Name: Przygotowanie próbki do analizy proteomicznej mikronaczyń oka w oparciu o spektrometrię mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji białek z mikronaczyń oka świni do analizy proteomicznej spektrometrią mas. Technika umożliwia badanie mechanizmów molekularnych chorób oczu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Manicam jest wspierany przez Wewnętrzne Finansowanie Badań Uniwersyteckich (Stufe 1) z Uniwersyteckiego Centrum Medycznego Uniwersytetu Jana Gutenberga w Moguncji oraz grant z Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).

<ol><li>Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+proteomics+with+emphasis+on+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.</a> Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).</li>
<li>Gregorich, Z. R., Ge, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+proteomics+in+health+and+disease%3A+Challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities.</a> Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422, 198-207 (2003).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537, 347-355 (2016).</li>
<li>Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+platforms+in+vitreoretinal+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Analytical platforms in vitreoretinal proteomics.</a> Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).</li>
<li>Manicam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+Unravels+the+Regulatory+Mechanisms+in+Human+Tears+Following+Acute+Renouncement+of+Contact+Lens+Use%3A+A+Comparison+between+Hard+and+Soft+Lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses.</a> Scientific Reports. 8, 11526(2018).</li>
<li>Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+lacrimal+proline-rich+protein+4+%28PRR+4%29+in+human+tear+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome.</a> Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).</li>
<li>Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+human+tears+from+aqueous-deficient+and+evaporative+dry+eye+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients.</a> Scientific Reports. 6, 29629(2016).</li>
<li>Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+reflex+tear+proteome+reveals+high+expression+of+lacrimal+proline-rich+protein+4+%28PRR4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4).</a> Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).</li>
<li>Perumal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+aqueous+humour+proteome%3A+A+comparison+of+the+genders%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders.</a> PloS ONE. 12, 0172481(2017).</li>
<li>Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+ciliary+artery+circulation+in+health+and+disease+the+Weisenfeld+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).</li>
<li>Zeitz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glaucoma+progression+is+associated+with+decreased+blood+flow+velocities+in+the+short+posterior+ciliary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery.</a> British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).</li>
<li>Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+use+of+Sus+scrofa+%28pig%29+as+a+model+system+for+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies.</a> Proteomics. 11, 776-793 (2011).</li>
<li>Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porcine+model+of+selective+retinal+capillary+closure+induced+by+embolization+with+fluorescent+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).</li>
<li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parameters+of+the+porcine+eyeball%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).</li>
<li>Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+insight+into+the+proteome+landscape+of+the+porcine+short+posterior+ciliary+arteries%3A+Key+signalling+pathways+maintaining+physiologic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions.</a> Scientific Reports. 6, 38298(2016).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).</li>
<li>Feist, P., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+challenges%3A+sample+preparation+techniques+for+microgram-quantity+protein+analysis+from+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).</li>
<li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+mouse+liver+plasma+membrane%3A+use+of+differential+extraction+to+enrich+hydrophobic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins.</a> Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+recovery+and+identification+of+membrane+proteins+from+rat+hepatic+cells+using+a+centrifugal+proteomic+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111(2011).</li>
<li>de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+proteomics+to+the+management+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Contribution of proteomics to the management of vascular disorders.</a> Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).</li>
<li>Cottingham, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1DE+proves+its+worth...+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">1DE proves its worth... again.</a> Journal of Proteome Research. 9, 1636(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kompleksowe profilowanie proteomu w różnorodnych próbkach oka jest ważnym i niezbędnym pierwszym krokiem do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych i szlaków sygnałowych związanych ze zdrowiem i chorobą. W celu uzyskania wysokiej jakości danych i zapewnienia odtwarzalności wyników uzyskanych z tych analiz, kluczowe znaczenie mają poprzednie etapy przygotowania próbki, jak podkreślono w przeglądzie przeprowadzonym przez Mandal i wsp., w którym szczegółowo omówiono procedury przetwarzania próbek dla różnych części oka z zast...

