Name: Analiza ilościowa składu komórkowego w zaawansowanych zmianach miażdżycowych myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy składu komórkowego w zmianach miażdżycowych myszy z wykorzystaniem barwienia immunofluorescencyjnego. Protokół umożliwia precyzyjną charakterystykę fenotypową komórek mięśni gładkich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Centrum Obrazowania Biologicznego (wspierane przez NIH 1S10OD019973-01) na Uniwersytecie w Pittsburghu za pomoc. Praca ta była wspierana przez Scientific Development Grant 15SDG25860021 od American Heart Association do D.G. R.A.B. był wspierany przez grant NIH F30 HL136188.

<ol><li>GBD DALYs and HALE Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+disability-adjusted+life-years+%28DALYs%29+for+315+diseases+and+injuries+and+healthy+life+expectancy+%28HALE%29%2C+1990-2015%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015.</a> Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).</li>
<li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2018+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).</li>
<li>Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+development+success+rates+for+investigational+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Clinical development success rates for investigational drugs.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).</li>
<li>Bhaskar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+targeting+IL-1+beta+reduce+biomarkers+of+atherosclerosis+in+vitro+and+inhibit+atherosclerotic+plaque+formation+in+Apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice.</a> Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).</li>
<li>Isoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+interleukin-1+receptor+antagonist+modulates+plaque+composition+in+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).</li>
<li>Kirii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+interleukin-1beta+decreases+the+severity+of+atherosclerosis+in+ApoE-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).</li>
<li>Gomez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1%CE%B2+has+atheroprotective+effects+in+advanced+atherosclerotic+lesions+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice.</a> Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).</li>
<li>Daugherty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendation+on+Design%2C+Execution%2C+and+Reporting+of+Animal+Atherosclerosis+Studies%3A+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).</li>
<li>Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifting+the+Focus+of+Preclinical%2C+Murine+Atherosclerosis+Studies+From+Prevention+to+Late-Stage+Intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention.</a> Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).</li>
<li>Kolodgie, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathologic+assessment+of+the+vulnerable+human+coronary+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%22%5BJournal%5D)">Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque.</a> Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).</li>
<li>Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+sudden+coronary+death%3A+a+comprehensive+morphological+classification+scheme+for+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).</li>
<li>Gomez, D., Owens, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis.</a> Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).</li>
<li>Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+differentiation+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease.</a> Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).</li>
<li>Speer, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cells+give+rise+to+osteochondrogenic+precursors+and+chondrocytes+in+calcifying+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries.</a> Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).</li>
<li>Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+histone+modifications+at+specific+gene+loci+in+single+cells+in+histological+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections.</a> Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).</li>
<li>Feil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+to+macrophage-like+cells+during+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis.</a> Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).</li>
<li>Shankman, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLF4-dependent+phenotypic+modulation+of+smooth+muscle+cells+has+a+key+role+in+atherosclerotic+plaque+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis.</a> Nature Medicine. 21, 628(2015).</li>
<li>Cherepanova, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+pluripotency+factor+OCT4+in+smooth+muscle+cells+is+atheroprotective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective.</a> Nature Medicine. 22, 657(2016).</li>
<li>Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+cells+involved+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis.</a> Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).</li>
<li>Chappell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Proliferation+of+a+Subset+of+Differentiated%2C+yet+Plastic%2C+Medial+Vascular+Smooth+Muscle+Cells+Contributes+to+Neointimal+Formation+in+Mouse+Injury+and+Atherosclerosis+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models.</a> Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).</li>
<li>Newman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irradiation+abolishes+smooth+muscle+investment+into+vascular+lesions+in+specific+vascular+beds%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds.</a> JCI Insight. 3 (15), (2018).</li>
<li>Dobnikar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-relevant+transcriptional+signatures+identified+in+individual+smooth+muscle+cells+from+healthy+mouse+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels.</a> Nature Communications. 9 (1), 4567(2018).</li>
<li>Misra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+beta3+regulates+clonality+and+fate+of+smooth+muscle-derived+atherosclerotic+plaque+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 2073(2018).</li>
<li>Majesky, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Smooth+Muscle+Cells+Generate+a+Subpopulation+of+Resident+Vascular+Progenitor+Cells+in+the+Adventitia+Regulated+by+Klf4%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4.</a> Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).</li>
<li>Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Previously+differentiated+medial+vascular+smooth+muscle+cells+contribute+to+neointima+formation+following+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Cell%22%5BJournal%5D)">Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury.</a> Vascular Cell. 6, 21(2014).</li>
<li>Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cell+progenitors+are+primed+to+muscularize+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension.</a> Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).</li>
<li>Bentzon, J. F., Majesky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracking+of+origin+and+fate+of+smooth+muscle+cells+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).</li>
<li>Wirth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G12-G13-LARG-mediated+signaling+in+vascular+smooth+muscle+is+required+for+salt-induced+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension.</a> Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).</li>
<li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> American Journal of Hypertension. 14 (5), Pt 1 405-408 (2001).</li>
<li>Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+simultaneous+measurement+of+mouse+systolic+arterial+blood+pressure+by+radiotelemetry+and+tail-cuff+methods%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).</li>
<li>Durgin, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cell-specific+deletion+of+Col15a1+unexpectedly+leads+to+impaired+development+of+advanced+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).</li>
<li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification%3A+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li>
<li>Lin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx2+Deletion+in+Smooth+muscle+Cells+Inhibits+Vascular+Osteochondrogenesis+and+Calcification+but+not+Atherosclerotic+Lesion+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation.</a> Cardiovascular Research. , (2016).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+Bioscience+Research+Reporting%3A+The+ARRIVE+Guidelines+for+Reporting+Animal+Research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research.</a> PLoS Biology. 8 (6), 1000412(2010).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li>
<li>Nishioka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+inadequate+compensatory+enlargement+to+development+of+human+coronary+artery+stenosis%3A+An+in+vivo+intravascular+ultrasound+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).</li>
<li>Pasterkamp, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+Arterial-Wall+Shrinkage+May+Contribute+to+Luminal+Narrowing+of+Human+Atherosclerotic+Femoral+Arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries.</a> Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).</li>
<li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).</li>
<li>Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+and+characterization+of+atherosclerotic+lesions+in+the+murine+aortic+sinus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus.</a> Journal of Visual Experiments. (82), 50933(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomimo dziesięcioleci badań i postępu technicznego w badaniu miażdżycy, dziedzina ta ma rozczarowującą historię przekładania wyników naukowych na terapie kliniczne34,35. Zjawisko to można częściowo wyjaśnić rozbieżnościami w modelach zwierzęcych, projektach eksperymentalnych i analizach zmian. W tym miejscu opisujemy eksperymentalny potok, który wykorzystaliśmy do analizy składu komórkowego w zaawansowanych zmianach miażdżycowych przy użyciu myszy śledzących lini...

