Name: Identyfikacja per- i polifluorowanych związków chemicznych za pomocą połączonego przepływu pracy spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości z ukierunkowanymi i nieukierunkowanymi badaniami przesiewowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji związków PFAS w próbkach wodnych przy użyciu spektrometrii mas z chromatografią cieczową. Protokół łączy analizę ukierunkowaną i nieukierunkowaną, umożliwiając wykrywanie znanych i nowych substancji fluorowanych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska, poprzez swoje Biuro Badań i Rozwoju, finansowała i zarządzała opisanymi tutaj badaniami. Niniejszy dokument został sprawdzony przez amerykańską Agencję Ochrony Środowiska, Biuro Badań i Rozwoju i zatwierdzony do publikacji. Poglądy wyrażone w tym artykule są poglądami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy lub politykę Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska. Badania te były częściowo wspierane przez powołanie do Programu Badań Podoktoranckich w Narodowym Laboratorium Badań nad Ekspozycją administrowanym przez Oak Ridge Institute for Science and Education na mocy umowy międzyagencyjnej DW89992431601 między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych a Agencją Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych.

1. Pobieranie próbek wody
<ol>
	<li>Przygotowanie standardowych zapasów PFAS
	<ol>
		<li>Przygotować wzorcową mieszaninę PFAS w metanolu zawierającą dowolne docelowe związki będące przedmiotem zainteresowania (np. PFOA, PFOS, HFPO-DA) w stężeniu 1 ng/μl. To jest natywna mieszanina PFAS. Dostępne są również mieszanki przygotowane na rynku (tj. PFAC Mix A i Mix B).</li>
		<li>Przygotować wzorcową mieszaninę zawierającą dopasowane związki PFAS znakowane stabilnymi izotopami (SIL) (np. 13C 4-PFOA, 13C8-PFOS, 13C3-HFPO-DA) w stężeniu 1 ng/μl. To jest mieszanina IS PFAS. Dostępne są również mieszanki przygotowane na rynku (tj. MPAFC Mix A i Mix B). 
		UWAGA: Jeśli wersja SIL docelowego PFAS jest niedostępna, można użyć substytutu o podobnej budowie i długości łańcucha (np. 13C 2-PFHxA dla HFPO-DA)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek ślepej próby polowej (FB), ślepej próby kolca (SB)
	<ol>
		<li>Napełnij dwie czyste butelki z polipropylenu (HDPE) lub polipropylenu (PP) o dużej gęstości 1,000 ml laboratoryjnej wody dejonizowanej (DI), o której wiadomo, że nie zawiera PFAS. 
		UWAGA: Materiały PFAS często mają nieokreśloną toksyczność i/lub rakowalność. Należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do kontaktu doustnego lub skórnego z roztworami wzorcowymi lub podstawowymi.</li>
		<li>Dodać pewną ilość mieszaniny wzorcowej PFAS do jednej z butelek o stężeniu końcowym równoważnym oczekiwanym stężeniom próbki (np. 100 ng/l). To jest Spike Blank (SB).</li>
		<li>Dodaj 5 ml 35% środka konserwującego kwas azotowy do Spike Blank.</li>
		<li>Przenieść zarówno próbkę SB, jak i ślepą próbę polową bez kolców do miejsca pobierania próbek jako kontrolę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek w terenie 
	UWAGA: Osoba zbierająca próbki powinna nosić rękawice nitrylowe i w miarę możliwości pobierać próbki z systemów przepływowych. Próbki z kranu powinny mieć możliwość przepływu i zrównoważenia przed pobraniem próbek (2-3 min).
	<ol>
		<li>Zbierz 500-1,000 ml wody z terenu w czystej butelce HDPE lub PP.</li>
		<li>Dodaj 5 ml 35% środka konserwującego kwas azotowy do butelek na próbki i pola ślepego. 
		UWAGA: Kwas azotowy jest i silnie utleniający</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek
UWAGA: PFAS są wszechobecne i trwałe. Upewnij się, że wszystkie rozpuszczalniki są najwyższej jakości i zostały przeanalizowane pod kątem niskiego poziomu zanieczyszczenia PFAS. Przed przygotowaniem ślepych prób i próbek należy dokładnie wypłukać cały sprzęt laboratoryjny używany do przygotowania wzorców.
<ol>
	<li>Obróbka wstępna próbki
	<ol>
		<li>Wlać każdą próbkę do oddzielnego, wstępnie oczyszczonego cylindra z podziałką HDPE o pojemności 1 l i zanotować dokładną objętość.</li>
		<li>Dodaj 10 ml metanolu do opróżnionej butelki z próbką, zakręć ją i dobrze wstrząśnij, aby wypłukać zaadsorbowane PFAS z wnętrza butelki.</li>
		<li>Odmierzoną próbkę wody należy umieścić z powrotem w wypłukanej butelce z płukanką metanolową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krzywa wzorcowa do oznaczania ilościowego
	<ol>
		<li>Napełnij osiem butelek o pojemności 1 l HDPE/PP wodą DI wolną od PFAS.</li>
		<li>Wybierz osiem równomiernie rozłożonych stężeń obejmujących żądany zakres ilościowy. Na przykład: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750 i 1 000 ng/L dla zakresu 10-1 000 ng/L.</li>
		<li>Dodać pewną ilość natywnej mieszanki PFAS do każdej butelki, aby uzyskać końcowe stężenia PFAS w 2.2.2 (np. 100 μL PFAS Mix A na 1 l wody DI = 100 ng/L).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodatek do wzorca wewnętrznego 
	UWAGA: Dodanie wzorca wewnętrznego znakowanego stabilnym izotopem (IS) jest konieczne tylko wtedy, gdy oprócz analizy nieukierunkowanej pożądane są wyniki ilościowe.
	<ol>
		<li>Dodać mieszaninę IS PFAS do każdej próbki w stężeniu zbliżonym do punktu środkowego krzywej kalibracyjnej (np. 250 μl mieszaniny IS PFAS = 250 ng/l)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>filtracja
	<ol>
		<li>Przefiltrować próbki przez filtry z włókna szklanego GF/A (47 mm, wielkość porów 1,6 μm) pod delikatnym podciśnieniem do wstępnie oczyszczonej kolby próżniowej o pojemności 1 l HDPE.</li>
		<li>Jeśli w butelce pozostaną cząstki stałe, spłucz filtr dodatkową wodą dejonizowaną. Przefiltrowaną wodę należy umieścić z powrotem w butelce z próbką lub w nowym pojemniku do ekstrakcji do fazy stałej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) 
	UWAGA: Opisane tutaj stężenie we wkładzie wykorzystuje pompę tłokową o stałym przepływie. Alternatywne metody zatężania przy użyciu kolektora próżniowego20 lub przy użyciu konfiguracji on-line SPE-LC-MS17 są możliwe, ale nie są omawiane.
	<ol>
		<li>Kondycjonować wkład ze słabą wymianą anionową (WAX) z 25 ml metanolu.</li>
		<li>Kondycjonuj wkład WAX dodatkowymi 25 ml wody dejonizowanej.</li>
		<li>Umieść rurki pompy w przefiltrowanych butelkach na próbki i oznacz wkłady SPE odpowiednimi nazwami próbek.</li>
		<li>Przepompować 500 ml próbki wody przez wkład ze stałym natężeniem przepływu 10 ml/min (łącznie 500 ml), odrzucając przepływającą ciecz do odpadów. 
		UWAGA: Większe lub mniejsze objętości mogą być skoncentrowane w zależności od oczekiwanych stężeń próbki.</li>
		<li>Wyjmij wkład z pompy tłokowej w celu elucji. 
		UWAGA: W przypadku zagęszczania dodatkowych próbek za pomocą tej samej pompy, pompę tłokową należy przepłukać 25 ml metanolu przed zainstalowaniem następnego wkładu w celu zrównoważenia.</li>
		<li>Przenieś wkład SPE do kolektora próżniowego i wyposaż w zewnętrzny szklany zbiornik</li>.
		<li>Przepłukać wkład SPE 4 ml buforu octanu sodu o pH 4,0 o pH 4,0 w delikatnym podciśnieniu. Odrzuć przepływ. Umyj wkład SPE 4 ml neutralnego metanolu. 
		UWAGA: Neutralną frakcję płuczącą można zebrać, jeśli spodziewane są określone niejonowe anality polarne. W przeciwnym razie wyrzuć do zmarnowania</li>
		<li>Umieść 15 ml polipropylenowej probówki wirówkowej pod każdym wkładem SPE, aby zebrać eluent. Elutę próbki za pomocą 4 ml 0,1% wodorotlenku amonu w metanolu.</li>
		<li>Wyjąć rurkę elucyjną i zmniejszyć objętość eluatu do 500 - 1 000 μl poprzez odparowanie pod suchym strumieniem azotu w łaźni wodnej o nieznacznie podwyższonej temperaturze (40 °C).</li>
		<li>Skoncentrowane ekstrakty próbek można przechowywać przed analizą w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ukierunkowana ocena ilościowa LC-MS/MS
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 100 μl ekstraktu próbki w 300 μl 2 mM buforu octanu amonu do fiolki z próbką HPLC.</li>
		<li>Skalibruj i zrównoważ systemy HPLC i MS zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: PFAS w tle są powszechnie wykrywane ze względu na stosowanie składników fluoropolimerowych w większości systemów LC oraz w przegrodach fiolek z próbkami. Przed użyciem należy upewnić się, że wykrywalne poziomy w ślepych próbach są znikome. Tam, gdzie to możliwe, sugerowana jest modyfikacja systemu LC w celu zastąpienia elementów teflonowych. Sugerowane jest również użycie analitycznej kolumny "podtrzymującej" przylegającej do zaworu mieszającego LC29.</li>