Postęp w dziedzinie proteomiki, który pozwala na zintegrowane i niezrównane gromadzenie danych, znacznie zrewolucjonizował nasze zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw niektórych stanów chorobowych, jak również w odzwierciedlaniu stanu fizjologicznego określonej populacji komórek lub tkanek1,2,3,4. Proteomika okazała się również ważną platformą w badaniach okulistycznych ze względu na czułość i bezstronną analizę różnych próbek ocznych, które ułatwiły identyfikację potencjalnych markerów choroby do ostatecznej diagnozy i rokowania, czego elegancko dowodzą liczne badania z ostatnich lat, w tym niektóre z naszych1,5,6,7,8,9,10. Jednak często trudno jest uzyskać próbki ludzkie do analiz proteomicznych ze względów etycznych, zwłaszcza biorąc pod uwagę zapotrzebowanie na materiał kontrolny od zdrowych osób do wiarygodnych analiz porównawczych. Z drugiej strony wyzwaniem jest również uzyskanie wystarczającej ilości próbek do optymalnych i wiarygodnych analiz spektrometrii mas. Jest to szczególnie istotne w przypadku materiałów biologicznych o ograniczonej masie, takich jak mikronaczynia krwionośne oka. Jednym z takich głównych zagałkowych naczyń krwionośnych, które odgrywają kluczową rolę w regulacji przepływu krwi w oku, jest krótka tylna tętnica rzęskowa (sPCA). Wszelkie zaburzenia lub anomalie w tym łożysku naczyniowym mogą skutkować poważnymi reperkusjami klinicznymi, które mogą prowadzić do patogenezy kilku chorób zagrażających wzrokowi, takich jak jaskra i nietętnicza neuropatia niedokrwienna przedniego niedokrwiennika nerwu wzrokowego (NAION)11,12. Brakuje jednak badań wyjaśniających zmiany proteomu w tym łożysku tętniczym ze względu na wyżej wymienione wady. Dlatego w ostatnich latach świnia domowa (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) stała się dobrym modelem zwierzęcym w badaniach okulistycznych ze względu na duże podobieństwa morfologiczne i filogenetyczne między ludźmi a świniami13,14,15. Próbki oczu świń są łatwo dostępne, a co najważniejsze, są dokładniejszym odwzorowaniem tkanek ludzkich.
Biorąc pod uwagę ważną rolę tych naczyń krwionośnych w oku, a także niedostatek metodologii umożliwiającej efektywną ekstrakcję białek i analizy z tych mikronaczyń, wcześniej scharakteryzowaliśmy proteom świńskiego sPCA za pomocą wewnętrznego protokołu, który zaowocował identyfikacją dużej liczby białek16. Na podstawie tego badania zoptymalizowaliśmy i szczegółowo opisaliśmy naszą metodologię w tym artykule, która umożliwia analizę proteomu z niewielkich ilości próbek przy użyciu sPCA świni jako tkanki modelowej. Chociaż głównym celem tego badania było ustalenie metodologii zgodnej ze stwardnieniem rozsianym dla naczyń krwionośnych oka o ograniczonej masie, dostarczyliśmy istotnych dowodów eksperymentalnych na to, że opisany przepływ pracy można również szeroko zastosować do różnych próbek tkankowych.
Przewiduje się, że ten proces pracy będzie kluczowy dla przygotowania wysokiej jakości próbek kompatybilnych z MS z małych ilości materiałów do kompleksowych analiz proteomowych.