Miażdżyca jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie, leżącą u podstaw większości chorób wieńcowych, chorób tętnic obwodowych i udaru mózgu. Późne stadium miażdżycy tętnic wieńcowych może prowadzić do poważnych powikłań, w tym zawału mięśnia sercowego, odpowiadającego za prawie 16% śmiertelności populacji światowej1,2. Ze względu na jego niszczycielski wpływ na zdrowie publiczne, podjęto znaczne wysiłki w celu rozszyfrowania mechanizmów kierujących postępem miażdżycy, a także opracowania nowych strategii terapeutycznych. Jednak wskaźnik prawdopodobieństwa zatwierdzenia (LOA) badań klinicznych dotyczących chorób sercowo-naczyniowych jest jednym z najniższych w porównaniu z innymi dziedzinami klinicznymi (tylko 8,7% dla fazy I)3. Można to częściowo wytłumaczyć wieloma barierami, jakie miażdżyca stwarza dla skutecznego opracowywania leków, w tym jej niemal wszechobecnym charakterem, klinicznie cichym postępem i znaczną różnorodnością choroby. Co więcej, nieoptymalna konstrukcja przedklinicznych badań na zwierzętach może być również odpowiedzialna za brak powodzenia w translacji klinicznej. W szczególności uważamy, że konieczne jest przeprowadzenie badań interwencyjnych, gdy tylko jest to możliwe, w celu zbadania skuteczności strategii terapeutycznych. Istnieje również pilna potrzeba przeprowadzenia ustandaryzowanych procedur analizy zmian chorobowych, w tym zaawansowanej charakterystyki składu komórkowego późnych stadiów zmian miażdżycowych poprzez mapowanie losu i fenotypowanie.
Zdecydowana większość badań nad miażdżycą skupia się na modelach zapobiegania miażdżycy, polegających na leczeniu farmakologicznym lub manipulacji genami (knockout lub knock-in) u zdrowych, młodych myszy, przed rozpoczęciem i progresją choroby. Badania te ujawniły dużą liczbę genów i cząsteczek sygnałowych, które odgrywają rolę w rozwoju miażdżycy. Jednak większość z tych celów nie przełożyła się na skuteczne terapie u ludzi. Rzeczywiście, trudno jest ekstrapolować wpływ terapii na zdrowe młode myszy na starszych pacjentów z zaawansowanymi zmianami miażdżycowymi. W związku z tym wdrożenie badań interwencyjnych w przedklinicznym procesie eksperymentalnym prawdopodobnie zapewni dokładniejszy obraz znaczenia i skuteczności nowego środka terapeutycznego. Pomysł ten jest wspierany przez uderzająco rozbieżne efekty hamowania prozapalnej cytokiny Interleukina-1β (IL-1β) przy zastosowaniu profilaktyki4,5,6 lub strategia interwencji7. Różnice między badaniami prewencyjnymi i interwencyjnymi sugerują, że różne procesy komórkowe zachodzą w różnych fazach rozwoju miażdżycy i podkreślają fakt, że badania prewencyjne są prawdopodobnie niewystarczające, aby odpowiednio modelować scenariusz kliniczny.
Amerykańskie Towarzystwo Kardiologiczne niedawno opublikowało naukowe oświadczenie, w którym szczegółowo opisuje zalecenia dotyczące prawidłowego projektowania eksperymentów, standaryzacji procedur, analizy i raportowania badań nad miażdżycą na zwierzętach8. Podkreśla korzyści i ograniczenia dominujących technik stosowanych w tej dziedzinie. Na przykład barwienie aorty en face Sudan IV jest często wykonywane jako pierwszy odczyt. Chociaż barwienie osadów lipidowych en face Sudan IV jest odpowiednią metodą oceny globalnego obciążenia blaszką miażdżycową, nie jest w stanie odróżnić zmian smugowych we wczesnym stadium od bardziej zaawansowanych zmian w późnym stadium. W związku z tym interpretacja barwienia en face jest często niejednoznaczna i powierzchowna9. Dokładna analiza przekrojów poprzecznych tkanek przy użyciu parametrów morfologicznych naczynia, zmiany chorobowej i wielkości światła oraz kwantyfikacja wskaźników stabilności zmiany zapewnia dokładniejsze zrozumienie efektu eksperymentu.
