Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytanie o czasoprzestrzenną regulację genu będącego przedmiotem zainteresowania podczas dynamicznego zdarzenia biologicznego, takiego jak odporność w nienaruszonych liściach rzodkiewnika. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam uchwycić czasoprzestrzenną dynamikę aktywności promotora w glebie wyhodowanej na nienaruszonych liściach roślin w ciągu kilku dni. Aby rozpocząć tę procedurę, napełnij tackę z plastikowymi komórkami autoklawowaną glebą.

Zasiej jedno transgeniczne nasiono rzodkiewnika do każdej komórki. Przenieś tacę do pomieszczenia do wzrostu, które jest utrzymywane w temperaturze 23 stopni Celsjusza i hoduj rośliny w ciągłych warunkach białego światła przez dwa do trzech tygodni. Dwa dni przed inokulacją patogenu należy przerzucić patogen przenoszący avrRpt2 z glicerolu na pożywkę NYG, która zawiera ryfampicynę w dawce 100 miligramów na litr i kanamycynę w ilości 50 miligramów na litr.

Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Za pomocą plastikowych końcówek zbierz komórki bakteryjne, które pojawiają się na powierzchni podłoża. Przenieś bakterie do plastikowej probówki zawierającej 10 milimolowy chlorek magnezu i ponownie je zawieś.

Następnie zmierz gęstość optyczną roztworu na 600 nanometrach. Dostosuj końcowe stężenie komórek bakteryjnych do 100 milionów jednostek tworzących kolonie na mililitr, co zwykle odpowiada OD600 wynoszącemu 0,2. Najpierw ostrożnie wytnij zatyczkę komórkową zawierającą dwu- lub trzytygodniową roślinę, uważając, aby nie uszkodzić rośliny.

Umieść ogniwo w pustej tacce na wtyczkę komórki, aby utrzymać dobrą równowagę. Wybierz widocznie zdrowy liść do zaszczepienia. Zauważając, że ogólnie rzecz biorąc, trzeci, czwarty i piąty liść od spodu rośliny są łatwe w obsłudze.

Podlej glebę, w której znajduje się roślina przed inokulacją, w celu długoterminowego obrazowania poklatkowego. Opcjonalnie, podczas analizy promotorów reagujących na stres, zbadaj liście pod stereomikroskopem fluorescencyjnym przed inokulacją patogenu, aby zweryfikować brak sygnału YFP. Następnie załóż jednorazowe rękawiczki lateksowe, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z patogenem podczas infiltracji.

Za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności jednego mililitra bez igły ostrożnie naciekaj zawiesinę bakteryjną w stronę liścia abysjalnego. Inokulacja niewielkiej porcji na połowie liścia umożliwia dobrą wizualizację aktywności promotora PR1. Użyj miękkiego ręcznika papierowego, aby wchłonąć nadmiar zawiesiny bakteryjnej z obszaru otaczającego infiltrowany obszar na infiltrowanym liściu.

Natychmiast po zaszczepieniu użyj taśmy chirurgicznej, aby przymocować szklane szkiełko do plastikowej tacki tak, aby naciekany liść znajdował się pośrodku szkiełka podstawowego. Upewnij się, że zaszczepiona blaszka liściowa jest całkowicie dopasowana do szkiełka podstawowego. Wytnij kawałek dwuwarstwowej plastikowej taśmy na dwie części, aby dopasować się do przestrzeni wzdłuż ogonka infiltrowanego liścia i odetnij róg od każdego kawałka.

Za pomocą cienkiej pęsety przyklej te kawałki taśmy po obu stronach ogonka liściowego tak, aby przycięte rogi każdego kawałka pokrywały się z podstawą blaszki liściowej, upewniając się, że kawałki taśmy nie dotykają ogonka liściowego ani blaszki liściowej. Następnie przygotuj dodatkowy kawałek dwuwarstwowej taśmy z tworzywa sztucznego, jak opisano na rysunku drugim protokołu tekstowego. Przyklej ten kawałek taśmy na wcześniej przyklejonych kawałkach, aby utworzyć most nad ogonkiem, uważając, aby nie zaczepić ogonka liściowego lub blaszki liściowej bezpośrednio między kawałkami taśmy.

Następnie delikatnie przyklej mały kawałek taśmy chirurgicznej do szkiełka podstawowego nad końcówką blaszki liściowej, tak aby bardzo miękko przymocować go do szkiełka. Mocno dociśnij tylko tę część taśmy, która bezpośrednio dotyka szkiełka. Delikatnie umieść kolejny mały kawałek taśmy chirurgicznej na granicy ogonka liściowego i kawałków taśmy z tworzywa sztucznego, tak aby ogonek był bardzo miękko przymocowany zarówno do szkiełka podstawowego, jak i kawałków taśmy z tworzywa sztucznego, upewniając się, że mocno przylega tylko do tej części taśmy chirurgicznej, która bezpośrednio dotyka szkiełka lub kawałków taśmy z tworzywa sztucznego.

Delikatnie włóż końcówki pipet o pojemności 200 mikrolitrów w glebę, aby delikatnie trzymać sąsiednie liście z dala od infiltrowanego liścia. Najpierw włącz fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy. Umieść roślinę w przestrzeni pod soczewką obiektywu stereomikroskopu w celu obrazowania.

Skonfiguruj parametry obrazowania poklatkowego. Użyj konwencjonalnego filtra YFP, aby zobrazować sygnał YFP. Użyj filtra Texas Red, aby zobrazować autofluorescencję chlorofilu, tak aby domena PCD była widoczna jako ciemny obszar otoczony warstwami komórek YFP-dodatnimi.

Następnie użyj konwencjonalnej konfiguracji epi-bright field, aby uzyskać dodatkowe kroki ekspozycji na światło, upewniając się, że zaprogramowałeś kroki ekspozycji na światło w okresie interwałowym obrazowania poklatkowego, ponieważ światło ma duży wpływ na odporność roślin. Uruchom program do obrazowania poklatkowego. W przypadku długotrwałej obserwacji przez kilka dni rozważ odpowiednie podlewanie rośliny.

Po pozyskaniu obrazu należy pominąć dodatkowe kanały używane do ekspozycji na światło w interwałach z zestawu danych. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, analizuj dane różnymi metodami, takimi jak analiza regionu zainteresowania. W tym badaniu zademonstrowano wszechstronną metodę montażu liści Arabidopsy do przyżyciowego obrazowania poklatkowego.

Reprezentatywny przykład danych poklatkowych z wykorzystaniem ETI indukowanego przez avrRpt2 uzyskuje się zarówno jako serię obrazów, jak i jako film poklatkowy. W udanych eksperymentach z użyciem pPR1-YPF-NLS podczas ETI indukowanego avrRpt2 obserwuje się przejściową aktywację promotora PR1, co wynika z ognisk ekspresji YFP i kilku warstw komórek otaczających domenę PCD. Aktywacja promotora PR1 w komórkach otaczających domenę PCD zwykle rozpoczyna się po około pięciu godzinach od inokulacji, osiąga szczyt po około 12 godzinach od inokulacji i trwa do 40 godzin po inokulacji.

Próbując wykonać tę procedurę, należy dokładnie ustalić warunki poklatkowe, zgodnie z opisem w tekście. Zgodnie z tą procedurą, aktywność promotora może być analizowana ilościowo i jakościowo za pomocą oprogramowania analitycznego. Analizy te pomagają nam badać czasoprzestrzenną dynamikę ekspresji genów w dowolnym zdarzeniu biologicznym zachodzącym w żywych liściach rzodkiewnika.