<table><tbody><tr><td>A. Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1, 4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.11474</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2)&nbsp;</td><td>&nbsp; Carl Roth&nbsp;</td><td>5239.1</td><td>2,5 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) firmy Dulbecco&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (CH2O2)</td><td>AppliChem</td><td>A0748</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl klasy HPLC (ACN, C2H3N)</td><td>AppliChem</td><td>A1605</td><td></td></tr><tr><td>Metanol klasy HPLC (CH3OH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1589</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek Kalium (KCl)&nbsp;</td><td>&nbsp; Carl Roth&nbsp;</td><td>6781.1</td><td>4,7 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan kalium (KH2PO4)</td><td>&nbsp; Carl Roth&nbsp;</td><td>3904.2</td><td>1,2 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas octowy klasy LC-MS</td><td>&nbsp; Carl Roth&nbsp;</td><td>AE69.1</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; Carl Roth&nbsp;</td><td>261,2</td><td>1,2 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidant</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Bufor do próbek&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>NP0007</td><td>4x</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE Środek redukujący próbki&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>NP0004</td><td>10x</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 wstępnie barwione białko standardowe&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowania</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>&nbsp; Carl Roth&nbsp;</td><td>9265,2</td><td>118,3 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>&nbsp; Carl Roth&nbsp;</td><td>965.3</td><td>25 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA,&nbsp; C2HF3O2)</td><td>Merck Millipore</td><td>108178</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-(D)-(+)- Monohydrat glukozy</td><td>&nbsp; Carl Roth&nbsp;</td><td>6780.1</td><td>11 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>B. Odczynniki i zestawy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm kulki z tlenku cyrkonu&nbsp;</td><td>Następny Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki z tlenku cyrkonu 1,0 mm&nbsp;</td><td>Next Advance</td><td>ZROB10</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie na niebiesko koloidalne&nbsp; Zestaw</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>LC6025</td><td>Do barwienia 25 mini żeli w zestawie</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12 % Bis-Tri żele</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>NP0321BOX</td><td>1,0 mm, 10-dołkowy</td></tr><tr><td>zestaw do oznaczania białek z kwasem bicynchoninowym (BCA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do transbłonowej ekstrakcji białek ProteoExtract, TM-PEK</td><td>Merck Millipore</td><td>71772-3</td><td>20 reakcji w zestawie</td></tr><tr><td>Odczynnik do ekstrakcji białek tkankowych (T-PER)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78510</td><td></td></tr><tr><td>C. Narzędzia</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki z dnem w kształcie litery V</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651180</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-dołkowe płytki z płaskim dnem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3595-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe ostrza mikrotomu</td><td>pfm Medical</td><td>207500014</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele jednorazowe #21</td><td>pfm Medyczne</td><td>200130021</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki preparacyjne&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>PK47.1</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra cienkie nożyczki do bonn</td><td>&nbsp; Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon (50 ml)</td>Nożyczki Mayo <td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>, Tough cut</td><td>&nbsp; Fine Science Tools</td><td>14130-17</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta precyzyjna</td><td>&nbsp; Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Typ 5</td></tr><tr><td>Pęseta precyzyjna, prosta z bardzo cienkimi końcówkami</td><td>Carl Roth</td><td>LH53.1</td><td>Typ 5</td></tr><tr><td>Samoprzylepne folie uszczelniające do mikropłytek</td><td>Ratiolab (vWR)</td><td>RATI6018412</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki o standardowym wzorze</td><td>&nbsp; Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Student Vannas</td><td>&nbsp; Fine Science Tools</td><td>91501-09</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do kapsulotomii Vannas&nbsp; &nbsp;</td><td>Geuder</td><td>19760</td><td>&nbsp; Proste, końcówki</td></tr><tr><td>do pipet ZipTipC18 proste, 77 mm Końcówki do pipet</td><td>Merck Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>D. Sprzęt i urządzenia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 &times; 0,5 mm Kolumna BioBasic C18</td><td>Thermo Scientific, Rockford, USA</td><td>72105-150565</td><td></td></tr><tr><td>30 &razy; 0,5 mm kolumna wstępna BioBasic C18&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Rockford, USA</td><td>72105-030515</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-0,5 3K&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC500396</td><td>opakowanie 96 szt.</td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Sartorius</td><td>H51</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler&nbsp;</td><td>CTC Analytics AG, Zwingen, Szwajcaria</td><td>HTS Pal</td><td></td></tr><tr><td>BBY24M Bullet Blender Storm&nbsp;</td><td>Next Advance</td><td>NA-BB-25</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator Eppendorf, model 5301</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z368172</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka Eppendorf, model 5424</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-403-93</td><td>Niechłodzona</td></tr><tr><td>wirówka Heraeus Primo R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75005440</td><td>Chłodzony</td></tr><tr><td>Labsonic M Homogenizator ultradźwiękowy&nbsp;</td><td>Pompa Sartorius</td><td>BBI-8535027</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS, model Rheos Allegro</td><td>Thermo Scientific, Rockford, USA</td><td>Spektrometr masowy 22080</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap XL&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Brema, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płyt Multiskan Ascent&nbsp;</td><td>Thermo Labsystems</td><td>v2.6</td><td></td></tr><tr><td>Rotator z wirem&nbsp;</td><td>neoLab</td><td>7-0045</td><td></td></tr><tr><td>Tytanowa sonda (&Oslash; 0,5 mm, długość 80 mm)</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8535612</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa, typ RK 31</td><td>Bandelin</td><td>329</td><td></td></tr><tr><td>Xcell Surelock Mini Cell</td><td>Life Technologies</td><td>El0001</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki do analizy proteomicznej mikronaczyń oka w oparciu o spektrometrię mas

