Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach

Opracowaliśmy wysokoprzepustowy test do pomiaru pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET). NET to immunogenne struktury DNA, które są eksponowane przez neutrofile. NET mogą wychwytywać i zabijać mikroorganizmy, a zatem są ważnym mechanizmem przeciwzakaźnym, ale odgrywają również patogenną rolę w chorobach autoimmunologicznych.

Dzięki tej technice NET są oznaczane ilościowo za pomocą trójwymiarowej immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej, co daje w wyniku bardzo czułą i wysokoprzepustową metodę badania powstawania i degradacji NET. Technika ta pozwala nam określić ilościowo powstawanie NET u pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi. Za pomocą tego testu można monitorować tworzenie się ex vivo NET u pacjentów z zapaleniem naczyń związanym z ANCA lub toczniem rumieniowatym układowym.

Ponadto za pomocą tego testu in vitro można przetestować potencjalne terapie ukierunkowane na tworzenie NET. Izolacja neutrofili może być wyzwaniem dla osób, które nigdy wcześniej nie wykonywały tej techniki. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pobrać 20 mililitrów krwi obwodowej od zdrowego dawcy w dwóch 10-mililitrowych probówkach kodowanych EDTA.

Przenieś 10 mililitrów krwi do sterylnej 50-mililitrowej probówki i PBS do końcowej całkowitej objętości 32,5 mililitra. Używając 10-mililitrowej pipety i kontrolera do pipet, nabierz 14 mililitrów gradientu gęstości. Umieść pipetę na dnie 50-mililitrowej probówki.

Następnie zdejmij kontroler pipet z pipety, pozwalając, aby gradient gęstości wypłynął grawitacyjnie, aż do osiągnięcia maksimum przez efekt kapilarny. Umieść kciuk na pipecie, aby zapobiec wyciekaniu pozostałego gradientu gęstości, a następnie wyjmij pipetę z probówki. Odwirować probówkę pod ciśnieniem 912 razy g w temperaturze pokojowej przez 20 minut bez przyspieszania i hamowania.

Ostrożnie usuń najpierw biały pierścień zawierający jednojądrzaste komórki krwi obwodowej, a następnie osocze rozcieńczone PBS. Na koniec usuń warstwę gradientu gęstości tak bardzo, jak to możliwe. Następnie wyjmij z lodówki butelkę zimnej, sterylnej wody destylowanej i kolbę z 10x skoncentrowanym PBS.

Pracując szybko, dodaj 36 mililitrów wody bezpośrednio na pelety i ostrożnie wymieszaj raz. Po 20 sekundach liczonych od początku dodaj cztery mililitry 10x PBS, aby uzyskać roztwór izotoniczny. I znowu dokładnie wymieszaj raz.

Odwirować probówkę w temperaturze 739 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Wyrzucić supernatant, zwracając szczególną ostrożność, ponieważ osad nie jest stały, i szybko powtórzyć proces dodawania zimnej sterylnej wody destylowanej i stężonego PBS, jak opisano wcześniej. Wirować w temperaturze 328 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.

Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach PBS. Policz neutrofile i trzymaj je na lodzie. Najpierw wykonaj zawiesinę neutrofili zawierającą około 10 do 20 milionów neutrofili w dwóch mililitrach PBS w 15-mililitrowej probówce.

W innej 15-mililitrowej probówce wymieszaj dwa mililitry PBS z czterema mikrolitrami dwumikromolowego łącznika czerwonych komórek fluorescencyjnych. Delikatnie dodać roztwór łącznika komórek czerwonej fluorescencji do zawiesiny neutrofili i dokładnie wymieszać. Owiń probówkę folią aluminiową, aby chronić mieszaninę przed światłem i inkubuj dokładnie przez 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby oznaczyć neutrofile łącznikiem komórek czerwonej fluorescencji.

Dezaktywuj etykietowanie, dodając pożywkę RPMI 1640 zawierającą 10% inaktywowanego termicznie FCS w temperaturze pokojowej do końcowej objętości 15 mililitrów i dokładnie wymieszaj. Jeśli po tym utworzy się osad, ostrożnie ponownie zawiesić mieszaninę. Odwirować probówkę o sile 328 razy g w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Przed usunięciem supernatantu należy upewnić się, że utworzyła się osadka. Następnie ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach wolnego od czerwieni podłoża RPMI 1640 zawierającego 2% FCS w temperaturze pokojowej. Następnie policz neutrofile.