		<li>Przygotuj analityczną listę roboczą składającą się z krzywej standardowej, próbek i dodatkowej repliki krzywej standardowej, aby ocenić dryf instrumentalny w całym przebiegu. Przykładowa lista robocza znajduje się w tabeli 1.</li>
		<li>Analizować próbki przy użyciu metod LC i MS ustalonych dla docelowego związku lub docelowych związków. Przykładowy gradient LC przedstawiono w tabeli 2, a parametry metody MS przedstawiono w tabelach 3 i 4. Dalsze szczegółowe dyskusje można znaleźć w McCord et al.21.</li>
		<li>Wygeneruj krzywą wzorcową z próbek wzorcowych, wykorzystując stosunek powierzchni piku analitu do wzorca wewnętrznego w funkcji stężenia analitu. Wygeneruj formułę regresji kwadratowej z wagą 1/x do przewidywania stężenia9.</li>
		<li>Określić ilościowo docelowe anality w każdej próbce, korzystając z przygotowanych krzywych wzorcowych i stosunku powierzchni (obszar standardowy/obszar IS) dla każdego pomiaru.</li>
		<li>Jeśli stężenie przekracza zakres kalibracji, rozcieńczyć pierwotną próbkę wodą demineralizowaną z dodatkiem odpowiedniego stężenia IS i ponownie wyekstrahować, aby doprowadzić stężenie do odpowiedniego zakresu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Niedocelowe gromadzenie danych LC-MS/MS
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 100 μl ekstraktu próbki w 300 μl 2 mM buforu octanu amonu do fiolki z próbką HPLC.</li>
		<li>Skalibrować i zrównoważyć HPLC i MS o wysokiej rozdzielczości zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Przygotować analityczną listę roboczą jak w ppkt 2.6.2.</li>
		<li>Korzystając z oprogramowania przyrządu, zbierz dane LC-MS za pomocą szerokiego skanowania MS1 w trybie zależnym od danych, aby zebrać MS/MS. Przykładowy gradient LC w tabeli 5. Więcej informacji na temat ustawień przyrządów można znaleźć w Strynar et al.30 oraz Newton et al.31. 
		UWAGA: W celu poprawy jakości MS/MS można przeprowadzić analizę zależną od danych z preferowaną listą jonów podzbioru cech pozostałych po przetworzeniu danych w 2.8.1-2.8.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nieukierunkowane przetwarzanie danych 
	UWAGA: Analizę danych można przeprowadzić za pomocą szerokiej gamy oprogramowania, a metody te nie odzwierciedlają jedynej lub najlepszej metody dla dowolnego zestawu danych. Tam, gdzie to możliwe, kroki zawierają ogólny opis, który można wykonać w alternatywnym oprogramowaniu. Przetwarzanie przykładowych danych użytych w tym manuskrypcie zostało przeprowadzone przy użyciu oprogramowania specyficznego dla dostawcy (Oprogramowanie 1 i Oprogramowanie 2), zgodnie z opisem w Newton et al.31.
	<ol>
		<li>Wykonaj ekstrakcję cech molekularnych cech chemicznych za pomocą jednego z kilku pakietów oprogramowania open source32,33 lub oprogramowania dostawcy, aby zidentyfikować masy monoizotopowe, czasy retencji i zintegrowane obszary pików cech chemicznych.
		<ol>
			<li>W obszarze Oprogramowanie 1 wybierz opcję Dodaj/Usuń przykładowe pliki > Dodaj pliki i wybierz nieprzetworzone dane z eksperymentu niedocelowego, a następnie naciśnij przycisk OK.</li>
			<li>W obszarze Oprogramowanie 1 wybierz opcję Batch Recursive Feature Extraction (Wyodrębnianie funkcji cyklicznych wsadowych) > Open Method (Metoda otwarta), aby załadować wstępnie ustaloną metodę, lub ręcznie edytuj ustawienia oprogramowania. Ustawienia programu Profinder dotyczące wyodrębniania obiektów znajdują się w Tabeli 6.</li>
			<li>W Oprogramowaniu 1 po wyodrębnieniu funkcji wybierz opcję Plik > Eksportuj jako CSV..., Plik > Eksportuj jako CEF... lub Plik > Eksportuj jako PFA... w celu dalszego przetwarzania. Zakłada się, że pliki CEF będą używane dla pozostałej części opisu.</li>
			<li>W oprogramowaniu 2 (MPP) utwórz nowy eksperyment z Kreatorem importu danych typu Niezidentyfikowany i Przepływ pracy, a następnie kliknij przycisk OK.</li>
			<li>W MPP wybierz opcję Pliki danych i zlokalizuj wyeksportowane wyniki oprogramowania 1 (CEF lub PFA) do zaimportowania, a następnie klikaj przycisk Dalej, aż pojawią się opcje parametru wyrównania.</li>
			<li>W MPP ustaw wartości wyrównania złożonego na 0,0 (wyrównanie zostało już wykonane w wyodrębnianiu funkcji w kroku 2.8.1.2 oprogramowania 1), a następnie klikaj przycisk Dalej, wykonując kolejne kroki, aż dostępna będzie opcja Zakończ.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Filtruj identyfikatory na podstawie odtwarzalności analitycznej. W przypadku gdy dostępnych jest wiele próbek, cechy powinny być obecne w >80% poszczególnych kontrprób, a ich analityczny współczynnik zmienności (CV) powinien wynosić < 30 %
		<ol>
			<li>W MPP wybierz Konfiguracja eksperymentalna > Grupowanie eksperymentów i przypisz każdemu plikowi raw grupę odpowiadającą jego próbce źródłowej (tj. repliki z tego samego źródła powinny znajdować się w tej samej grupie). Można utworzyć wiele grup odpowiadających zmiennym zagnieżdżonym (np. repliki instrumentalne i techniczne).</li>
			<li>W MPP wybierz Ustawienia eksperymentalne > Utwórz interpretację, a następnie wybierz parametr eksperymentu (tj. grupę) i klikaj przycisk Dalej, aż będzie dostępna opcja Zakończ. Spowoduje to utworzenie kategorii, na której będzie można operować w przyszłości.</li>
			<li>W MPP wybierz Kontrola jakości > Filtruj według częstotliwości. Ustaw Listę encji na Wszystkie jednostki i Interpretację na przykładową grupę (nieuśrednioną) utworzoną w 2.8.2.2, a następnie naciśnij przycisk Dalej.</li>
			<li>W polu Parametry wejściowe ustaw przechowywanie jednostek na 80% próbkowania w co najmniej jednym warunku, a następnie klikaj przycisk Dalej, dopóki opcja Zakończ nie będzie dostępna. Nazwij listę Funkcje filtrowane częstotliwościowo</li>
			<li>W MPP wybierz Kontrola jakości > Filtruj według zmienności próbki. Ustaw listę encji na Funkcje filtrowane z częstotliwością z 2.8.2.4 i interpretację na Grupuj (nieuśrednione), a następnie naciśnij Dalej.</li>
			<li>Wybierz przycisk radiowy dla danych pierwotnych i Zakres zainteresowania do Współczynnik zmienności < 30%. Kliknij Dalej> Zakończ i zapisz listę jako Funkcje filtrowane CV.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usuń obiekty, w przypadku których żadna próbka nie ma znacznie większej (>3-krotnej) liczebności niż próbka ślepej próby pola (FB).
		<ol>
			<li>W MPP wybierz Analiza > Zmiana składania. Ustaw Listę encji na Funkcje filtrowane CV i Interpretację na przykładową grupę, a następnie naciśnij przycisk Dalej. Wybierz opcję zmiany krotności na Wszystkie względem pojedynczego warunku i wybierz warunek FB lub dowolną nazwę grupy dla pustej przetworzonej próbki.</li>
			<li>Na następnym ekranie ustaw odcięcie Fold-Change na 3.0 i kliknij do końca monitów. Zapisz listę jako listę filtrowaną FC.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonaj binarne porównania poszczególnych próbek będących przedmiotem zainteresowania z odpowiednią próbką tła (np. przed i za źródłem punktowym) w celu określenia zmian fałdowania dla poszczególnych cech chemicznych.
		<ol>
			<li>W MPP wybierz Analiza > Filtruj na wykresie wulkanu. Ustaw listę encji na Lista filtrowana FC i Interpretacja na Grupa.</li>
			<li>Dla pary warunków krotności-zmiany wybierz dwie próbki do porównania (np. sparowaną próbkę przed i za próbką) i wybierz test Mann-Whitney Unpaired.</li>
			<li>W przypadku analizy wstępnej nie wybieraj wartości do wielokrotnej korekty testowej Na następnym ekranie kliknij na wykres wyników.</li>
			<li>Na ekranie wyników wybierz wartość odcięcia zmiany zagięcia wynoszącą 3,0 i wartość odcięcia wartości p równą 0,1. Następnie zakończ i wyeksportuj listę jako wyniki wstępne.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dla każdej cechy pozostałej po przefiltrowaniu wygeneruj przewidywane wzory chemiczne na podstawie dokładnego widma masowego i kompozytowego.
		<ol>
			<li>W MPP wybierz pozycję Interpretacja wyników > identyfikacji IDBrowser i listę jednostek Wyniki wstępne.</li>
			<li>W IDBrowser wybierz opcję Zidentyfikuj wszystkie związki przy użyciu generatora wzorów cząsteczkowych (MFG) jako metodę identyfikacji.</li>
			<li>W opcjach Generuj formułę dodaj wartość F w kolumnie Elementy i ustaw wartość Maksimum na 50, a następnie wybierz pozycję Zakończ. Po wygenerowaniu formuły wybierz pozycję Zapisz i zwróć, aby powrócić do MPP.</li>
			<li>W MPP kliknij prawym przyciskiem myszy przefiltrowaną i dopasowaną listę encji MFG i wybierz polecenie Eksportuj listę. Zapisz wyniki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zbadaj masę monoizotopową gatunków na liście zredukowanych istotnych cech chemicznych dla tych, które zawierają defekty masy wskazujące na fluorowanie; patrz Kind i Fiehn34.</li>