Na koniec, badania histopatologiczne na ludziach sugerują, że skład komórkowy jest lepszym predyktorem pęknięcia niż sama wielkość zmiany, przy czym zmiany ubogie w komórki mięśni gładkich (SMC) i bogate w makrofagi są bardziej podatne na pęknięcie10,11. Obserwacje te opierały się na barwieniu markerów klasycznie stosowanych do identyfikacji komórek (tj. ACTA2 dla SMC i LGALS3 lub CD68 dla makrofagów). Jednak ekspresja tych markerów nie jest ściśle ograniczona do pojedynczego typu komórek w zmianach miażdżycowych ze względu na plastyczność wielu linii, w tym SMC, komórek śródbłonka i komórek szpikowych12. W szczególności jednoznaczna identyfikacja SMC w obrębie zmiany miażdżycowej była praktycznie niemożliwa aż do ostatniej dekady ze względu na właściwość tych komórek do deróżnicowania i tłumienia genów markerowych specyficznych dla linii (proces określany jako przełączanie fenotypowe) w uszkodzonych lub chorych naczyniach13. To ograniczenie w identyfikacji SMC zostało ominięte przez rozwój śledzenia linii7,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Polega ona na trwałym znakowaniu SMC i ich potomstwa w celu śledzenia ich losu i ewolucji fenotypowej podczas progresji miażdżycy przy użyciu kombinacji ekspresji rekombinazy Cre napędzanej przez promotory specyficzne dla SMC (tj. Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23,24, Acta225,26 i, SM22α14,16) oraz aktywacja reporterów (np. białek fluorescencyjnych, β-galaktozydazy) [recenzja w Bentzon i Majesky 201827]. W jednym z pierwszych badań wykorzystujących śledzenie linii SMC poza środowiskiem embriogenezy, Speer i wsp.14 dostarczyli dowodów na to, że SMC może modulować swój fenotyp i transróżnicować się w komórki chondrogenne podczas zwapnienia naczyń krwionośnych przy użyciu modelu śledzenia linii SM22α Cre R26R LacZ. Chociaż badania te zapoczątkowały śledzenie linii SMC, były one częściowo niejednoznaczne, ponieważ każdy dany pojazd niewyrażający SM22α w otoczeniu choroby byłby znakowany przez osobę zgłaszającą. Ograniczenie to zostało ominięte dzięki opracowaniu i zastosowaniu induplikowanego tamoksyfenem Cre ERT/LoxP, co pozwala na czasową kontrolę znakowania komórek. Znakowanie komórek zachodzi wyłącznie podczas dostarczania tamoksyfenu i będzie ograniczone do komórki wykazującej ekspresję promotora specyficznego dla typu komórki napędzającego ekspresję Cre ERT w czasie ekspozycji na tamoksyfen, unikając śledzenia alternatywnych typów komórek aktywujących Cre w warunkach progresji choroby. Do śledzenia linii SMC w miażdżycy, indukowany tamoksyfenem transgen Myh11-Cre/ERT2 związany z reporterami fluorescencyjnymi (eYFP7,15,17,18,21, mTmG19,25, Confetti20,22,23 dla badań nad ekspansją klonalną) wykazał niezwykłą skuteczność i specyficzność w znakowaniu SMC i został wykorzystany do mapowania losów populacji SMC w zmianach miażdżycowych w ostatnich badaniach. Co ważne, badania te wykazały, że: 1) 80% SMC w zaawansowanych zmianach miażdżycowych nie wykazuje ekspresji żadnych konwencjonalnych markerów SMC (ACTA2, MYH11) stosowanych w analizie immunohistologicznej, a zatem zostałoby błędnie zidentyfikowane bez śledzenia linii17; 2) podzbiory markerów ekspresji SMC alternatywnych typów komórek, w tym markery makrofagów lub markery mezenchymalnych komórek macierzystych<klasa sup="xref">16,<klasa sup="xref">17,<klasa sup="xref">19; oraz 3) SMC inwestuje i wypełnia zmianę miażdżycową poprzez ekspansję oligoklonalną, a klony SMC zachowują plastyczność, aby przejść do fenotypowo różnych populacji20,23. Podsumowując, jest teraz jasne, że komórki mięśni gładkich wykazują niezwykłą różnorodność fenotypową w zmianach miażdżycowych i mogą odgrywać korzystną lub szkodliwą rolę w patogenezie zmian w zależności od charakteru ich przemian fenotypowych. Odkrycia te stanowią niezwykłą nową drogę terapeutyczną ukierunkowaną na przemiany fenotypowe promujące miażdżycę SMC w późnym stadium miażdżycy.
Niniejszym proponujemy ustandaryzowany protokół analizy zmian miażdżycowych w późnym stadium u myszy, w tym systematyczne metody selekcji zwierząt, osadzania, cięcia, barwienia i kwantyfikacji zmian w tętnicy ramienno-głowowej. Aby określić wpływ inhibicji interleukiny-1β na los i fenotyp SMC, użyliśmy myszy śledzących linię SMC ApoE-/- karmionych zachodnią dietą przez 18 tygodni przed otrzymaniem cotygodniowych wstrzyknięć przeciwciała anty-IL1β lub kontroli IgG dopasowanej izotypem.

