Przygotowanie próbki do analizy proteomicznej mikronaczyń oka w oparciu o spektrometrię mas

Przygotowanie wysokiej jakości próbek zgodnych ze spektrometrią mas do kompleksowej analizy proteomu próbek oka ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów molekularnych i szlaków sygnałowych związanych ze zdrowiem i chorobą. Opisany przepływ pracy reprezentuje proste, ale solidne podejście do rygorystycznych etapów przygotowania próbek, przeznaczonych specjalnie do analizy próbek o ograniczonej masie, takich jak mikronaczynia krwionośne oka. Chociaż głównym celem badania jest ustalenie metodologii zgodnej ze stwardnieniem rozsianym dla naczyń krwionośnych oka, opisany przepływ pracy może być szeroko stosowany do różnych próbek komórkowych i tkankowych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć trudności, ponieważ identyfikacja i izolacja wybranej krótkiej tylnej tętnicy rzęskowej lub gałęzi SPCA może być wyzwaniem. Świeże oczy świń wraz z tkankami nerwu wzrokowego i zewnątrzgałkowego pobrano z lokalnej rzeźni bezpośrednio po sekcji zwłok. Umieść gałkę oczną w komorze separacyjnej zawierającej lodowaty bufor Krebsa-Henseleita.

Ostrożnie odetnij otaczające mięśnie i tkanki ostrymi nożyczkami Mayo. Wykonaj nacięcie skalpelem i przetnij kulę ziemską wzdłuż płaszczyzny równikowej ostrymi nożyczkami Mayo, aż oko zostanie rozdzielone na przednią i tylną połowę. Usuń jak najwięcej ciała szklistego z tylnej połowy oka za pomocą pary standardowych kleszczy.

Po użyciu szpilek preparacyjnych do ostrożnego przygwożdżenia tylnej połowy oka, delikatnie odetnij tkanki łączne otaczające nerw wzrokowy, aby odsłonić leżące poniżej unaczynienie zagałkowe za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas. Odizoluj przywzrokową i dystalną krótką tylną tętnicę rzęskową wraz z otaczającymi tkankami łącznymi za pomocą pary precyzyjnych pęset typu piątego i nożyczek do kapsulotomii Vannasa. Delikatnie usuń tkanki łączne z odcinków tętnic za pomocą pęsety i nożyczek z bardzo cienką końcówką, a następnie przepłucz izolowane tętnice w lodowatym PBS w celu usunięcia zanieczyszczeń i pozostałości krwi.

Pobrać tętnice z dwóch oczu, aby uzyskać jedną kontrpróbę biologiczną, a następnie zważyć próbki za pomocą wagi analitycznej. Do każdej probówki dodaj mieszaninę 0,5 i jednomilimetrowych kulek tlenku cyrkonu, a następnie odczynnik do ekstrakcji białek tkankowych. Teraz załaduj probówki z próbkami do homogenizatora blendera.

Ustaw minutnik na dwie minuty, ustaw poziom prędkości na sześć i rozpocznij homogenizację. Po uruchomieniu należy sprawdzić próbki pod kątem pełnej homogenizacji i przechowywać próbki na lodzie pomiędzy każdym cyklem. Powtarzać cykl, aż próbki zostaną całkowicie zhomogenizowane.

Ostrożnie pipetować homogenację do świeżych probówek do mikrowirówek. Odwirować próbki w temperaturze 10 000 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu osadzenia nierozpuszczalnych białek. Ostrożnie odpipetować supernatant zawierający rozpuszczalne białka, nie dotykając warstwy osadu, i przenieść do świeżych probówek do mikrowirówek.

Dodaj 200 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego 2A i pięć mikrolitrów koktajlu inhibitorów proteazy do każdej próbki granulek. Następnie kilkakrotnie zawiesić osad za pomocą pipety. Użyj homogenizatora ultradźwiękowego, aby całkowicie zhomogenizować granulki.

Ustaw amplitudę na 60 i przełączaj na jeden. Użyj sondy wykonanej z tytanu, który jest odpowiedni do homogenizacji próbek o małych objętościach. Zanurz sondę w mieszaninie osadów i ekstrakcyjnych na lodzie i naciśnij przycisk start.

Sonizuj próbkę, aż grudki osadu zostaną całkowicie zhomogenizowane, zatrzymując się na kilka sekund między każdą sonikacją. Sprawdź wizualnie pełną homogenizację. Wymieszaj homogenat kilka razy pipetą, aby upewnić się, że nie ma grudek.

Do tej procedury należy użyć odśrodkowych urządzeń filtrujących z odcięciem trzech kilodaltonów. Włóż trzykilodaltonową jednostkę filtrującą odcinający do probówki mikrowirówkowej. Odpipetować 200 mikrolitrów próbki homogenizować do jednego urządzenia filtrującego i dodać 200 mikrolitrów wody dejonizowanej do tego samego filtra.

Po szczelnym zamknięciu umieść jednostkę filtrującą w wirówce i wiruj przez 14 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu oddzielić jednostkę filtrującą zawierającą koncentrat próbki od probówki mikrowirówki zawierającej filtrat, odrzucając filtrat. Koncentrat należy rozpuścić, dodając 400 mikrolitrów wody dejonizowanej do jednostki filtrującej.