		<li>Zwróć uwagę na serie chemiczne zawierające typowe motywy polifluorowania (CF2 (m/z 49.9968), CF2O (m/z 65.9917), CH2CF2O (m/z 80.0074) itp.) przy użyciu wykresu defektów masy lub algorytmu oprogramowania; patrz sekcja dyskusji, Liu et al.17, Loos et al.35 oraz Dimzon et al.36.</li>
		<li>Przeszukuj przewidywane wzory chemiczne lub neutralne masy w bazie danych EPA Chemistry Dashboard i/lub innych bazach danych, aby zwrócić potencjalne struktury chemiczne.
		<ol>
			<li>Otwórz narzędzie do wyszukiwania partii EPA Comptox Chemicals Dashboard (https://comptox.epa.gov/dashboard/dsstoxdb/batch_search) i wklej listę identyfikatorów (formuł lub mas) w polu identyfikatora, po wybraniu typu identyfikatora (tj. Formuła gotowa dla MS lub Masa monoizotopowa).</li>
			<li>Wybierz opcję Pobierz dane chemiczne..., a także wybierz z listy rozwijanej dowolne dane fizyczne/chemiczne/toksykologiczne dotyczące potencjalnych dopasowań.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Korzystając z intuicji chemicznej i dostępnych danych referencyjnych, usuń mało prawdopodobne dopasowania z listy potencjalnej struktury chemicznej dla każdej formuły w oparciu o wykonalność ze względu na stabilność chemiczną, właściwości fizyczne, takie jak jonizacja lub hydrofobowość, obecność chemikaliów wytwarzających z pobliskich źródeł itp. W przypadku braku dodatkowych danych, wykonalność spektralna może być uszeregowana wyłącznie na podstawie rozpowszechnienia w literaturze; zob. McEachran et al.37.</li>
		<li>Potwierdź struktury za pomocą dostępnych standardów i/lub ukierunkowanego dopasowania MS/MS o wysokiej rozdzielczości do widm z baz danych, widm teoretycznych in silico lub ręcznego kuratorstwa.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Postępowanie z próbkami i ich przygotowanie Uwzględnienie wzorców referencyjnych/szczytowych ma zasadnicze znaczenie dla każdej ukierunkowanej analizy, ponieważ stanowią one zabezpieczenie dla sprawdzenia poprawności analitycznej. Brak próbek kontroli jakości uniemożliwia jakąkolwiek ocenę dokładności wyników; wszechobecność fluorochemikaliów oznacza, że przypadkowe zanieczyszczenie próbek terenowych, materiałów przetwórczych lub systemu LC-MS nie jest rzadkością i należy je uwzględnić. Co więcej, pozwala to na walidację protokołu niezależnie od zmian w codziennym przetwarzaniu próbek, ponieważ wiele etapów może być bardzo zmiennych, w szczególności etapy SPE i stężenia próbki. Na ekstrakcję zarówno starszych, jak i nowych perfluorowanych substancji chemicznych duży wpływ może mieć wybór fazy stacjonarnej do zagęszczenia oraz składników próbek źródłowych, takich jak pH i zasolenie46. Wpływ warunków pobierania próbek powinien być brany pod uwagę, jeżeli interesujące są poszczególne klasy pefluorowanych substancji chemicznych. Można zastosować alternatywne schematy przygotowania próbek do ekstrakcji wodnych, jeśli dostępna jest konfiguracja laboratoryjna, a dalsza analiza danych pozostaje podobna.
Ukierunkowana analiza danych W przypadku związków o dostępnych wzorcach i dopasowanych, stabilnych wzorcach wewnętrznych znakowanych izotopami, główne problemy związane z analizą danych mają charakter instrumentalny, a określenie granic wykrywalności metody i odpowiednich zakresów raportowania można określić na podstawie poszczególnych laboratoriów przy użyciu standardowych podejść, takich jak stosunek sygnału do szumu z niskich skoków wzorca47. W przypadku braku dopasowanych wzorców wewnętrznych mogą wystąpić błędy wynikające z efektów niedopasowanej matrycy, a dokładne przewidywanie wsteczne próbek wzbogaconych może być wykorzystane do oszacowania dokładności pomiarów. W przypadku braku wzorców do przygotowania krzywej, ilościowe oszacowanie niewiadomej można dokonać, traktując ją identycznie z ściśle dopasowanym związkiem wzorcowym, ale błędy w oszacowaniu są rzędu 10+ krotności z ograniczoną zdolnością do ilościowego określenia niepewności, patrz McCord, Newton i Strynar21. W takich przypadkach nadal można gromadzić dane dotyczące trendów, ale szacunki dotyczące koncentracji są z natury niewiarygodne.
Nieukierunkowana analiza danych Ustawienia pobierania wartości szczytowych mają znaczący wpływ na liczbę zidentyfikowanych cech chemicznych, ale duży wpływ ma również jakość wyboru cech. Decyzje będące przedmiotem zainteresowania w wybieraniu pików to: 1) intensywność poszczególnych mas, które mają być uwzględnione w widmach, próg obfitości jonów, 2) intensywność wyekstrahowanych pików chromatogramu, które należy uznać za cechy, próg obfitości cech, 3) częstotliwość wykrywania cech, próg kontrpróby i 4) zmienność analityczna, próg CV (rysunek 10).
Ustawienie nierealistycznie niskich progów dla szczytowej kompletacji powoduje wykładnicze wydłużenie czasu pobierania próbek w celu rozwiązania dodatkowych cech o coraz niższej liczebności (Tabela 7). Próg obfitości jonów filtruje cechy widma mas, w których wystarczająca ilość pojedynczych izotopów nie przekracza tego progu. To idealnie wybiera tylko cechy o wysokiej jakości widmach MS, zapewniając, że są to rzeczywiste cechy chemiczne, a nie szum instrumentalny, i umożliwiając przewidywanie formuły w dalszym przetwarzaniu. Odpowiedni próg opiera się na szumie instrumentalnym, najlepiej co najmniej 3-krotnie wyższym niż próg szumu dla skanów MS1. Próg liczebności cech filtruje cechy chemiczne w oparciu o intensywność lub obszar wyodrębnionej cechy chromatograficznej. Ten krok umożliwia odrzucenie pików o niskiej obfitości, które zazwyczaj mają niską jakość chromatograficzną, mają wysokie wariancje lub są wynikiem innej złej ekstrakcji oprogramowania. Odpowiedni próg musi zostać określony dla każdego eksperymentu i dla każdej matrycy w oparciu o akceptowalny poziom słabej generacji cech (np. cechy poniżej progu wykazują niedopuszczalnie słabą chromatografię). Dalsza analityczna kontrola jakości może być stosowana do odrzucania cech na poziomie chromatograficznym na podstawie niespójnej identyfikacji w kontrpróbach analitycznych i/lub przygotowawczych (próg kontrpróby) lub na podstawie słabej odtwarzalności w różnych kontrpróbach (próg CV). Odpowiednie poziomy zależą od jakości zastosowanego oprogramowania do integracji pików i badanych jednostek chemicznych. W przypadku rozpuszczalnych w wodzie związków perfluorowanych i lekko zoptymalizowanych protokołów integracji, cechy powinny być zidentyfikowane w 80+% kontrprób analitycznych, a CV oczekuje się, że spadną poniżej 30%, jak szczegółowo opisano w sekcji dotyczącej metod.
Piki wykryte w wyniku analizy nieukierunkowanej nie dają ilościowych oszacowań stężeń wykrytych materiałów. Co więcej, tożsamość prawdziwych niewiadomych może być trudna do potwierdzenia, ponieważ nowe związki nie występują w publicznie dostępnych bazach danych. Nowatorskie oznaczanie strukturalne wymaga szeroko zakrojonej analizy przy użyciu wielu metod i wymaga specjalistycznej wiedzy zarówno w zakresie spektrometrii mas, jak i chemii. Jednak normalizacja obszarów pików cech chemicznych może dostarczyć półilościowych szacunków stężeń nieznanych gatunków21. Jeżeli stosuje się spójne etapy pobierania próbek i przygotowania, można uzyskać informacje o trendach czasowych dla poszczególnych gatunków w celu monitorowania trwałości substancji chemicznej w przyszłości, ponieważ reakcja dla poszczególnych gatunków powinna być spójna, z wyjątkiem dużych różnic w matrycy21.
Główną zaletą tej metody jest możliwość rozszerzenia obróbki próbki, aby umożliwić zarówno analizę ukierunkowaną, jak i nieukierunkowaną. Podczas gdy analiza ukierunkowana dostarcza równoważnych lub lepszych informacji ilościowych, bardzo brakuje jej zakresu analizy pożądanej w przypadku nowych i powstających materiałów, a także ich związku z materiałami matrycowymi. Stosowanie ukierunkowanej metodologii, a nawet podejrzanej metody badań przesiewowych opartej wyłącznie na znanych materiałach i ograniczonych bazach danych, jest całkowicie ślepe na wcześniej nieobserwowane gatunki, nawet jeśli mogą one mieć znaczące skutki zdrowotne. Wraz z ulepszaniem oprogramowania i coraz bardziej niezawodnymi bazami danych, dokładność nieznanej identyfikacji będzie nadal rosła, przy jednoczesnym zmniejszeniu inwestycji czasowych i poziomu wiedzy specjalistycznej niezbędnej do analizy wielowymiarowych danych generowanych przez to podejście. Niemniej jednak dane generowane obecnie mają znaczącą wartość w przyszłości, ponieważ bankowanie danych pozwala na analizę post-hoc za pomocą nowo opracowanego oprogramowania i umożliwia porównanie w czasie, nawet jeśli tożsamość wykrytego związku jest obecnie nieznana.

