FC, który może być zastosowany do wstępnie wzbogaconych próbek uzyskanych przez ultrawirowanie lub bezpośrednio do CM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W metodzie wykorzystuje się kulki pokryte specyficznym przeciwciałem, które wiąże kanoniczne epitopy powierzchniowe związane z egzowirusem (CD63, CD9, CD81) bez dodatkowych płukań. Analizy FC można wykonywać przy użyciu konwencjonalnego cytometru bez konieczności regulacji przed pomiarami. Metody charakterystyki antygenów na pojedynczych małych cząstkach za pomocą cytometrów przepływowych zostały opisane przez inne grupy w odniesieniu do różnych zastosowań11,12,13. W tym przypadku użyliśmy funkcjonalizowanych kulek magnetycznych do wychwytywania małych cząstek i Exo, a następnie fenotypowania wychwyconych cząstek za pomocą FC. Chociaż metoda ta może być stosowana do scharakteryzowania składu antygenowego małych pęcherzyków uwalnianych przez dowolny typ komórek in vitro, tutaj przedstawiliśmy określone warunki hodowli komórkowej, które mają zastosowanie do hodowli ludzkich komórek progenitorowych serca (CPC) i najbardziej odpowiednie środowisko do produkcji EV przez te komórki.

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membrana, 100&nbsp; kDa&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>- CytoFlex - Platforma cytometru przepływowego</td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFlex</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, HEPES, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>21063045</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (PBS) Zestaw do wychwytywania Ca i Mg Dulbecco</td><td>BE17-512F</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExoCap CD63</td><td>JSR Life Sciences</td><td>Ex-C63-SP</td><td></td></tr><tr><td>ExoCap CD81 Capture Zestaw</td><td>JSR Life Sciences</td><td>Ex-C81-SP</td><td></td></tr><tr><td>ExoCap CD9 Zestaw wychwytujący</td><td>JSR Life Sciences</td><td>Ex-C9-SP</td><td></td></tr><tr><td>FBS zubożony w egzosomy</td><td>Thermofisher</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>Suplement FBS zubożony w egzosomy</td><td>SBI</td><td>EXO-FBS-250A-1</td><td></td></tr><tr><td>FBS-Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC przeciwciało anty-ludzkie CD9</td><td>Legenda biologiczna</td><td>312104&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; RRID: Oprogramowanie do</td> analizy cytometru przepływowego AB_2075894 <td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>Kaluza</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>Malvern</td><td>NanoSight LM10</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NanoSight</td><td>Malvern</td><td>NTA 2.3</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>PE anty-ludzkie przeciwciało CD63 Biolegend</td><td></td><td>353004&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; RRID:AB_10897809</td><td></td></tr><tr><td>PE przeciwciało anty-ludzkie CD81 (TAPA-1) Biolegend</td><td></td><td>349505&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; RRID:AB_10642024</td><td></td></tr><tr><td>Wirniki penicyliny-streptomycyny</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000 015</td><td></td></tr><tr><td>TLA-110</td> Wirniki <td></td><td>Beckman Coulter</td><td>TLA-110</td></tr></tbody></table>

analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Cytometria przepływowa (FC) jest metodą z wyboru do półilościowego pomiaru markerów antygenowych na powierzchni komórki. Ostatnio technika ta została wykorzystana do analiz fenotypowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), w tym egzosomów (Exo) we krwi obwodowej i innych płynach ustrojowych. Niewielkie rozmiary EV wymuszają stosowanie dedykowanych przyrządów o progu detekcji około 50-100 nm. Alternatywnie, EV może być związany z mikrogranulkami lateksowymi, które mogą być wykryte przez FC. Mikrogranulki, sprzężone z przeciwciałami, które rozpoznają markery związane z EV / Cluster of Differentiation CD63, CD9 i CD81 mogą być używane do wychwytywania EV. Egzo wyizolowany z CM może być analizowany ze wstępnym wzbogacaniem lub bez niego przez ultrawirowanie. Podejście to jest odpowiednie dla analiz EV przy użyciu konwencjonalnych instrumentów FC. Nasze wyniki wskazują na liniową korelację między wartościami średniej intensywności fluorescencji (MFI) a stężeniem EV. Zakłócenie EV poprzez sonikację radykalnie zmniejszyło MFI, co wskazuje, że metoda ta nie wykrywa resztek membrany. Podajemy dokładną i wiarygodną metodę analizy antygenów powierzchniowych EV, którą można łatwo wdrożyć w każdym laboratorium.