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

Użycie izolowanych naczyń krwionośnych oka in vitro do rozszyfrowania patofizjologicznego stanu oka przy użyciu zaawansowanych metod technologicznych znacznie poszerzyło nasze zrozumienie niektórych chorób. Proteomika oparta na spektrometrii mas (MS) stała się potężnym narzędziem do odkrywania zmian w mechanizmach molekularnych i szlakach sygnałowych białek w łożyskach naczyniowych w zdrowiu i chorobie. Jednak etapy przygotowania próbki przed analizami w kierunku stwardnienia rozsianego mają kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnych wyników i dogłębnego wyjaśnienia złożonego proteomu. Jest to szczególnie ważne w przypadku przygotowania mikronaczyń ocznych, gdzie ilość próbki dostępnej do analizy jest często ograniczona, a tym samym stanowi wyzwanie dla optymalnej ekstrakcji białka. Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie skutecznego, szybkiego i solidnego protokołu przygotowania próbki z przykładowego zagałkowego łożyska naczyniowego oka wykorzystującego krótkie tylne tętnice rzęskowe świni. Niniejsza metoda koncentruje się na procedurach ekstrakcji białek zarówno z supernatantu, jak i osadu próbki po homogenizacji, czyszczeniu próbki za pomocą filtrów odśrodkowych przed jednowymiarową elektroforezą żelową i etapami oczyszczania peptydów w celu bezznacznikowej kwantyfikacji w chromatografii cieczowej-jonizacji elektronatrysko-liniowej pułapce jonowej-Orbitrap MS. Chociaż metoda ta została opracowana specjalnie do analiz proteomicznych mikronaczyń oka, dostarczyliśmy również przekonujących dowodów na to, że można ją również łatwo zastosować w przypadku innych próbek tkankowych.

Ograniczona dostępność próbek jest jedną z głównych wad badań okulistycznych. W związku z tym metody ekstrakcji zapewniające optymalną wydajność białek z niewielkich ilości próbek, takich jak naczynia krwionośne oka, są często przedmiotem dyskusji. Do tej pory brakowało metod opracowanych specjalnie dla ekstrakcji białek z naczyń krwionośnych zaocznych. Dlatego, jako pierwszy krok w optymalizacji metody oraz jako dowód koncepcji w celu porównania skuteczności i stabilności kilku powszechn...