Klasa substancji per- i polifluoroalkilowych (PFAS) to trwałe zanieczyszczenia organiczne o poważnym zagrożeniu dla zdrowia publicznego. Specyficzne związki kwas perfluorooktanowy (PFOA) i perfluorooktanosulfonian (PFOS) mają zalecane poziomy zdrowotne dla wody pitnej ustalone przez EPA1,2, a ich główna produkcja w USA zakończyła się w 2000 roku3,4. Aby uzyskać znaczące zrozumienie właściwości materiałów PFAS w sferze produkcji tekstyliów i produktów konsumenckich, opracowano setki, jeśli nie tysiące, alternatywnych chemikaliów PFAS w celu wypełnienia nisz produktowych, w tym zamienników przestarzałych związków5,6,7,8. Istnieje ciągła potrzeba monitorowania poziomów środowiskowych perfluorowanych kwasów karboksylowych i sulfonianów o prostym łańcuchu, takich jak PFOS, PFOA i ich pokrewne serie homologiczne, ale pojawiające się związki chemiczne nie są objęte ustalonymi metodami, takimi jak metoda EPA 5379 i często brakuje standardów analitycznych dla tradycyjnej analizy ukierunkowanej. Cel tego protokołu jest zatem dwojaki. Zapewnia ścieżkę do ukierunkowanej analizy LC-MS/MS związków fluorochemicznych w wodzie, w której dostępne są wzorce analityczne, i szczegółowo opisuje bezproblemową integrację nieukierunkowanego podejścia opartego na spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości do analizy danych, które umożliwia wykrywanie nieznanych lub nieoczekiwanych związków w tych samych próbkach.
Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) jest sprawdzoną techniką oczyszczania i zagęszczania próbki, z zastosowaniem do wielu analitów i matryc próbek10,11. Do analizy PFAS wiele stałych faz retencyjnych, w tym niepolarne, funkcjonalizowane kolumny polarne i jonowymienne, zostało w różnym stopniu użytych dla podklas gatunków fluorowanych w szerokiej gamie matryc9,12,13,14,15,16. Postępy w analizie próbek SPE przy użyciu konfiguracji on-line znacznie zwiększają wydajność podejścia i poprawiają odtwarzalność obsługi próbek, ale podstawowy proces pozostaje niezmienny17. Podjęto również pewne wysiłki w celu usunięcia stężenia SPE offline za pomocą wstrzyknięć o dużej objętości, ale wymagają one modyfikacji chromatografii, które umieszczają je poza sferą potocznej analizy18,19. Nasza analiza próbki wykorzystuje polimeryczną fazę retencyjną słabej wymiany anionów (WAX) w celu dokładnego oddzielenia kwaśnych materiałów PFAS od tradycyjnych zanieczyszczeń organicznych przy jednoczesnym osiągnięciu znacznych współczynników stężenia próbki. Ta faza WAX jest ważna dla wychwytywania krótkołańcuchowych kwasów perfluorowanych, takich jak sulfonian perfluorobutanu (PFBS) lub etery perfluorowane, takie jak kwas dimerowy tlenku heksafluoropropylenu (HFPO-DA), które są bardziej polarne niż starsze gatunki perfluorowane o dłuższym łańcuchu20,21. Ponieważ w ostatnich latach chemii PFAS nastąpiła znacząca zmiana w kierunku krótszych łańcuchów fluorowanych i włączenia eteru5, ten wybór faz umożliwia dokładniejsze odzyskiwanie nowych związków do analizy MS.
Ukierunkowana kwantyfikacja LC-MS/MS przy użyciu uwierzytelnionych wzorców i stabilnych wzorców wewnętrznych znakowanych izotopami zapewnia niezrównany poziom swoistości i czułości dla analizy ilościowej. Chociaż takie podejście jest pożądane w wielu sytuacjach, jest niepraktyczne w zbyt powszechnych sytuacjach w analizie. Podejścia celowane sprawdzają się tylko w przypadku gatunków, które są oczekiwane w próbce i dla których metody zostały wcześniej ustalone. W przypadku nowych i powstających związków podejście to nie jest nawet w stanie wykryć gatunków, które mogą być interesujące, niezależnie od ich składu chemicznego lub stężenia, a spektrometry mas o niskiej rozdzielczości są prawie niezdolne do dostarczenia wystarczającej ilości informacji, aby jednoznacznie przypisać chemiczne nieznane związki. W związku z tym pojawiła się dziedzina analizy nieukierunkowanej, wykorzystująca moc nowoczesnych spektrometrów masowych o wysokiej rozdzielczości do analizy próbek bez z góry założonej hipotezy i wstecznego przypisywania substancji chemicznych do wykrywalnych cech próbki. Podejście to jest szeroko stosowane w dziedzinach biologii22,23,24 i nauk o środowisku25,26,27 na wielu klasach chemikaliów. Perfluorowane chemikalia są szczególnie łatwe do zidentyfikowania w tej metodzie ze względu na ich unikalne wzorce widma masowego, a w ciągu ostatnich kilku lat opisano setki związków5,28.
Omawiany tutaj protokół ma na celu dostosowanie ukierunkowanej oceny ilościowej LC-MS/MS PFAS do potrzeby identyfikacji i półilościowego monitorowania pojawiających się interesujących związków. Techniki selekcji faz SPE i przygotowania próbek mają na celu zapewnienie wychwytywania z wody bardziej hydrofilowych powstających kwasów PFAS i mogą być mniej odpowiednie dla długołańcuchowych form polimerowych i niejonowych. Co więcej, dane generowane przez analizę nieukierunkowaną są gęste i mają dużą wymiarowość, co wymaga użycia oprogramowania do analizy danych. Takie pakiety oprogramowania są często specyficzne dla dostawcy i wymagają modyfikacji w celu działania między platformami urządzeń. Tam, gdzie to możliwe, proces analizy został opisany w sposób ogólny i odniesiono się do alternatyw open source/freeware, ale skuteczność i dokładność każdego podejścia do oprogramowania musi być oceniana indywidualnie.

