Testy oderwanych liści w celu uproszczenia badań ekspresji genów u ziemniaków podczas porażenia owadem żującym Manduca sexta
15 maja 2019
Przedstawiona metoda tworzy naturalną tkankę roślinną uszkodzoną przez roślinożerców poprzez zastosowanie larw Manduca sexta do oderwanych liści ziemniaka. Tkanka roślinna jest badana pod kątem ekspresji sześciu homologów czynników transkrypcyjnych biorących udział we wczesnych reakcjach na roślinożerność owadów.
Protokół ten wykorzystuje uproszczone podejście do pomiaru ekspresji genów roślin w odpowiedzi na roślinożerność owadów. Dzięki zastosowaniu oderwanych liści wyizolowanych na szalkach Petriego, owady są łatwiejsze do stosowania i monitorowania w stosunkowo krótkim okresie porażenia, co przyczynia się do uzyskania powtarzalnych danych dotyczących ekspresji genów. Protokół ten może być dostosowany do wielu interakcji między roślinami a owadami.
jeżeli uwzględnia się obserwacje podstawowe z całych systemów roślin. Nieprzewidywalna natura żerowania owadów może być wyzwaniem. Dlatego największe szanse na sukces daje niezawodna dostawa odpowiednio wyprofilowanych larw i zdrowych roślin.
Wizualizacja, jak zdrowe powinny wyglądać i zachowywać się rośliny i owady, ma zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia optymalnych wyników, szczególnie dla naukowców nowych w tej dziedzinie. Procedurę zademonstruje Frances Perez, biolog molekularny w laboratorium zajmującym się genetycznym ulepszaniem owoców i warzyw. Aby przygotować rozmnażane węzłowo hodowle tkankowe roślin ziemniaka, najpierw uzyskaj sadzonki Kennebec wyhodowane z materiału eksplantacyjnego z co najmniej trzema do czterech węzłów.
Użyj sterylnego ostrza, aby usunąć liście, przycinając gałęzie blisko głównej łodygi i pozostawiając około dwóch milimetrów tkanki gałęzi na liść. Wytnij około dwóch milimetrów powyżej i poniżej każdego węzła, aby usunąć odcinki węzłowe z łodyg i ułożyć sadzonki węzłowe w sterylnym naczyniu do hodowli tkanek zawierającym węzłowe podłoże transferowe z gałęzią skierowaną do góry. Następnie przenieś sadzonki węzłowe do komory hodowli tkanek roślinnych na dwa do trzech tygodni wzrostu w temperaturze 24 stopni Celsjusza i 16-godzinnym jasnym, ośmiogodzinnym ciemnym okresie fotograficznym.
Aby przygotować owady do żerowania, należy uzyskać pożądane stadium larwalne M.sexta i przenieść jedną larwę do każdej studzienki odpowiedniego naczynia zabezpieczającego w zależności od wielkości larwy. Przygotuj szablony rozmieszczenia dla każdego punktu czasowego zbiorów, korzystając z pięciu solidnych tac, które są w stanie pomieścić zestaw sześciu szalek Petriego o odpowiedniej wielkości, wyłożonych białym papierem. Za pomocą szalki Petriego o odpowiedniej wielkości narysuj zestaw sześciu okręgów na papierze w każdej tacy i oznacz jeden zestaw okręgów kontrolą A, B i C, a drugi porażone A, B i C. Następnie oznacz każdy szablon umieszczania odpowiednim czasem zbiorów.
Następnie oznacz jedną probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,7 mililitra dla każdego okręgu w szablonie umieszczenia, aby odpowiednio zidentyfikować zakłócenia, literę replikacji roślin i punkt czasowy zbioru. Gdy wszystkie probówki zostaną oznaczone, umieścić sterylny krążek z bibuły filtracyjnej na jednej szalce Petriego na szablon i zwilżyć krążki sterylną wodą, nie dopuszczając do gromadzenia się nadmiaru płynu w każdym naczyniu. Następnie umieść po jednym naczyniu w każdym okręgu w każdym szablonie umieszczania i umieść trzy rośliny ziemniaka w tym samym wieku i względnej wielkości obok każdego szablonu umieszczania.
