Name: Testy oderwanych liści w celu uproszczenia badań ekspresji genów u ziemniaków podczas porażenia owadem żującym Manduca sexta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę testów oderwanych liści ziemniaka do badania ekspresji genów w odpowiedzi na żerowanie larw Manduca sexta. Protokół zapewnia powtarzalne dane ekspresyjne w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Bobowi Farrarowi i Alexis Park za dostarczenie owadów użytych w tym badaniu oraz za ich ekspertyzę w zakresie stadium larw. Dodatkowe podziękowania dla Michaela Blackburna i Saikata Ghosha za krytyczną recenzję rękopisu.
Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tej publikacji ma na celu wyłącznie dostarczenie konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych.
USDA jest Dostawcą Równych Szans i Pracodawcą.

UWAGA: Poniższy protokół jest przeznaczony dla jednej osoby do ustawienia, obserwacji i pobierania próbek. Wiele przebiegów tej samej konfiguracji może być łączonych w celu zwiększenia replikacji biologicznej. Wszelkie dodatkowe powtórzenia eksperymentu powinny być ustawione o tej samej porze dnia, aby wyeliminować możliwe dobowe wpływy na ekspresję genów. Protokół ma na celu stworzenie 3 "zarażonych" liści dla 5 oddzielnych punktów czasowych zbiorów. Dopasowane liście kontrolne dla każdego punktu czasowego tworzą w sumie 30 próbek. Doświadczenie można przeprowadzić z różnymi rozmiarami liści i stadiami larwalnymi, ale zaleca się, aby rozmiar liścia, stadium larwalne i czas porażenia były spójne przez cały czas trwania procedury.
1. Przygotowanie roślin ziemniaka
UWAGA: Wszystkie kroki wymagające sterylnej techniki muszą być wykonane w kapturze do hodowli tkankowej18,19.
<ol>
	<li>Przygotuj sadzonki Kennebec ze źródła eksplantacji.
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę do rozmnażania.
		<ol>
			<li>Dodać 4,43 g Murashige i Skoog (MS) z witaminami w proszku, 20 g sacharozy i 2 g substytutu agaru do 1 l wody oczyszczonej metodą odwróconej osmozy (RO) w kolbie o pojemności 2 l z prętem wirowym. Przenieść kolbę na płytkę mieszającą i wymieszać. Dostosuj pH do 5,8 za pomocą NaOH, kontynuując mieszanie. 
			UWAGA: Agar nie rozpuści się, dopóki nie zostanie autoklawowany.</li>
			<li>Dodać 1 ml środka konserwującego/biocydu i sterylizować w autoklawie w cyklu płynnym przez 20 minut (121 °C, 101,3 kPa). Natychmiast po zakończeniu cyklu usunąć pożywkę z autoklawu i schłodzić ją do temperatury 50 °C. Przenieść 100 ml sterylnej i schłodzonej pożywki do rozmnażania do sterylnych naczyń hodowlanych (np. Magenta lub Plantcon) przy użyciu sterylnej techniki w kapturze do hodowli tkankowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj materiał eksplantacyjny.
		<ol>
			<li>Pozyskać źródło eksplantacji w postaci sadzeniaków Kennebec i usunąć wszelkie ślady gleby, myjąc je kranemH2O. Usuń kiełki i pokrój na 2 cm kawałki sterylnym skalpelem.</li>
			<li>Sterylizuj kawałki kiełków, mocząc przez 15 s w 70% etanolu, a następnie 13 minut w wybielaczu 1:1 (1 część wody RO: 1 część skoncentrowanego wybielacza bakteriobójczego/komercyjnego). Spłukać 5 razy w sterylnym H2O.</li>
			<li>Przenieść materiał eksplantacyjny do sterylnych naczyń do hodowli tkanek z pożywką do rozmnażania w kapturze do hodowli tkankowych przy użyciu sterylnej techniki. Przenieś naczynia do komory do hodowli tkanek roślinnych i hoduj przez 2-3 tygodnie lub do momentu powstania sadzonek w temperaturze 24 °C, 16 godzin światła (140 μmol·m-2·s-1)/8 godzin ciemnego fotoperiodu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj rozmnażane węzłowo kultury tkankowe rośliny ziemniaka.
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę do transferu węzłowego. 
		UWAGA: W ten sposób powstaje 10 naczyń do hodowli tkankowych, które mogą być użyte tego samego dnia lub mogą być wykonane z wyprzedzeniem i przechowywane w temperaturze 4 °C do czasu transferu węzłowego.
		<ol>
			<li>Dodać 36,43 g mieszanki agarowej składników odżywczych do 1 l wody oczyszczonej z odwróconej osmozy w kolbie o pojemności 2 l z prętem wirowym. Przenieść kolbę na płytkę mieszającą i wymieszać. Dostosuj pH do 5,8 za pomocą KOH, kontynuując mieszanie. 
			UWAGA: Agar nie rozpuści się, dopóki nie zostanie autoklawowany.</li>
			<li>Autoklaw w cyklu cieczy przez 20 min (121 °C, 101,3 kPa). Natychmiast po zakończeniu cyklu usunąć pożywkę z autoklawu i schłodzić ją do temperatury 50 °C. Przenieść 100 ml sterylnie schłodzonej węzłowej pożywki do przenoszenia do sterylnych naczyń hodowlanych (patrz tabela materiałów) przy użyciu sterylnej techniki w kapturze do hodowli tkankowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj sadzonki węzłowe.
		<ol>
			<li>Uzyskać sadzonki Kennebec wyhodowane z materiału eksplantowanego (wyprodukowanego w kroku 1.1.2). Sadzonki powinny mieć co najmniej 3 do 4 węzłów (punktów rozgałęzień). Usuń liście za pomocą sterylnych nożyczek lub skalpela. Odetnij gałęzie blisko głównej łodygi, pozostawiając około 2 mm tkanki gałęzi.</li>
			<li>Usuń sekcje węzłowe z łodygi, przycinając około 2 mm powyżej i poniżej każdego punktu rozgałęzienia lub węzła. Ułożyć zwierciadły węzłowe w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym węzłowe podłoże transferowe (wyprodukowane w kroku 1.2.1.2) w tej samej orientacji, co w poprzednim naczyniu (gałąź skierowana do góry).</li>
			<li>Przenieś naczynia z sadzonkami węzłowymi do komory hodowli tkanek roślinnych i hoduj przez 2\u20123 tygodnie w temperaturze 24 °C, 16 h światła (140 μmol·m-2·s-1)/8 h ciemnego fotoperiodu. 
			UWAGA: Z każdego cięcia węzłowego wyrośnie nowa sadzonka. Liczba sadzonek w każdym naczyniu określa wielkość liści. Mniejsza liczba sadzonek przenoszonych na naczynie spowoduje większe liście. Trzy rośliny na naczynie będą miały liście o wymiarach 15 mm x 20 mm w ciągu 2-3 tygodni.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Opcjonalnie) Przygotuj rośliny ziemniaka Kennebec uprawiane w glebie. 
	UWAGA: Aby uzyskać większe liście, rozmnażane węzłowo sadzonki ziemniaków można przenieść do gleby.
	<ol>
		<li>Przenieś sadzonki ziemniaków uprawiane w węzłowym podłożu transferowym do gleby, delikatnie odciągając roślinę od podłoża, aż cała tkanka korzeniowa zostanie uwolniona z agaru.</li>
		<li>Przenieś do gleby tuż nad 1. węzłem od korzeni i lekko upakuj glebę wokół przeszczepu. Podlewaj delikatnie, aby zapewnić kontakt gleby z systemem korzeniowym.</li>
		<li>Umieścić w komorze wzrostowej o 16 h światła (140 μmol·m-2·s-1)/8 h ciemnego fotoperiodu i temperaturze dzień/noc 25/20 °C. 
		UWAGA: Rośliny są gotowe, gdy dwa w pełni rozwinięte liście osiągną rozmiar odpowiedni dla testu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Opcjonalnie) Przygotuj rośliny ziemniaka z wyrosłych bulw. 
	UWAGA: Rośliny ziemniaka wyhodowane z bulw są większe i bardziej wytrzymałe i mogą być przydatne w przypadku hodowli larw na roślinach lub gdy pożądane jest nocne karmienie larw.
	<ol>
		<li>Umieść bulwę ziemniaka na głębokości 6 cali w doniczce zawierającej mieszankę gleby uzupełnioną 10 ml granulowanego nawozu o powolnym uwalnianiu.</li>
		<li>Umieścić w komorze wzrostowej o 16 h światła (140 μmol·m-2·s-1)/8 h ciemnego fotoperiodu i temperaturze dzień/noc 25/20 °C. Rośliny są gotowe około 30–40 dni od posadzenia bulw. 
		UWAGA: Nie używaj roślin, które zaczęły kwitnąć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie owadów do żerowania
<ol>
	<li>Uzyskać pożądane stadium larwalne M. sexta. 
	UWAGA: Larwy do tego badania były hodowane na sztucznej diecie przez 5. instar20 i inscenizowane przez doświadczoną osobę z wewnętrznego insektariusza. Larwy mogą być również hodowane częściowo lub całkowicie na tkance roślinnej. Larwy nie jedzą bezpośrednio przed linieniem i najprawdopodobniej jedzą zaraz po linieniu, dlatego ważna jest odpowiednia inscenizacja21.</li>
	<li>Przenieść larwy do odpowiedniego naczynia zabezpieczającego (np. 6-, 12-, 24-dołkowego naczynia do hodowli tkankowych) w zależności od wielkości larw. W naczyniu powinna znajdować się jedna larwa na studzienkę. 
	UWAGA: Larwy mogą wykazywać zachowania terytorialne lub kanibalistyczne bez źródła pożywienia i mogą zostać zranione, jeśli są trzymane razem.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Głodzić larwy do 2 godzin, ponieważ może to poprawić żerowanie larw. 
	UWAGA: W tym czasie larwy powinny znajdować się w naczyniu zabezpieczającym przechowywanym w komorze wzrostowej.</li>
</ol>
