Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są coraz częściej wykorzystywane jako biomarker diagnostyczny i potencjalne narzędzie terapeutyczne w wielu dziedzinach. Cytometria przepływowa jest najprostszą metodą analityczną do charakteryzowania markerów w kombinezonie, protokół ten może być używany do analizy cząstki o wymiarach, jest szybki i ma zastosowanie do konwencjonalnych sejsmometrów bez konieczności specjalnego ustawiania lub dedykowanego instrumentu. Chociaż protokół ten służy do kategoryzacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ze wspomnianego stanu i pożywki, można go rozszerzyć w kierunku kategoryzacji przybyłych AV krwi, aby zastąpić inwazyjne biopsje tkanek u pacjentów.

Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w protokole, bardzo ważne jest wykonanie kroków opisanych w sekcji dotyczącej metody konfiguracji i ścisłe przestrzeganie zademonstrowanych strategii uzyskiwania Zacznij od pokrycia 55-centymetrowych kwadratowych szalek Petriego 02% żelatyną ze skóry świń w PBS. Po 15 minutach umyj naczynie i talerz 4,4 razy po 10 do piątej komórki progenitorowej serca na każdym naczyniu w 7 mililitrach zmodyfikowanego podłoża Dulbecco lub IMDM firmy Iscove, uzupełnionego 20% płodową surowicą bydlęcą oraz 1% penicyliną i streptomycyną do ich inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, przemyj kultury dwa razy PBS Dulbecco bez wapnia i magnezu i nakarm komórki 10 milileterami pożywki do produkcji egzosomów wolnych od surowicy.

Po 7 dniach zbierz kondycjonowaną pożywkę z każdej płytki w jednej polipropylenowej probówce wirówkowej i odwiruj pożywkę, aby usunąć wszelkie resztki komórek. Przenieść supernatent do probówki filtracyjnej wirówki o mocy 100 kilodaltonów i zagęścić oczyszczone, kondycjonowane podłoże za pomocą dodatkowego odwirowania. Przenieś koncentrat do mikroprobówki wirówkowej w celu końcowego odwirowania na stole i dodaj supernatent do grubościennej probówki do mikrowirówki z poliwęglanu.

Napełnij probówkę PBS do końcowej objętości 3,2 mililetera i załaduj próbkę do tytanowego stałego wirnika aniołowego. Następnie załaduj wirnik do ultrawirówki stołowej w celu ultrawirowania i ponownie zawieś granulat w 100 mikrolitrach świeżego PBS. W celu śledzenia i analizy ilościowej nanocząstek rozcieńczyć 1 mikrolitr ultrawirowanej próbki w 999 mikrolitrach PBS i załadować próbkę do strzykawki o pojemności 1 mililetera bez pęcherzyków.

Załaduj strzykawkę do portu wlotowego komory badawczej i włącz laser. Użyj przycisku przechwytywania, aby otworzyć aparat i wyregulować ostrość. Następnie nagraj co najmniej trzy różne klatki po 60 sekund każda i użyj opcji procesu wsadowego w oprogramowaniu, aby przeanalizować trzy różne akwizycje.

Aby przygotować próbkę do pobrania, najpierw dodaj odpowiednie eksperymentalne kulki wychwytujące sprzężone z przeciwciałami monoklonalnymi w stosunku 1:1:1 do probówki z mikrowirówką i wymieszaj powstałą pulę kulek wychwytujących. Następnie dodać odpowiednią objętość próbki do 1 mikrolitra puli kulek wychwytujących, aby wygenerować 1 razy 10 do 8 cząstek plus 1,2 razy 10 do 5 kulek na badane stężenie. Dodaj 1 mikrolitr kulek do probówki oznaczonej jako kontrola ujemna i dostosuj objętość w każdej probówce do 100 mikrolitrów ze świeżym PBS.

Następnie umieść probówki w mikserze termicznym, wstrząsając, przy 400 obrotach na minutę i w temperaturze od 4 do 10 stopni Celsjusza na noc. Następnego dnia przenieś próbki na okrągłodenną płytkę 96-dołkową i dodaj odpowiednie przeciwciała koniugowane z fluorescencją do każdej studzienki. Po 1 godzinnej inkubacji w temperaturze od 4 do 10 stopni Celsjusza dodaj 100 mikrolitrów PBS do każdej studzienki i otwórz oprogramowanie do akwizycji.

