Name: Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj zaawansowaną metodę przygotowania próbek biologicznych łączącą zamrażanie pod wysokim ciśnieniem z przetwarzaniem wspomaganym mikrofalami. Technika ta zapewnia lepszą kontrastowość błon i doskonałą jakość obrazowania 3D w mikroskopii elektronowej FIB-SEM.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

FIB-SEM i A.S. (stanowisko operatora FIB-SEM) są finansowane przez Klaster Doskonałości i Centrum Badawcze Mikroskopii Nanoskalowej i Fizjologii Molekularnej Mózgu (CNMPB) oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Dziękujemy laboratorium Thomasa Müllera-Reicherta za dostarczenie próbek C. elegans. Dziękujemy Ulrichowi Weikertowi za udział w filmie.

Wszystkie eksperymenty, w tym próbki od zwierząt opisane tutaj, zostały zatwierdzone przez Instytucję Opieki nad Zwierzętami oraz Krajowy Urząd Ochrony Klienta i Bezpieczeństwa Żywności Dolnej Saksonii (LAVES).
1. Zamrażanie wysokociśnieniowe i substytucja zamrażania
<ol>
	<li>Wypreparuj nerw piszczelowy myszy (np. C57Bl6N, 12 tygodni, samica)9.</li>
	<li>Zanurz nerw piszczelowy w kropli 20% poliwinylopirolidonu (1 g PVP w 5 ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i pokrój na kawałki o długości 2 mm. Następnie umieść go w metalowym nośniku próbki (typ A, głębokość 0,2 mm) za pomocą drobnych kleszczyków. Dodaj kolejny płaski nośnik (typ B) pokryty cienką warstwą heksadekanu jako pokrywkę i włóż ten zespół do wkładu z próbką.</li>
	<li>Przenieść kilka C. elegan zawieszonych w kropli 20% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w M9 (patrz Tabela Materiałów) za pomocą jednorazowej plastikowej pipety do metalowego nośnika (Typ A). Następnie dodaj drugi nośnik jako pokrywę na górze (typ B) i zmontuj wkład.</li>
	<li>W przypadku obu próbek należy postępować zgodnie z poniższymi krokami: zamrozić pod wysokim ciśnieniem zespoły nośników próbek jeden po drugim, ładując je do trzyczęściowego wkładu w stacji załadowczej zamrażarki wysokociśnieniowej. Naciśnij przycisk procesu zgodnie z instrukcją obsługi producenta. 
	UWAGA: Oba rodzaje próbek mogą być przetwarzane razem w późniejszym podmienianiu przez zamrożenie.</li>
	<li>Umieścić próbki w kriowialach zawierających 2 ml zamrożonego 0,1% kwasu garbnikowego w acetonie. Przeprowadzić transfer w kąpieli ciekłego azotu bez rozlewania ciekłego azotu do fiolek. Przenieś kriowiale do automatycznego urządzenia do podstawiania zamrażania10 ustawionego na -90 °C i uruchom program. 
	UWAGA: Próbki przechowuje się w temperaturze -90 °C przez 100 godzin. Kwas garbnikowy przed osmyfikacjami jest stosowany jako zaprawa w celu zwiększenia absorpcji tetratlenku osmu11.</li>
	<li>Ręcznie przemyć próbki 3 razy przez 30 minut 2 ml acetonu w temperaturze -90 °C w jednostce substytucji przez zamrożenie.</li>
	<li>Pozostawić próbki w 2 ml 2% tetratlenku osmu, 0,1% octanu uranylu w acetonie do dalszego barwienia w automatycznej jednostce substytucji przez zamrażanie przez 7 godzin w temperaturze -90 °C. 
	UWAGA: Tetratlenek osmu jest toksyczny i należy go obchodzić pod wyciągiem, a także nosić sprzęt ochronny. 
	UWAGA: Jednostka zamianowa zamrażania automatycznie podnosi temperaturę do -20 °C przy 5 °C/h. Próbki przechowuje się w temperaturze -20 °C przez 16 godzin w jednostce substytucyjnej zamrażania. Temperatura zostanie automatycznie podniesiona do 4 °C przy 10 °C/h.</li>
	<li>Roztwór tetratlenku osmu należy wymienić na czysty aceton, gdy temperatura osiągnie 4 °C. Wyjąć kriowiale z urządzenia do substytucji przez zamrożenie.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie wspomagane mikrofalami
UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki w temperaturze pokojowej12 używając jednostki sterującej temperaturą, aby utrzymać stabilną temperaturę (patrz Tabela Materiałów).
<ol>
	<li>Pozostaw nasadki probówek reakcyjnych otwarte podczas przetwarzania w kuchence mikrofalowej.</li>
	<li>Wyjąć metalowe nośniki próbek z kriowialów i usunąć próbki z metalowego nośnika za pomocą cienkich kleszczy lub igły, trzymając próbki zanurzone w acetonie w szklanym naczyniu zegarkowym (150 mm).</li>
	<li>Przenieść próbki do probówek reakcyjnych o pojemności 2 ml za pomocą drobnych kleszczy lub pipety i przemyć 1 ml acetonu czterokrotnie przez 40 s przy 250 W. 
	UWAGA: Tiokarbohydrazyd jest toksyczny i należy go obchodzić pod wyciągiem, należy nosić sprzęt ochronny.</li>
	<li>Próbki należy zabarwić 1 ml 1% tiokarbohydrazydu w acetonie przez 14 minut przy 150 W w celu zwiększenia kontrastu. Aby przeprowadzić barwienie, należy odpipetować roztwór tiokarbohydrazydu do probówki reakcyjnej, umieścić probówkę w kuchence mikrofalowej i ustawić program na poziom mocy 150 W (przy włączonej funkcji próżni) na 2 minuty włączenia/2 minuty wyłączenia, iterując łącznie przez 14 minut. Uruchom kuchenkę mikrofalową. 