3. Konfiguracja komponentów do eksperymentu z infestacją
UWAGA: Zobacz podsumowanie schematu w Rysunek 1.
<ol>
	<li>Utwórz szablony rozmieszczenia dla każdego punktu czasowego zbiorów. 
	UWAGA: Pomocne jest ustawienie 5 różnych tac dla każdego punktu czasowego zbiorów. Dzięki temu próbki są uporządkowane i można bardziej efektywnie przemieszczać naczynia jako zestaw bez zmiany ich układu. Jeśli mają być przeprowadzone obliczenia procentowe szkód, jest to niezbędne, ponieważ obrazy przed i po inwazji muszą być rejestrowane przy tej samej ogniskowej.
	<ol>
		<li>Zaopatrz się w 5 solidnych tac, które mogą pomieścić zestaw sześciu szalek Petriego o odpowiedniej wielkości i wyłóż je białym papierem. 
		UWAGA: Rozmiar szalki Petriego zależy od wielkości liścia wybranego do testu karmienia. Liść powinien łatwo zmieścić się w naczyniu, nie dotykając boków. Na przykład naczynie o wymiarach 60 mm x 15 mm nadaje się do liści o długości lub szerokości do 50 mm.</li>
		<li>Na papierze w każdej tacy, używając szalki Petriego o odpowiedniej wielkości, obrysuj zestaw sześciu okręgów. Oznacz jeden zestaw okręgów jako "kontrola" A, B i C, a drugi jako "zainfekowany" A, B i C. Oznacz również każdy szablon umieszczania odpowiednim czasem zbiorów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Opcjonalnie) Skonfiguruj kamerę do przechwytywania obrazów "przed inwazją" i "po inwazji".
	<ol>
		<li>Zamocuj kamerę na stojaku pod odpowiednią ogniskową, aby uchwycić obraz wszystkich szalek Petriego w szablonie umieszczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz probówki z punktem czasu zbioru.
	<ol>
		<li>Oznacz zestaw 30 probówek do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml odpowiadających każdemu okręgowi w szablonie umieszczania. Oznacz probówki, aby odpowiednio zidentyfikować zakłócenie (kontrola/porażenie), literę replikacji rośliny (A, B lub C) oraz punkt czasowy zbioru (liczba minut po okresie porażenia).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować szalki Petriego wybrane w kroku 3.1.1.
	<ol>
		<li>Umieścić sterylny krążek z bibuły filtracyjnej na każdej z 30 płytek Petriego z kroku 3.1.1. Dodaj sterylną wodę, aby zwilżyć krążki; Nie pozwól, aby nadmiar wody gromadził się w naczyniu. Umieść każde danie w każdym z sześciu okręgów w każdym szablonie umieszczania.</li>
		<li>Umieść trzy rośliny ziemniaka obok każdego szablonu umieszczania. Upewnij się, że wszystkie rośliny są w tym samym wieku i względnej wielkości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przeprowadzanie inwazji
UWAGA: Jeden punkt czasowy/szablon miejsca zbiorów jest ustawiany na raz.
<ol>
	<li>Usuń dwa górne liście o dopasowanej wielkości z każdej rośliny za pomocą sterylnych nożyczek i umieść jeden liść na kontrolnej szalce Petriego i jeden na porażonej szalce Petriego dla każdej rośliny (A, B i C). Przeprowadź ten proces tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Przenieś szablon umieszczenia na stojaku aparatu, aby uchwycić obraz "przed inwazją".</li>
	<li>Przenieś larwy do każdego porażonego naczynia za pomocą miękkich w dotyku kleszczy tak szybko, jak to możliwe. Ustaw timer na żądany czas "inwazji". 
	UWAGA: Okres, w którym larwy zjadają tkankę liścia, to "czas porażenia". Jest to coś, co można określić empirycznie za pomocą kilku liści testowych/larw przed rozpoczęciem właściwej inwazji. Wybrany "czas porażenia" powinien być spójny dla wszystkich porażonych liści. 
	UWAGA: Z larwami należy obchodzić się ostrożnie za pomocą miękkich w dotyku kleszczy. Stadium od 2 do 4 może być delikatnie chwytane przez róg lub brzuch.</li>
	<li>Obserwuj karmienie, aby upewnić się, że wszystkie larwy jedzą. Larwy powinny być dodawane/usuwane w oparciu o zachowania żywieniowe. Trzymaj pokrywki na szalkach Petriego tak bardzo, jak to możliwe. 
	UWAGA: Na jeden liść można użyć wielu larw.</li>
	<li>Usuń larwy z liści pod koniec czasu porażenia. Uruchom minutnik na czas zbiorów.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Przenieś szablon umieszczania na stojak kamery, aby uchwycić obraz "po inwazji". 
	UWAGA: Wszystkie sześć liści w szablonie umieszczania jest zbieranych w określonym czasie zbiorów.</li>
</ol>
5. Zbieranie liści
<ol>
	<li>Przenieś każdy liść do odpowiedniej oznakowanej probówki na końcu każdego punktu czasu zbioru i natychmiast zamroź, wrzucając probówkę do cieczy N2. Pobraną tkankę roślinną należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu wyizolowania RNA.</li>
	<li>Powtórz kroki 4\u20125.1 dla każdego punktu czasowego zbioru.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie tkanki liścia do analizy ekspresji genów
<ol>
	<li>Zmiel zamrożoną tkankę liścia na proszek za pomocą mikrotłuczka.</li>
	<li>Wyizoluj całkowite RNA i proces ekspresji genów zgodnie z wcześniejszym opisem22.</li>
</ol>
7. (Opcjonalnie) Szacowanie uszkodzeń liści
<ol>
	<li>Oszacuj wizualnie procent uszkodzeń liści lub oblicz powierzchnię liści na obrazach przed i po inwazji.</li>
	<li>Zmierz powierzchnię liści za pomocą narzędzi programowych (np. Phenophyte)23.</li>
	<li>Na podstawie pomiarów powierzchni liści oblicz procent uszkodzeń jako 
	% obrażeń = [(powierzchnia liścia przed – powierzchnia liścia po)/powierzchnia liścia przed] x 100.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, H. W., Klessig, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAMPs%2C+MAMPs%2C+and+NAMPS+in+plant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity.</a> BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).</li>
<li>Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polypeptide+from+tomato+leaves+induces+wound-inducible+proteinase+inhibitor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins.</a> Science. 253, 895-897 (1991).</li>
<li>Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+in+the+plant+tissue%3A+the+defense+of+a+dangerous+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage.</a> Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).</li>
<li>Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+Plant+Defenses%3A+Herbivore-Associated+Molecular+Patterns+and+Effector+Arsenal+of+Chewing+Herbivores%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).</li>
<li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivore+exploits+orally+secreted+bacteria+to+suppress+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).</li>
<li>Chen, M. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+direct+plant+defense+against+insect+herbivores%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review.</a> Insect Science. 15, 101-114 (2008).</li>
<li>Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modularity+in+jasmonate+signaling+for+multistress+resilience%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience.</a> Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).</li>
<li>War, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+defence+against+herbivory+and+insect+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22AoB+PLANTS%22%5BJournal%5D)">Plant defence against herbivory and insect adaptations.</a> AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).</li>
<li>McCloud, E. S., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivory+and+caterpillar+regurgitants+amplify+the+wound-induced+increases+in+jasmonic+acid+but+not+nicotine+in+Nicotiana+sylvestris%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris.</a> Planta. 203, 430-435 (1997).</li>
<li>Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+between+the+specialist+herbivore+Manduca+sexta+%28Lepidoptera%2C+Sphingidae%29+and+its+natural+host+Nicotiana+attenuate%3A+II.+Accumulation+of+plant+mRNAs+responding+to+insect-derived+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues.</a> Plant Physiology. , 701-710 (2001).</li>
<li>Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+between+the+specialist+herbivore+Manduca+sexta+%28Lepidoptera%2C+Sphingidae%29+and+its+natural+host+Nicotiana+attenuate.+III.+Fatty+acid-amino+acid+conjugates+in+herbivore+oral+secretions+are+necessary+and+sufficient+for+herbivore-specific+plant+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses.</a> Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).</li>
<li>Lortzing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+responses+of+Solanum+dulcamara+to+natural+and+simulated+herbivory%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory.</a> Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).</li>