Całkowita liczba cząsteczek dla pojedynczego barwienia
Ponieważ pojedyncza kulka może wiązać więcej niż jedną cząsteczkę, przetestowano różne warunki w celu ustalenia najmniejszej całkowitej ilości EV (pojedyncze przeciwciało na probówkę), która pozwala osiągnąć wczesną fazę wykładniczą krzywej MFI. Zastosowano stałe stężenie przeciwciała, podczas gdy całkowita liczba cząsteczek wahała się od 5 x 105 ...

Protokół opisuje powtarzalną metodę przeznaczoną do użycia z supernatantami do hodowli komórkowych do wykrywania epitopów powierzchniowych na małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV). Wykorzystuje specyficzną immunoprecypitację EV za pomocą kulek sprzężonych z przeciwciałami, które rozpoznają antygen powierzchniowy CD9, CD63 i CD81. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są coraz częściej wykorzystywane jako biomarker diagnostyczny i potencjalne narzędzie terapeutyczne w wielu dziedzinach. Cytometria przepływowa jest najprostszą metodą analityczną do charakteryzowania markerów w kombinezonie, protokół ten może być używany do analizy cząstki o wymiarach, jest szybki i ma zastosowanie do konwencjonalnych sejsmometrów bez konieczności specjalnego ustawiania lub dedykowanego instrumentu. Chociaż protokół ten służy do kategoryzacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ze wspomnianego stanu i pożywki, można go rozszerzyć w kierunku kategoryzacji przybyłych AV krwi, aby zastąpić inwazyjne biopsje tkanek u pacjentów.Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w protokole, bardzo ważne jest wykonanie kroków opisanych w sekcji dotyczącej metody konfiguracji i ścisłe przestrzeganie zademonstrowanych strategii uzyskiwania Zacznij od pokrycia 55-centymetrowych kwadratowych szalek Petriego 02% żelatyną ze skóry świń w PBS. Po 15 minutach umyj naczynie i talerz 4,4 razy po 10 do piątej komórki progenitorowej serca na każdym naczyniu w 7 mililitrach zmodyfikowanego podłoża Dulbecco lub IMDM firmy Iscove, uzupełnionego 20% płodową surowicą bydlęcą oraz 1% penicyliną i streptomycyną do ich inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, przemyj kultury dwa razy PBS Dulbecco bez wapnia i magnezu i nakarm komórki 10 milileterami pożywki do produkcji egzosomów wolnych od surowicy.Po 7 dniach zbierz kondycjonowaną pożywkę z każdej płytki w jednej polipropylenowej probówce wirówkowej i odwiruj pożywkę, aby usunąć wszelkie resztki komórek. Przenieść supernatent do probówki filtracyjnej wirówki o mocy 100 kilodaltonów i zagęścić oczyszczone, kondycjonowane podłoże za pomocą dodatkowego odwirowania. Przenieś koncentrat do mikroprobówki wirówkowej w celu końcowego odwirowania na stole i dodaj supernatent do grubościennej probówki do mikrowirówki z poliwęglanu.Napełnij probówkę PBS do końcowej objętości 3,2 mililetera i załaduj próbkę do tytanowego stałego wirnika aniołowego. Następnie załaduj wirnik do ultrawirówki stołowej w celu ultrawirowania i ponownie zawieś granulat w 100 mikrolitrach świeżego PBS. W celu śledzenia i analizy ilościowej nanocząstek rozcieńczyć 1 mikrolitr ultrawirowanej próbki w 999 mikrolitrach PBS i załadować próbkę do strzykawki o pojemności 1 mililetera bez pęcherzyków.Załaduj strzykawkę do portu wlotowego komory badawczej i włącz laser. Użyj przycisku przechwytywania, aby otworzyć aparat i wyregulować ostrość. Następnie nagraj co najmniej trzy różne klatki po 60 sekund każda i użyj opcji procesu wsadowego w oprogramowaniu, aby przeanalizować trzy różne akwizycje.Aby przygotować próbkę do pobrania, najpierw dodaj odpowiednie eksperymentalne kulki wychwytujące sprzężone z przeciwciałami monoklonalnymi w stosunku 1:1:1 do probówki z mikrowirówką i wymieszaj powstałą pulę kulek wychwytujących. Następnie dodać odpowiednią objętość próbki do 1 mikrolitra puli kulek wychwytujących, aby wygenerować 1 razy 10 do 8 cząstek plus 1,2 razy 10 do 5 kulek na badane stężenie. Dodaj 1 mikrolitr kulek do probówki oznaczonej jako kontrola ujemna i dostosuj objętość w każdej probówce do 100 mikrolitrów ze świeżym PBS.Następnie umieść probówki w mikserze termicznym, wstrząsając, przy 400 obrotach na minutę i w temperaturze od 4 do 10 stopni