	UWAGA: Tiokarbohydrazyd reaguje z tetratlenkiem osmu, który został zastosowany podczas substytucji przez wymrażanie. Tworzy most, który pozwala na osadzenie większej ilości tetratlenku osmu na oryginalnych miejscach tetratlenku osmu13.</li>
	<li>Umyć próbki 4x 1 ml acetonu przez 40 s przy 250 W. Odpipetować aceton do probówki reakcyjnej, umieścić probówkę w kuchence mikrofalowej i wybrać 250 W na 40 s. Uruchom kuchenkę mikrofalową.</li>
	<li>Zabarwić w 1 ml 2% tetratlenku osmu w acetonie przez 14 minut przy 150 W. Odpipetować roztwór tetratlenku osmu do probówki reakcyjnej, umieścić probówkę w kuchence mikrofalowej i ustawić program na poziom mocy 150 W (przy włączonej funkcji próżni) na 2 minuty włączenia/2 minuty wyłączenia, iterując łącznie przez 14 minut. Uruchom kuchenkę mikrofalową.</li>
	<li>Przemyć próbki 4x 1 ml acetonu przez 40 s przy 250 W (jak to opisano w kroku 2.5).</li>
	<li>Naciekać 1 ml zwiększającym stężenie żywicy w acetonie (patrz tabela materiałów) 25%, 50%, 75%, 90%, 100% i 100% przez 3 minuty przy 250 W. Odpipetować żywicę do probówki reakcyjnej, umieścić probówkę w kuchence mikrofalowej i ustawić program na poziom mocy 250 W (przy włączonej funkcji próżni) na 3 minuty. Uruchom kuchenkę mikrofalową.</li>
</ol>
3. Minimalne osadzanie żywicy8
<ol>
	<li>Wyjąć nervus piszczelowo i C. elegans z probówki reakcyjnej za pomocą wykałaczki i umieścić je na kawałku folii z tworzywa sztucznego (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Użyj wykałaczki, aby delikatnie przesunąć próbkę po folii z tworzywa sztucznego, aż nie zostanie wykryta pozostała żywica. Do ogrzewania należy używać lampy halogenowej (patrz tabela materiałów), aby żywica stała się mniej lepka i można ją było łatwiej usunąć. Umieść halogen lamp wystarczająco blisko, aby podgrzać żywicę (uważając, aby nie poparzyć rąk).</li>
	<li>Próbki należy polimeryzować przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 60 °C na wierzchu folii z tworzywa sztucznego w piecu.</li>
</ol>
4. Przygotowanie do FIB-SEM
<ol>
	<li>Wyciąć spolimeryzowane próbki wraz z folią z tworzywa sztucznego za pomocą żyletki o rozmiarze pasującym do króćca SEM i przymocować je do króćców SEM za pomocą przewodzącej żywicy srebrnej (patrz tabela materiałów). Ponownie polimeryzować w temperaturze 60 °C przez co najmniej 4 godziny lub przez noc.</li>
	<li>Próbki na króćcu SEM należy pokryć złotem przez 1 minutę przy natężeniu 35 mA za pomocą napylarki (można również użyć platyny/palladu; wystarczy powłoka o grubości 10 nm) i umieścić je w FIB-SEM.</li>
</ol>
5. Akwizycja danych wewnątrz FIB-SEM
<ol>
	<li>Zobrazuj próbki za pomocą wtórnego detektora elektronów za pomocą podstawowego oprogramowania sterującego mikroskopem (patrz Tabela materiałów). Próbka powinna być zorientowana w taki sposób, aby obszar zainteresowania (np. środkowa część nerwu piszczelowego lub C. elegans) znajdował się w polu widzenia. 
	UWAGA: Aby przeprowadzić akwizycję danych, należy przechylić stolik do pozycji tak, aby próbka była skierowana w stronę wiązki jonów pod kątem 90° w odpowiedniej odległości roboczej (5 mm) w tzw. punkcie koincydencji wiązki jonów i elektronów. Za pomocą naszego przyrządu osiąga się to przy nachyleniu stopnia 54° i odległości roboczej 5 mm.</li>
	<li>Aby ustawić prawidłową pozycję próbki, wyśrodkuj wspólną cechę pod kątem 0° podczas obrazowania za pomocą wtórnego detektora elektronów. Powoli przechylaj do 54° (5°, 20°, 54°), cofając ten sam obiekt, przesuwając oś M.</li>
	<li>Znajdź punkt zbieżności, centrując cechę podczas obrazowania za pomocą wtórnego detektora elektronów pod kątem 54°, a następnie przesuwając cechę do pozycji środkowej w trybie FIB. Wykonaj to, wyświetlając krzyżyk w oprogramowaniu SEM, aby wskazać środek. Następnie najpierw przesuń wybrany przykładowy element na środek obszaru obrazu za pomocą funkcji punktu środkowego w oprogramowaniu SEM. Następnie wyśrodkuj element wzdłuż osi y, przesuwając stół montażowy w osi z. Każde końcowe przesunięcie między FIB i SEM jest korygowane za pomocą przesunięcia belki SEM.</li>
	<li>Otwórz zaawansowane oprogramowanie (patrz Spis materiałów) do nagrywania zestawów danych 3D i postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora oprogramowania krok po kroku.</li>
	<li>W obszarze zainteresowania umieść węgiel lub platynę (400 nm) na szczycie ROI za pomocą prądu 3 nA, aby umożliwić równomierne mielenie i zmniejszyć artefakty wywołane ładowaniem. 