Aby zainicjować inwazję, użyj sterylnych nożyczek, aby usunąć dwa górne liście o dopasowanej wielkości z każdej rośliny i umieść jeden liść na kontrolnej szalce Petriego i jeden na porażonej szalce Petriego dla każdej rośliny tak szybko, jak to możliwe. Po umieszczeniu wszystkich liści użyj miękkich w dotyku kleszczy, aby jak najszybciej przenieść co najmniej jedną larwę do każdego porażonego naczynia i ustaw minutnik na żądany czas porażenia. Obserwuj karmienie, aby upewnić się, że wszystkie larwy jedzą, w razie potrzeby zastępując larwy nieżerujące.
Usuń wszystkie larwy ze wszystkich liści pod koniec czasu porażenia i uruchom licznik czasu do zbiorów. Pod koniec każdego punktu czasu zbioru przenieś każdy liść do odpowiedniej probówki i natychmiast wrzuć probówkę do ciekłego azotu, aby zamrozić próbkę liści przed przechowywaniem w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do izolacji RNA. Zdrowe, dokładnie wyprofilowane larwy powinny rozpocząć żerowanie natychmiast po umieszczeniu na powierzchni liścia, a karmienie powinno być kontynuowane w dość spójny sposób przez cały okres porażenia.
Larwa na dnie tego liścia nie spożywała żadnego materiału roślinnego i jest przykładem nieudanej inwazji. Liście te zostały oderwane od dwutygodniowych węzłowych rozmnażanych roślin kultur tkankowych i spożywane w różnych dawkach i stylach odżywiania dla każdego stadium larwalnego. Na podstawie tych wyników wybrano larwy czwartego stadium rozwojowego w celu dalszej oceny uszkodzeń liści w przypadku bardziej dojrzałych roślin ziemniaka uprawianych w glebie, które są bardziej zbliżone do roślin ziemniaka uprawianych na polu.
W tych badaniach ekspresji genów zidentyfikowano dwa nowe czynniki transkrypcyjne C2H2 palca cynkowego, które silnie reagują na roślinożerność M.sexta, co potwierdza użycie oderwanych liści do testów infestacji. Pamiętaj, aby używać liści dopasowanych do wieku i wielkości oraz odpowiednio ustawić larwy w każdym eksperymencie, ponieważ jednorodność skutkuje bardziej powtarzalnymi danymi. Tkanki liści można badać pod kątem indukowanych stresem reaktywnych form tlenu i pochodnych hormonu kwasu jasmonowego.
Całe badania transkryptomu, proteomu lub mikrobiomu można również przeprowadzić na tkankach liści.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół wykorzystuje usprawnione podejście do pomiaru ekspresji genów roślin w odpowiedzi na żerowanie owadów. Poprzez naniesienie larw Manduca sexta na oddzielone liście ziemniaka, badacze mogą w łatwy sposób monitorować wpływ żerowania na ekspresję genów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Interakcje owad-roślina
- Analiza ekspresji genów
Wstęp
- Herbivoria owadów znacząco wpływa na zdrowie i rozwój roślin.
- Zrozumienie reakcji roślin na herbivorię jest kluczowe dla praktyk rolniczych.
- Tradycyjne metody badania tych interakcji mogą być złożone i zmienne.
- Testy na odciętych liściach zapewniają kontrolowane środowisko do prowadzenia eksperymentów.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody oceny ekspresji genów roślin w odpowiedzi na herbiworię.
- Ułatwienie badania różnych interakcji między roślinami a owadami.
- Poprawa powtarzalności danych dotyczących ekspresji genów.
Zastosowane Metody
- Przeniesienie larw Manduca sexta na odcięte liście ziemniaka.
- Izolacja liści w szalkach Petriego w celu kontrolowanej obserwacji.
- Monitorowanie zachowań żerowania owadów podczas testu.
- Analiza ekspresji homologów czynników transkrypcyjnych.
Główne wyniki
- Skuteczne naniesienie larw prowadzi do mierzalnych zmian w ekspresji genów.
- Przeanalizowano ekspresję sześciu homologów czynników transkrypcyjnych.
- Dane potwierdzają powtarzalność i możliwość adaptacji tej metody.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia reakcji roślin na roślinożerność.
