Identyfikacja per- i polifluorowanych związków chemicznych za pomocą połączonego przepływu pracy spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości z ukierunkowanymi i nieukierunkowanymi badaniami przesiewowymi

Tutaj prezentujemy protokół sekwencyjnej celowanej kwantyfikacji i nieukierunkowanej analizy związków fluorowanych w wodzie za pomocą spektrometrii mas. Metodologia ta zapewnia ilościowe poziomy znanych związków fluorochemicznych i identyfikuje nieznane substancje chemiczne w powiązanych próbkach wraz z półilościowymi oszacowaniami ich obfitości.

Podejście to pozwala na ilościowe określenie znanych PFAS i odkrycie nowych substancji w tych samych próbkach, w porównaniu z samymi podejściami ukierunkowanymi, które pomijają pojawiające się związki budzące obawy. Protokół ten jest ukierunkowany na szerszą gamę związków PFAS, które są reprezentatywne dla najnowszych pojawiających się chemikaliów. Jeżeli krok stężenia zostanie dostosowany do związków, stosowane tu metody pomiaru można zastosować do każdej klasy chemikaliów.

Aby pobrać próbkę z pola, załóż rękawice nitrylowe i zbierz od 500 do 1 000 mililitrów wody z terenu w czystej butelce z polietylenu, HDPE lub polipropylenu o dużej gęstości. Dodaj pięć mililitrów 35% środka konserwującego kwas azotowy do butelki z próbką i do ślepej próby polowej, a następnie przetransportuj próbki z powrotem do laboratorium. Wlej każdą próbkę do pojedynczych, wstępnie oczyszczonych, jednolitrowych cylindrów z polipropylenu z podziałką o dużej gęstości i zapisz dokładną objętość próbek.

Dodaj 10 mililitrów metanolu do każdej opróżnionej butelki z próbką, a następnie zamknij i energicznie wstrząśnij, aby wypłukać wchłonięte substancje per- i polifluoroalkilowe lub PFAS z wnętrza butelki. Następnie należy umieścić odmierzoną próbkę wody z powrotem w przepłukanej butelce z płukanką metanolową. Aby uzyskać standardową krzywą do oznaczania ilościowego, napełnij osiem pustych, jednolitrowych butelek na próbki wodą dejonizowaną niezawierającą PFAS i oznacz butelki ośmioma równomiernie rozmieszczonymi stężeniami obejmującymi żądany zakres ilościowy.

Następnie dodaj pewną ilość natywnej mieszanki PFAS do każdej butelki, aby uzyskać odpowiednie stężenia PFAS, i dodaj wewnętrzną wzorcową mieszaninę PFAS do każdej próbki w stężeniu zbliżonym do punktu środkowego krzywej kalibracyjnej. Następnie przefiltruj próbki przez filtry A z włókna szklanego pod delikatnym podciśnieniem do indywidualnych, wstępnie oczyszczonych, jednolitrowych polipropylenowych kolb próżniowych. Jeśli w butelce pozostaną cząstki stałe, przepłucz dodatkową wodę dejonizowaną i przefiltruj płyn do kolby.

W przypadku ekstrakcji do fazy stałej należy wlać przefiltrowaną wodę z powrotem do butelki z próbką i kondycjonować wkład ze słabą wymianą anionową lub woskiem z 25 mililitrami metanolu i dodatkowymi 25 mililitrami wody dejonizowanej. Umieść rurkę do pobierania pompy w butelkach z przefiltrowaną próbką i oznacz wkłady do ekstrakcji do fazy stałej lub SPE odpowiednimi nazwami próbek. Przepompuj 500 mililitrów każdej próbki przez każdy wkład ze stałym natężeniem przepływu 10 mililitrów na minutę, odrzucając przepływ.

Wyjmij wkłady WAX SPE z pomp tłokowych i przenieś wkład SPE do kolektora próżniowego, wyposażonego w zewnętrzne szklane zbiorniki. Przepłukać każdy wkład SPE czterema mililitrami 25-milimolowego buforu octanu sodu o pH czterym w delikatnej próżni, a następnie przepłukać czteromililitrowym neutralnym metanolem. Pod koniec płukania umieścić 15-mililitrową probówkę wirówkową z polipropylenu pod każdym wkładem SPE, aby zebrać eluent i wymyć próbki czterema mililitrami 0,1% wodorotlenku amonu w metanolu.

Następnie wyjmij rurki elucyjne i zmniejsz objętość eluatu do 500 do 1 000 mikrolitrów przez odparowanie pod suchym strumieniem azotu w łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza. W przypadku ukierunkowanej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas należy rozcieńczyć 100 mikrolitrów ekstraktu próbki 300 mikrolitrami dwumilimolowego buforu octanu amonu w fiolce z próbką do wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej i przygotować analityczną listę roboczą składającą się z krzywej wzorcowej, próbek i dodatkowej repliki krzywej wzorcowej w celu oceny dryfu instrumentalnego w całym przebiegu. Analizować próbki przy użyciu standardowych metod chromatografii cieczowej i spektrometrii mas ustalonych dla docelowych związków będących przedmiotem zainteresowania.

