Name: Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych móżdżku myszy do badań mielinizacji i remielinizacji z zachowaniem architektury tkanek. Technika umożliwia obrazowanie na żywo oraz ilościową analizę dynamiki pochew mielinowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Seanowi Freemanowi, dr Nathalie Sol-Foulon i dr Thomasowi Roux za cenne uwagi na temat manuskryptu. Praca ta została sfinansowana przez INSERM, ICM, ARSEP Grants R13123DD, ANR R17127DD (do A.D.) i FRM fellowship, SPF20110421435 (do A.D.), FDT20170437332 (do M.T.). Dziękujemy zakładowi hodowli komórkowych CELIS oraz platformie obrazowania icm.Quant.

Wszystkie prace związane ze zwierzętami były zgodne z instytucjonalnymi zasadami i wytycznymi ustanowionymi przez UPMC, INSERM oraz Dyrektywę Rady Francji i Wspólnoty Europejskiej 86/609/EWG.
1. Przygotowanie podłoża hodowlanego i wkładek do kultur (czas pracy ≈ 10–15 min)
UWAGA: Wykonaj ten krok w okapie do hodowli przepływowej w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Przygotuj 40 ml pożywki hodowlanej, która składa się z 50% BME, 25% zbilansowanego roztworu soli Hanka (1x), 25% inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, uzupełnionej 2 mM pochodną glutaminy, 100 j.m./ml penicyliny-streptomycyny i 4,5 mg/ml D-glukozy. Dostosować pH do 7,4.</li>
	<li>Przefiltruj i wysterylizuj pożywkę przez filtr 0,22 μm przystosowany do plastikowej strzykawki o pojemności 50 ml. 
	nuta: Pożywkę hodowlaną można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej tydzień.</li>
	<li>W przypadku standardowego miotu składającego się z 6 szczeniąt należy użyć dwóch sterylnych płytek 6-dołkowych. Na każdą płytkę zdejmij pokrywę i dodaj 1 ml pożywki do akwarium</li>.
	<li>Umieść jedną wkładkę hodowlaną w każdej studzience, przytrzymując plastikową krawędź sterylnymi kleszczami. Załóż pokrywę z powrotem na talerz. 
	nuta: Plastry móżdżku pobrane od jednego młodego (6-8) mogą być wysyłane na dwie błony (3-4 plastry móżdżku na wkładkę błonową).</li>
</ol>
2. Przygotowanie podłoża preparacyjnego (czas ćwiczeń ≈ 5 min)
UWAGA: Wykonaj ten krok w kapturze do hodowli przepływowej w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Przygotuj 100 ml pożywki preparyjnej, która składa się ze zbilansowanego roztworu soli Geya uzupełnionego 4,5 mg / ml D-glukozy i 1x penicyliny-streptomycyny (100 IU / ml każdy).</li>
	<li>Filtruj i sterylizuj medium przez jednostkę filtrującą 0,22 μm. 
	nuta: Pożywka preparująca może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez co najmniej miesiąc.</li>
	<li>Dodać 5 ml zimnej pożywki preparacyjnej do 60 mm szalek do hodowli komórkowych. Przygotuj jedno naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm dla każdego młodego, które ma zostać poddane sekcji.</li>
	<li>Trzymaj naczynia do wycinki na lodzie do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie materiału preparacyjnego (czas praktyczny ≈ 15 min)
<ol>
	<li>Wyczyść ławkę 100% etanolem.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia do preparowania, żyletkę i plastikową platformę rozdrabniacza tkanek 100% etanolem.</li>
	<li>Zamocuj żyletkę i plastikową platformę na rozdrabniaczu do tkanek i dostosuj grubość cięcia do 300 μm.</li>
	<li>Upewnij się, że cały etanol wyparował przed rozpoczęciem sekcji.</li>
</ol>
4. Presekcja móżdżku i przygotowanie sekcji (czas ćwiczeń ≈ 15–20 minut na zwierzę)
<ol>
	<li>Umieścić jedną z 60-milimetrowych szalek do hodowli komórkowych zawierających lodowatą pożywkę separacyjną pod mikroskopem dwuokularowym i zdjąć górną płytkę.</li>
	<li>Przetrzyj sierść głowy 70% etanolem (ostrożnie unikając dotykania oczu zwierzęcia) i odetnij głowę zwierzęcia dużymi ostrymi nożycami, zgodnie z zatwierdzoną procedurą. 