Wybierz cytometr i program uruchamiający system, aby uruchomić instrument i otworzyć nowy eksperyment. Utwórz szablon eksperymentalny, a następnie wybierz blachę i dodaj blachę. Zaznacz położenie próbek na płycie i kliknij przycisk Ustaw jako źródło próbki.

Wprowadź nazwę próbki w regułach nazewnictwa, otwórz zakładkę kanał i wybierz odpowiednie kanały sygnału kwiatowego. Teraz załaduj płytkę do instrumentu. I kliknij wykres punktowy, aby utworzyć nowy wykres punktowy obszaru rozproszonego do przodu w porównaniu z bocznym obszarem punktowym.

Wybierz opcję Zainicjuj, aby uruchomić laser i fluidykę, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć akwizycję. Dostosuj skalę, aby pokazać populację w środku wykresu punktowego z przodu i z boku, a następnie narysuj bramę koralików wokół całej populacji próbki, aby wykluczyć szczątki. Kliknij przycisk stop and dot plot, aby utworzyć wykres punktowy wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do wykresu punktowego obszaru rozproszenia do przodu i przebramować próbkę w populacji koralików.

Narysuj nową bramę wokół większej populacji i nazwij ją Singlets, a następnie kliknij wykres kropkowy, aby utworzyć jeden wykres punktowy sygnału fluorescencyjnego w funkcji bocznego obszaru rozproszenia, dla każdego użytego eksperymentalnego fluoroforu. Bramka nowego wykresu punktowego na singletach. Następnie wybierz liczbę zdarzeń do zarejestrowania, a następnie wybierz pozycję rekord, aby rozpocząć eksperymentalne pozyskiwanie.

Po zakończeniu analizy załaduj pliki akwizycji do odpowiedniego oprogramowania analitycznego i otwórz nowy protokół. Utwórz wykresy punktowe dla każdego pliku, jak pokazano, i ustaw całą oś punktową na skalę liniową, a całą oś fluorescencyjną na skalę logarytmiczną. Następnie pokaż średnią geometryczną kwiatostanu w odpowiednich kanałach sygnałowych, aby obliczyć pełną zmianę średniej intensywności kwitnienia w różnych preparatach pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Po przetestowaniu różnych warunków w celu ustalenia najmniejszej całkowitej ilości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, aby osiągnąć wczesną fazę wykładniczą średniej krzywej intensywności kwitnienia, minimalną liczbę cząstek określono na 1 razy 10 do 8 cząstek na barwienie. Optymalne stężenie przeciwciała dla 1 razy 10 do 8 cząstek, aby osiągnąć najwyższy sygnał bez niespecyficznego wiązania przeciwciał, określono na 10 mikrogramów na mililitr zarówno dla przeciwciał anty CD9_FITC, jak i anty CD63_PE oraz pięć mikrogramów na mililitr dla przeciwciała anty CD81_PE. Aby potwierdzić przydatność metody do analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w kształcie miseczki, a nie resztek błony, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe poddano sonikacji, co spowodowało spadek średniej intensywności kwitnienia już po 30 sekundach sonikacji, przy czym po jednej minucie mechanicznego zakłócenia w ogóle nie wykryto kwitnienia.

Własne oczyszczenie X z komórek progenitorowych serca, jak wykazano, daje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, wyrażające niskie poziomy CD9 i wysokie poziomy CD63 i CD81 z obu populacji komórek. Co więcej, podczas gdy własne markery powierzchniowe X są wyraźnie identyfikowalne bez ultrawirowania, ten etap wzbogacania znacznie zwiększa średnią intensywność fluorescencji tych markerów. Podczas pracy z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi jest więcej nieostrożnych granulek nanocząstek, które można łatwo przeoczyć.

Dlatego ważne jest, aby wykonać wszystkie kroki, jak pokazano w protokole. Wykorzystanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jako biomarkera jest obecnie jednym z najbardziej rozwijających się badań terenowych. A wkrótce może zostać przełożone na diagnostykę kliniczną stosowaną jako alternatywne narzędzie przesiewowe.