Na koniec analizy wygeneruj krzywą wzorcową z próbek wzorcowych, używając stosunku powierzchni piku analitu do wzorca wewnętrznego w stosunku do stężenia analitu i wygeneruj wzór na regresję kwadratową z wagą jeden powyżej x w celu przewidywania stężenia. Określić ilościowo docelowe anality w każdej próbce, korzystając z przygotowanych krzywych wzorcowych i stosunku powierzchni dla każdego pomiaru. Jeśli stężenie przekroczy zakres kalibracji, rozcieńczyć oryginalną próbkę wodą dejonizowaną wzbogaconą odpowiednim stężeniem wzorca wewnętrznego i ponownie wyekstrahować, aby doprowadzić stężenie do odpowiedniego zakresu.

W przypadku nieukierunkowanej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas rozcieńczyć 100 mikrolitrów ekstraktu próbki 300 mikrolitrami dwumilimolowego buforu octanu amonu do fiolki z próbką do wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej. Po ustawieniu listy roboczej, jak pokazano, użyj oprogramowania przyrządu do zebrania danych z chromatografii cieczowej i spektrometrii mas z szerokim skanowaniem w trybie zależnym od danych. W przypadku przetwarzania danych niedocelowych otwórz odpowiedni pakiet oprogramowania do wyodrębniania cech molekularnych, a następnie wybierz pozycję Dodaj/Usuń przykładowe pliki i Dodaj pliki, a następnie wybierz nieprzetworzone dane z eksperymentu niedocelowego.

Kliknij przycisk OK i wybierz opcję Batch Recursive Feature Extraction (Wyodrębnianie funkcji wsadowych) i Open Method (Metoda otwierania), aby załadować wstępnie ustaloną metodę lub ręcznie edytować ustawienia oprogramowania. Dla każdej cechy pozostałej po filtrowaniu wygeneruj przewidywane wzory chemiczne na podstawie dokładnego widma masy i kompozytu, a następnie otwórz narzędzie CompTox Chemicals Dashboard Batch Search Agencji Ochrony Środowiska. Aby wyszukać przewidywane wzory chemiczne lub masy obojętne, aby zwrócić potencjalne struktury chemiczne, wybierz typ identyfikatora i wklej listę identyfikatorów w polu identyfikatora.

Z menu rozwijanego wybierz opcję Pobierz dane chemiczne i wszelkie dane fizyczne, chemiczne lub toksykologiczne wymagane dla potencjalnych dopasowań. Następnie należy potwierdzić struktury za pomocą dostępnych wzorców i/lub ukierunkowanej spektrometrii mas tandemowej o wysokiej rozdzielczości, dopasowania fragmentów do widm z baz danych, widm teoretycznych in silico lub ręcznej selekcji. Wyniki ilościowej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas przedstawiono w postaci chromatogramów jonowych dla całkowitego chromatogramu jonowego oraz wyekstrahowanych chromatogramów jonowych określonych przemian chemicznych dla mierzonych substancji chemicznych.

Zintegrowana powierzchnia piku przemiany chemicznej jest związana z obfitością związku i może być wykorzystana do obliczenia dokładnego stężenia przy użyciu krzywej kalibracyjnej znormalizowanej do wzorca wewnętrznego. Nieukierunkowana analiza przy użyciu pełnego skanowania MS daje chromatogram jonów całkowitych dla próbek, który umożliwia generowanie ad hoc chromatogramów jonowych wyekstrahowanych dla poszczególnych jonów. Związki PFAS mają ujemne defekty masy ze względu na przewagę atomów fluoru, a związki polifluorowane mają dodatnie, ale znacznie mniejsze defekty masy niż homologiczne materiały organiczne.

Drugim etapem metody filtrowania jest identyfikacja szeregów homologicznych zawierających powtarzające się jednostki wspólne dla gatunków PFAS przy użyciu odpowiedniego pakietu oprogramowania. Na podstawie danych MS o wysokiej rozdzielczości można dopasować jeden lub więcej przypuszczalnych wzorów chemicznych do izotopowego odcisku palca widma mas i ocenić ich wynik. Wzory chemiczne mogą być dalej potwierdzane, a pewne informacje strukturalne można uzyskać z danych z tandemowej spektrometrii mas.

Dalsze eksperymenty ze spektrometrią mas mogą być wykorzystane do potwierdzenia tożsamości nowych związków, a porównania próbek mogą dostarczyć informacji na temat rozpowszechnienia i względnej ilości chemikaliów. Bardzo ważne jest, aby mieć odpowiednie ślepe próby i próbki kontroli jakości dla matrycy w celu walidacji pomiarów ilościowych i niedocelowych. Przedstawione strategie stały się nowym podejściem do badań przesiewowych w środowisku pod kątem PFAS, umożliwiając odkrywanie niewiadomych i przewidywanie ich tożsamości.