Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego
19 marca 2019
Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.
Ta technika przygotowania próbki została zaprojektowana tak, aby połączyć najlepszą jakość zachowania ultrastruktury z najbardziej odpowiednim kontrastem dla metody obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym ze skupioną wiązką jonów. Protokół ten jest szczególnie przydatny w przypadku próbek, które wymagają przygotowania przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem w celu niezawodnego zachowania ultrastruktury, ale nie uzyskują wystarczającego kontrastu podczas substytucji przez zamrożenie do obrazowania objętościowego. Aby zminimalizować osadzanie żywicy, konieczne jest usunięcie jak największej ilości żywicy, aby umożliwić prawidłowe celowanie później w skaningowym mikroskopie elektronowym ze skupioną wiązką jonów.
Na początek użyj pipety, aby nakroplić jedną kroplę 20% PVP PBS na matę do cięcia. Zanurz wypreparowany nerw piszczelowy w kropli. Użyj skalpela, aby przeciąć próbkę o długości dwóch milimetrów.
Użyj cienkich kleszczyków, aby umieścić próbkę w metalowym nośniku próbki typu A o głębokości 0,2 milimetra. Przenieś nośnik do środkowej płyty wkładu. Umieść nośnik typu B pokryty sześciokątem na górze jako pokrywę.
Zamknij zespół, opuszczając górną połowę wkładu. Zamknij trzyczęściowy wkład w stacji ładowania zamrażarki wysokociśnieniowej. Naciśnij przycisk procesu i postępuj zgodnie z instrukcją obsługi producenta.
W kąpieli ciekłego azotu umieścić nośniki próbek w fiolkach kriogenicznych zawierających dwa mililitry zamrożonego 0,1% kwasu garbnikowego i acetonu i zamknąć nakrętki. Umieścić fiolki kriogeniczne w jednostce substytucji zamrażania ustawionej na minus 90 stopni Celsjusza. Uruchom program i przechowuj w nim próbki przez 100 godzin.
W jednostce do substytucji zamrażania przemyć próbki dwoma mililitrami acetonu trzykrotnie przez 30 minut. Umieścić 2% tetratlenek osmu w 0,1% octanie uranylu w jednostce substytucji zamrażania w celu ochłodzenia i dodać go do próbek na siedmiogodzinne ciągłe barwienie w temperaturze minus 90 stopni Celsjusza. Gdy temperatura programu w jednostce substytucji zamrażania osiągnie minus 20 stopni Celsjusza, należy przechowywać próbki w tym miejscu przez kolejne 16 godzin.
Gdy temperatura wzrośnie do 4 stopni Celsjusza, wylej płyn z fiolek i wlej czysty aceton. Wyjąć fiolki kriogeniczne z jednostki do substytucji zamrażania. Obchodzenie się z próbką przed zamrożeniem i po osmofikacji ma kluczowe znaczenie, ponieważ próbka może zostać poważnie uszkodzona.
W dygestorii użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć metalowe nośniki z fiolek kriogenicznych i przenieś próbki z nośników, aby zanurzyć je w szklanym naczyniu zegarkowym o głębokości 150 milimetrów wypełnionym acetonem. Za pomocą drobnych kleszczyków przenieś próbki do dwóch mililitrowych probówek reakcyjnych wypełnionych acetonem. Ustaw kuchenkę mikrofalową na 250 watów na 40 sekund i uruchom kuchenkę mikrofalową, aby umyć próbki i powtórz cztery razy.
Odpipetować jeden mililitr 1% roztworu tiokarbohydrazydu do probówki reakcyjnej i umieścić ją w kuchence mikrofalowej. Włącz funkcję próżni po dwóch minutach włączenia i dwóch minutach wyłączenia, iterując łącznie przez 14 minut i ustaw ją na 150 watów. Uruchom kuchenkę mikrofalową.
Umyć próbkę czterokrotnie w acetonie, tak jak poprzednio. Odpipetować jeden mililitr 2% roztworu tetratlenku osmu do probówki reakcyjnej. Umieścić próbkę w kuchence mikrofalowej i użyć tych samych ustawień kuchenki mikrofalowej, co w przypadku tiokarbohydrazydu.
