Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Protokół ten opisuje proste i skuteczne badanie przesiewowe supresorów w celu identyfikacji mutacji supresorowych u mutantów, które mają defekt wzrostu drożdży rozszczepialnych. Tradycyjne metody mutagenezy wykorzystują toksyczne chemikalia lub promieniowanie UV, które mogą generować wiele mutacji w komórce. I odwrotnie, protokół ten może wzbogacić pojedynczego mutanta supresorowego w poszczególnych komórkach bez stosowania metod indukujących mutacje.

Rozpocznij tę procedurę od budowy i przygotowania szczepu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj 200 mikrolitrów płynnego podłoża do każdej studzienki 96-dołkowej mikropłytki polistyrenowej. Za pomocą sterylnego aplikatora weź niewielką ilość każdej z przygotowanych kolonii i zawieś każdą kolonię w indywidualnych studzienkach zawierających płynne podłoże.

Dołączyć ślepą próbkę do każdego rzędu na płytce zawierającej 200 mikrolitrów tego samego podłoża. Teraz skonfiguruj protokół w oprogramowaniu do wykrywania czytnika płytek podłączonego do automatycznego czytnika mikropłytek. Ustaw temperaturę na 30 stopni Celsjusza i ustaw program kinetyczny na 24 godziny z częstotliwością odczytu dwóch minut.

Daje to łącznie 721 odczytów w ciągu 24 godzin na odwiert. Ustaw wytrząsanie na ciągłe szybkie wytrząsanie orbitalne. Ustaw odczyty optyczne, aby mierzyć rozproszenie światła na długości fali 600 nanometrów, aby zmierzyć gęstość optyczną i ustaw światło do odczytu spod płytki.

Po 24 godzinach zapisać końcowe odczyty ślepej próby i użyć wzoru w protokole tekstowym w celu określenia objętości potrzebnej do rozcieńczenia każdej z próbek do gęstości optycznej 0,1. Aby przetworzyć wsadowo objętość rozcieńczenia, która ma być użyta z każdego dołka doświadczalnego, należy wyeksportować dane z oprogramowania czytnika płytek i użyć oprogramowania arkusza kalkulacyjnego, aby wstawić ten sam wzór jako funkcję. Co 24 godziny należy używać tej samej pożywki, co w dniu zero, aby rozcieńczyć każdą z próbek do gęstości optycznej 0,1 przy użyciu wzoru.

Upewnij się, że używasz wzoru do rozcieńczenia wszystkich studzienek do gęstości optycznej 0,1. Obejmuje to studnie, które mogły zacząć wykazywać pewną regenerację w swoim dupcie wzrostu. Zapisz wszystkie krzywe wzrostu generowane codziennie.

Zwróć uwagę na każdą pojedynczą kolonię, która wykazuje zwiększone tempo wzrostu, ocenianą na podstawie końcowej gęstości optycznej, która jest znacznie wyższa niż w przypadku reszty kohorty o tym samym tle genetycznym lub na podstawie krzywej wzrostu podobnej do krzywej kolonii typu dzikiego. Ten test trwa zwykle około siedmiu do 14 dni. Wszystkie kroki wykonuj w sterylnych warunkach.

Od ostatniego dnia testu czytnika płytek, niektóre płynne kultury mają zauważalnie odzyskane tempo wzrostu, prawdopodobnie poprzez uzyskanie mutacji supresorowej, która może złagodzić fenotyp mutacji rodzicielskiej. Aby przechowywać fenotypowo odzyskane kultury, przenieś i wymieszaj 250 mikrolitrów płynnej kultury do krioprobówki zawierającej 250 mikrolitrów 50% glicerolu. Błyskawicznie zamroź komórki w ciekłym azocie i zachowaj szczepy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na czas nieokreślony.