<li>Hjältén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulating+herbivory%3A+problems+and+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Studies%22%5BJournal%5D)">Simulating herbivory: problems and possibilities.</a> Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).</li>
<li>Lehtilä, K., Boalt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+and+usefulness+of+artificial+herbivory+in+plant-herbivore+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Studies%22%5BJournal%5D)">The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies.</a> Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).</li>
<li>Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eating+the+evidence%3F+Manduca+sexta+larvae+can+not+disrupt+specific+jasmonate+induction+in+Nicotiana+attenuata+by+rapid+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption.</a> Planta. 210, 343-346 (2000).</li>
<li>Zebelo, S. A., Maffei, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+early+signalling+events+in+plant-insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Role of early signalling events in plant-insect interactions.</a> Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).</li>
<li>Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Before+gene+expression%3A+early+events+in+plant-insect+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Before gene expression: early events in plant-insect interaction.</a> Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).</li>
<li>Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+potato+by+shoot+tip+culture+in+Petri+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Potato+Research%22%5BJournal%5D)">Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes.</a> Potato Research. 23, 445-448 (1980).</li>
<li>Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+propagation+of+potato+by+single+node+cuttings%5BTitle%5D)+AND+%22Field+Crops+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid propagation of potato by single node cuttings.</a> Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).</li>
<li>Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+combinatorics+to+screen+Bacillus+thuringiensis+isolates+for+toxicity+against+Manduca+sexta+and+Plutella+xylostella%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella.</a> Biological Control. 42, 226-232 (2007).</li>
<li>Bell, R. A., Joachim, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+rearing+laboratory+colonies+of+tobacco+hornworms+and+pink+bollworms%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms.</a> Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).</li>
<li>Lawrence, S. D., Novak, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable+plethora+of+infestation-responsive+Q-type+C2H2+transcription+factors+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato.</a> BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).</li>
<li>Green, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhenoPhyte%3A+a+flexible+affordable+method+to+quantify+2D+phenotypes+from+imagery%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery.</a> Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).</li>
<li>Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R. Jr, Blackburn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivory+responsive+C2H2+zinc+finger+transcription+factor+protein+StZFP2+from+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).</li>
<li>Korth, K. L., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+chewing+insect-specific+molecular+events+distinct+from+a+general+wound+response+in+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves.</a> Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).</li>
<li>Browne, R. A., Cooke, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+in+vitro+detached+leaf+assay+for+pre-screening+resistance+to+Fusarium+head+blight+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat.</a> European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).</li>
<li>Browne, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+components+of+fusarium+head+blight+resistance+in+soft+red+winter+wheat+germ+plasm+using+a+detached+leaf+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay.</a> Plant Disease. 89, 404-411 (2005).</li>
<li>Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detached+leaf+and+whole+plant+assays+for+soybean+aphid+resistance%3A+differential+responses+among+resistance+sources+and+biotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes.</a> Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).</li>
<li>Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detached+leaf+assay+to+screen+for+host+plant+resistance+to+Helicoverpa+armigera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera.</a> Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).</li>
<li>Vivianne, G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+laboratory+assay+for+Phytophthora+infestans+resistance+in+various+Solanum+species+reflects+the+field+situation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation.</a> European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).</li>
<li>Kamoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+encoding+a+protein+elicitor+of+Phytophthora+infestans+is+down-regulated+during+infection+of+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).</li>
<li>Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appraisal+of+artificial+screening+techniques+of+tomato+to+accurately+reflect+field+performance+of+the+Late+Blight+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance.</a> Plos One. 9, e109328(2014).</li>
<li>Arimura, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivory-induced+volatiles+elicit+defence+genes+in+lima+bean+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves.</a> Nature. 406, 512-515 (2000).</li>
<li>Erb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatiles+as+inducers+and+suppressors+of+plant+defense+and+immunity-origins%2C+specificity%2C+perception+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+of+wounding-induced+root-to-shoot+communication+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana.</a> Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).</li>
<li>Ryan, C. A., Moura, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+wound+signaling+in+plants%3A+A+new+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Systemic wound signaling in plants: A new perception.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).</li>
<li>Hilleary, R., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+signaling+in+response+to+wounding+and+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Systemic signaling in response to wounding and pathogens.</a> Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).</li>
<li>Carolina Biological Supply Company. Hornworms. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr">https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr</a> (2018).</li>
<li>Great Lakes Hornworm. Products. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.greatlakeshornworm.com/products/">https://www.greatlakeshornworm.com/products/</a> (2018).</li>
<li>The Board of regents of the University of Wisconsin System. Manduca. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/">http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/</a> (2018).</li>
<li>Raising Manduca sexta. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html">https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html</a> (2018).</li>
<li>Berkley, C. Teach life cycles with the tobacco hornworm. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr">https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr</a> (2018).</li>
<li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plant+species+determines+symbiotic+bacterial+community+mediating+suppression+of+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses.</a> Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Stosowanie istniejących metodologii roślinożernych całych roślin nie jest konieczne do osiągnięcia celu tego konkretnego badania (tj. badania przesiewowego zestawu genów kandydujących pod kątem ich odpowiedzi na porażenie). Oczywistą korzyścią płynącą z uszlachetnienia oderwanych liści jest skrócenie czasu potrzebnego na wykonanie testów roślinobójczych. Nieporęczna natura całych roślin z klatkami klipsowymi jest eliminowana, a testy są wykonywane szybciej, ponieważ rośliny w wieku zaledwie 2 tygodni mogą być używane do ...