Umyć próbkę czterokrotnie w acetonie, tak jak poprzednio. Odpipetować jeden mililitr 25% żywicy w acetonie do probówki reakcyjnej i włożyć do kuchenki mikrofalowej. Włącz funkcję odkurzania na trzy minuty i ustaw ją na 250 watów.
Uruchom kuchenkę mikrofalową. Użyj wykałaczki, aby usunąć nerw piszczelowy z rurki reakcyjnej i umieść je na kawałku plastikowej folii. Umieść lampę halogenową w pobliżu próbek, aby podgrzać żywicę.
Za pomocą wykałaczki delikatnie popchnij próbkę po folii z tworzywa sztucznego, aż nie zostanie wykryta pozostała żywica. Umieść plastikową folię z próbką na wierzchu w piekarniku i ustaw temperaturę na 60 stopni Celsjusza, aby polimeryzować próbki przez co najmniej 48 godzin. Za pomocą żyletki wyciąć spolimeryzowane próbki wraz z folią z tworzywa sztucznego w rozmiarze pasującym do króćca SEM.
Użyj wykałaczki, aby dodać przewodzącą żywicę srebrną na króćce SEM i przymocuj do niej wycięte próbki. A następnie dodaj żywicę wokół próbek. Włóż kikuty SEM do piekarnika do polimeryzacji w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez co najmniej 4 godziny lub przez noc.
Po polimeryzacji umieść kikuty SEM w powlekarce napylającej. Ustaw napylarkę na 35 miliamperów i nałóż złotą powłokę lub powłokę o grubości 10 nanometrów na jedną minutę. Po pokryciu umieść króćce SEM w skaningowym mikroskopie elektronowym ze skupioną wiązką jonów.
W tym badaniu przeprowadzono ulepszony protokół dla nerwu piszczelowego myszy, a także C. elegans, aby zilustrować optymalne zachowanie i kontrast w celu wykonania obrazowania objętości 3D za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego ze skupioną wiązką jonów. Standardowe protokoły często cierpią z powodu braku kontrastu membranowego, podczas gdy ulepszony protokół zapewnia silny kontrast membranowy. Obrazy przekroju poprzecznego C.elegans z ulepszonym protokołem i standardowym protokołem pokazują wyraźną różnicę.
Podobnie jak w przypadku obrazów przekroju poprzecznego nerwu piszczelowego, ulepszony protokół pomaga pokazać silniejszy kontrast błony w porównaniu ze standardowym protokołem. Po przetworzeniu dane z mikroskopu elektronowego są wizualizowane za pomocą IMOD, programu do przetwarzania i modelowania obrazów. Podświetlony na niebiesko obszar pokazuje segmentowane aksony.
Podświetlony na czerwono obszar pokazuje pakiety Remak. Obszary podświetlone na żółto i pomarańczowo pokazują osłonki mielinowe. A podświetlony na turkus obszar pokazuje mitochondria.
Wirtualne krojenie i trójwymiarowy model ilustrują architekturę drobnotkankową i pomagają zrozumieć jej funkcję. Można również zastosować inne metody objętościowej skaningowej mikroskopii elektronowej, takie jak skaningowa mikroskopia elektronowa z szeregową powierzchnią blokową i tomografia matrycowa. Protokół ten może być również stosowany do transmisyjnej mikroskopii elektronowej i innych typów próbek, takich jak próbki z ośrodkowego układu nerwowego.
Tetrtlenek osmu, tiokarbohydrozyd i octan uranylu są toksycznymi chemikaliami i należy je stosować ostrożnie. Żywica jest również szkodliwa i należy jej używać ostrożnie. Aby uzyskać pełny protokół, należy nosić środki ochrony osobistej, takie jak rękawice i fartuch laboratoryjny.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia ulepszony protokół przygotowania próbek, który łączy zamrażanie pod wysokim ciśnieniem z przetwarzaniem wspomaganym mikrofalowo w celu lepszej konserwacji ultrastruktury i zwiększenia kontrastu obrazowania. Wykorzystując nerw piszczelowy myszy oraz Caenorhabditis elegans jako systemy modelowe, technika ta wykazuje znaczące zalety w stosunku do standardowych protokołów w zakresie kontrastu błon oraz możliwości obrazowania 3D.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Mikroskopia
- Techniki obrazowania
- Przygotowanie próbek
Wstęp
- Zachowanie ultrastruktury ma kluczowe znaczenie dla efektywnego obrazowania.