Aby potwierdzić, że mutacja supresorowa jest elementem dziedzicznym genetycznie, użyj standardowych metod krzyżowania genetycznego, aby skrzyżować swoje ulubione zmutowane komórki P z ulubionymi zmutowanymi komórkami S. Kiedy dwie haploidalne komórki o uzupełniającym typie kojarzenia są mieszane i poddawane głodowi azotu, mogą wytworzyć zygotę, która zarodnikuje, tworząc tetradę czterech zarodników. Rodzicielski materiał genetyczny ulegnie segregacji podczas mejozy zgodnie z zasadami genetyki mendlowskiej.

Po zarodnikowaniu pojedyncze zarodniki z tych samych tetrad można rozciąć i utworzyć cztery indywidualne kolonie, jak obserwuje się pionowo na płytce. Równomiernie umieść zarodniki jeden po drugim na płytce za pomocą mikroigły. Po rozbiorze pozostaw komórki do wzrostu w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza na kilka dni, aż pojawią się kolonie.

Jeśli mutacja supresorowa jest elementem dziedzicznym genetycznie, ta krzyżówka powinna dać tetrady, w których dwie kolonie mają fenotyp choroby szczepu rodzicielskiego, a dwie kolonie mają tempo wzrostu regeneracji szczepu supresorowego. Wybierz trzy kolonie z fenotypem supresorowym i trzy kolonie z fenotypem rodzicielskim z tej samej krzyżówki genetycznej i kontynuuj etapy ekstrakcji i sekwencjonowania genomowego DNA, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie wykonaj analizę bioinformatyczną w celu identyfikacji mutacji supresorowych, jak opisano w tekście.

Krzywe wzrostu poszczególnych rodzin rejestrowano w początkowym punkcie czasowym i przez sześć dni z ciągłym monitorowaniem za pomocą czytnika płytek. Zgodnie z oczekiwaniami, kolonie typu dzikiego nie wykazują zauważalnych zmian w swoich krzywych wzrostu przez cały czas trwania eksperymentu. Warto zauważyć, że cztery kolonie z tłem delecji elf1 i jedna kolonia z delecją fal1 wykazują dramatyczną zmianę wzrostu od powolnego wzrostu do pewnych różnych poziomów wzrostu, podobnych do kolonii typu dzikiego.

Co dramatyczne, wszystkie mutanty clr6 wykazują konsekwentną regenerację fenotypową, rosnąc w szybszym tempie pod koniec testu. Dwie ze zidentyfikowanych niesynonimicznych zmian, mutacja cue2 i mutacja rpl2702, zostały zrekonstruowane w laboratorium przy użyciu standardowych protokołów mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Podwójne mutanty Cue2 elf1 i podwójne mutanty rpl2702 elf1 skrzyżowano z komplementarnym szczepem mutanta delecji elf1.

Krzyżowanie genetyczne wykazało, że zidentyfikowane mutacje supresorowe są skuteczne w tłumieniu wolno rosnącego fenotypu mutanta delecji elf1 i są dziedziczne. Podczas codziennego rozcieńczania płytki 96-dołkowej ważne jest, aby rozcieńczyć wszystkie studzienki do tego samego stężenia, aby uniknąć powrotu do sztucznego wzrostu. Metoda ta pozwala na izolację mutacji supresorowych w sposób wysokoprzepustowy, przyspieszając odkrycie setek genów, które nie zostały dobrze scharakteryzowane w rozszczepieniu, drożdżach i innych mikroorganizmach.

Metoda ta może być stosowana do izolowania supresorów dla wszystkich mikroorganizmów, które mają mutację powodującą wadę wzrostu i które mogą być hodowane do dużej populacji w płynnej kulturze. Identyfikacja mutacji supresorowych u drożdży rozszczepialnych może mieć potencjalne implikacje w poszukiwaniu genów wywołujących choroby w nakładających się szlakach, zwłaszcza jeśli chodzi o wysoce konserwatywne szlaki od drożdży do ludzi.