	UWAGA: Rysując obszar zainteresowania do frezowania na powierzchni próbki zobrazowanej za pomocą FIB (szerokość, wysokość, głębokość), oprogramowanie oblicza i nakłada rozmiary różnych cech przygotowania próbki, takich jak rowy do frezowania lub obszar osadzania platyny/węgla. Należy również zachować ostrożność podczas obrazowania powierzchni próbki za pomocą zbyt wysokich prądów FIB, ponieważ może to spowodować uszkodzenie powierzchni próbki. Do obrazowania wystarczy prąd o natężeniu 50 pA.</li>
	<li>Użyj skupionej wiązki jonów do frezowania rowu, aby odsłonić obszar zainteresowania (ROI) za pomocą prądu 15/30 nA.</li>
	<li>Użyj skupionej wiązki jonów, aby wypolerować przekrój prądem 7 nA.</li>
	<li>Po zakończeniu przygotowania próbki należy ustawić następujące parametry obrazowania: parametry mielenia FIB w zakładce Ustawienia FIB (prąd frezowania FIB); Parametry obrazowania SEM w zakładce setup oraz parametry strojenia obrazu w zakładce SEM AutoTune (wykonuj autofokus i autostygmatyzację co 60 min, rozmiar piksela 50 nm, czas przebywania 3, średnia liniowa 3). Zoptymalizuj to dla każdej próbki.</li>
	<li>Aby zapobiec dryfowaniu termicznemu powodującemu dryft bloku podczas biegu, należy pozostawić pomieszczenie na co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem akwizycji.</li>
	<li>Uzyskaj zestaw danych w trybie młyna ciągłego i akwizycji z prądem FIB 700 pA. Użyj detektora ESB 1,5 kV (tryb analityczny, 900 V) o napięciu siatki 400 V, aby uzyskać obrazy o rozmiarze piksela 5 nm za pomocą zaawansowanego oprogramowania (patrz tabela materiałów) i grubości warstwy 50 nm. Jedna akwizycja obrazu trwa około 1,5 minuty przy czasie przebywania 6 μs.</li>
	<li>Rozpocznij pobieranie danych. Uzyskuje się obraz FIB przy prądzie mielenia, aby upewnić się, że próbka się nie poruszyła i wybrano właściwy obszar zainteresowania. W razie potrzeby dostosuj.</li>
</ol>
6. Wizualizacja danych
<ol>
	<li>Otwórz obrazy na Fidżi, przeciągając folder zawierający wszystkie obrazy na Fidżi i wybierz Wirtualny stos.</li>
	<li>Przytnij obszar zainteresowania za pomocą narzędzia prostokąt (Obraz > Przytnij).</li>
	<li>Odwróć dane, aby pokazać kontrast tradycyjnej transmisyjnej mikroskopii elektronowej z membranami widocznymi w ciemności (Edytuj > Odwróć).</li>
	<li>Użyj TrackEM214 (Fiji15) do wyrównania. Załaduj dane do TrackEM2 (File > New > TrackEM2), klikając warstwę. Po załadowaniu wszystkich obrazów wyrównaj je za pomocą funkcji mozaiki wielowarstwowej (kliknij prawym przyciskiem myszy Obraz > Wyrównaj > Wyrównaj mozaikę wielowarstwową). Po wyrównaniu obrazy są eksportowane jako pojedyncze pliki tiff (kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie > Eksportuj > Utwórz płaski obraz). Zaznacz wszystkie obrazy, które mają zostać wyeksportowane, i wybierz opcję Zapisz do pliku.</li>
	<li>Do przetwarzania końcowego użyj rozmycia gaussowskiego (Filtry procesowe > > Rozmycie gaussowskie; sigma 2) i lokalnego wzmocnienia kontrastu (Procesuj > Zwiększ kontrast lokalny; CLAHE: rozmiar bloku 127, przedziały histogramu 256, maksymalne nachylenie 1,5), które są stosowane na Fidżi w celu wygładzenia obrazu i uzyskania lepszego stosunku sygnału do szumu.</li>
	<li>IMOD16 służy do ręcznej segmentacji i wizualizacji interesującej nas struktury w 3D. Otwórz zestaw danych w IMOD i wybierz Narzędzia do rysowania (Special > Drawing Tools), aby przeprowadzić ręczną segmentację. Do śledzenia interesującej nas struktury w całym tomie można używać różnych narzędzi ręcznych (na przykład Połącz, Rzeźbię). Użyj przeglądarki obrazów mikroskopowych (MIB17) do półautomatycznej segmentacji.</li>
</ol>

<ol><li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples%3A+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).</li>
<li>Möbius, W., Nave, K. -A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+myelin%3A+Structure+preservation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of myelin: Structure preservation by high-pressure freezing.</a> Brain Research. 1641, 92-100 (2016).</li>
<li>Mancuso, J., Lich, B., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Reconstruction+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Reconstruction Methods for Caenorhabditis elegans Ultrastructure.</a> Methods in Cell Biology. 96, 331-361 (2010).</li>
<li>Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol">https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol</a> (2010).</li>
<li>Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focussed+Ion+Beam+Milling+and+Scanning+Electron+Microscopy+of+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2588(2011).</li>
<li>Eberle, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution%2C+high-throughput+imaging+with+a+multibeam+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">High-resolution, high-throughput imaging with a multibeam scanning electron microscope.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 114-120 (2015).</li>
<li>Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-volume+en-bloc+staining+for+electron+microscopy-based+connectomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics.</a> Nature Communications. 6, 1-7 (2015).</li>
<li>Schieber, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+resin+embedding+of+multicellular+specimens+for+targeted+FIB-SEM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Minimal resin embedding of multicellular specimens for targeted FIB-SEM imaging.</a> Methods in Cell Biology. 140, (2017).</li>
<li>Batt, J. A. E., Bain, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tibial+nerve+transection+-+a+standardized+model+for+denervation-induced+skeletal+muscle+atrophy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50657(2013).</li>
<li>Möbius, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Microscopy+of+the+Mouse+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron Microscopy of the Mouse Central Nervous System.</a> Methods in Cell Biology. 96, 475-512 (2010).</li>