Celsjusza na noc. Następnego dnia przenieś próbki na okrągłodenną płytkę 96-dołkową i dodaj odpowiednie przeciwciała koniugowane z fluorescencją do każdej studzienki. Po 1 godzinnej inkubacji w temperaturze od 4 do 10 stopni Celsjusza dodaj 100 mikrolitrów PBS do każdej studzienki i otwórz oprogramowanie do akwizycji.Wybierz cytometr i program uruchamiający system, aby uruchomić instrument i otworzyć nowy eksperyment. Utwórz szablon eksperymentalny, a następnie wybierz blachę i dodaj blachę. Zaznacz położenie próbek na płycie i kliknij przycisk Ustaw jako źródło próbki.Wprowadź nazwę próbki w regułach nazewnictwa, otwórz zakładkę kanał i wybierz odpowiednie kanały sygnału kwiatowego. Teraz załaduj płytkę do instrumentu. I kliknij wykres punktowy, aby utworzyć nowy wykres punktowy obszaru rozproszonego do przodu w porównaniu z bocznym obszarem punktowym.Wybierz opcję Zainicjuj, aby uruchomić laser i fluidykę, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć akwizycję. Dostosuj skalę, aby pokazać populację w środku wykresu punktowego z przodu i z boku, a następnie narysuj bramę koralików wokół całej populacji próbki, aby wykluczyć szczątki. Kliknij przycisk stop and dot plot, aby utworzyć wykres punktowy wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do wykresu punktowego obszaru rozproszenia do przodu i przebramować próbkę w populacji koralików.Narysuj nową bramę wokół większej populacji i nazwij ją Singlets, a następnie kliknij wykres kropkowy, aby utworzyć jeden wykres punktowy sygnału fluorescencyjnego w funkcji bocznego obszaru rozproszenia, dla każdego użytego eksperymentalnego fluoroforu. Bramka nowego wykresu punktowego na singletach. Następnie wybierz liczbę zdarzeń do zarejestrowania, a następnie wybierz pozycję rekord, aby rozpocząć eksperymentalne pozyskiwanie.Po zakończeniu analizy załaduj pliki akwizycji do odpowiedniego oprogramowania analitycznego i otwórz nowy protokół. Utwórz wykresy punktowe dla każdego pliku, jak pokazano, i ustaw całą oś punktową na skalę liniową, a całą oś fluorescencyjną na skalę logarytmiczną. Następnie pokaż średnią geometryczną kwiatostanu w odpowiednich kanałach sygnałowych, aby obliczyć pełną zmianę średniej intensywności kwitnienia w różnych preparatach pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.Po przetestowaniu różnych warunków w celu ustalenia najmniejszej całkowitej ilości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, aby osiągnąć wczesną fazę wykładniczą średniej krzywej intensywności kwitnienia, minimalną liczbę cząstek określono na 1 razy 10 do 8 cząstek na barwienie. Optymalne stężenie przeciwciała dla 1 razy 10 do 8 cząstek, aby osiągnąć najwyższy sygnał bez niespecyficznego wiązania przeciwciał, określono na 10 mikrogramów na mililitr zarówno dla przeciwciał anty CD9_FITC, jak i anty CD63_PE oraz pięć mikrogramów na mililitr dla przeciwciała anty CD81_PE. Aby potwierdzić przydatność metody do analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w kształcie miseczki, a nie resztek błony, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe poddano sonikacji, co spowodowało spadek średniej intensywności kwitnienia już po 30 sekundach sonikacji, przy czym po jednej minucie mechanicznego zakłócenia w ogóle nie wykryto kwitnienia.Własne oczyszczenie X z komórek progenitorowych serca, jak wykazano, daje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, wyrażające niskie poziomy CD9 i wysokie poziomy CD63 i CD81 z obu populacji komórek. Co więcej, podczas gdy własne markery powierzchniowe X są wyraźnie identyfikowalne bez ultrawirowania, ten etap wzbogacania znacznie zwiększa średnią intensywność fluorescencji tych markerów. Podczas pracy z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi jest więcej nieostrożnych granulek nanocząstek, które można łatwo przeoczyć.Dlatego ważne jest, aby wykonać wszystkie kroki, jak pokazano w protokole. Wykorzystanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jako biomarkera jest obecnie jednym z najbardziej rozwijających się badań terenowych. A wkrótce może zostać przełożone na diagnostykę kliniczną stosowaną jako alternatywne narzędzie przesiewowe.