- Standardowe protokoły często nie zapewniają odpowiedniego kontrastu dla konkretnych tkanek.
- Połączenie wielu technik może poprawić wyniki obrazowania.
Zastosowane metody
- Mrożenie pod wysokim ciśnieniem i mikrofalowe przetwarzanie próbek
- Nerw piszczelowy myszy oraz Caenorhabditis elegans
- Skaningowa mikroskopia elektronowa z wykorzystaniem skupionej wiązki jonów (FIB-SEM)
Główne wyniki
- Udoskonalony protokół zapewnia lepszy kontrast błon w porównaniu z metodami standardowymi.
- Obrazy w przekroju poprzecznym ilustrują wyraźne różnice w wizualizacji strukturalnej.
- Wyniki potwierdzają skuteczność protokołu w przypadku szczegółowego obrazowania objętościowego w 3D.
Wnioski
- Niniejsze badanie wykazuje, że połączenie specyficznych technik przetwarzania znacząco poprawia jakość obrazowania.
- Protokół ten ma zastosowanie do różnych próbek biologicznych i może pomóc w zrozumieniu architektury tkanki.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół rozwiązuje istotny problem w obrazowaniu ultrastrukturalnym, w którym standardowe mrożenie pod wysokim ciśnieniem nie zapewnia wystarczającego kontrastu do obrazowania wolumetrycznego w technice FIB-SEM. Dzięki zwiększeniu kontrastu błon za pomocą barwienia wspomaganego mikrofalowo oraz minimalnemu zatopieniu w żywicy, metoda ta umożliwia niezawodną rekonstrukcję 3D tkanek nerwowych. Wspiera to walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach odkryć neurobiologicznych poprzez dostarczanie predykcyjnych, wysokiej wierności danych strukturalnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dzięki zachowaniu ultrastruktury i zwiększonemu kontrastowi błon w tkankach nerwowych.
- Wartość operacyjna: Redukuje niejednoznaczność w badaniach nad angażowaniem celu poprzez zapewnienie przejrzystej wizualizacji architektury aksonów i mieliny.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych z ilościowymi wynikami ultrastrukturalnymi do późniejszego przesiewania związków.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności analizy poprzez spójne wzmocnienie kontrastu i minimalne zatopienie w żywicy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie istotne dla chorób poprzez zachowanie szczegółowej architektury tkankowej w próbkach ośrodkowego układu nerwowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki generowaniu powtarzalnych danych objętościowych 3D.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od identyfikacji celu po ocenę przedkliniczną, w szczególności w programach skoncentrowanych na neuronauce, które wymagają walidacji strukturalnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez obrazowanie struktur subkomórkowych krytycznych dla funkcji neuronów.
- Screening: Zapewnia gotowość do analizy dzięki powtarzalnym, wysokokontrastowym próbkom odpowiednim dla zautomatyzowanych procesów obrazowania FIB-SEM.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty morfometryczne (np. średnica aksonu, grubość mieliny), które umożliwiają analizę porównawczą w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie architektury tkankowej istotnej dla mechanizmów chorobowych w neuropatiach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do walidacji ultrastrukturalnej w ramach wielu programów badawczych nad celami neuronalnymi.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celów poprzez ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej w ultrastrukturze neuronalnej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność przygotowania próbek dla wysokoprzepustowych kampanii obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki wiarygodnym biomarkerom strukturalnym, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach programów badawczych nad OUN.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów neuronalnych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane fenotypy ultrastrukturalne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagane jest doświadczenie w zakresie mrożenia pod wysokim ciśnieniem, przetwarzania wspomaganego mikrofalowo oraz mikroskopii elektronowej.
- Niezbędny jest dostęp do mrożąrek wysokociśnieniowych, procesorów mikrofalowych, FIB-SEM oraz urządzeń do napylania.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa pomiędzy jednostkami histologii, obrazowania i analizy danych w celu uzyskania spójnych wyników.
- Adaptacja w różnych systemach modelowych (np. mysz, C. elegans, tkanka ludzka) wymaga optymalizacji czasu barwienia i zatapiania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują obchodzenie się z toksycznymi odczynnikami (tetroksyd osmu, octan uranylu) oraz wydłużony czas przetwarzania podczas substytucji mrożeniowej i polimeryzacji.