Wnioski
- Protokół zapewnia wiarygodne ramy do badania reakcji roślin na roślinożerność owadów.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych interakcji roślina/owad przy zastosowaniu odpowiednich kontroli.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu zgłębienia szerszych skutków ekologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Testy z wykorzystaniem oddzielonych liści ograniczają zmienność biologiczną w badaniach nad interakcjami roślina-owad, umożliwiając uzyskanie bardziej powtarzalnych danych dotyczących ekspresji genów w celu walidacji celów w biotechnologii rolniczej. To usprawnione podejście wspomaga mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniu szlaków odpowiedzi na żerowanie poprzez izolację wczesnych zdarzeń transdukcji sygnału w kontrolowanym, skalowalnym systemie. Metoda ta zwiększa wiarygodność predykcyjną w identyfikacji czynników transkrypcyjnych i węzłów sygnalizacyjnych istotnych dla rozwoju cech ochrony roślin uprawnych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie odpowiedzi transkrypcyjnych na żerowanie owadów gryzących, wspierając funkcjonalną walidację genów kandydackich, takich jak czynniki transkrypcyjne z motywem cynkowego palca C2H2.
- Wartość operacyjna: Upraszcza przebieg eksperymentu poprzez oddzielanie liści przed infestacją, co zmniejsza zapotrzebowanie na przestrzeń i zwiększa przepustowość w przesiewaniu celów.
- Wartość strategiczna: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących szlaków obronnych roślin, pomagając w priorytetyzacji cech w procesach ulepszania upraw.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia zestandaryzowaną platformę do ilościowego określania zmian w ekspresji genów w odpowiedzi na zdefiniowane zaburzenia wywołane żerowaniem roślinożerców.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje metodę ograniczania liści w szalkach Petriego, aby zapewnić powtarzalność i łatwość monitorowania zachowań żywieniowych larw.
- Wartość strategiczna: Umożliwia adaptację w różnych układach roślina-owad, co wspiera szeroką stosowalność w programach agrochemicznych i badaniach nad odkrywaniem cech.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając późniejszą analizę markerów stresu, takich jak reaktywne formy tlenu i pochodne kwasu jasmonowego.
- Wartość operacyjna: Pozwala na profilowanie całego transkryptomu, proteomu lub mikrobiomu tkanek liścia, co usprawnia integrację danych multiomicznych w ocenie cech.
- Wartość strategiczna: Wzmacnia ciągłość translacyjną poprzez powiązanie wczesnych odpowiedzi w ekspresji genów z efektami fenotypowymi w zakresie odporności na żerowanie owadów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza na oddzielonych liściach wpisuje się w fazę biologii odkrywczej, umożliwiając wczesne testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków metabolicznych przed przejściem do identyfikacji wiodących kandydatów w rozwoju cech roślin uprawnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków sygnalizacyjnych indukowanych przez roślinożerność i wyjaśnia role czynników transkrypcyjnych we wczesnych odpowiedziach obronnych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzacji przygotowania liści i kontrolowanym warunkom infestacji, co gwarantuje powtarzalne wyniki ilościowe.
- Analityka: Generuje odczyty ekspresji genów umożliwiające porównanie warunków infestacji z grupą kontrolną, co pozwala na statystyczną ocenę efektów zabiegów.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną, umożliwiając analizę pochodnych hormonów i markerów stresu oksydacyjnego powiązanych z odpornością fenotypową.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku w badaniach nad wieloma interakcjami roślina-owad, redukując koszty ponownego opracowywania metod w programach odkrywania cech.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję szumu wynikającego ze zmienności całej rośliny i skupienie się na sygnalizacji autonomicznej liścia.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność dzięki uproszczonemu odcinaniu liści i formatowi testu opartemu na szalkach Petriego.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w rozwoju cech poprzez dostarczanie wiarygodnych i powtarzalnych danych na temat wczesnych odpowiedzi obronnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację genów kandydackich z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o spójne wzorce ekspresji odpowiedzi na żerowanie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w kulturach tkanek roślinnych, wyznaczaniu stadiów larwalnych oraz technikach izolacji RNA.
- Zależne od sterylnego instrumentarium, kontrolowanych komór wzrostowych oraz infrastruktury do przechowywania RNA (ciekły azot, przechowywanie w -80°C).
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji wieku i wielkości liści oraz wyboru stadium larwalnego w celu zapewnienia jednorodności eksperymentalnej.
- Wymaga rozważenia adaptacji przy rozszerzeniu metody na inne gatunki roślin lub owady roślinożerne o różnych zachowaniach żerowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność pozyskania zdrowych larw o jednolitym stadium rozwoju oraz uważnego monitorowania w celu potwierdzenia stałego żerowania przez cały okres analizy.