flow-cytometric-analysis-extracellular-vesicles-from-cell-conditioned

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje immunologiczne wychwytywanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą znakowanych fluorescencyjnie koniugatów przeciwciało-magnetyczne nanocząstki wychwytywane. Proces obejmuje tworzenie kompleksów, barwienie fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami wykrywającymi, separację magnetyczną i analizę cytometryczną przepływową w celu charakterystyki antygenowej.

Wychwytywanie immunologiczne i cytometria przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu charakterystyki antygenowej

Istnieje wiele różnych metod pomiaru pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą cytometrii przepływowej (FCM). Przy określaniu najodpowiedniejszej metody należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Przedstawiono dwa protokoły pomiaru EV, wykorzystujące albo indywidualną detekcję, albo podejście oparte na kulkach.

Techniki analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

W tym protokole opisujemy kompletny proces szybkiej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od ludzkiej krwi pełnej i charakteryzacji specyficznych markerów za pomocą analizy nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności i mogą być dostosowane do supernatantów z hodowli komórkowych.

Szybka charakterystyka oparta na fluorescencji pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkiej krwi z analizą śledzenia nanocząstek

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przyczyniają się do biologii komórkowej i komunikacji międzykomórkowej. Istnieje potrzeba przeprowadzenia praktycznych testów w celu wizualizacji i ilościowego określenia wychwytu EV przez komórki. Obecny protokół proponuje test wychwytu EV poprzez wykorzystanie trójwymiarowego obrazowania fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii konfokalnej, po izolacji EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Obecny protokół opisuje metodę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krwi obwodowej i tkanek stałych z późniejszym profilowaniem antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych.

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Najnowsza generacja narzędzi do charakteryzacji EV jest w stanie przeprowadzić pojedynczą analizę EV dla wielu parametrów jednocześnie. Cytometria nanoprzepływowa mierzy wszystkie cząstki biologiczne większe niż 45 nm bez znakowania i identyfikuje specyficzne cechy subpopulacji za pomocą różnych technik znakowania fluorescencyjnego.

Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Tutaj opisujemy prosty protokół, który umożliwia in vitro ocenę obfitości znakowanych fluorescencyjnie mikroRNA w celu zbadania dynamiki pakowania mikroRNA i eksportu do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Śledzenie uwalniania miRNA do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych. Protokół umożliwia identyfikację markerów powierzchniowych CD9, CD63 i CD81 z wysoką powtarzalnością.

Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

Przeglądaj więcej filmów