	nuta: Plastry móżdżku są generowane z myszy P9-P10 bez określonego odchylenia płciowego lub szczepu.</li>
	<li>Użyj małych nożyczek, aby przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej głowy, zaczynając od szyi i idąc w górę do pyska myszy.</li>
	<li>Aby przytrzymać głowę i odsłonić czaszkę, odchyl skórę brzusznie pod głową i ściśnij dwa fałdy skóry między palcami.</li>
	<li>Delikatnie włóż małe nożyczki do otworu wielkiego i przetnij czaszkę, wykonując jedno boczne nacięcie w bok, a następnie przetnij wokół czaszki głowy. Podczas cięcia trzymaj czubek nożyczek jak najbardziej równolegle i blisko czaszki, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej.</li>
	<li>Odzyskaj grzbietową część czaszki za pomocą drobno prostych kleszczy. Ostrożnie unosząc grzbietową część czaszki, w razie potrzeby przetnij przylegające opony mózgowe (półprzezroczystą nawadnianą błonę otaczającą tkankę mózgową), aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadź drobno-proste kleszcze (lub alternatywnie użyj szpatułki) między brzuszną czaszkę a mózg, delikatnie odwróć mózg i przetnij nerwy wzrokowe i trójdzielne małymi nożyczkami.</li>
	<li>Pomóż mózgowi opaść grawitacyjnie do naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm zawierającego lodowatą pożywkę do preparacji, obracając głowę do góry nogami tuż nad naczyniem i w razie potrzeby uwalniając ostatnie zrosty małymi nożyczkami.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy zorientuj mózg tak, aby strona grzbietowa była skierowana w stronę badacza, a strona brzuszna leżała na dnie naczynia.</li>
	<li>Pod mikroskopem lornetkowym użyj cienkich, prostych kleszczy, aby unieruchomić mózg po stronie przodomózgowia i unikaj dotykania tyłomózgowia, ponieważ może dojść do uszkodzenia. Oddziel tyłomózgowie od reszty mózgu (przodomózgowie i śródmózgowie, patrz schemat na Rysunek 1Aa), używając drobno prostych kleszczy. Aby oddzielić móżdżek od reszty tyłomózgowia, użyj cienkich kleszczy, aby przeciąć szypułki móżdżku pod móżdżkiem (patrz schemat na rysunku 1Aa').</li>
	<li>Po wyizolowaniu móżdżku ostrożnie oderwij opony mózgowe za pomocą drobno prostych kleszczy (patrz schemat na rysunku 1Aa').</li>
	<li>Chwyć delikatnie móżdżek za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczyków i umieść go grzbietem do góry na plastikowej platformie prostopadle do żyletki do rozdrabniacza (patrz schemat na <silna klasa="xfig">Rysunek 1Bb).</li>
	<li>Nadmiar pożywki preparacyjnej wokół móżdżku należy odessać za pomocą sterylnej końcówki pipety z cienkim końcem dostosowanej do pipety o pojemności 1 ml (patrz schemat na rysunku 1Bb).</li>
	<li>Upewnij się, że móżdżek leży płasko, ale nie jest rozciągnięty, po umieszczeniu na platformie, aby uzyskać optymalne plastry strzałkowe podczas cięcia (patrz schemat na rysunku 1Bb).</li>
	<li>Pokrój strzałkowe odcinki móżdżku o grubości 300 μm za pomocą rozdrabniacza tkanek (patrz schemat na rysunku 1Bb'). Siła i prędkość ostrza muszą być zoptymalizowane na miejscu.</li>