Wykonać zawiesinę komórek o gęstości 420 000 komórek na mililitr w pożywce RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej zawierającej 2% FCS. Dodaj 37 500 neutrofili w 90 mikrolitrach do każdej studzienki czarnej 96-dołkowej płytki o płaskim dnie. Następnie dodaj 10 mikrolitrów wybranego bodźca w trzech powtórzeniach, aby osiągnąć stężenie 10% w każdym dołku.

Kontrolę ujemną należy zawsze dołączyć w trzech egzemplarzach. Inkubuj w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez żądany czas, od 30 minut do dwóch, czterech lub sześciu godzin. Następnie przygotuj objętość nieprzepuszczalnego barwnika DNA potrzebną do dodania 25 mikrolitrów pięciomikromolowego nieprzepuszczalnego barwnika DNA, aby osiągnąć końcowe stężenie jednego mikromola w każdym dołku.

Na 15 minut przed końcem czasu inkubacji dodać 25 mikrolitrów pięciomikromolowego nieprzepuszczalnego barwnika DNA do każdej studzienki. Kontynuuj inkubację przez ostatnie 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Następnie bardzo ostrożnie usunąć supernatant i przechowywać w razie potrzeby.

Dodaj 100 mikrolitrów 4% paraformaldehydu. Trzymaj płytkę w ciemności i natychmiast przejdź do następnej sekcji. Po skonfigurowaniu ustawień wybierz opcję Z Series (Seria Z).

Wybierz 10 jako liczbę kroków. Wybierz trzy mikrometry jako rozmiar kroku. Załaduj płytkę do immunofluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego.

Kliknij zakładkę Uruchom. Wypełnij nazwę i opis tablicy, a następnie wybierz miejsce przechowywania. Wybierz studnie, które chcesz zdobyć.

Wybierz czas naświetlania dla Texas Red i FITC. Następnie kliknij Zdobądź Płytę i rozpocznij akwizycję, która zajmie około godziny na płytę. Następnie wybierz opcję Makro analizy.

Następnie wybierz pozycję w1 i wybierz wartość progową. Następnie wybierz żądaną wartość pikseli. I na koniec, w drugim oknie obrazu J, wybierz w2 i wybierz wartość progową z żądaną wartością piksela.

Wybierz miejsce docelowe dla pliku arkusza kalkulacyjnego, uruchom analizę, a następnie zapisz plik dziennika. Przedstawiono tutaj wysoce czuły, szeroko stosowany test do półautomatycznego oznaczania ilościowego tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w celu oceny indukcji ex vivo pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili pod wpływem różnych bodźców. Powstawanie NET określa się ilościowo w sposób trójwymiarowy poprzez ilościowe oznaczanie barwionego zewnątrzkomórkowego DNA na 10 stosach Z z odległością trzech mikrometrów, zaczynając od płaszczyzny ogniskowej w każdym dołku.

Mierząc łączną powierzchnię, zwiększa się czułość testu. Całkowita powierzchnia obrazowanych barwionych neutrofili jest określana ilościowo tylko w płaszczyźnie ogniskowej w każdym dołku, co istotnie koreluje z całkowitą liczbą neutrofili w każdym dołku ze współczynnikiem korelacji Pearsona wynoszącym 0,99. Reprezentatywny wynik kwantyfikacji powstawania NET w neutrofilach jest wyrażony jako skumulowany barwiony zewnątrzkomórkowy obszar DNA na 10 stosach Z na obrazowany neutrofil.

Następnie wykonuje się migawki testu kwantyfikacji netto. Reprezentatywne obrazy niestymulowanych neutrofili i NET w neutrofilach stymulowanych AAV są pokazane tutaj z neutrofilami znakowanymi fluorescencyjnie na czerwono i barwionym zewnątrzkomórkowym DNA na zielono. Z neutrofilami należy obchodzić się ostrożnie, a znakowanie PKH powinno być wykonywane dokładnie zgodnie z protokołem.

Ten test może być używany do badania morfologii, kinetyki i składu NET. Ta technika jest kolejną metodą, która daje możliwość badania NET w zdrowiu i chorobie. Z błękitem trypanowym, PKH i PFA należy obchodzić się w rękawiczkach i nie należy go wdychać bezpośrednio.