<table><tbody><tr><td>Ultra-wysokosprawny system chromatografii cieczowej Acqity&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td>Zmodyfikowany zestawem do analizy PFC (176001744); równoważny system UPLC jest dopuszczalny, jeśli tło PFAS jest sprawdzone i potwierdzone, że jest nisko</td></tr><tr><td>osadzone w octanie amonu</td><td>Fluka</td><td>17836</td><td>Klasa spektrometrii mas >99% czysty</td></tr><tr><td>wodorotlenek amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler</td><td>AB204S</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna UPLC BEH C18 z odwróconą fazą, 2,1 i razy; 50&nbsp; mm, 1,7&nbsp; &mu; m&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>186002350</td><td></td></tr><tr><td>Dwutłokowa pompa strzykawkowa&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>SPC10-C</td><td></td></tr><tr><td>Lodowcowy kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ARK2183&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtry szklane z mikrofibry</td><td>Whatman</td><td>1820-070</td><td></td></tr><tr><td>Butelka na próbkę z polietylenu o wysokiej gęstości&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>2189-0032&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości</td><td>Różne</td><td></td><td>spektrometry masowe powinny być w stanie zapewnić dokładną masę do < 10ppm i zbieranie danych MS/MS.&nbsp; W tej pracy użyto Agilent 6530 qTOF i Thermo Fisher Orbitrap Fusion</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas azotowy (35% w/w)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SVCN-5-1</td><td>Można przygotować w domu przy użyciu stężonego kwasu azotowego i wody odczynnikowej</td></tr><tr><td>Lejek polipropylenowy Buchner</td><td>ACE Glass</td><td>12557-09&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowa rurka i nasadka z cylindrem</td> Polipropylenowy <td>termos BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>(1 L)</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy potrójny kwadrupolowy Quattro Premier XE&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td>Zamiast tego można użyć równoważnego systemu z potrójnym kwadrupolem lub lepszym, który powinien zapewniać wysoką czułość i stabilność do ukierunkowanej analizy</td></tr><tr><td>Odczynnik Woda</td><td></td><td></td><td>Dowolne źródło uznane za wolne od PFAS</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Parownik azotu Sigma-Aldrich</td><td>W302406</td><td></td></tr><tr><td>TurboVap&nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>103198</td><td>Zamiast tego można zastosować równoważne systemy lub obrotową wyparkę próżniową</td></tr><tr><td>Wkład SPE ze słabą wymianą anionów (Oasis WAX Plus)</td><td>Waters Corporation</td><td>186003519</td><td></td></tr><tr><td>Standard Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,3,3-tetrafluoro-2-(1,1,2,2,3,3,3-heptafluoropropoksy)kwas propanowy (HFPO-DA)</td><td>Wellington</td><td>HFPO-DA</td><td></td></tr><tr><td>Dodatkowe docelowe standardy związków będących przedmiotem zainteresowania</td><td></td><td></td><td>zostaną określone na podstawie wstępnej analizy i dostępności normy</td></tr><tr><td>Znakowana masowo HFPO-DA</td><td>Wellington</td><td>M2HFPO-DA</td><td></td></tr><tr><td>Natywna mieszanina PFCA/PFAS (2 ug/ml)</td><td>Wellington</td><td>PFAC-MXA</td><td>lub PFAC-MXB; lub indywidualnie przygotowana mieszanina zawierająca związki będące przedmiotem zainteresowania</td></tr><tr><td>Stabilny izotop znakowany PFCA/PFAS Mieszanina (2 ug/ml)</td><td>Wellington</td><td>MPFAC-MXA</td><td>lub MPFAC-MXB; lub indywidualnie przygotowana mieszanina zawierająca związki będące przedmiotem zainteresowania, odpowiednio do natywnych PFASs</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mass Profiler Professional</td><td>Agilent</td><td></td><td>Lub pakiety oprogramowania open source</td></tr><tr><td>Profinder</td><td>Agilent</td><td></td><td>Lub pakiety oprogramowania open source</td></tr></tbody></table>