<table><tbody><tr><td>16% wodny roztwór paraformaldehydu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>RT 15710</td><td>Perfuzja i utrwalanie tkanek</td></tr><tr><td>Igła motylkowa 23G</td><td>Fisher</td><td>BD367342</td><td></td></tr><tr><td>Igła 25G</td><td>Fisher</td><td>14-821-13D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny A1</td><td>Mikroskop konfokalny</td><td>firmy Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało ACTA2-FITC (mysz)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3777</td><td>Przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>Alexa-647 przeciw kozie</td><td>Invitrogen</td><td>A-21447</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Antygen Roztwór demaskujący, na bazie kwasu cytrynowego</td><td>Vector Labs</td><td>H-3300</td><td>Roztwór do odzyskiwania antygenu</td></tr><tr><td>Dieta</td> <td>chowHarlan Teklad</td><td>TD.7012</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>12-544-14</td><td>Dowolna szklanka nakrywkowa 50 x 24 mm</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Jądro fluorescencyjne przeciwbarwiące</td></tr><tr><td>osioł Alexa-488 anty-królik</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Donkey Alexa-555 anty-szczury</td><td>Abcam</td><td>ab150154</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>DPBS 10X bez wapnia i magnezu</td><td>Gibco</td><td>14200166</td><td>PBS do rozcieńczania roztworu i przemywania roztworu. Rozcieńczyć do 1x w wodzie dejonizowanej</td></tr><tr><td>Kaseta do zatapiania</td><td>Fisher</td><td>15-182-701D Rura</td><td></td></tr><tr><td>próżniowa ETDA</td><td>Fisher</td><td>02-685-2B</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka piankowa</td><td>Fisher</td><td>22-222-012</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry ryb</td><td>zimnowodnych Sigma Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało GFP (koza)</td><td>abcam</td><td>ab6673</td><td>Pierwszorzędowe przeciwciało</td></tr><tr><td>kozie IgG kontrola</td><td>Vector Labs</td><td>I-5000</td><td>IgG kontrola</td></tr><tr><td>Dieta wysokotłuszczowa</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.88137</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Program komputerowy https://imagej.nih.gov/ij/&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało LGALS3 (szczur)</td><td>Cedarlane</td><td>CL8942AP</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny LSM700</td><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, Superfrost Plus</td><td>Ostrza</td> mikrotomu Fisher <td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td></td><td>30-538-35</td><td></td></tr><tr><td>Mysz</td> kontrola <td>IgG Vector Labs</td><td>I-2000</td><td>IgG control</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania elementów NIS</td><td>Nikon</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania do akwizycji obrazu z-stack</td></tr><tr><td>Normal Horse surowica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Pap Pen</td><td>Fisher</td><td>50-550-221</td><td></td></tr><tr><td>Olej arachidowy</td><td>Sigma</td><td>P2144</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold Antifade mocowanie</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Medium montażowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Kontrola IgG królika</td><td>Vector Labs</td><td>I-1000</td><td>Kontrola IgG</td></tr><tr><td>Kontrola IgG</td><td>Szczura Vector Labs</td><td>I-4000</td><td>Kontrola IgG</td></tr><tr><td>Przeciwciało RUNX2 (królik)</td><td>Abcam</td><td>ab192256</td> Strzykawka <td>z przeciwciałem pierwotnym</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>309628</td><td>Strzykawka 1 ml</td></tr><tr><td>Tamoksyfen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher</td><td>X55K-4</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania Zen</td><td>Oprogramowanie Zeiss</td><td></td><td>Imaging do akwizycji obrazów z-stack</td></tr></tbody></table>