Roślinożerność uruchamia serię molekularnych zdarzeń, podczas których roślina może zarówno zidentyfikować atak, jak i podjąć odpowiednią reakcję dla swojego przetrwania. Roślina otrzymuje dwie podstawowe wskazówki od żucia owadów; jeden z powodu fizycznego uszkodzenia tkanki, a drugi z powodu substancji specyficznych dla owadów. Wzorce molekularne związane z uszkodzeniem (DAMP) są uwalniane w odpowiedzi na uszkodzenia wywołane przez aparat gębowy larw i wywołują dobrze zdefiniowaną reakcję na ranę, która powoduje wzrost hormonu kwasu jasmonowego i transkrypcję genów obronnych1. Jednym z najbardziej znanych DAMP jest systemina, polipeptyd, który powstaje w wyniku rozszczepienia większego białka prosysteminy po zranieniu liścia2,3. Reakcja na rany wywołana kwasem jasmoninowym jest dodatkowo modulowana przez wzorce molekularne związane z roślinożercami (HAMP), które mogą pochodzić ze śliny gąsienicy, treści jelitowej (niedomykalności) i kału (frass)4. Owady używają tych substancji, aby wzmocnić lub uniknąć reakcji obronnej5. Czynniki transkrypcyjne następnie przekazują wiadomość z sygnałów hormonalnych w odpowiedzi obronnej poprzez regulację dalszych genów obronnych6,7,8.
Niektóre badania interakcji roślina-owad używane w warunkach laboratoryjnych są symulowane, a ich celem jest przybliżenie naturalnej metody odżywiania się owadów. Symulowane roślinożerność jest zwykle osiągane poprzez tworzenie sztucznych uszkodzeń tkanek roślinnych za pomocą różnych narzędzi, które naśladują specyficzny mechanizm aparatu gębowego owadów wystarczający do spowodowania uwolnienia DAMP i wyzwalenia produkcji genów obronnych. Inne składniki specyficzne dla owadów, takie jak wydzieliny z jamy ustnej lub regurgitant, są często dodawane w celu odtworzenia wkładu z HAMPs9,10,11. Stworzenie określonego rozmiaru i rodzaju rany oraz zastosowanie precyzyjnych ilości HAMP jest jedną z zalet tego typu badań i może zapewnić bardziej powtarzalne wyniki. Naturalne badania roślinożerne, w których uszkodzenia tkanek roślinnych są dokonywane przez zastosowanie owadów pozyskanych w terenie lub hodowanych w laboratorium, są często trudniejsze, ponieważ wielkość rany i ilości HAMP zależą od zachowania owadów i zwiększają zmienność danych. Metody naturalne i symulowane oraz ich zalety i wady są dobrze omówione w literaturze12,13,14.
Aby zbadać wczesne zdarzenia sygnalizacyjne, takie jak czynniki transkrypcyjne, pewien procent liścia musi zostać zużyty w stosunkowo krótkim czasie, więc larwy muszą natychmiast zacząć żuć i kontynuować konsumpcję, dopóki liść nie zostanie zamrożony do analizy. M. sexta jest żarłocznym żywicielem wielu roślin psiankowatych podczas wielu stadiów larwalnych, co czyni go idealnym do zadawania maksymalnych szkód w stosunkowo krótkim czasie15. Jest to wygodne podczas badania wczesnych zdarzeń sygnalizacyjnych, ponieważ reakcja rośliny następuje niemal natychmiast po zetknięciu się owada z powierzchnią liścia16,17. Powszechnie stosowana metoda przechowywania w klatkach zaciskowych okazuje się niezdarna, ponieważ wiele klatek wymagałoby ciągłych regulacji w trakcie eksperymentu, aby umożliwić usunięcie lub dodanie larw. Liście muszą być również wystarczająco duże i wystarczająco mocne, aby utrzymać wiele owadów żerujących w tym samym czasie. Tego typu rośliny ziemniaka wymagają dużej ilości miejsca do obserwacji karmienia. Larwy często przenoszą się na spód powierzchni liścia, co również utrudnia obserwacje żerowania. Używanie całych roślin do przeprowadzania tych eksperymentów jest oczywiście kłopotliwe.
Obecne badanie wykorzystuje oderwane liście izolowane na szalkach Petriego, a nie całe rośliny, aby usprawnić i uprościć podejście całej rośliny do badania roślinożerności. Zastosowanie protokołu w tym badaniu ogranicza się do obserwacji grupy czynników transkrypcyjnych C2H2 indukowanych wcześnie w liściach ziemniaka po roślinożernym uszkodzeniu przez larwy M. sexta.