Po trzykrotnym powtórzeniu filtracji ostrożnie odpipetować oczyszczoną próbkę koncentratu do czystej mikroprobówki. Przygotować próbki do jednowymiarowej elektroforezy żelowej, zgodnie z wykazem w protokole tekstowym, i dobrze wymieszać pipetą. Podgrzewać próbki w temperaturze 70 stopni Celsjusza w suchym bloku grzewczym przez 15 minut i schłodzić do temperatury pokojowej.

Ostrożnie załadować 50 mikrogramów próbki na linię za pomocą pipety, a także wstępnie wybarwiony wzorzec białka jako marker masy cząsteczkowej. Uruchom żele na około 60 minut przy stałym napięciu 175 woltów. Pod koniec cyklu ostrożnie usuń żel z płytki kasety za pomocą noża do żelu i przenieś żel do pudełka do barwienia żelu.

Wykonaj utrwalanie i barwienie żelu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wstrząśnij żelami w roztworze barwiącym przez noc, aby uzyskać najlepsze ogólne rezultaty. Ostrożnie zdekantuj roztwór barwiący i zastąp go 200 mililitrami wody dejonizowanej przed potrząsaniem żelami przez co najmniej siedem do ośmiu godzin w wodzie, aby oczyścić tło.

Wyciąć pasma białkowe z żelu za pomocą czystych nowych ostrzy mikrotomu. Pokrój opaskę na małe kawałki i ostrożnie przenieś kawałki żelu do 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek. Dodać 500 mikrolitrów roztworu odbarwiającego zawierającego 100-milimolowy wodorowęglan amonu i acetonitryl.

Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, od czasu do czasu wstrząsając. Ostrożnie odpipetować roztwór odbarwiający. Sprawdź wzrokowo, czy nie ma probówek z pozostałościami plam i powtórz ten krok, jeśli kawałki żelu są nadal zabarwione na niebiesko.

Dodać około 400 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu DTT i inkubować w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po odrzuceniu roztworu redukującego za pomocą pipety, dodać około 400 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu IAA i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Usunąć bufor alkilujący za pomocą pipety i wyrzucić.

Dodaj 500 mikrolitrów czystego acetonitrylu w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut, aż kawałki żelu skurczą się i staną się nieprzezroczyste. Odpipetuj acetonitryl i susz kawałki żelu na powietrzu przez pięć do 10 minut pod maską. Następnie odpipetuj 50 mikrolitrów roztworu trypsyny do każdej probówki, aby całkowicie pokryć kawałki żelu i inkubuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po 30 minutach dodaj wystarczającą ilość buforu trypsyny, aby w razie potrzeby całkowicie pokryć kawałki żelu. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić ekstrakcję peptydów, ostrożnie odpipetuj wyekstrahowany roztwór peptydu z probówek i przenieś do czystych mikroprobówek.

Wysuszyć supernatant w odśrodkowym parowniku próżniowym. Dodać 100 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do każdej probówki z kawałkami żelu i inkubować przez 30 minut z wytrząsaniem. Pipetować supernatant do tych samych mikroprobówek zawierających wyekstrahowane peptydy zgodnie z ich odpowiednimi pasmami i suszyć w wirówce próżniowej.

Przystąpić do oczyszczania peptydów i chromatografii cieczowej z jonizacją elektrorozpylania MS/MS zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Poniżej przedstawiono całkowitą ilość białek w próbkach ekstrahowanych każdym rodzajem detergentu. Najwyższy plon uzyskano z tkanek ekstrahowanych buforem do ekstrakcji białek tkankowych, następnie DDM, CHAPS, ASB-14, a najniższy z ACN i TFA.

Konsekwentnie, całkowita liczba zidentyfikowanych białek była również najwyższa w próbce wyekstrahowanej buforem do ekstrakcji białek tkankowych i podążała za tym samym trendem, co całkowita wydajność. Poniżej przedstawiono porównanie jednowymiarowych profili białkowych SPCA do elektroforezy żelowej, przed i po poddaniu zoptymalizowanym etapom przygotowania i czyszczenia próbki. Ogólnie rzecz biorąc, na trzecim pasie zaobserwowano wysoki stopień rozmazywania i słabą separację prążków białkowych.

Profil ten pokazuje, że próbki mogą zawierać odczynnik ekstrakcyjny, a także zanieczyszczenia, takie jak lipidy i szczątki komórkowe. Jednak próbki SPCA, które zostały rozdzielone na supernatant i osad, a następnie poddane zoptymalizowanemu protokołowi, dały w rezultacie przykładowe jednowymiarowe profile elektroforezy żelowej. Zoptymalizowana metoda szybkiej, solidnej i wydajnej ekstrakcji białek z mikronaczyń oka może być również z łatwością zastosowana do innych próbek tkankowych.

Pokazano tutaj profile białkowe supernatantu i osadu mysich próbek mózgu i tkanki sercowej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o poddaniu próbek pełnej homogenizacji, oddzieleniu supernatantu od osadu oraz usunięciu zanieczyszczeń i odczynników ekstrakcyjnych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się okulistyką eksperymentalną i translacyjną do dokładnego zbadania proteomu naczyń krwionośnych na podstawie modelu oczu świni.