analiza ilościowa składu komórkowego w zaawansowanych zmianach miażdżycowych myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Miażdżyca pozostaje główną przyczyną zgonów na całym świecie i, pomimo niezliczonych badań przedklinicznych opisujących obiecujące cele terapeutyczne, nowe interwencje pozostają nieuchwytne. Jest to prawdopodobnie częściowo spowodowane poleganiem na przedklinicznych modelach prewencji badających wpływ manipulacji genetycznych lub leczenia farmakologicznego na rozwój miażdżycy, a nie na ustaloną chorobę. Ponadto wyniki tych badań są często mylące ze względu na stosowanie powierzchownych analiz zmian chorobowych i brak charakterystyki populacji komórek uszkodzonych. Aby pomóc w pokonaniu tych przeszkód translacyjnych, proponujemy większe poleganie na modelach interwencyjnych, które wykorzystują badanie zmian w składzie komórkowym na poziomie pojedynczej komórki za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i mikroskopii konfokalnej. W tym celu opisujemy protokół testowania przypuszczalnego środka terapeutycznego w mysim modelu interwencji, w tym systematyczne podejście do sekcji zwierząt, osadzania, cięcia, barwienia i kwantyfikacji zmian w tętnicy ramienno-głowowej. Ponadto, ze względu na różnorodność fenotypową komórek w późnym stadium zmian miażdżycowych, opisujemy znaczenie stosowania specyficznych dla komórek, indukowalnych systemów śledzenia linii myszy i jak można to wykorzystać do bezstronnej charakterystyki populacji komórek zmian miażdżycowych. Razem te strategie mogą pomóc biologom naczyniowym w dokładniejszym modelowaniu interwencji terapeutycznych i analizie choroby miażdżycowej i, miejmy nadzieję, przełożą się na wyższy wskaźnik sukcesu w badaniach klinicznych.