<li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+MA+%22Stains+and+Cytochemical+Methods%22">Stains and Cytochemical Methods</a>. , Plenum Press. New York and London. (1993).</li>
<li>Hall, T. J., Hartweig, E., Nguyen, K. C. Q. OTO Fixation for SEM and Blockface Imaging. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.wormatlas.org/EMmethods/OTOFix.htm">http://www.wormatlas.org/EMmethods/OTOFix.htm</a> (2018).</li>
<li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li>
<li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+Image+Browser%3A+A+Platform+for+Segmentation+and+Analysis+of+Multidimensional+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Walther, P., Ziegler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+substitution+of+high-pressure+frozen+samples%3A+The+visibility+of+biological+membranes+is+improved+when+the+substitution+medium+contains+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Freeze substitution of high-pressure frozen samples: The visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water.</a> Journal of Microscopy. 208 (1), 3-10 (2002).</li>
<li>Mcdonald, K. L., Webb, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+substitution+in+3+hours+or+less%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Freeze substitution in 3 hours or less.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 227-233 (2011).</li>
<li>Reipert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agitation+Modules%3A+Flexible+Means+to+Accelerate+Automated+Freeze+Substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Agitation Modules: Flexible Means to Accelerate Automated Freeze Substitution.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. , (2018).</li>
<li>Lešer, V., Drobne, D., Pipan, Ž, Milani, M., Tatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+preparation+methods+of+biological+samples+for+FIB+milling+and+SEM+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation.</a> Journal of Microscopy. 233 (2), 309-319 (2009).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Protokół został opracowany w celu zilustrowania optymalnego zachowania i kontrastu w celu wykonania seryjnego obrazowania blokowego za pomocą FIB-SEM. Dlatego zdecydowaliśmy się na zastosowanie kriounieruchomania, a następnie barwienia końcowego przy użyciu substytucji przez zamrożenie i przetwarzania wspomaganego mikrofalami. Dlatego protokół ten jest ograniczony do próbek, które są wystarczająco małe, aby można je było zamrażać pod wysokim ciśnieniem. Ograniczenia wielkości od 3 do 6 mm szerokości i grubości ~200 μm są ustalane przez rozmiar nośnika próbki, który odpowiada wielkości próbki, którą można prawidłowo zamrozić za pomocą tej techniki. Jest to istotne w przypadku próbki nerwu myszy, ponieważ nerw kulszowy ma zbyt dużą średnicę, aby zmieścić się w nośnikach 0,2 mm, które są wymagane do zapewnienia prawidłowego zamrożenia. Dlatego zaleca się staranne wypreparowanie mniejszego nerwu, takiego jak nerw piszczelowy lub innego cienkiego nerwu, takiego jak nerw udowy. Ponieważ osłonka mielinowa jest wrażliwa na rozciąganie, należy zachować szczególną ostrożność podczas preparowania świeżego i żywego nerwu, aby uniknąć obchodzenia się z artefaktami. Ogólnie rzecz biorąc, do badań mikroskopu elektronowego należy używać tylko żywych próbek.
Przetwarzanie wspomagane mikrofalami i minimalne zatapianie żywicy mają na celu przyspieszenie procesu przygotowania i celowania. Przetwarzanie wspomagane mikrofalami z zastosowaniem zmodyfikowanego protokołu OTO4 służy do utrwalania chemicznego w temperaturze pokojowej. Domowa kuchenka mikrofalowa nie przyniesie takich samych rezultatów, ponieważ nie ma jednorodnego rozkładu mikrofal, jej temperatura nie jest kontrolowana i nie ma próżni, którą można zastosować. Im mniejsza próbka, tym lepsza penetracja substancji chemicznych; Dlatego najlepsze wyniki osiąga się na mniejszych próbach. Aby uniknąć uszkodzenia próbki w wyniku przegrzania, kluczowe znaczenie ma kontrola temperatury i zastosowanie minimalnie wymaganej mocy mikrofalowej. Etapy przetwarzania wspomaganego mikrofalami można wykonać na stole, jeśli nie ma dostępnej kuchenki mikrofalowej, co doprowadzi do wydłużenia czasu przetwarzania. Aby bezpośrednio celować w struktury w SEM, ważne jest, aby usunąć jak najwięcej żywicy z górnej części próbki. Po zarejestrowaniu zestawu danych konieczne jest przetwarzanie końcowe surowych danych w celu zmniejszenia rozmiaru pliku i poprawy stosunku sygnału do szumu. Nowoczesne techniki obrazowania objętościowego generują duże ilości danych. Dlatego, aby przetwarzanie danych przebiegało w sposób szybki i wystarczający, potrzebna jest wystarczająca ilość pamięci RAM na stacji roboczej. W przypadku operacji wyrównywania wymagane jest co najmniej dwa razy więcej pamięci RAM niż rozmiar zestawu danych.
Protokół ten został przetestowany na nerwie piszczelowym myszy, a także na C. elegans. Hall i wsp.12 osób zastosowało podobny etap wzmacniania po zamianie ich przez zamrożenie na ławce rezerwowych w celu przygotowania C. elegans. W przypadku każdego innego organizmu modelowego, takiego jak danio pręgowany, prawdopodobnie konieczne są zmiany w protokole. Jedną z możliwych modyfikacji jest zmiana składu koktajlu substytucji zamrażania, na przykład poprzez dodanie wody, która jest używana do wzmocnienia kontrastu18. Ponadto czas trwania substytucji przez wymrażanie musi być dostosowany do próbki i może zostać znacznie skrócony zgodnie z protokołem szybkiej substytucji przez zamrożenie19. Jedną z możliwości jest zastosowanie agitacji w celu przyspieszenia procesu substytucji przez zamrożenie20. Po podstawieniu przez zamrożenie możliwe są dalsze modyfikacje, takie jak wielokrotne stosowanie wzmacniających chemikaliów i tetratlenku osmu21. Podczas przetwarzania mikrofalowego temperatura, czas inkubacji i ustawienia mocy mogą być zmieniane w celu optymalizacji wyników dla danej próbki.