identyfikacja per- i polifluorowanych związków chemicznych za pomocą połączonego przepływu pracy spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości z ukierunkowanymi i nieukierunkowanymi badaniami przesiewowymi

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historyczne i powstające substancje per- i polifluoroalkilowe (PFAS) wzbudziły znaczne zainteresowanie opinii publicznej i agencji rządowych, od poziomu lokalnego do federalnego. Ciągła ewolucja chemii PFAS stanowi wyzwanie dla monitorowania środowiska, w którym ciągły rozwój metod celowanych nieuchronnie opóźnia odkrywanie nowych związków chemicznych. W związku z tym istnieje potrzeba dysponowania perspektywicznymi metodologiami, które mogą wykrywać pojawiające się i nieoczekiwane związki, monitorować te gatunki w czasie i ustalać szczegóły ich struktury chemicznej, aby umożliwić przyszłe prace nad zdrowiem ludzkim. W tym celu nieukierunkowana analiza za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości oferuje szerokie podejście do wykrywania baz, które można połączyć z prawie każdym schematem przygotowania próbki i zapewnia znaczące możliwości identyfikacji związku po wykryciu. W niniejszym artykule opisujemy metodę zatężania próbki opartą na ekstrakcji do fazy stałej (SPE), dostosowaną do krótszych łańcuchów i bardziej hydrofilowych substancji chemicznych PFAS, takich jak fluorowane kwasy eterowe i sulfoniany, oraz opisujemy analizę próbek przygotowanych w ten sposób zarówno w trybie ukierunkowanym, jak i niedocelowym. Metody celowane zapewniają lepszą kwantyfikację, gdy dostępne są wzorce referencyjne, ale są z natury ograniczone do oczekiwanych związków podczas przeprowadzania analizy. Z kolei podejście nieukierunkowane może zidentyfikować obecność nieoczekiwanych związków i dostarczyć pewnych informacji na temat ich struktury chemicznej. Informacje o cechach chemicznych można wykorzystać do korelacji związków w różnych lokalizacjach próbek oraz śledzenia obfitości i występowania w czasie.