Myszy Myh11-Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe-/- otrzymały iniekcje tamoksyfenu między szóstym a ósmym tygodniem życia, przed wprowadzeniem diety wysokotłuszczowej. Po 18 tygodniach karmienia dietą wysokotłuszczową dwie grupy po osiem myszy otrzymywały cotygodniowo albo mysi przeciwciało monoklonalne anty-IL-1β, albo kontrolne IgG izotypowe w dawce 10 mg/kg przez 8 tygodni (Rysunek 1)7. Myszy uśmiercono i poddano perfuzji roz...

Proponujemy ustandaryzowany protokół do scharakteryzowania składu komórkowego późnych zmian miażdżycowych u myszy, w tym systematyczne metody preparacji zwierząt, osadzania tkanek, cięcia, barwienia i analizy tętnic ramienno-głowowych od myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich w atheroprone.

Analiza ilościowa składu komórkowego w zaawansowanych zmianach miażdżycowych myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Nasz protokół pomaga badaczom wdrażać ustandaryzowane procedury eksperymentalne do przeprowadzania charakterystyki fenotypowej podobnych populacji za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Dzięki tej technice naukowcy mogą rygorystycznie analizować podobny skład złożonych tkanek chorobowych oraz przeprowadzać analizy jakościowe i ilościowe fenotypów interesujących typów komórek. Procedurę zademonstruje Sidney Mahan, technik z mojego laboratorium.Aby przygotować zwierzę do pobrania tętnicy ramienno-głowowej, przetnij otrzewną aż do mostka, uważając, aby nie uszkodzić tkanek jamy brzusznej. I wykonaj dwa nacięcia na linii środkowej pachy przez klatkę piersiową, uważając, aby nie uszkodzić serca i płuc. Następnie przetnij membranę, aby częściowo odsłonić serce.Aby obficie wykorzystać mysz, zainstaluj system profuzji grawitacyjnej tak, aby ciśnienie płynu profuzyjnego było równoważne średniemu ciśnieniu krwi u myszy, aby umożliwić stałą obfitość i utrzymanie morfologii naczynia. Następnie nasyc zwierzę pięcioma mililitrami PBS o temperaturze pokojowej, 10 mililitrami 4% paraformaldehydu o temperaturze pokojowej i pięcioma dodatkowymi mililitrami PBS o temperaturze pokojowej. Podłącz igłę motylkową o rozmiarze 23 lub 25 do systemu profuzji grawitacyjnej i przeprowadź PBS przez igłę, aby usunąć powietrze z rurek przed włożeniem igły do lewej komory.Po zamocowaniu igły na miejscu, użyj nożyczek do tęczówki, aby wykonać mniej niż dwucentymetrowe nacięcie w prawym przedsionku. Zbierz interesujące Cię tkanki na świeży 4% paraformaldehyd. Aby odsłonić tętnicę ramienno-głowową, użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej mostka przez manubrium i użyj kleszczy, aby pociągnąć obie strony klatki piersiowej, aby całkowicie otworzyć jamę klatki piersiowej.Następnie umieść zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym, aby częściowo uwidocznić tętnice szyjne i użyj cienkiej pęsety, aby pociągnąć mięśnie, tkankę łączną i tłuszcz, aż prawa tętnica szyjna, tętnica ramienno-głowowa, rozwidlenie podobojczykowe i łuk aorty zostaną oczyszczone i odizolowane od otaczającej tkanki łącznej i tłuszczu. Następnie użyj kleszczy, aby chwycić prawą tętnicę szyjną poniżej jej rozwidlenia i wykonaj wstępne cięcie nad kleszczami. Mimo to, trzymając tętnicę szyjną, wykonaj drugie przecięcie przez tętnicę podobojczykową i wykonaj ostatnie dwa cięcia przez łuk aorty po obu stronach tętnicy ramienno-głowowej.Następnie zbierz wszelkie inne interesujące tkanki naczyniowe i umieść tętnicę ramienno-głowową i inne tkanki w 4% roztworze paraformaldehydu na noc w temperaturze pokojowej. Do barwienia immunofluorescencyjnego tętnicy ramienno-głowowej należy użyć mikrotomu, aby uzyskać 10 mikrometrów przekrojów przez próbkę tkanki zatopionej w parafinie, aż będzie można potwierdzić za pomocą mikroskopii świetlnej, że łuk aorty został przecięty i widoczna jest tętnica ramienno-głowowa. Dostosuj orientację bloku, aż tkanka będzie całkowicie prostopadła do ostrza mikrotomu i uzyskaj trzy szeregowe odcinki tętnicy ramienno-głowowej o grubości 10 mikrometrów na szkiełko podstawowe, aż do osiągnięcia rozwidlenia podobojczykowego.Po zebraniu wszystkich skrawków należy uwodnić próbki tkanek pod kapturem chemicznym za pomocą dwóch pięciominutowych zanurzeń w ksylenie, a następnie pięciominutowej serii zanurzeń etanolu, jak wskazano, i dwóch pięciominutowych zanurzeń w wodzie dejonizowanej. Następnie inkubować szkiełka w roztworze do pobierania antygenu, zgodnie ze standardowymi protokołami, a następnie podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 20 minut. Po godzinnym schłodzeniu w temperaturze pokojowej użyj hydrofobowego pisaka, aby owinąć każdy fragment tkanki.I zablokuj wszelkie niespecyficzne powiązania za pomocą bufora blokującego na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji oznacz próbki tkanek przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą głównego koktajlu przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania lub przeciwciał kontrolnych IgG dopasowanych izotypem. Następnego ranka przemyj szkiełka trzy razy w PBS przez pięć minut na pranie, a następnie godzinną inkubację w odpowiednim koktajlu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych fluorescencyjnie i DAPI w celu wizualizacji jądra.Następnie użyj podłoża montażowego odpowiedniego do mikroskopii fluorescencyjnej, aby zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach. Do obrazowania mikroskopii konfokalnej znakowanych skrawków tkanek należy użyć skrawków wybarwionych kontrolą IgG i przeciwciałami pierwotnymi, aby ustawić czułość detektora, moc lasera i przesunięcie dla każdego kanału z osobna. Następnie ustaw górną i dolną pozycję dla akwizycji z-stack oraz określ grubość i liczbę stosów do zobrazowania.Po pobraniu wszystkich obrazów otwórz obrazy w programie ImageJ i otwórz panel narzędzi kanałów, a następnie pokoloruj pseudo różne kanały barwienia. Scalanie kanałów kolorów. Wszystkie kanały powinny stać się widoczne na tym samym obrazie.Włącz lub wyłącz poszczególne kanały kolorów w panelu narzędzi kanałów, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę zliczania, aby wybrać narzędzie wielopunktowe. Kliknij dwukrotnie ikonę liczenia, aby otworzyć panel narzędzi punktów i wybierz typ i rozmiar elementów używanych do liczenia komórek. Zaznacz opcję pokaż wszystko i włącz tylko kanał DAPI w panelu narzędzi kanału.Następnie wybierz kanał licznika zero i kliknij na poszczególne jądra, które mają zostać oznaczone, przewijając stosy z, aby policzyć wszystkie jądra barwione w obszarze zainteresowania. Liczba ilościowo określonych zdarzeń jednokomórkowych zostanie wskazana poniżej w panelu narzędzi punktów. Gdy wszystkie jądra zostaną oznaczone, włącz kolejny kanał barwienia i wybierz pierwszy kanał przeciwstawny, aby oznaczyć komórki, w których występuje kolokalizacja między DAPI a barwieniem przeciwciał.Do barwienia cytoplazmatycznego wybierz komórki z barwieniem otaczającym jądro na całej głębokości jądra, sprawdzając w razie potrzeby wiele stosów z. Wyniki można następnie wyrazić jako liczbę komórek do całkowitej liczby komórek DAPI dodatnich lub liczbę komórek na obszar w obszarze zainteresowania. Barwienie immunofluorescencyjne przeciwciałami skierowanymi przeciwko markerom fenotypowym, jak pokazano, pozwala na uzyskanie obrazów każdego pojedynczego barwienia markera i kontrastu interferencji różnicowej w celu wyznaczenia obszarów zainteresowania do zliczania pojedynczych komórek.Zliczanie pojedynczych komórek w celu określenia liczebności różnych populacji pochodzących z komórek mięśni gładkich można następnie przeprowadzić za pomocą ImageJ. Na przykład analiza zliczania pojedynczych komórek w regionie czapeczki włóknistej tych reprezentatywnych przekrojów wykazała niezwykłe różnice w składzie komórkowym obszaru czapeczki włóknistej między myszami leczonymi przeciwciałem beta anty IL-1 a myszami traktowanymi kontrolą IgG dopasowaną do izotypu. Rzeczywiście, hamowanie IL-1 beta wiązało się ze spadkiem komórek mięśni gładkich YFP-dodatnich i wzrostem komórek galektyno-3-dodatnich.Ponadto zaobserwowano zmniejszenie liczby komórek mięśni gładkich aorty alfa-aktynowo-dodatnich YFP-dodatnich. Natomiast względna liczba makrofagów galektyno-dodatnich 3-dodatnich pochodzących z komórek mięśni gładkich YFP-dodatnich była znacznie zwiększona w obu lokalizacjach tętnicy ramienno-głowowej. Warto zauważyć, że hamowanie IL-1 beta nie wpłynęło na ogólną liczbę komórek osteochondrogennych w obrębie zmiany ani na odsetek komórek chondrogennych pochodzących z komórek mięśni gładkich lub makrofagów.Protokół ten został opracowany w celu zwiększenia rygoru i powtarzalności analizy zmian miażdżycowych poprzez standaryzację kluczowych etapów, takich jak pobieranie, przetwarzanie i cięcie tkanek, a także liczenie pojedynczych komórek. Protokół ten może być wykorzystany do analizy dodatkowych łożysk naczyniowych podatnych na zmiany miażdżycowe, w tym aorty i korzenia aorty.