<table><tbody><tr><td>substytut agaru</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>G3251</td> produkt to naczynie <td>zabezpieczające Gelzan</td></tr><tr><td>(naczynie 6,12 lub 24 dołkowe)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-772-49, 08-772-50, 08-72-51</td><td>Wiele innych firm sprzedaje te produkty</td></tr><tr><td>Jaja Manduca&nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>143880</td><td>30-50 jaj</td></tr><tr><td>manduca&nbsp;</td><td>Hornworm Great Lakes</td><td>NA</td><td>50, 100, 250 lub 500 jaj</td></tr><tr><td>larw manduca</td> Carolina <td>Biological Supply Company</td><td>apeluje o konkretne prośby o larwy w stadium larwalnym</td><td></td></tr> wszelkie <tr><td>larwy manduca</td> w stadium <td>Hornworm z Wielkich Jezior</td><td>wzywa do konkretnych larw w stadium zapytania</td> o wszelkie probówki do mikrowirówek <td>w stadium rozwojowym</td></tr><tr><td>, 1,7 ml&nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td>1158R22</td><td>zostały przetestowane w cieczy N2 i nie eksplodują</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog (MS) Basal Medium z witaminami</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M519</td><td>używany do produkcji mieszanki agarowej pożywki do rozmnażania</td></tr><tr><td></td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M5825</td><td>produkt to Murashige & Skoog Basal Medium z witaminami, sacharozą i</td></tr><tr><td>papierowymi krążkami filtracyjnymi</td> Gelzan <td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>09-805A</td><td>Koła Whatmana - kup pasujące do szalki Petriego</td></tr> szalka <tr><td>Petriego, 60X15 mm lub 100X15 mm</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB0875713A lub FB0875712</td><td>zakup wielkości odpowiedniej dla wielkości</td></tr><tr><td>liści ziemniaka&nbsp;</td><td>dowolny</td><td>rozmiar B (nie organiczny)</td> <td>sugeruje Maine Farmer ' s</td></tr><tr><td>Doniczki wymienne, 10"&nbsp;</td><td>Zaopatrzenie szklarni Griffin, Inc.</td><td>41PT1000CN2</td><td></td></tr><tr><td>konserwant / biocyd</td><td>Plant Cell Technology</td><td>NA</td><td>produkt to PPM (Plant Preservative Mixture)</td></tr> <tr><td>sadzeniaki do eksplantacji źródło</td><td>dowolny</td><td>rozmiar B (nie organiczny)</td> <td>sugeruje Maine Farmer ' s</td></tr><tr><td>Nawóz o spowolnionym uwalnianiu Exchange (14-14-14)</td> <td>dowolny</td><td>NA</td><td>Osmocote to popularna marka</td></tr>, <tr><td>miękkie w dotyku kleszcze</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td></td></tr><tr><td>mieszanka gleby</td><td>Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td><td>65-51121</td><td>produkt to</td></tr><tr><td>sterylne naczynie hodowlane</td> Sunshine LC1 mix&nbsp;<td>Laboratoria Fitotechnologiczne</td><td>C2100</td><td>Naczynie typu magenta, PTL-100</td></tr><tr><td>sterylne naczynie hodowlane&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>ICN2672206</td><td>produktem jest MP Biomedicals Plantcon</td></tr></tbody></table>

