Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku
20 marca 2019
Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.
Metoda ta pozwala na poznanie podstawowego mechanizmu mielinizacji i remielinizacji na poziomie komórkowym i tkankowym. Technika ta znajduje się na skrzyżowaniu kultur pierwotnych i podejść in vivo. Jest to szybki i dostępny model, którego główną zaletą jest zachowanie architektury tkankowej.
Procedurę zademonstrują Melina Thetiot, badaczka z tytułem doktora i Remi Ronzano, doktorant z mojego laboratorium. Na początek delikatnie włóż małe nożyczki do otworu wielkiego i przetnij czaszkę, wykonując jedno boczne nacięcie w bok, a następnie przetnij wokół czaszki głowy. Aby odzyskać grzbietową część czaszki, użyj cienkich, prostych kleszczy, aby ostrożnie podnieść grzbietową część czaszki.
Następnie ostrożnie wprowadź kleszcze między brzuszną czaszkę a mózg. Delikatnie odwróć mózg i przetnij nerw wzrokowy i trójdzielny małymi nożyczkami. Następnie odwróć głowę lub grzbietową część czaszki do góry nogami tuż nad 60-milimetrowym naczyniem do hodowli komórek zawierającym lodowato zimne podłoże do preparacji, aby pomóc mózgowi opaść grawitacyjnie.
Za pomocą cienkich kleszczy zorientuj mózg tak, aby strona grzbietowa była skierowana do góry, a strona brzuszna leżała. Pod mikroskopem dwuokularowym użyj cienkich, prostych kleszczy, aby unieruchomić mózg po stronie przodomózgowia. Następnie oddziel tylną część mózgu od reszty mózgu.
Przetnij szypułki móżdżku pod móżdżkiem, aby oddzielić móżdżek od reszty tylnej części mózgu. Po odizolowaniu móżdżku użyj cienkich, prostych kleszczy, aby ostrożnie oderwać opony mózgowe. Delikatnie przytrzymaj móżdżek cienkimi, zakrzywionymi kleszkami i umieść go grzbietową stroną do góry na plastikowej platformie, prostopadle do żyletki.
Następnie, za pomocą sterylnej, cienkiej końcówki pipety przymocowanej do pipety o pojemności jednego mililitra, odessać wszelki dostęp pożywki preparacyjnej wokół móżdżku. Następnie za pomocą rozdrabniacza do tkanek pokrój odcinki szoskowe móżdżku o grubości 300 mikrometrów. Następnie delikatnie dodaj kroplę pożywki preparacyjnej na pokrojony móżdżek.
Następnie, za pomocą szerokiej końcówki pipety knurowej przymocowanej do pipety o pojemności jednego mililitra, powoli zasysaj pokrojony móżdżek i przenieś go z powrotem do 60-milimetrowej pożywki do hodowli komórek zawierającej lodowatą pożywkę do preparacji. Następnie użyj dwóch cienkich, prostych kleszczyków, aby oddzielić poszczególne plasterki. Następnie, za pomocą szerokiej końcówki pipety z dzika przymocowanej do pipety o pojemności jednego mililitra, przenieś do czterech wybranych plasterków z robaka wraz z odrobiną pożywki preparacyjnej na jedną wkładkę hodowlaną na sześciodołkowej płytce.
Usuń wszelki dostęp pożywki preparacyjnej wokół plastrów za pomocą cienkiej końcówki pipety. W przypadku demielinizacji należy usunąć całą pożywkę hodowlaną poniżej wkładek hodowlanych po sześciu dniach in vitro i zastąpić ją jednym mililitrem na studzienkę wstępnie podgrzanej, świeżej pożywki hodowlanej zawierającej 0,5 miligrama na mililitr LPC. Inkubować przez 15 do 17 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% dwutlenku węgla.
Po inkubacji umyj wkładki, umieszczając je na 25-mililitrowej szalce Petriego zawierającej jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej. Następnie natychmiast przenieś wkładki hodowlane na nową, sześciodołkową płytkę, zawierającą świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę hodowlaną. Aby rozpocząć immunohistochemię, najpierw użyj kleszczy, aby podnieść wkładki hodowlane i usunąć pożywkę hodowlaną znajdującą się pod nimi.
Następnie dodaj dwa mililitry 4% PFA w 1x PBS, ph 7,4, na wkładki membranowe, aby utrwalić plastry móżdżku. Po 30 minutach umyj plastry trzy razy dwoma mililitrami 1x PBS przez 10 minut przy każdym myciu. Następnie pod mikroskopem lornetkowym, przy powiększeniu od 25x do 30x, za pomocą skalpela lub szczoteczki delikatnie oderwij plastry od wkładów membranowych.
Następnie za pomocą pędzla przenieś pływające plastry do dołków czterodołkowej płytki, zawierającej 1x PBS, aby ograniczyć zużycie przeciwciał. Następnie odessać PBS z każdej studzienki i inkubować plastry we wstępnie schłodzonym 100% etanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut. Po inkubacji odessać 100% etanol i krótko umyć plastry 1x PBS.
Następnie umyj je dwa razy w temperaturze pokojowej z 1x PBS przez 10 minut przy każdym praniu. Aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał, odessać PBS i inkubować plastry w roztworze zawierającym 1x PBS, 5% NGS i 0,3% niejonowego detergentu w temperaturze pokojowej przez 30 do 45 minut. Następnie dodaj przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubuj plastry w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.
Po całonocnej inkubacji umyj plastry trzy razy 1x PBS przez 10 minut przy każdym myciu. Następnie dodać przeciwciała drugorzędowe, rozcieńczone w roztworze blokującym, w stosunku rozcieńczenia jeden do 500 i inkubować plastry w temperaturze pokojowej w ciemności przez trzy godziny. Po inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym umyj plastry trzy razy w 1x PBS w ciemności przez 10 minut przy każdym myciu.