Protokół ten pokazuje, że takie ulepszenie można połączyć z innymi protokołami substytucji przez zamrożenie i różnymi typami próbek, jak opisano w Hali12 , które są obrazowane w FIB-SEM lub za pomocą seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej. Te techniki obrazowania wymagają zwiększonego kontrastu, który jest mniej ważny w transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wysokociśnieniowe to metoda przygotowania próbki z wyboru w celu uzyskania wysokiej jakości ultrastrukturalnej konserwacji, która znacznie lepiej reprezentuje natywny stan próbki niż konwencjonalne metody przygotowania przy użyciu chemicznego utrwalania1. Ta metoda krioprzygotowania jest przydatna w przypadku próbek takich jak mielinizowana tkanka myszy2 i ścisłe wymagania dotyczące stosowania organizmu modelowego Caenorhabditis elegans3. Po podstawieniu przez zamrożenie i zatopieniu w żywicy, próbki te są zwykle analizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) lub tomografii elektronowej (ET). Jeśli większe objętości muszą być obrazowane za pomocą FIB-SEM lub szeregowego obrazowania blokowego w celu rekonstrukcji 3D o wysokiej rozdzielczości na dużą skalę, z naszego doświadczenia wynika, że prawidłowe obrazowanie za pomocą SEM jest często utrudnione przez brak kontrastu. W FIB-SEM obraz jest zwykle rejestrowany przez detekcję elektronów wstecznie rozproszonych z pierwotnej wiązki elektronów. Wydajność elektronów wstecznie rozproszonych jest proporcjonalna do zawartości metali ciężkich w próbce. W związku z tym protokoły zostały specjalnie zaprojektowane do obrazowania objętościowego, aby zwiększyć kontrast poprzez dodatkową impregnację metalami ciężkimi. Takie metody opierają się na chemicznie utrwalonych próbkach i stosują kombinację tetrtlenku osmu-tiokarbohydrazydu-tetratlenku osmu4, zgodnie z opisem Knott et al.5, do seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z blokową powierzchnią i skupioną wiązką jonów. Modyfikacje, w tym zastosowanie formamidu i pirogalolu6 lub asparaginianu ołowiu7 zostały z powodzeniem zastosowane w różnych technikach obrazowania.
Dostarczony tutaj protokół łączy krioprzygotowanie próbek za pomocą HPF i substytucję przez zamrażanie z późniejszym przetwarzaniem wspomaganym mikrofalami w celu zwiększenia kontrastu przy użyciu tiokarbohydrazydu/tetratlenku osmu w acetonie w temperaturze pokojowej. Wykazujemy to na mielinizowanym nerwie piszczelowym myszy oraz na Caenorhabditis elegans, które reprezentują próbki wymagające zamrażania pod wysokim ciśnieniem w celu uzyskania wysokiej jakości konserwacji ultrastrukturalnej. Ponadto pokazano, w jaki sposób, po odwodnieniu i infiltracji, próbki są zatapiane z jak najmniejszą ilością żywicy. To minimalne osadzanie żywicy8 pozwala na szybsze ukierunkowanie interesującej struktury i skraca czas poświęcony na przetwarzanie próbki, w tym mniej czasu potrzebnego na naświetlenie obszaru zainteresowania wiązką jonów. Po wykonaniu dalszych etapów przygotowania próbki wewnątrz mikroskopu, obrazowanie i mielenie próbki odbywa się w sposób ciągły w celu uzyskania stosu obrazów. W przypadku wizualizacji 3D oprogramowanie do przetwarzania obrazu (IMOD) służy do rekonstrukcji części zestawu danych.
Nasz przepływ pracy opisuje, jak najbardziej odpowiednie kontrastowanie próbek do obrazowania objętościowego może być połączone z najlepszym zachowaniem ultrastrukturalnym przez HPF i podstawienie przez zamrożenie. Jest to przydatne w przypadku próbek, które ściśle wymagają kriopreparacji. Zastosowania są ograniczone do małych próbek, które można przygotować za pomocą HPF. W próbkach o różnym charakterze, takich jak materiał roślinny lub mikroorganizmy, protokół ten wymaga adaptacji.

<table><tbody><tr><td>Instrumentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica HPM100</td><td>Leica</td> Automatyczne zastępowanie przez zamrożenie Leica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratoryjna kuchenka mikrofalowa z regulatorem temperatury</td><td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EM ACE600 ze złotą tarczą</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crossbeam 540</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żarówka halogenowa 12 V/ 20 W</td><td>Piekarnik Osram</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>freezezing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>M9</td><td>Domowa według</td><td></td><td>C. Elegans- Praktyczne podejście I.A.Hope</td></tr><tr><td>Hexadecene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52276</td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2307</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik typu A</td><td>Wohlwend GmbH</td><td>#241</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik typu B</td><td>Wohlwend GmbH</td><td>#242</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik szczeliny</td><td>Wohlwend GmbH</td><td>#446</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe pipety Pasteura</td><td>VWR</td><td>612-1684</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>FST</td><td>11200-10</td><td></td></tr><tr><td>Freeze substytucja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>usługi naukowe</td><td>10015</td><td></td></tr><tr><td>Kwas garbnikowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Tetroxide osmu</td><td>EMS</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>SPI-Chem</td><td>02624-AB</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>EMS</td><td>10015</td><td></td></tr><tr><td>Tiokarbohydrazyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223220</td><td></td></tr><tr><td>Nunc CryoTubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V7884-450EA</td><td></td></tr><tr><td>Szklane czasze zegarka, 150 mm</td><td>VWR</td><td>216-2189H</td><td></td></tr><tr><td>Dętki Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Durcupan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44610</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Montaż</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SEM odgałęzienia</td><td>Science Services</td><td>E75200</td><td></td></tr><tr><td>Aclar</td><td>Science Services</td><td>50425-10</td><td></td></tr><tr><td>Wykałaczki bibuła</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtracyjna</td><td>VWR</td><td>512-3618</td><td></td></tr><tr><td>przewodząca żywica srebrna</td><td>EMS</td><td>12670-EE</td><td>EPO-TEK EE 129-4</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image acquisition</td><td>Zeiss</td><td>SmartSEM</td><td></td></tr><tr><td>Akwizycja obrazu</td><td>Zeiss</td><td>Atlas5 A3D</td><td></td></tr><tr><td>Przetwarzanie obrazu</td><td>Open source</td><td>Fiji</td><td>http://fiji.sc/#download</td></tr><tr><td>Wizualizacja obrazu</td><td>Open source</td><td>IMOD</td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Opisana technika przygotowania próbki została zaprojektowana tak, aby połączyć najlepszą jakość zachowania ultrastrukturalnego z najbardziej odpowiednim kontrastem dla metody obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym ze skupioną wiązką jonów (FIB-SEM), który jest używany do uzyskiwania stosów sekwencyjnych obrazów do rekonstrukcji i modelowania 3D. Zamrażanie wysokociśnieniowe (HPF) pozwala na zachowanie struktury zbliżonej do natywnej, ale późniejsza substytucja przez zamrożenie często nie zapewnia wystarczającego kontrastu, szczególnie w przypadku większego próbki, który jest potrzebny do wysokiej jakości obrazowania w SEM wymaganego do rekonstrukcji 3D. Dlatego w tym protokole, po podstawieniu przez zamrożenie, przeprowadza się dodatkowe kontrastujące etapy w temperaturze pokojowej. Chociaż czynności te są wykonywane w kuchence mikrofalowej, możliwe jest również zastosowanie tradycyjnej obróbki stołowej, która wymaga dłuższego czasu inkubacji. Późniejsze zatopienie w minimalnej ilości żywicy pozwala na szybsze i bardziej precyzyjne celowanie i przygotowanie wewnątrz FIB-SEM. Protokół ten jest szczególnie przydatny w przypadku próbek, które wymagają przygotowania przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem w celu niezawodnej konserwacji ultrastrukturalnej, ale nie uzyskują wystarczającego kontrastu podczas substytucji przez zamrożenie do obrazowania objętościowego przy użyciu FIB-SEM. W połączeniu z minimalnym zatopieniem żywicy, protokół ten zapewnia wydajny przepływ pracy w celu pozyskiwania wysokiej jakości danych objętościowych.