Tutaj prezentujemy protokół sekwencyjnej celowanej kwantyfikacji i nieukierunkowanej analizy związków fluorowanych w wodzie za pomocą spektrometrii mas. Metodologia ta zapewnia ilościowe poziomy znanych związków fluorochemicznych i identyfikuje nieznane substancje chemiczne w powiązanych próbkach wraz z półilościowymi oszacowaniami ich obfitości.

Identyfikacja per- i polifluorowanych związków chemicznych za pomocą połączonego przepływu pracy spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości z ukierunkowanymi i nieukierunkowanymi badaniami przesiewowymi

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Podejście to pozwala na ilościowe określenie znanych PFAS i odkrycie nowych substancji w tych samych próbkach, w porównaniu z samymi podejściami ukierunkowanymi, które pomijają pojawiające się związki budzące obawy. Protokół ten jest ukierunkowany na szerszą gamę związków PFAS, które są reprezentatywne dla najnowszych pojawiających się chemikaliów. Jeżeli krok stężenia zostanie dostosowany do związków, stosowane tu metody pomiaru można zastosować do każdej klasy chemikaliów.Aby pobrać próbkę z pola, załóż rękawice nitrylowe i zbierz od 500 do 1 000 mililitrów wody z terenu w czystej butelce z polietylenu, HDPE lub polipropylenu o dużej gęstości. Dodaj pięć mililitrów 35% środka konserwującego kwas azotowy do butelki z próbką i do ślepej próby polowej, a następnie przetransportuj próbki z powrotem do laboratorium. Wlej każdą próbkę do pojedynczych, wstępnie oczyszczonych, jednolitrowych cylindrów z polipropylenu z podziałką o dużej gęstości i zapisz dokładną objętość próbek.Dodaj 10 mililitrów metanolu do każdej opróżnionej butelki z próbką, a następnie zamknij i energicznie wstrząśnij, aby wypłukać wchłonięte substancje per- i polifluoroalkilowe lub PFAS z wnętrza butelki. Następnie należy umieścić odmierzoną próbkę wody z powrotem w przepłukanej butelce z płukanką metanolową. Aby uzyskać standardową krzywą do oznaczania ilościowego, napełnij osiem pustych, jednolitrowych butelek na próbki wodą dejonizowaną niezawierającą PFAS i oznacz butelki ośmioma równomiernie rozmieszczonymi stężeniami obejmującymi żądany zakres ilościowy.Następnie dodaj pewną ilość natywnej mieszanki PFAS do każdej butelki, aby uzyskać odpowiednie stężenia PFAS, i dodaj wewnętrzną wzorcową mieszaninę PFAS do każdej próbki w stężeniu zbliżonym do punktu środkowego krzywej kalibracyjnej. Następnie przefiltruj próbki przez filtry A z włókna szklanego pod delikatnym podciśnieniem do indywidualnych, wstępnie oczyszczonych, jednolitrowych polipropylenowych kolb próżniowych. Jeśli w butelce pozostaną cząstki stałe, przepłucz dodatkową wodę dejonizowaną i przefiltruj płyn do kolby.W przypadku ekstrakcji do fazy stałej należy wlać przefiltrowaną wodę z powrotem do butelki z próbką i kondycjonować wkład ze słabą wymianą anionową lub woskiem z 25 mililitrami metanolu i dodatkowymi 25 mililitrami wody dejonizowanej. Umieść rurkę do pobierania pompy w butelkach z przefiltrowaną próbką i oznacz wkłady do ekstrakcji do fazy stałej lub SPE odpowiednimi nazwami próbek. Przepompuj 500 mililitrów każdej próbki przez każdy wkład ze stałym natężeniem przepływu 10 mililitrów na minutę, odrzucając przepływ.Wyjmij wkłady WAX SPE z pomp tłokowych i przenieś wkład SPE do kolektora próżniowego, wyposażonego w zewnętrzne szklane zbiorniki. Przepłukać każdy wkład SPE czterema mililitrami 25-milimolowego buforu octanu sodu o pH czterym w delikatnej próżni, a następnie przepłukać czteromililitrowym neutralnym metanolem. Pod koniec płukania umieścić 15-mililitrową probówkę wirówkową z polipropylenu pod każdym wkładem SPE, aby zebrać eluent i wymyć próbki czterema mililitrami 0,1% wodorotlenku amonu w metanolu.Następnie wyjmij rurki elucyjne i zmniejsz objętość eluatu do 500 do 1 000 mikrolitrów przez odparowanie pod suchym strumieniem azotu w łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza. W przypadku ukierunkowanej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas należy rozcieńczyć 100 mikrolitrów ekstraktu próbki 300 mikrolitrami dwumilimolowego buforu octanu amonu w fiolce z próbką do wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej i przygotować analityczną listę roboczą składającą się z krzywej wzorcowej, próbek i dodatkowej repliki krzywej wzorcowej w celu oceny dryfu instrumentalnego w całym przebiegu. Analizować próbki przy użyciu standardowych metod chromatografii cieczowej i spektrometrii mas ustalonych dla docelowych związków będących przedmiotem zainteresowania.Na koniec analizy wygeneruj krzywą wzorcową z próbek wzorcowych, używając stosunku powierzchni piku analitu do wzorca wewnętrznego w stosunku do stężenia analitu i wygeneruj wzór na regresję kwadratową z wagą jeden powyżej x w celu przewidywania stężenia. Określić ilościowo docelowe anality w każdej próbce, korzystając z przygotowanych krzywych wzorcowych i stosunku powierzchni dla każdego pomiaru. Jeśli stężenie przekroczy zakres kalibracji, rozcieńczyć oryginalną próbkę wodą dejonizowaną wzbogaconą odpowiednim stężeniem wzorca wewnętrznego i ponownie wyekstrahować, aby doprowadzić stężenie do odpowiedniego zakresu.W przypadku nieukierunkowanej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas rozcieńczyć 100 mikrolitrów ekstraktu próbki 300 mikrolitrami dwumilimolowego buforu octanu amonu do fiolki z próbką do wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej. Po ustawieniu listy roboczej, jak pokazano, użyj oprogramowania przyrządu do zebrania danych z chromatografii cieczowej i spektrometrii mas z szerokim skanowaniem w trybie zależnym od danych. W przypadku przetwarzania danych niedocelowych otwórz odpowiedni pakiet oprogramowania do wyodrębniania cech molekularnych, a następnie wybierz pozycję Dodaj/Usuń przykładowe pliki i Dodaj pliki, a następnie wybierz nieprzetworzone dane z eksperymentu niedocelowego.Kliknij przycisk OK i wybierz opcję Batch Recursive Feature Extraction (Wyodrębnianie funkcji wsadowych) i Open Method (Metoda otwierania), aby załadować wstępnie ustaloną metodę lub ręcznie edytować ustawienia oprogramowania. Dla każdej cechy pozostałej po filtrowaniu wygeneruj przewidywane wzory chemiczne na podstawie dokładnego widma masy i kompozytu, a następnie otwórz narzędzie CompTox Chemicals Dashboard Batch Search Agencji Ochrony Środowiska. Aby wyszukać przewidywane wzory chemiczne lub masy obojętne, aby zwrócić potencjalne struktury chemiczne, wybierz typ identyfikatora i wklej listę identyfikatorów w polu identyfikatora.Z menu rozwijanego wybierz opcję Pobierz dane chemiczne i wszelkie dane fizyczne, chemiczne lub toksykologiczne wymagane dla potencjalnych dopasowań. Następnie należy potwierdzić struktury za pomocą dostępnych wzorców i/lub ukierunkowanej spektrometrii mas tandemowej o wysokiej rozdzielczości, dopasowania fragmentów do widm z baz danych, widm teoretycznych in silico lub ręcznej selekcji. Wyniki ilościowej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas przedstawiono w postaci chromatogramów jonowych dla całkowitego chromatogramu jonowego oraz wyekstrahowanych chromatogramów jonowych określonych przemian chemicznych dla mierzonych substancji chemicznych.Zintegrowana powierzchnia piku przemiany chemicznej jest związana z obfitością związku i może być wykorzystana do obliczenia dokładnego stężenia przy użyciu krzywej kalibracyjnej znormalizowanej do wzorca wewnętrznego. Nieukierunkowana analiza przy użyciu pełnego skanowania MS daje chromatogram jonów całkowitych dla próbek, który umożliwia generowanie ad hoc chromatogramów jonowych wyekstrahowanych dla poszczególnych jonów. Związki PFAS mają ujemne defekty masy ze względu na przewagę atomów fluoru, a związki polifluorowane mają dodatnie, ale znacznie mniejsze defekty masy niż homologiczne materiały organiczne.Drugim etapem metody filtrowania jest identyfikacja szeregów homologicznych zawierających powtarzające się jednostki wspólne dla gatunków PFAS przy użyciu odpowiedniego pakietu oprogramowania. Na podstawie danych MS o wysokiej rozdzielczości można dopasować jeden lub więcej przypuszczalnych wzorów chemicznych do izotopowego odcisku palca widma mas i ocenić ich wynik. Wzory chemiczne mogą być dalej potwierdzane, a pewne informacje strukturalne można uzyskać z danych z tandemowej spektrometrii mas.Dalsze eksperymenty ze spektrometrią mas mogą być wykorzystane do potwierdzenia tożsamości nowych związków, a porównania próbek mogą dostarczyć informacji na temat rozpowszechnienia i względnej ilości chemikaliów. Bardzo ważne jest, aby mieć odpowiednie ślepe próby i próbki kontroli jakości dla matrycy w celu walidacji pomiarów ilościowych i niedocelowych. Przedstawione strategie stały się nowym podejściem do badań przesiewowych w środowisku pod kątem PFAS, umożliwiając odkrywanie niewiadomych i przewidywanie ich tożsamości.