	<li>Delikatnie dodaj kroplę pożywki preparacyjnej na pokrojony móżdżek. Używając końcówki pipety o szerokim otworze umieszczonej na pipecie o pojemności 1 ml, powoli odessać pokrojony móżdżek i przenieść go z powrotem do 60-milimetrowej płytki do hodowli komórkowej zawierającej lodowato zimne podłoże preparacyjne (patrz schemat na rysunku 1Bb'').</li>
	<li>Wyczyść plastikową platformę rozdrabniacza tkanek 100% etanolem między każdym krojeniem móżdżku. Pozwól, aby etanol odparował przed umieszczeniem następnego móżdżku na platformie.</li>
	<li>Użyj dwóch drobno prostych kleszczyków (lub alternatywnie tytanowych igieł), aby oddzielić poszczególne plastry i wybierz 6-8 plasterków z robaka (patrz schemat na rysunku 1Cc i 1Cc').</li>
	<li>Weź 6-dołkową płytkę z wkładkami hodowlanymi i przenieś do 4 wybranych wycinków na jedną wkładkę hodowlaną wraz z odrobiną pożywki preparcyjnej, używając końcówki pipety o szerokim otworze dostosowanej do pipety o pojemności 1 ml (patrz schemat na rysunku 1Cc').</li>
	<li>Umieść plastry na środku wkładki hodowlanej, używając pożywki do preparowania lub kleszczy, aby delikatnie popchnąć i pociągnąć je we właściwe miejsce, unikając ich kontaktu ze sobą (patrz schemat na rysunku 1Cc').</li>
	<li>Usuń nadmiar pożywki preparacyjnej wokół plastrów za pomocą cienkiej końcówki pipety. Upewnij się, że plastry leżą płasko na membranie (patrz schemat na rysunku 1Cc').</li>
	<li>Umieścić płytkę 6-dołkową w inkubatorze natychmiast po dodaniu plastrów do membrany.</li>
</ol>
5. Plastry Kultura i Demielinizacja (czas praktyczny ≈ 15–20 min)
UWAGA: Wykonaj ten krok w kapturze do hodowli przepływowej w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Zastąp pożywkę hodowlaną 1 ml na studzienkę wstępnie podgrzanej i buforowanej świeżej pożywki hodowlanej co 3 dni po przygotowaniu plastrów.</li>
	<li>W przypadku demielinizacji należy usunąć całą pożywkę hodowlaną poniżej wkładek hodowlanych po 6 dniach in vitro (DIV) i zastąpić ją 1 ml na studzienkę wstępnie podgrzanej świeżej pożywki hodowlanej zawierającej 0,5 mg/ml LPC. Inkubować przez 15-17 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Po inkubacji umyć wkładki, umieszczając je na szalce Petriego o średnicy 25 mm zawierającej 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej. 
	nuta: Wkładki powinny stykać się z medium, ale nie powinny być nim przykryte.</li>
	<li>Natychmiast przenieść wkładki hodowlane na nową 6-dołkową płytkę zawierającą świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Zastąp pożywkę hodowlaną 1 ml wstępnie podgrzanej świeżej pożywki hodowlanej co 2-3 dni, aż do utrwalenia plastrów.</li>
</ol>
6. Immunohistochemia (czas praktyczny ≈ 1:30–2 h)
UWAGA: Wykonaj kroki od 6.1. do 6.3. pod wyciągiem. Unikaj narażenia na działanie paraformaldehydu (PFA) i zapoznaj się z kartą charakterystyki produktu w celu uzyskania odpowiednich manipulacji i ochrony.