quantitative-analysis-cellular-composition-advanced-atherosclerotic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analiza ex vivo zmian w tętnicach z modeli zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych klasycznie opiera się na technikach histologicznych i immunohistochemicznych. Zapewniają one 2-wymiarowe pomiary w 3-wymiarowych zmianach. W artykule opisano generowanie zmian tętniczych do analizy ilościowej w 3 wymiarach z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej.

Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Opisujemy procedury ilościowego określania i charakteryzowania zmian miażdżycowych w modelach mysich, wykorzystując precyzyjne przekroje zatoki aortalnej aorty i aorty wstępującej w połączeniu z analizą histochemiczną i immunohistochemiczną.

Analiza ilościowa i charakterystyka zmian miażdżycowych w mysiej zatoce aortalnej

Ten film pokazuje dwa modele rozwoju blaszki miażdżycowej w tętnicach mysich i podkreśla różnice w przeroscie mięśniowo-brzuszkowym i miażdżycy.

Wywoływanie przerostu mięśniowo-wewnętrznego, a miażdżyca u myszy: wprowadzenie dwóch prawidłowych modeli

Zwapnienie naczyń krwionośnych jest ważnym czynnikiem predykcyjnym i przyczyniającym się do chorób sercowo-naczyniowych u ludzi. Protokół ten opisuje metody indukowania zwapnienia hodowanych pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz ilościowego określania zwapnienia i obciążenia makrofagami w aorcie zwierzęcej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni.

zwapnienie komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz obrazowanie zwapnień i stanów zapalnych aorty

To badanie opisuje inwazyjną procedurę indukcji przyspieszonej miażdżycy u myszy. W porównaniu z innymi metodami wykorzystującymi urazy wywołane elektrycznością lub kriogenicznością, uraz wywołany mechanicznie naśladuje ludzki stan restenozy po terapiach rewaskularyzacyjnych i jest idealny do badania zaangażowanych mechanizmów molekularnych.

Indukcja przyspieszonej miażdżycy u myszy: model "urazu drutowego"

Protokoły badania embrionalnej i okołoporodowej mysiej aorty za pomocą analizy klonalnej in vivo i mapowania losu, eksplantatów aorty i izolowanych komórek mięśni gładkich są szczegółowo opisane tutaj. Te różnorodne podejścia ułatwiają badanie morfogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej w prawidłowym rozwoju oraz patogenezy choroby.

Wykorzystanie metod in vivo oraz eksplantatów tkanek i komórek do badania morfogenezy i patogenezy aorty embrionalnej i okołoporodowej

Opisujemy protokół indukowania miażdżycy w korzeniu aorty myszy ApoE-/- karmionych dietą aterogenną, poprzez ciągłe uwalnianie aldosteronu. Opisano również metody charakteryzowania składu płytki nazębnej.

Indukcja blaszek miażdżycowych poprzez aktywację receptorów mineralokortykoidowych u myszy z niedoborem apolipoproteiny E

Mysie modele miażdżycy są użytecznymi narzędziami do badania szlaków patogennych na poziomie molekularnym, ale wymagają standaryzowanej kwantyfikacji rozwoju zmian. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę określania wielkości zmiany w głównych naczyniach tętniczych, w tym w korzeniu aorty, łuku aortalnym i tętnicy ramienno-głowowej.

Kwantyfikacja miażdżycy u myszy

Ten protokół krok po kroku przeprowadza procedurę analizy obciążenia miażdżycowego u myszy. Badacze mogą użyć tego protokołu do porównania obfitości, lokalizacji i wielkości zmian miażdżycowych u różnych zwierząt.

Obrazowanie i analiza zmian całej aorty barwionych czerwienią olejową O w mysim modelu hiperlipidemii tętniaka

Ten protokół dostarcza kompleksową metodologię analizy ilościowej blaszek miażdżycowych, aby ułatwić bardziej dogłębne badania nad mechanizmami i postępem miażdżycy.

Izolacja i analiza zmian łuku aorty i korzeni w mysim modelu miażdżycowym

Poznaj metodę ilościowej analizy składu komórkowego w zmianach miażdżycowych myszy z wykorzystaniem barwienia immunofluorescencyjnego. Protokół umożliwia precyzyjną charakterystykę fenotypową komórek mięśni gładkich.

Analiza ilościowa składu komórkowego w zaawansowanych zmianach miażdżycowych myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich

Przeglądaj więcej filmów