testy oderwanych liści w celu uproszczenia badań ekspresji genów u ziemniaków podczas porażenia owadem żującym manduca sexta

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

Wielotroficzna natura badań nad ekspresją genów u owadów wymaga dużej liczby biologicznych powtórzeń, co stwarza potrzebę prostszych, bardziej usprawnionych protokołów roślinożernych. Zaburzenia owadów żujących są zwykle badane w całych systemach roślinnych. Chociaż ta strategia całego organizmu jest popularna, nie jest konieczna, jeśli podobne obserwacje można powtórzyć w jednym oderwanym liściu. Zakłada się, że podstawowe elementy niezbędne do transdukcji sygnału są obecne w samym liściu. W przypadku wczesnych zdarzeń w transdukcji sygnału, komórki muszą tylko odebrać sygnał z perturbacji i przekazać ten sygnał do sąsiednich komórek, które są badane pod kątem ekspresji genów.
Proponowana metoda po prostu zmienia czas odłączenia. W eksperymentach z całą rośliną larwy są ograniczone do pojedynczego liścia, który jest ostatecznie odłączany od rośliny i badany pod kątem ekspresji genów. Jeśli kolejność wycinania jest odwrócona, od ostatniego w badaniach nad całą rośliną do pierwszego w badaniu oderwanym, eksperyment żywieniowy jest uproszczony.
Solanum tuberosum var. Kennebec rozmnaża się przez transfer węzłowy w prostym pożywce do hodowli tkankowej i przenosi do gleby w celu dalszego wzrostu, jeśli jest to pożądane. Liście są wycinane z rośliny rodzicielskiej i przenoszone na szalki Petriego, gdzie przeprowadza się test karmienia stadiami larwalnymi M. sexta. Uszkodzona tkanka liścia jest badana pod kątem ekspresji stosunkowo wczesnych zdarzeń w transdukcji sygnału. Analiza ekspresji genów zidentyfikowała specyficzne dla porażenia czynniki transkrypcyjne Cys2-His2 (C2H2), potwierdzając sukces stosowania oderwanych liści w badaniach wczesnej odpowiedzi. Metoda jest łatwiejsza do wykonania niż porażenie całych roślin i zajmuje mniej miejsca.

Zużycie liścia określa sukces protokołu. Zdrowe larwy o precyzyjnie określonym stadium rozwoju powinny zacząć żerować natychmiast po umieszczeniu na powierzchni liścia, a żerowanie powinno być kontynuowane w dość stałym tempie przez cały czas trwania infestacji. W Video 1 larwa na górze zaczyna żerować natychmiast po umieszczeniu i utrzymuje stałe tempo podczas pobierania pokarmu. Jest to szczególnie istotne przy badaniu wczesnych zdarzeń ekspresji genów po infestacji. La...