<ol>
	<li>Użyj kleszczy, aby podnieść każdą wkładkę hodowlaną, przytrzymując plastikową krawędź i usuń pożywkę hodowlaną pod wkładkami membranowymi z każdej studzienki.</li>
	<li>Utrwal plastry móżdżku na 30 minut, dodając 2 ml 4% PFA w 1x PBS pH 7,4 na wkładki membranowe. 
	nuta: Punkt czasowy utrwalenia zależy od stadium badanej mielinizacji: 4 DIV odpowiada początkowi mielinizacji, 7 DIV w pełni zmielinizowanym warstwom. W przypadku leczenia LPC, 9 DIV odpowiada pikowi demielinizacji, 11 DIV początkowi remielinizacji, a 14 DIV całkowicie zremielinizowanym warstwom.</li>
	<li>Umyj wkładki z plastrami trzy razy za pomocą 2 ml 1x PBS przez 10 min.</li>
	<li>Oddziel plastry od wkładek membranowych pod mikroskopem lornetkowym za pomocą powiększenia od 25x do 30x, delikatnie popychając je skalpelem lub szczotką. Alternatywnie, aby uniknąć ryzyka uszkodzenia plastrów podczas odłączania ich od membrany, użyj skalpela, aby przeciąć membranę z nadal przymocowanymi plastrami.</li>
	<li>Przenieś pływające plastry do dołków 4-dołkowej płytki zawierającej 1x PBS, za pomocą pędzla.</li>
	<li>Odessać PBS z każdej studzienki i inkubować plastry we wstępnie schłodzonym 100% etanolu w temperaturze -20 °C przez 15-20 minut. Ten etap ułatwia penetrację przeciwciał we włóknach mielinowych.</li>
	<li>Odessać 100% etanol i przemyć raz krótko 1x PBS, a następnie dwukrotnie w 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać PBS i inkubować plastry przez 30 do 45 minut z roztworem zawierającym 1x PBS, 5% NGS, 0,3% niejonowego detergentu w temperaturze pokojowej w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania przeciwciał.</li>
	<li>Zassać roztwór blokujący. Nie jest konieczne pranie.</li>
	<li>Inkubować plastry przez noc z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze blokującym w temperaturze 4 °C. Aby uwidocznić mielinę na organotypowych wycinkach móżdżku, użyj przeciwciał MBP (kurczak, 1/150 lub mysz IGg2b, Smi99, 1/200) lub PLP (szczur, hybrydoma, 1/5 do 1/10). 
	nuta: Aby ujawnić ekspresję więcej niż jednego antygenu w tym samym wycinku, wykonaj procedurę podwójnego lub potrójnego barwienia (zobacz <silna klasa="xfig">Rysunek 1 jako przykład). Aby przeprowadzić inkubację jednocześnie, upewnij się, że przeciwciała pierwotne są wytwarzane u różnych gatunków. Następnie użyj odpowiadających im przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z różnymi fluoroforami (patrz Tabela materiałów dla przeciwciał węzłowych i przywęzłowych marker18).</li>
	<li>Drugiego dnia umyj plastry trzy razy w 1x PBS przez 10 minut.</li>
	<li>Inkubować przez 3 godziny z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze blokującym (rozcieńczenie 1/500) w ciemności w temperaturze pokojowej. 