Procedura rozpoczyna się od umieszczenia próbki (w tym przypadku świeżo wypreparowanego nerwu piszczelowego myszy) w metalowych nośnikach do zamrażania wysokociśnieniowego (Rysunek 1a). Nośniki są wyjmowane z ciekłego azotu (Rysunek 1b) i umieszczane w urządzeniu do substytucji zamrożonej, na zamrożonym pierwszym koktajlu chemicznym (Rysunek 1c). Po długim protokole substytucji zamrożonej, obejmującym 2% cztlenku osmu i 0,1% octanu uranylu, próbki są usuwane z nośników w temperaturze pokojowej (Rysunek 1d). Aby dodatkowo zwiększyć kontrast, próbki są przenoszone do plastikowych probówek w celu obróbki w mikrofalówce (Rysunek 1e). Do optymalizacji procesu wykorzystuje się komorę próżniową oraz jednostkę kontroli temperatury (Rysunek 1f).
Aby przeprowadzić minimalne zatopienie w żywicy, potrzebne są wykałaczką i arkusze folii plastikowej (Rycina 2a). Po infiltrowaniu próbek żywicą za pomocą mikrofal, umieszcza się je na kawałkach folii plastikowej i przesuwa, aż na powierzchni próbki nie pozostanie żywica. Lampę halogenową wykorzystuje się do wspomagania odprowadzenia pozostałej żywicy, aby próbka pozostała minimalnie zatopiona (Rycina 2b) na folii plastikowej. Należy zauważyć, że usunięcie większej ilości żywicy z górnej części próbki jest korzystne. Pod próbką powinna jednak pozostać niewielka ilość żywicy, aby utrzymać ją w połączeniu z podłożem. Polimeryzowana na folii plastikowej próbka zostaje wycięta i zamontowana na podstawie do SEM za pomocą srebrnej żywicy przewodzącej (Rycina 2c). Podstawę polimeryzuje się przez co najmniej 4 h w temperaturze 60 °C (Rycina 2d). Składniki powinny być dokładnie wymieszane, w przeciwnym razie mieszanina może nie spolimeryzować prawidłowo. Aby uniknąć efektu ładowania w skaningowym mikroskopie elektronowym, podstawę napyla się złotem lub platyną/palladem (Rycina 2e).
Próbki umieszcza się w FIB-SEM i obrazuje za pomocą detektora elektronów wtórnych, aby zlokalizować obszar zainteresowania (Rysunek 3a,e). Wiązka jonów jest wykorzystywana do usunięcia materiału bezpośrednio przed obszarem zainteresowania w celu odsłonięcia przekroju poprzecznego (Rysunek 3b-d, 3f-h). Standardowe protokoły często charakteryzują się brakiem kontrastu błon (Rysunek 3b,f), podczas gdy protokół ulepszony zapewnia silny kontrast błon (Rysunek 3c-d, 3g-h).
Dane EM (po postprocesingu) są wizualizowane za pomocą IMOD, programu do przetwarzania i modelowania obrazów. W celu lepszego zrozumienia informacji 3D zastosowano wirtualne ponowne rzuty danych (Rycina 4a). Różne struktury zbioru danych są segmentowane ręcznie (Rycina 4b-d).