Następnie pod mikroskopem lornetkowym umieść 100 mikroletów 1x PBS na szkiełku podstawowym i za pomocą pędzla przenieś plastry do PBS i spłaszcz je na szkiełku. Usuń wszelki dostęp do Usługi książek telefonicznych. Na koniec umieść kroplę podłoża montażowego bezpośrednio na szkiełku nakrywkowym i delikatnie przykryj plastry.
Barwienie immunologiczne mieliny w organotypowych wycinkach móżdżku, uzyskanych od 9 do 10 dni po urodzeniu C57 czarnych myszy typu dzikiego obserwowano po 11 dniach in vitro z węzłami ronviae wzbogaconymi w kanały sodowe bramkowane napięciem, otoczone domeną przywęzłowego połączenia aksogliowego. Takie same wyniki zaobserwowano dla myszy transgenicznych PLP-GFP. Mielinizacja komórek parkengy odbywa się najczęściej po tygodniu w hodowli.
Leczenie LPC w pełni demielinizuje wycinki, które remielinizują się spontanicznie i są w pełni zmielinizowane sześć dni po demielinizacji. Ta procedura powinna zająć maksymalnie 25 minut. To jest naprawdę najbardziej krytyczny punkt.
Organotypowe kultury warstwowe nadają się do obrazowego badania dynamiki mielinizacji na żywo. Może być również stosowany do ukierunkowanych eksperymentów przesiewowych leków. Technika ta pozwala na łatwe, ilościowe podejście do badania procesów mielinizacji i remielinizacji.
Eksperymentatorzy mają przestrzegać podstawowych procedur bezpieczeństwa dotyczących dobrostanu zwierząt, nadmiernej i ostrej mielinizacji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia metodę przygotowania kultur tkankowych kroków organotypowych z móżdżku mysiego, koncentrując się na barwieniu osłonek mielinowych poprzez immunohistochemiczną analizę. Podejście to pozwala na badanie mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym, zachowując architekturę tkanki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Tło
- Mielinienie jest niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania i rozwoju neuronów.
- Badania nad mielinizacją mogą poprawić zrozumienie chorób demielinizacyjnych.
- Kultury kroków organotypowych łączą badania in vitro i in vivo.
Cel badania
- Opracowanie metody badania procesów mielinizacji i remielinizacji.
- Udostępnienie modelu dostępnego i efektywnego dla badań z obrazowaniem na żywo.
- Wprowadzenie kwalitywnych podejść do eksperymentów z badaniem działania leków związanych z mielinizacją.
Zastosowane metody
- Kultury kroków organotypowych zostały przygotowane z móżdżku mysiego.
- Model obejmuje myszy po urodzeniu, z technikami wywoływania demielnizacji i indukcji mielinizacji.
- Do analizy tworzenia osłonek mielinowych wykorzystano immunohistochemiczną analizę.
- Krytyczne kroki obejmują izolację tkanki, cięcie i protokoły fiksacji.
Główne wyniki
- Kręgi móżdżku wykazały samoistną remielinizację po leczeniu LPC.
- Mielinienie komórek Purkinjego osiągnięto w większości w ciągu jednego tygodnia kultury.
- Wyniki potwierdzają model do badania dynamiki mielinizacji.
Wnioski
- Ta metoda ułatwia badania z obrazowaniem na żywo i zapewnia systematyczne podejście do badania mielinizacji.
- Zwiększa zrozumienie mechanizmów neuronowych i może być zastosowana do badania działania leków w przypadku chorób demielinizacyjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This ex vivo cerebellar slice model enables mechanistic de-risking of myelin biology by preserving native tissue architecture while supporting quantitative readouts of myelination and remyelination dynamics. It bridges discovery and preclinical workflows by providing a reproducible system for target validation and assay development in demyelinating disease research. The model supports predictive confidence in lead identification through live imaging and drug screening compatibility.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses on myelin sheath formation and glial-axon interactions in a disease-relevant system.
- Operational Value: Supports biological de-risking by validating targets in a system that maintains cerebellar cytoarchitecture and myelination competence.
- Predictive Value: Facilitates assessment of target engagement and pathway modulation through quantifiable myelin immunostaining readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized platform for preparing validated biological systems amenable to compound screening and live imaging.
- Operational Value: Enables assay reproducibility through consistent slice preparation, fixation, and immunostaining protocols.
- Scalability Value: Supports multiplexed evaluation of pharmacological agents on demyelination and remyelination processes.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Offers disease-relevant system continuity from discovery through preclinical validation of remyelination therapeutics.
- Mechanistic De-risking: Allows observation of remyelination dynamics post-LPC demyelination, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of immunohistochemical readouts with functional myelination milestones such as node of Ranvier formation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, supporting assay development for myelin-modulating compounds.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of myelin-related targets through inducible demyelination and remyelination readouts.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized slice culture and quantitative immunostaining outputs.
- Analytics: Generates measurable dependent variables including myelin sheath intensity, node of Ranvier localization, and remyelination kinetics.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling spontaneous remyelination after injury.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cerebellar slice platform for iterative screening and target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantitative myelin and remyelination metrics.
- Operational Value: Standardization and reproducibility of slice preparation, immunostaining, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in myelin mechanism studies.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of remyelination candidates based on dose-response and kinetic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, tissue slicing, and immunohistochemistry.
- Dependent on sterile dissection tools, tissue chopper, culture inserts, and fluorescence microscopy.
- Necessitates standardization across teams for slice thickness, culture duration, and antibody titration.
- Adaptation considerations include species-specific myelin markers and culture condition optimization.
- Practical limitations include culture viability beyond several weeks and dependency on postnatal tissue sources.