	nuta: Optymalizacja czasu rozcieńczania przeciwciał i inkubacji może być wymagana w przypadku stosowania innych przeciwciał niż opisane tutaj.</li>
	<li>Umyj plastry trzy razy w 1x PBS przez 10 minut w ciemności.</li>
	<li>Pod mikroskopem lornetkowym zamontuj plastry na szklanym szkiełku. Umieść 100 μl 1x PBS na szkiełku podstawowym i przenieś plastry do PBS za pomocą pędzla. W razie potrzeby rozłóż plastry i spłaszcz je na szkiełku. Usuń nadmiar PBS. W przypadku gdy znakowanie immunologiczne przeprowadza się z plastrami nadal przymocowanymi do błon, należy zamontować w taki sposób, aby plastry były skierowane w stronę szkiełka nakrywkowego, tak aby membrana znajdowała się na szkiełku podstawowym.</li>
	<li>Umieść kroplę podłoża montażowego bezpośrednio na szklanym szkiełku nakrywkowym i delikatnie przykryj plastry. Zamontowane szkiełka można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
</ol>

<ol><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li>
<li>Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains%3A+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+Houndmills+Basingstoke+England%22%5BJournal%5D)">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li>
<li>Waxman, S. G., Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+the+myelinated+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of the myelinated axon.</a> Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).</li>
<li>Fünfschilling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+oligodendrocytes+maintain+myelin+and+long-term+axonal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity.</a> Nature. 485, 517-521 (2012).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487, 443-448 (2012).</li>
<li>Chang, K. -J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+myelination%3A+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li>
<li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity%3A+activity-dependent+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li>
<li>Nave, K. -A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+of+the+nervous+system%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Myelination of the nervous system: mechanisms and functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).</li>
<li>Nave, K. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li>
<li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li>
<li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li>
<li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li>
<li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li>
<li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li>
<li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+An+Official+Journal+of+the+Society+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li>
<li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li>
<li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li>
<li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nodes+of+Ranvier%3A+Molecular+Assembly+and+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495(2015).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Hussain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+and+Nestorone+facilitate+axon+remyelination%3A+a+role+for+progesterone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. , 3820-3831 (2011).</li>
<li>Wioland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsilon+toxin+from+Clostridium+perfringens+acts+on+oligodendrocytes+without+forming+pores%2C+and+causes+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination.</a> Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Medina-Rodríguez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules%3A+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li>
<li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+steps+of+oligodendrogenesis%3A+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage%3A+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li>
<li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304(2014).</li>
<li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li>
<li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li>
<li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologia.+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów.

W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół generowania modelu ex vivo odpowiadającego organotypowym kulturom plastrów móżdżku myszy, zaadaptowanym z wcześniej opublikowanych metod 15,16,19 i późniejszego barwienia mielinowego tych preparatów. Strategia ta daje możliwość wizualizacji składników mieliny w wysokiej rozdzielczości zarówno w stanie zdrowym, jak i patologicznym.
Organotypowe kultury warst...

Neurony to wysoce spolaryzowane komórki, które składają się z komory somato-dendrytycznej, która otrzymuje dane wejściowe z otoczenia, oraz aksonu, który zapewnia generowanie i propagację impulsów elektrycznych do innych komórek. Szybkie propagowanie i terminowe dostarczanie informacji jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania układu nerwowego. U kręgowców jest to ułatwione przez mielinizację, która pozwala na zwiększenie prędkości przewodzenia aksonalnego1. Mielina jest wyspecjalizowaną strukturą utworzoną przez zagęszczone warstwy błony plazmatycznej wytwarzane przez mielinizujący glej, a mianowicie oligodendrocyty w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i komórki Schwanna w obwodowym układzie nerwowym (PNS). Zarówno w OUN, jak i PNS, interakcje aksoglialne napędzają tworzenie wyspecjalizowanych domen aksonalnych: węzłów Ranviera i otaczających je domen, parawęzłów i juxtaparanodes2. Segmenty aksonalne izolowane mieliną lub międzywęźlami przeplatają się z węzłami Ranviera, które odpowiadają małym niezmielinizowanym domenom wzbogaconym w kanały sodowe bramkowane napięciem (Nav). Wysokie stężenie i szybka aktywacja kanałów Nav w węzłach Ranviera umożliwiają regenerację potencjałów czynnościowych, a wraz z właściwościami izolacyjnymi osłonek mielinowych zapewniają skuteczne i szybkie przewodzenie solne impulsu nerwowego wzdłuż aksonu3.