Charakterystyka proteomu łożysk mikronaczyniowych oka jest kluczowa dla dogłębnego zrozumienia wielu patologii oczu u ludzi. Badanie to demonstruje skuteczną, szybką i solidną metodę ekstrakcji białek i przygotowania próbek z małych naczyń krwionośnych, wykorzystującą krótkie tylne tętnice rzęskowe świń jako naczynia modelowe do analiz proteomicznych opartych na spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do analizy proteomicznej mikronaczyń oka w oparciu o spektrometrię mas

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Przygotowanie wysokiej jakości próbek zgodnych ze spektrometrią mas do kompleksowej analizy proteomu próbek oka ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów molekularnych i szlaków sygnałowych związanych ze zdrowiem i chorobą. Opisany przepływ pracy reprezentuje proste, ale solidne podejście do rygorystycznych etapów przygotowania próbek, przeznaczonych specjalnie do analizy próbek o ograniczonej masie, takich jak mikronaczynia krwionośne oka. Chociaż głównym celem badania jest ustalenie metodologii zgodnej ze stwardnieniem rozsianym dla naczyń krwionośnych oka, opisany przepływ pracy może być szeroko stosowany do różnych próbek komórkowych i tkankowych.Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć trudności, ponieważ identyfikacja i izolacja wybranej krótkiej tylnej tętnicy rzęskowej lub gałęzi SPCA może być wyzwaniem. Świeże oczy świń wraz z tkankami nerwu wzrokowego i zewnątrzgałkowego pobrano z lokalnej rzeźni bezpośrednio po sekcji zwłok. Umieść gałkę oczną w komorze separacyjnej zawierającej lodowaty bufor Krebsa-Henseleita.Ostrożnie odetnij otaczające mięśnie i tkanki ostrymi nożyczkami Mayo. Wykonaj nacięcie skalpelem i przetnij kulę ziemską wzdłuż płaszczyzny równikowej ostrymi nożyczkami Mayo, aż oko zostanie rozdzielone na przednią i tylną połowę. Usuń jak najwięcej ciała szklistego z tylnej połowy oka za pomocą pary standardowych kleszczy.Po użyciu szpilek preparacyjnych do ostrożnego przygwożdżenia tylnej połowy oka, delikatnie odetnij tkanki łączne otaczające nerw wzrokowy, aby odsłonić leżące poniżej unaczynienie zagałkowe za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas. Odizoluj przywzrokową i dystalną krótką tylną tętnicę rzęskową wraz z otaczającymi tkankami łącznymi za pomocą pary precyzyjnych pęset typu piątego i nożyczek do kapsulotomii Vannasa. Delikatnie usuń tkanki łączne z odcinków tętnic za pomocą pęsety i nożyczek z bardzo cienką końcówką, a następnie przepłucz izolowane tętnice w lodowatym PBS w celu usunięcia zanieczyszczeń i pozostałości krwi.Pobrać tętnice z dwóch oczu, aby uzyskać jedną kontrpróbę biologiczną, a następnie zważyć próbki za pomocą wagi analitycznej. Do każdej probówki dodaj mieszaninę 0,5 i jednomilimetrowych kulek tlenku cyrkonu, a następnie odczynnik do ekstrakcji białek tkankowych. Teraz załaduj probówki z próbkami do homogenizatora blendera.Ustaw minutnik na dwie minuty, ustaw poziom prędkości na sześć i rozpocznij homogenizację. Po uruchomieniu należy sprawdzić próbki pod kątem pełnej homogenizacji i przechowywać próbki na lodzie pomiędzy każdym cyklem. Powtarzać cykl, aż próbki zostaną całkowicie zhomogenizowane.Ostrożnie pipetować homogenację do świeżych probówek do mikrowirówek. Odwirować próbki w temperaturze 10 