Przedstawiona metoda tworzy naturalną tkankę roślinną uszkodzoną przez roślinożerców poprzez zastosowanie larw Manduca sexta do oderwanych liści ziemniaka. Tkanka roślinna jest badana pod kątem ekspresji sześciu homologów czynników transkrypcyjnych biorących udział we wczesnych reakcjach na roślinożerność owadów.

Testy oderwanych liści w celu uproszczenia badań ekspresji genów u ziemniaków podczas porażenia owadem żującym Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Protokół ten wykorzystuje uproszczone podejście do pomiaru ekspresji genów roślin w odpowiedzi na roślinożerność owadów. Dzięki zastosowaniu oderwanych liści wyizolowanych na szalkach Petriego, owady są łatwiejsze do stosowania i monitorowania w stosunkowo krótkim okresie porażenia, co przyczynia się do uzyskania powtarzalnych danych dotyczących ekspresji genów. Protokół ten może być dostosowany do wielu interakcji między roślinami a owadami.jeżeli uwzględnia się obserwacje podstawowe z całych systemów roślin. Nieprzewidywalna natura żerowania owadów może być wyzwaniem. Dlatego największe szanse na sukces daje niezawodna dostawa odpowiednio wyprofilowanych larw i zdrowych roślin.Wizualizacja, jak zdrowe powinny wyglądać i zachowywać się rośliny i owady, ma zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia optymalnych wyników, szczególnie dla naukowców nowych w tej dziedzinie. Procedurę zademonstruje Frances Perez, biolog molekularny w laboratorium zajmującym się genetycznym ulepszaniem owoców i warzyw. Aby przygotować rozmnażane węzłowo hodowle tkankowe roślin ziemniaka, najpierw uzyskaj sadzonki Kennebec wyhodowane z materiału eksplantacyjnego z co najmniej trzema do czterech węzłów.Użyj sterylnego ostrza, aby usunąć liście, przycinając gałęzie blisko głównej łodygi i pozostawiając około dwóch milimetrów tkanki gałęzi na liść. Wytnij około dwóch milimetrów powyżej i poniżej każdego węzła, aby usunąć odcinki węzłowe z łodyg i ułożyć sadzonki węzłowe w sterylnym naczyniu do hodowli tkanek zawierającym węzłowe podłoże transferowe z gałęzią skierowaną do góry. Następnie przenieś sadzonki węzłowe do komory hodowli tkanek roślinnych na dwa do trzech tygodni wzrostu w temperaturze 24 stopni Celsjusza i 16-godzinnym jasnym, ośmiogodzinnym ciemnym okresie fotograficznym.Aby przygotować owady do żerowania, należy uzyskać pożądane stadium larwalne M.sexta i przenieść jedną larwę do każdej studzienki odpowiedniego naczynia zabezpieczającego w zależności od wielkości larwy. Przygotuj szablony rozmieszczenia dla każdego punktu czasowego zbiorów, korzystając z pięciu solidnych tac, które są w stanie pomieścić zestaw sześciu szalek Petriego o odpowiedniej wielkości, wyłożonych białym papierem. Za pomocą szalki Petriego o odpowiedniej wielkości narysuj zestaw sześciu okręgów na papierze w każdej tacy i oznacz jeden zestaw okręgów kontrolą A, B i C, a drugi porażone A, B i C. Następnie oznacz każdy szablon umieszczania odpowiednim czasem zbiorów.Następnie oznacz jedną probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,7 mililitra dla każdego okręgu w szablonie umieszczenia, aby odpowiednio zidentyfikować zakłócenia, literę replikacji roślin i punkt czasowy zbioru. Gdy wszystkie probówki zostaną oznaczone, umieścić sterylny krążek z bibuły filtracyjnej na jednej szalce Petriego na szablon i zwilżyć krążki sterylną wodą, nie dopuszczając do gromadzenia się nadmiaru płynu w każdym naczyniu. Następnie umieść po jednym naczyniu w każdym okręgu w każdym szablonie umieszczania i umieść trzy rośliny ziemniaka w tym samym wieku i względnej wielkości obok każdego szablonu umieszczania.Aby zainicjować inwazję, użyj sterylnych nożyczek, aby usunąć dwa górne liście o dopasowanej wielkości z każdej rośliny i umieść jeden liść na kontrolnej szalce Petriego i jeden na porażonej szalce Petriego dla każdej rośliny tak szybko, jak to możliwe. Po umieszczeniu wszystkich liści użyj miękkich w dotyku kleszczy, aby jak najszybciej przenieść co najmniej jedną larwę do każdego porażonego naczynia i ustaw minutnik na żądany czas porażenia. Obserwuj karmienie, aby upewnić się, że wszystkie larwy jedzą, w razie potrzeby zastępując larwy nieżerujące.Usuń wszystkie larwy ze wszystkich liści pod koniec czasu porażenia i uruchom licznik czasu do zbiorów. Pod koniec każdego punktu czasu zbioru przenieś każdy liść do odpowiedniej probówki i natychmiast wrzuć probówkę do ciekłego azotu, aby zamrozić próbkę liści przed przechowywaniem w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do izolacji RNA. Zdrowe, dokładnie wyprofilowane larwy powinny rozpocząć żerowanie natychmiast po umieszczeniu na powierzchni liścia, a karmienie powinno być kontynuowane w dość spójny sposób przez cały okres porażenia.Larwa na dnie tego liścia nie spożywała żadnego materiału roślinnego i jest przykładem nieudanej inwazji. Liście te zostały oderwane od dwutygodniowych węzłowych rozmnażanych roślin kultur tkankowych i spożywane w różnych dawkach i stylach odżywiania dla każdego stadium larwalnego. Na podstawie tych wyników wybrano larwy czwartego stadium rozwojowego w celu dalszej oceny uszkodzeń liści w przypadku bardziej dojrzałych roślin ziemniaka uprawianych w glebie, które są bardziej zbliżone do roślin ziemniaka uprawianych na polu.W tych badaniach ekspresji genów zidentyfikowano dwa nowe czynniki transkrypcyjne C2H2 palca cynkowego, które silnie reagują na roślinożerność M.sexta, co potwierdza użycie oderwanych liści do testów infestacji. Pamiętaj, aby używać liści dopasowanych do wieku i wielkości oraz odpowiednio ustawić larwy w każdym eksperymencie, ponieważ jednorodność skutkuje bardziej powtarzalnymi danymi. Tkanki liści można badać pod kątem indukowanych stresem reaktywnych form tlenu i pochodnych hormonu kwasu jasmonowego.Całe badania transkryptomu, proteomu lub mikrobiomu można również przeprowadzić na tkankach liści.