<img alt="Etapy przygotowania próbek; konfiguracja wirówki dla badania biomateriałów; metoda: separacja, analiza, schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Mrożenie wysokociśnieniowe, substytucja mrożenia oraz przetwarzanie wspomagane mikrofalowo. (a) Nośnik próbki zawierający mysi nervus tibialis, pasek skali 3 mm. (b) Nośnik próbki zawierający mysi nervus tibialis po mrożeniu wysokociśnieniowym, pasek skali 3 mm. (c) Urządzenie do automatycznej substytucji mrożenia (AFS) z próbkami. Wstawka: wykonany na zamówienie metalowy pojemnik na maksymalnie 23 fiolki z próbkami oraz dwie duże fiolki zawierające odczynniki w jednostce AFS. (d) Próbki usuwane z nośników do szklanego naczynia z acetonem, pasek skali 3 mm. (e) Próbki w probówkach reakcyjnych przygotowane do umieszczenia w kuchence mikrofalowej w celu przetworzenia. (f) Komora próżniowa i jednostka kontroli temperatury kuchenki mikrofalowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Przygotowanie próbek petrograficznych, obraz mikroskopowy, analiza metali, poszukiwanie minerałów, ustawienie próbki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Minimalne zatopienie w żywicy i przygotowanie do FIB-SEM. (a) Folia plastikowa i wykałaczki używane do minimalnego zatopienia w żywicy, pasek skali 4 cm. (b) Nervus tibialis odciekający z żywicy na folii plastikowej, pasek skali 250 µm. (c) Nervus tibialis spolimeryzowany na folii plastikowej, następnie wycięty i zamocowany na uchwycie SEM za pomocą srebrnej żywicy przewodzącej, pasek skali 250 µm. (d) Próbki spolimeryzowane na uchwycie SEM, pasek skali 3 mm. (e) Próbki pokryte złotem na uchwycie SEM, pasek skali 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa tkanek neuronalnych; obrazy przedstawiają struktury komórkowe i szczegóły przekrojów poprzecznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przygotowanie próbki wewnątrz FIB-SEM. (a i e) Obraz elektronów wtórnych powierzchni próbki w FIB-SEM (a) Nervus tibialis, pasek skali 100 µm. (e) C. elegans, pasek skali 2 µm. (b-d) i (f-h) Przekrój poprzeczny przez próbkę z wykorzystaniem detektora ESB do obrazowania. (b i c) Nervus tibialis, pasek skali 2 µm. (f i g) C. elegans, paski skali 1 µm i 200 nm. (b i f) Przedstawiono wyniki mrożenia pod wysokim ciśnieniem i substytucji mroźniczej bez wzmocnienia, podczas gdy wszystkie pozostałe obrazy pokazują wyniki wzmocnionej substytucji mroźniczej. (d i h) Szczegółowy obraz próbki z wykorzystaniem detektora ESB. (d) Nervus tibialis, pasek skali 200 nm. (h) C. elegans, pasek skali 200 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia elektronowa 3D, segmentacja tkanki nerwowej, kolorowe obszary, analiza struktur komórkowych, schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Pozyskiwanie i wizualizacja obrazów. (a) Dane EM przedstawione w IMOD z wirtualnie przeciętymi płaszczyznami x/z i y/z, pasek skali 2 µm. (b) Segmentowane aksony na danych EM (niebieskie), pęczki Remaka (czerwone), osłonki mielinowe (żółte i pomarańczowe) oraz mitochondria (turkusowe), pasek skali 2 µm. (c i d) Model 3D, paski skali 2 µm i 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Ta technika przygotowania próbki została zaprojektowana tak, aby połączyć najlepszą jakość zachowania ultrastruktury z najbardziej odpowiednim kontrastem dla metody obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym ze skupioną wiązką jonów. Protokół ten jest szczególnie przydatny w przypadku próbek, które wymagają przygotowania przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem w celu niezawodnego zachowania ultrastruktury, ale nie uzyskują wystarczającego kontrastu podczas substytucji przez zamrożenie do obrazowania objętościowego. Aby zminimalizować osadzanie żywicy, konieczne jest usunięcie jak największej ilości żywicy, aby umożliwić prawidłowe celowanie później w skaningowym mikroskopie elektronowym ze skupioną wiązką jonów.Na początek użyj pipety, aby nakroplić jedną kroplę 20% PVP PBS na matę do cięcia. Zanurz wypreparowany nerw piszczelowy w kropli. Użyj skalpela, aby przeciąć próbkę o długości dwóch milimetrów.Użyj cienkich kleszczyków, aby umieścić próbkę w metalowym nośniku próbki typu A o głębokości 0,2 milimetra. Przenieś nośnik do środkowej płyty wkładu. Umieść nośnik typu B pokryty sześciokątem na górze jako pokrywę.Zamknij zespół, opuszczając górną połowę wkładu. Zamknij trzyczęściowy wkład w stacji ładowania zamrażarki wysokociśnieniowej. Naciśnij przycisk procesu i postępuj zgodnie z instrukcją obsługi producenta.W kąpieli ciekłego azotu umieścić nośniki próbek w fiolkach kriogenicznych zawierających dwa mililitry zamrożonego 0,1% kwasu garbnikowego i acetonu i zamknąć nakrętki. Umieścić fiolki kriogeniczne w jednostce substytucji zamrażania ustawionej na minus 90 stopni Celsjusza. Uruchom program i przechowuj w nim próbki przez 100 godzin.W jednostce do substytucji zamrażania przemyć próbki dwoma mililitrami acetonu trzykrotnie przez 30 minut. Umieścić 2% tetratlenek osmu w 0,1% octanie uranylu w jednostce substytucji zamrażania w celu ochłodzenia i dodać go do próbek na siedmiogodzinne ciągłe barwienie w temperaturze minus 90 stopni Celsjusza. Gdy temperatura programu w jednostce substytucji zamrażania osiągnie minus 20 stopni Celsjusza, należy przechowywać próbki w tym miejscu przez kolejne 16 godzin.Gdy temperatura wzrośnie do 4 stopni Celsjusza, wylej płyn z fiolek i wlej czysty aceton. Wyjąć fiolki kriogeniczne z jednostki do substytucji zamrażania. Obchodzenie się z próbką przed zamrożeniem i po osmofikacji ma kluczowe znaczenie, ponieważ próbka może zostać poważnie uszkodzona.W dygestorii użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć metalowe nośniki z fiolek kriogenicznych i przenieś próbki z nośników, aby zanurzyć je w szklanym naczyniu zegarkowym o głębokości 150 milimetrów wypełnionym acetonem. Za pomocą drobnych kleszczyków przenieś próbki do dwóch mililitrowych probówek reakcyjnych wypełnionych acetonem. Ustaw kuchenkę mikrofalową na 250 watów na 40 sekund i uruchom kuchenkę mikrofalową, aby umyć próbki i powtórz cztery razy.Odpipetować