Oprócz swojej roli w przyspieszaniu prędkości przewodzenia impulsu nerwowego, mielinizacja gleju zapewnia metaboliczne wsparcie aksonowi, zachowując jego długoterminową integralność i uczestnicząc w jego przetrwaniu4,5. Co więcej, w ostatnich latach stało się jasne, że mielina jest dynamicznie modulowana przez całe życie, przypuszczalnie uczestnicząc w ten sposób w regulacji i plastyczności różnych funkcji układu nerwowego. Korekty rozkładu, liczby, długości i grubości osłonek mielinowych wzdłuż aksonów mogą zatem stanowić nowatorski sposób precyzyjnego dostrajania różnych sieci6,7,8. W związku z tym ewolucyjne nabywanie mieliny jest kluczowym procesem dla funkcji czuciowych, motorycznych i poznawczych, a zaburzenia interakcji między aksonami a glejem są coraz częściej uważane za przyczyniające się do rozwoju lub nabytych chorób neurologicznych9.
Scharakteryzowano skład mieliny, którego specyficzną cechą jest wysoki udział lipidów (70%) w porównaniu z białkami (30%) w przeciwieństwie do innych błon komórkowych10. Jednak w przeciwieństwie do lipidów mielinowych, większość białek mieliny jest specyficzna dla mieliny, w tym podstawowe białko mieliny (MBP), białko proteolipidowe (PLP), 2',3'-cykliczny nukleotyd 3'-fosfodiesterazy (CNP), glikoproteina związana z mieliną (MAG), glikoproteina mielinowo-oligodendrocytowa (MOG), PMP-22 i P010. Istnieją różne metody histologiczne barwienia mieliny w oparciu o jej skład lipidowy, takie jak Luxol fast blue11, Sudan Black B12, metoda hematyny kwasowej Bakera13, a także barwienie srebrem14. Niemniej jednak podejścia te nie zawsze pozwalają na odpowiedni kontrast i rozdzielczość do wizualizacji poszczególnych włókien. Alternatywnym podejściem do wykrywania mieliny jest immunohistochemia skierowana przeciwko białkom mieliny. Różne przeciwciała są ukierunkowane na antygeny specyficzne dla mieliny o wysokiej swoistości i mogą być rutynowo stosowane do wykrywania struktur mielinowych. Interakcja przeciwciało-antygen może być dalej ujawniona za pomocą przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem skierowanym przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu i uwidocznionego za pomocą odpowiedniej mikroskopii fluorescencyjnej. W tym miejscu opisujemy protokół immunochemiczny barwienia mieliny na wycinkach móżdżku ex vivo, model, który pozwala na dobre zachowanie architektury tkanki nerwowej. Ponadto organizacja i rozmiar komórek Purkinjego (jedyny zmielinizowany neuron móżdżku) sprawiają, że są one klasycznym modelem do badań elektrofizjologicznych i są podobnie idealne do wykonywania badań obrazowania stałego lub na żywo.
Warstwy móżdżku są generowane z myszy P9-P10, czas odpowiadający wczesnemu początkowi mielinizacji komórek Purkinjego, procesu, który najczęściej osiąga się przez jeden tydzień ex vivo (6-7 dni in vitro, DIV)15. Ponadto model ten jest przystosowany do badania zaburzeń demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane (SM), ponieważ rozległa demielinizacja może być indukowana w wycinkach móżdżku za pomocą związku mielinotoksycznego lizofosfatydylocholiny (lub lizolecytyny, LPC), po której następuje spontaniczna remielinizacja16,17. Endogenna remielinizacja odbywa się po dwóch dniach od usunięcia LPC z pożywki hodowlanej i jest prawie zakończona tydzień po zabiegu.