detached-leaf-assays-to-simplify-gene-expression-studies-potato

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Źródło: Shi, J. i inni. Przesiewowe badania i identyfikacja supresorów tłumiących RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje test współinfiltracji w celu identyfikacji białek efektorowych patogenów, które hamują wyciszanie RNA w Nicotiana benthamiana 16c. Fluorescencjonujący raport oraz gen efektorowy kandydatów są dostarczane do liści rośliny za pomocą Agrobacterium. Zazwyczaj wyciszanie RNA degraduje transkrypcje reporterów, zmniejszając...

Badanie współinfiltracyjne w celu wykrywania efektorów patogenów tłumiących wyciszanie RNA roślin

Źródło: Rufián, J. S. i in. Analiza ekspresji genów strzykawki pseudomonas w tkance roślinnej na poziomie pojedynczych komórek. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje metodę analizy ekspresji genów u patogennych bakterii roślinnych na poziomie pojedynczych komórek, wykorzystując fluorescencyjnie oznaczony czynnik transkrypcyjny. Obrazowanie konfokalne ujawnia heterogeniczność ekspresji genów zjadliwości, podkreślając funkcjonalną różnorodność w populacji bakterii klonalnych.

Analiza ekspresji genów w pojedynczych komórkach z patogenów ekstrahowanych roślinnie

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX to rutynowe testy funkcjonalne dla przejściowej ektopowej ekspresji genów w roślinach. Metody te są skutecznymi testami w strategiach efektoromicznych (szybkie odkrywanie genów oporności i wirulencji) i mają kluczowe znaczenie dla nowoczesnych badań w zakresie molekularnej patologii roślin. Spełniają one zapotrzebowanie na solidną, wysokowydajną analizę funkcjonalną w zakładach.

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX u ziemniaka i Nicotiana benthamiana

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Wiele ważnych rozwojowo genów ma specyficzne dla komórek lub tkanek wzorce ekspresji. W artykule opisano eksperymenty LM RNA-seq w celu identyfikacji genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej kukurydzy i pochwy oraz w mutantach lg1-R w porównaniu z typem dzikim. Omówione tu rozważania eksperymentalne odnoszą się do analiz transkryptomicznych innych zjawisk rozwojowych.

Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

Ten artykuł demonstruje nowe techniki opracowane do doustnego dostarczania dwuniciowego RNA (dsRNA) przez tkanki naczyniowe roślin w celu interferencji RNA (RNAi) u owadów żywiących się sokiem łyka.

Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym

Celem przedstawionego tutaj protokołu jest zbadanie transkryptomicznej odpowiedzi izolowanych endosferą Bacillus mycoides na wysięki z korzenia ziemniaka. Metoda ta ułatwia identyfikację ważnych genów bakteryjnych zaangażowanych w interakcje roślina-mikroorganizm i zasadniczo ma zastosowanie do innych endofitów i roślin, z niewielkimi dostosowaniami.

Interakcja roślina-mikroorganizm: odpowiedź transkrypcyjna Bacillus mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę przesiewową, która może być szeroko stosowana do szybkiego badania przesiewowego supresorów wyciszających RNA u patogenów roślinnych.

Badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla systemu wyciszania mikroRNA (VbMS) opartego na wirusie ziemniaka X (PVX), aby funkcjonalnie scharakteryzować endogenne mikroRNA (miRNA) u ziemniaka. Docelowe cząsteczki mimiczne (TM) interesującego nas miRNA są integrowane z wektorem PVX i przejściowo ulegają ekspresji w ziemniakach w celu wyciszenia docelowego miRNA lub rodziny miRNA.

Wyciszanie mikroRNA na bazie wirusa ziemniaka (VbMS) w ziemniakach.

Protokół opisuje zakażenie korzeni Solanum tuberosum pasożytniczymi nicieniami w warunkach szklarniowych in vivo oraz transgeniczne korzenie ziemniaka in vitro do analizy histochemicznej struktury korzenia za pomocą mikroskopii optycznej.

Zakażenie in vivo i in vitro korzeni ziemniaka nicieniami pasożytniczymi roślin w celu oceny indukowanych zmian strukturalnych

Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.

Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Poznaj uproszczoną metodę testów oderwanych liści ziemniaka do badania ekspresji genów w odpowiedzi na żerowanie larw Manduca sexta. Protokół zapewnia powtarzalne dane ekspresyjne w kontrolowanych warunkach.

Testy oderwanych liści w celu uproszczenia badań ekspresji genów u ziemniaków podczas porażenia owadem żującym Manduca sexta

Przeglądaj więcej filmów