jeden mililitr 1% roztworu tiokarbohydrazydu do probówki reakcyjnej i umieścić ją w kuchence mikrofalowej. Włącz funkcję próżni po dwóch minutach włączenia i dwóch minutach wyłączenia, iterując łącznie przez 14 minut i ustaw ją na 150 watów. Uruchom kuchenkę mikrofalową.Umyć próbkę czterokrotnie w acetonie, tak jak poprzednio. Odpipetować jeden mililitr 2% roztworu tetratlenku osmu do probówki reakcyjnej. Umieścić próbkę w kuchence mikrofalowej i użyć tych samych ustawień kuchenki mikrofalowej, co w przypadku tiokarbohydrazydu.Umyć próbkę czterokrotnie w acetonie, tak jak poprzednio. Odpipetować jeden mililitr 25% żywicy w acetonie do probówki reakcyjnej i włożyć do kuchenki mikrofalowej. Włącz funkcję odkurzania na trzy minuty i ustaw ją na 250 watów.Uruchom kuchenkę mikrofalową. Użyj wykałaczki, aby usunąć nerw piszczelowy z rurki reakcyjnej i umieść je na kawałku plastikowej folii. Umieść lampę halogenową w pobliżu próbek, aby podgrzać żywicę.Za pomocą wykałaczki delikatnie popchnij próbkę po folii z tworzywa sztucznego, aż nie zostanie wykryta pozostała żywica. Umieść plastikową folię z próbką na wierzchu w piekarniku i ustaw temperaturę na 60 stopni Celsjusza, aby polimeryzować próbki przez co najmniej 48 godzin. Za pomocą żyletki wyciąć spolimeryzowane próbki wraz z folią z tworzywa sztucznego w rozmiarze pasującym do króćca SEM.Użyj wykałaczki, aby dodać przewodzącą żywicę srebrną na króćce SEM i przymocuj do niej wycięte próbki. A następnie dodaj żywicę wokół próbek. Włóż kikuty SEM do piekarnika do polimeryzacji w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez co najmniej 4 godziny lub przez noc.Po polimeryzacji umieść kikuty SEM w powlekarce napylającej. Ustaw napylarkę na 35 miliamperów i nałóż złotą powłokę lub powłokę o grubości 10 nanometrów na jedną minutę. Po pokryciu umieść króćce SEM w skaningowym mikroskopie elektronowym ze skupioną wiązką jonów.W tym badaniu przeprowadzono ulepszony protokół dla nerwu piszczelowego myszy, a także C. elegans, aby zilustrować optymalne zachowanie i kontrast w celu wykonania obrazowania objętości 3D za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego ze skupioną wiązką jonów. Standardowe protokoły często cierpią z powodu braku kontrastu membranowego, podczas gdy ulepszony protokół zapewnia silny kontrast membranowy. Obrazy przekroju poprzecznego C.elegans z ulepszonym protokołem i standardowym protokołem pokazują wyraźną różnicę.Podobnie jak w przypadku obrazów przekroju poprzecznego nerwu piszczelowego, ulepszony protokół pomaga pokazać silniejszy kontrast błony w porównaniu ze standardowym protokołem. Po przetworzeniu dane z mikroskopu elektronowego są wizualizowane za pomocą IMOD, programu do przetwarzania i modelowania obrazów. Podświetlony na niebiesko obszar pokazuje segmentowane aksony.Podświetlony na czerwono obszar pokazuje pakiety Remak. Obszary podświetlone na żółto i pomarańczowo pokazują osłonki mielinowe. A podświetlony na turkus obszar pokazuje mitochondria.Wirtualne krojenie i trójwymiarowy model ilustrują architekturę drobnotkankową i pomagają zrozumieć jej funkcję. Można również zastosować inne metody objętościowej skaningowej mikroskopii elektronowej, takie jak skaningowa mikroskopia elektronowa z szeregową powierzchnią blokową i tomografia matrycowa. Protokół ten może być również stosowany do transmisyjnej mikroskopii elektronowej i innych typów próbek, takich jak próbki z ośrodkowego układu nerwowego.Tetrtlenek osmu, tiokarbohydrozyd i octan uranylu są toksycznymi chemikaliami i należy je stosować ostrożnie. Żywica jest również szkodliwa i należy jej używać ostrożnie. Aby uzyskać pełny protokół, należy nosić środki ochrony osobistej, takie jak rękawice i fartuch laboratoryjny.

biological-sample-preparation-high-pressure-freezing-microwave

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uzyskanie wysokiej jakości obrazów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest wyzwaniem, szczególnie w przypadku komórek roślinnych, które mają obfite duże wakuole wypełnione wodą i napowietrzone przestrzenie. Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zastępowanie przez zamrażanie znacznie skracają czas przygotowania próbek roślinnych do TEM, jednocześnie wytwarzając próbki o doskonałej konserwacji ultrastrukturalnej.

Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

W tym manuskrypcie prezentujemy wysokoprzepustową, półautomatyczną platformę kriohistologiczną do tworzenia wyrównanych obrazów kompozytowych pomiarów wielokrotnej odpowiedzi z kilku rund obrazowania fluorescencyjnego na zamrożonych odcinkach zmineralizowanych tkanek.

Wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj oferujemy łatwy, tani i efektywny czasowo protokół chemicznego utrwalania tkanki mózgowej naczelnych za pomocą utrwalacza akroleiny, co pozwala na długoterminową konserwację, która jest zgodna z immunohistochemią dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

Opracowaliśmy protokoły i zaprojektowaliśmy niestandardowe urządzenie, aby umożliwić osadzanie próbek w skali milimetrowej. Przedstawiamy procedury przygotowania próbek z naciskiem na zatapianie w rurkach z żywicy akrylowej i poliimidu w celu uzyskania sztywnego unieruchomienia i długotrwałego przechowywania próbek w celu zbadania architektury tkanek i morfologii komórek za pomocą mikro-CT.

Sztywne osadzanie utrwalonych i barwionych, całych próbek w skali milimetrowej do bezsekcyjnej histologii 3D za pomocą mikrotomografii komputerowej

Tutaj pokazujemy, jak używać urządzenia do zamrażania kanapek do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazujemy również, jak przygotować próbki do ultracienkiego cięcia po szybkim zamrożeniu.

Szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Poznaj zaawansowaną metodę przygotowania próbek biologicznych łączącą zamrażanie pod wysokim ciśnieniem z przetwarzaniem wspomaganym mikrofalami. Technika ta zapewnia lepszą kontrastowość błon i doskonałą jakość obrazowania 3D w mikroskopii elektronowej FIB-SEM.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Przeglądaj więcej filmów