Ukończenie tego protokołu zajmuje około 3 tygodnie, w tym pół dnia na przygotowanie kultur móżdżku, tydzień na uzyskanie w pełni zmielinizowanych plastrów, następnie 2 dni na osiągnięcie szczytu demielinizacji i kolejny tydzień na ich pełną remielinizację. Ponadto immunohistochemię można wykonać w ciągu 2 dni. Opisany tutaj protokół jest dostosowany do standardowego miotu 6 młodych myszy i musi być dostosowany do liczby zwierząt wykorzystanych do planowanego eksperymentu.

<table><tbody><tr><td>BME medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli (10x HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowane termicznie serum dla koni</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; Streptomycyna (10 000 j.m./ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Gey' s Zrównoważony roztwór soli</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór D-glukozy (45%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Lizofosfatydylocholina (LPC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny (100% etanolu)</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.330</td><td>Chłodzenie w temperaturze -20& C</td></tr><tr><td>Tryton&reg; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10% normalna surowica kozia (NGS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>500622</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy fosforanowy</td><td>EuroMEDEX</td><td>ET330-A</td><td>pH 7,4</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFP (poliklonalne, kurczak)</td><td>Merck Millipore</td><td>06-896</td><td>Rozcieńczenie 1/300</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko białku zasadowemu mieliny (MBP) (poliklonalne, kurczak)</td><td>Merck Millipore</td><td>AB9348</td><td>Rozcieńczenie 1/150</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko zasadowemu białku mieliny (MBP) (monoklonalne, mysie IgG2b)</td><td>Merck Millipore</td><td>NE1019</td><td>Rozcieńczenie 1/200</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PLP (szczur, hybrydoma)</td><td>Prezent od dr K. Ikenaka; Okasaki, Japonia</td><td></td><td>Rozcieńczenie 1/5 do 1/10</td></tr><tr><td>Kanał antysodowy, przeciwciało Pan (monoklonalne, mysie IgG1, klon K58/35)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>S8809</td><td>Rozcieńczenie 1/150</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Caspr (poliklonalne, królik)</td> <td>Abcam</td><td>ab34151</td><td>Rozcieńczenie 1/500</td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe kozy sprzężone z Alexa Fluor 488, 594, 647 lub 405</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Rozcieńczenie 1/500</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz do tkanek</td><td>McIlwain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duże nożyczki</td><td>FST</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki</td><td>FST</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki drobno-proste</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki zakrzywione</td><td>FST</td><td>11297-00</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych (60 mm i 100 mm)</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-, 6-dołkowe płytki do hodowli</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli milikomórkowych (0,4 i mikro; m, średnica 30 mm)</td><td>Merck Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td> do hodowli komórkowych <td>37&deg; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z drobnym końcem</td><td>Dutscher</td><td>134000CL</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o szerokim otworze</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079G</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka</td><td>Terumo Europe</td><td></td><td>20 lub 50 ml</td></tr><tr><td>Sterylne filtry strzykawkowe</td><td>Terumo Europe</td><td></td><td>0,22 i mikro; </td></tr><tr><td>m Skalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td></td></tr><tr><td>Szczotka Szkiełka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskopowe</td><td>RS France</td><td></td><td>76 mm x 26 mm x 1,1 mm</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>RS France</td><td></td><td>22 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Kimtech Sciences Wycieraczki do tkanek</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> <td>lornetkowy</td></tr></tbody></table>

przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

W układzie nerwowym, mielina jest złożoną strukturą błonową generowaną przez mielinizujące się komórki glejowe, która otacza aksony i ułatwia szybkie przewodnictwo elektryczne. Wykazano, że zmiany mielinowe występują w różnych chorobach neurologicznych, gdzie są związane z deficytami funkcjonalnymi. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis modelu ex vivo składającego się z mysich organotypowych wycinków móżdżku, które można przechowywać w hodowli przez kilka tygodni, a następnie znakować w celu wizualizacji mieliny.