000 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu osadzenia nierozpuszczalnych białek. Ostrożnie odpipetować supernatant zawierający rozpuszczalne białka, nie dotykając warstwy osadu, i przenieść do świeżych probówek do mikrowirówek.Dodaj 200 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego 2A i pięć mikrolitrów koktajlu inhibitorów proteazy do każdej próbki granulek. Następnie kilkakrotnie zawiesić osad za pomocą pipety. Użyj homogenizatora ultradźwiękowego, aby całkowicie zhomogenizować granulki.Ustaw amplitudę na 60 i przełączaj na jeden. Użyj sondy wykonanej z tytanu, który jest odpowiedni do homogenizacji próbek o małych objętościach. Zanurz sondę w mieszaninie osadów i ekstrakcyjnych na lodzie i naciśnij przycisk start.Sonizuj próbkę, aż grudki osadu zostaną całkowicie zhomogenizowane, zatrzymując się na kilka sekund między każdą sonikacją. Sprawdź wizualnie pełną homogenizację. Wymieszaj homogenat kilka razy pipetą, aby upewnić się, że nie ma grudek.Do tej procedury należy użyć odśrodkowych urządzeń filtrujących z odcięciem trzech kilodaltonów. Włóż trzykilodaltonową jednostkę filtrującą odcinający do probówki mikrowirówkowej. Odpipetować 200 mikrolitrów próbki homogenizować do jednego urządzenia filtrującego i dodać 200 mikrolitrów wody dejonizowanej do tego samego filtra.Po szczelnym zamknięciu umieść jednostkę filtrującą w wirówce i wiruj przez 14 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu oddzielić jednostkę filtrującą zawierającą koncentrat próbki od probówki mikrowirówki zawierającej filtrat, odrzucając filtrat. Koncentrat należy rozpuścić, dodając 400 mikrolitrów wody dejonizowanej do jednostki filtrującej.Po trzykrotnym powtórzeniu filtracji ostrożnie odpipetować oczyszczoną próbkę koncentratu do czystej mikroprobówki. Przygotować próbki do jednowymiarowej elektroforezy żelowej, zgodnie z wykazem w protokole tekstowym, i dobrze wymieszać pipetą. Podgrzewać próbki w temperaturze 70 stopni Celsjusza w suchym bloku grzewczym przez 15 minut i schłodzić do temperatury pokojowej.Ostrożnie załadować 50 mikrogramów próbki na linię za pomocą pipety, a także wstępnie wybarwiony wzorzec białka jako marker masy cząsteczkowej. Uruchom żele na około 60 minut przy stałym napięciu 175 woltów. Pod koniec cyklu ostrożnie usuń żel z płytki kasety za pomocą noża do żelu i przenieś żel do pudełka do barwienia żelu.Wykonaj utrwalanie i barwienie żelu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wstrząśnij żelami w roztworze barwiącym przez noc, aby uzyskać najlepsze ogólne rezultaty. Ostrożnie zdekantuj roztwór barwiący i zastąp go 200 mililitrami wody dejonizowanej przed potrząsaniem żelami przez co najmniej siedem do ośmiu godzin w wodzie, aby oczyścić tło.Wyciąć pasma białkowe z żelu za pomocą czystych nowych ostrzy mikrotomu. Pokrój opaskę na małe kawałki i ostrożnie przenieś kawałki żelu do 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek. Dodać 500 mikrolitrów roztworu odbarwiającego zawierającego 100-milimolowy wodorowęglan amonu i acetonitryl.Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, od czasu do czasu wstrząsając. Ostrożnie odpipetować roztwór odbarwiający. Sprawdź wzrokowo, czy nie ma probówek z pozostałościami plam i powtórz ten krok, jeśli kawałki żelu są nadal zabarwione na niebiesko.Dodać około 400 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu DTT i inkubować w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po odrzuceniu roztworu redukującego za pomocą pipety, dodać około 400 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu IAA i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Usunąć bufor alkilujący za pomocą pipety i wyrzucić.Dodaj 500 mikrolitrów czystego acetonitrylu w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut, aż kawałki żelu skurczą się i staną się nieprzezroczyste. Odpipetuj acetonitryl i susz kawałki żelu na powietrzu przez pięć do 10 minut pod maską. Następnie odpipetuj 50 mikrolitrów roztworu trypsyny do każdej probówki, aby całkowicie pokryć kawałki żelu i inkubuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po 30 minutach dodaj wystarczającą ilość buforu trypsyny, aby w razie potrzeby całkowicie pokryć kawałki żelu. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić ekstrakcję peptydów, ostrożnie odpipetuj wyekstrahowany roztwór peptydu z probówek i przenieś do czystych mikroprobówek.Wysuszyć supernatant w odśrodkowym parowniku próżniowym. Dodać 100 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do każdej probówki z kawałkami żelu i inkubować przez 30 minut z wytrząsaniem. Pipetować supernatant do tych samych mikroprobówek zawierających wyekstrahowane peptydy zgodnie z ich odpowiednimi pasmami i suszyć w wirówce próżniowej.Przystąpić do oczyszczania peptydów i chromatografii cieczowej z jonizacją elektrorozpylania MS/MS zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Poniżej przedstawiono całkowitą ilość białek w próbkach ekstrahowanych każdym rodzajem detergentu. Najwyższy plon uzyskano z tkanek ekstrahowanych buforem do ekstrakcji białek tkankowych, następnie DDM, CHAPS, ASB-14, a najniższy z ACN i TFA.Konsekwentnie, całkowita liczba zidentyfikowanych białek była również najwyższa w próbce wyekstrahowanej buforem do ekstrakcji białek tkankowych i podążała za tym samym trendem, co całkowita wydajność. Poniżej przedstawiono porównanie jednowymiarowych profili białkowych SPCA do elektroforezy żelowej, przed i po poddaniu zoptymalizowanym etapom przygotowania i czyszczenia próbki. Ogólnie rzecz biorąc, na trzecim pasie zaobserwowano wysoki stopień rozmazywania i słabą separację prążków białkowych.Profil ten pokazuje, że próbki mogą zawierać odczynnik ekstrakcyjny, a także zanieczyszczenia, takie jak lipidy i szczątki komórkowe. Jednak próbki SPCA, które zostały rozdzielone na supernatant i osad, a następnie poddane zoptymalizowanemu protokołowi, dały w rezultacie przykładowe jednowymiarowe profile elektroforezy żelowej. Zoptymalizowana metoda szybkiej, solidnej i wydajnej ekstrakcji białek z mikronaczyń oka może być również z łatwością zastosowana do innych próbek tkankowych.Pokazano tutaj profile białkowe supernatantu i osadu mysich próbek mózgu i tkanki sercowej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o poddaniu próbek pełnej homogenizacji, oddzieleniu supernatantu od osadu oraz usunięciu zanieczyszczeń i odczynników ekstrakcyjnych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się okulistyką eksperymentalną i translacyjną do dokładnego zbadania proteomu naczyń krwionośnych na podstawie modelu oczu świni.