identifying-per-polyfluorinated-chemical-species-with-combined

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Czas reakcji transferu protonów w locie Spektrometria mas umożliwia bardzo czułą, szybką i nieinwazyjną analizę lotnych związków organicznych. Aby pokazać jej potencjał, podajemy trzy przykłady: fermentację mlekową jogurtu (monitorowanie bioprocesów on-line), różne genotypy jabłek (badania przesiewowe na dużą skalę) oraz przestrzeń zanosową po wypiciu kawy (analiza przestrzeni nosowej).

PTR-ToF-MS w połączeniu ze zautomatyzowanym systemem pobierania próbek i dostosowaną analizą danych do badań żywności: monitorowanie bioprocesów, badania przesiewowe i analiza przestrzeni nosowej

Opisana jest ulepszona metoda polimorfizmu długości fragmentów ograniczających reakcję łańcuchową polimerazy do genotypowania gatunków rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas. Kolumna monolitu krzemionkowego z odwróconymi fazami służy do oddzielania strawionych amplikonów. Metoda ta może wyjaśnić monoizotopowe masy oligonukleotydów, co jest przydatne do identyfikacji składu zasadowego.

Ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy Genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Celem tego protokołu jest wykrywanie metabolitów fenolowych w osoczu za pomocą metody częściowo ukierunkowanej chromatografii i spektrometrii mas.

Częściowo ukierunkowana ultrawysokosprawna chromatografia sprzężona ze spektrometrią mas Analiza metabolitów fenolowych w osoczu osób w podeszłym wieku

Skonstruowaliśmy nieukierunkowany przepływ metabolomiczny, który zintegrował XY-Meta i metaX razem. W tym protokole pokazaliśmy, jak używać XY-Meta do generowania wabikowej biblioteki spektralnej na podstawie odniesienia do widm w otwartym dostępie, a następnie przeprowadziliśmy kontrolę FDR i użyliśmy metaX do ilościowego określenia metabolitów po zidentyfikowaniu widm metabolomicznych.

Zintegrowany proces identyfikacji i kwantyfikacji nieukierunkowanego metabolomu opartego na kontroli FDR

Obecny protokół opisuje prostą i efektywną metodę transportu kwasów perfluoroalkilowych w pszenicy na duże odległości.

Badanie transportu kwasów perfluoroalkilowych na duże odległości w pszenicy za pomocą techniki ekspozycji z rozszczepionymi korzeniami

Metoda badania analogów fentanylu na podstawie czasu ich retencji, mobilności i wzorca fragmentacji spektrometrii mas.

Analogowe badanie przesiewowe fentanylu przy użyciu LC-TIMS-TOF MS/MS

Poznaj metodę identyfikacji związków PFAS w próbkach wodnych przy użyciu spektrometrii mas z chromatografią cieczową. Protokół łączy analizę ukierunkowaną i nieukierunkowaną, umożliwiając wykrywanie znanych i nowych substancji fluorowanych.

Identyfikacja per- i polifluorowanych związków chemicznych za pomocą połączonego przepływu pracy spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości z ukierunkowanymi i nieukierunkowanymi badaniami przesiewowymi (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja per- i polifluorowanych związków chemicznych za pomocą połączonego przepływu pracy spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości z ukierunkowanymi i nieukierunkowanymi badaniami przesiewowymi

Przeglądaj więcej filmów