sample-preparation-for-mass-spectrometry-based-proteomics-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje protokół izolacji krótkich tylnych tętnic rzęskowych od oka świni. Izolowane krótkie tętnice tylne są odpowiednim źródłem do wyjaśnienia wglądu molekularnego i profili białkowych naczyń krwionośnych oka.

Izolowanie krótkich tylnych tętnic rzęskowych: protokół wycinania nienaruszonych krótkich tylnych mikronaczyń rzęskowych z oka świni

Ludzka siatkówka składa się z funkcjonalnie i molekularnie odrębnych regionów, w tym dołka, plamki żółtej i siatkówki obwodowej. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą biopsje stemplowe i ręczne usuwanie warstw tkanek z ludzkiego oka w celu wypreparowania i zebrania tych odrębnych obszarów siatkówki do dalszej analizy proteomicznej.

Rozwarstwienie ludzkiej siatkówki i naczyniówki RPE w celu analizy proteomicznej

Ten artykuł przedstawia protokół wirowania o różnicowej prędkości w połączeniu z wirowaniem gradientu gęstości w celu oddzielenia mitochondriów od tkanek ludzkiego raka jajnika i kontroli tkanek jajnika do ilościowej analizy proteomicznej, co skutkuje wysokiej jakości próbką mitochondrialną oraz wysokoprzepustową i wysoce odtwarzalną ilościową analizą proteomiczną ludzkiego raka jajnika.

Przygotowanie mitochondriów z tkanek raka jajnika i tkanek jajnika kontrolnego do ilościowej analizy proteomicznej

Sfingolipidy to bioaktywne metabolity o ugruntowanej roli w chorobach człowieka. Scharakteryzowanie zmian w tkankach za pomocą spektrometrii mas może ujawnić role w etiologii choroby lub zidentyfikować cele terapeutyczne. Jednak związek KTT stosowany do kriokonserwacji w biorepozytoriach zakłóca spektrometrię mas. Przedstawiono metody analizy sfingolipidów w tkankach ludzkich osadzonych w OCT za pomocą LC-ESI-MS/MS.

Przygotowanie tkanek ludzkich osadzonych w związku o optymalnej temperaturze skrawania do analizy metodą spektrometrii mas

Solidny protokół jest tutaj prezentowany do izolowania granulek neuromelaniny z ludzkiej tkanki pośmiertnej istoty czarnej pars compacta za pomocą mikrodysekcji laserowej. Ten zmieniony i zoptymalizowany protokół znacznie minimalizuje wymagany czas pobierania próbek, zmniejsza wymaganą ilość próbki oraz usprawnia identyfikację i kwantyfikację białek za pomocą analizy LC-MS/MS.

Protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny

Przedstawiono protokół do oznaczania biomarkerów o niskiej obfitości z wysuszonych próbek surowicy, czego przykładem jest biomarker peptydu uwalniającego progastrynę (ProGRP). Kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami są używane do selektywnego oczyszczania i wzbogacania proteotypowego peptydu ProGRP. Wychwycony peptyd jest następnie analizowany za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas.

Mikropróbkowanie w ukierunkowanej analizie białek o niskiej liczebności opartej na spektrometrii mas

Ten protokół opisuje metodę pobierania próbek łez za pomocą pasków Schirmera oraz zintegrowany ilościowy przepływ pracy do odkrywania nieinwazyjnych biomarkerów białka łez. Proces przygotowania próbki do wychwytywania zawiesiny umożliwia szybkie i niezawodne przygotowanie próbki do rozdarcia oraz analizę spektrometryczną mas, co skutkuje wyższą wydajnością odzyskiwania peptydów i identyfikacją białek niż standardowe procedury w roztworze.

Przygotowanie próbki zatrzymującej zawiesinę białek do proteomiki łez metodą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas

Ten artykuł opisuje metodologię izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkiego osocza (EV) i przedstawia przebieg pracy do bezznacznikowej analizy proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Protokół ten skutecznie przygotował wystarczającą ilość wysokiej jakości tkanki neowaskularnej z próbek glejaka za pomocą mikrodyssekcji laserowej do ilościowej analizy proteomicznej angiogenezy guza, przezwyciężając ograniczenia badań tradycyjnie koncentrujących się głównie na czynnikach angiogennych oraz dostarczając szeroko zakrojonego profilu proteomicznego angiogenezy glejaka.

Przygotowanie tkanek neowaskularnych z tkanek glejaka ludzkiego do ilościowej analizy proteomiki angiogenezy guza

Poznaj metodę ekstrakcji białek z mikronaczyń oka świni do analizy proteomicznej spektrometrią mas. Technika umożliwia badanie mechanizmów molekularnych chorób oczu.

Przygotowanie próbki do analizy proteomicznej mikronaczyń oka w oparciu o spektrometrię mas

Przeglądaj więcej filmów