Przykłady reprezentatywnych immunobarwień mieliny w organotypowych skrawkach móżdżku uzyskanych od myszy szczepu C57black6 typu dzikiego (WT) w wieku P9-P10 (Rycina 2A), a także od myszy transgenicznych PLP-GFP (Rycina 2B), wraz z barwieniem komórek Purkinjego. Skrawki móżdżku mielinizują od obszaru szlaków istoty białej skrawków w kierunku obwodu listków, a mielinizacja komórek Purkinjego zostaje w większości osiągnięta po 6 do ...

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Metoda ta pozwala na poznanie podstawowego mechanizmu mielinizacji i remielinizacji na poziomie komórkowym i tkankowym. Technika ta znajduje się na skrzyżowaniu kultur pierwotnych i podejść in vivo. Jest to szybki i dostępny model, którego główną zaletą jest zachowanie architektury tkankowej.Procedurę zademonstrują Melina Thetiot, badaczka z tytułem doktora i Remi Ronzano, doktorant z mojego laboratorium. Na początek delikatnie włóż małe nożyczki do otworu wielkiego i przetnij czaszkę, wykonując jedno boczne nacięcie w bok, a następnie przetnij wokół czaszki głowy. Aby odzyskać grzbietową część czaszki, użyj cienkich, prostych kleszczy, aby ostrożnie podnieść grzbietową część czaszki.Następnie ostrożnie wprowadź kleszcze między brzuszną czaszkę a mózg. Delikatnie odwróć mózg i przetnij nerw wzrokowy i trójdzielny małymi nożyczkami. Następnie odwróć głowę lub grzbietową część czaszki do góry nogami tuż nad 60-milimetrowym naczyniem do hodowli komórek zawierającym lodowato zimne podłoże do preparacji, aby pomóc mózgowi opaść grawitacyjnie.Za pomocą cienkich kleszczy zorientuj mózg tak, aby strona grzbietowa była skierowana do góry, a strona brzuszna leżała. Pod mikroskopem dwuokularowym użyj cienkich, prostych kleszczy, aby unieruchomić mózg po stronie przodomózgowia. Następnie oddziel tylną część mózgu od reszty mózgu.Przetnij szypułki móżdżku pod móżdżkiem, aby oddzielić móżdżek od reszty tylnej części mózgu. Po odizolowaniu móżdżku użyj cienkich, prostych kleszczy, aby ostrożnie oderwać opony mózgowe. Delikatnie przytrzymaj móżdżek cienkimi, zakrzywionymi kleszkami i umieść go grzbietową stroną do góry na plastikowej platformie, prostopadle do żyletki.Następnie, za pomocą sterylnej, cienkiej końcówki pipety przymocowanej do pipety o pojemności jednego mililitra, odessać wszelki dostęp pożywki preparacyjnej wokół móżdżku. Następnie za pomocą rozdrabniacza do tkanek pokrój odcinki szoskowe móżdżku o grubości 300 mikrometrów. Następnie delikatnie dodaj kroplę pożywki preparacyjnej na pokrojony móżdżek.Następnie, za pomocą szerokiej końcówki pipety knurowej przymocowanej do pipety o pojemności jednego mililitra, powoli zasysaj pokrojony móżdżek i przenieś go z powrotem do 60-milimetrowej pożywki do hodowli komórek zawierającej lodowatą pożywkę do preparacji. Następnie użyj dwóch cienkich, prostych kleszczyków, aby oddzielić poszczególne plasterki. Następnie, za pomocą szerokiej końcówki pipety z dzika przymocowanej do pipety o pojemności jednego mililitra, przenieś do czterech wybranych plasterków z robaka wraz z odrobiną pożywki preparacyjnej na jedną wkładkę hodowlaną na sześciodołkowej płytce.Usuń wszelki dostęp pożywki preparacyjnej wokół plastrów za pomocą cienkiej końcówki pipety. W przypadku demielinizacji należy usunąć całą pożywkę hodowlaną poniżej wkładek hodowlanych po sześciu dniach in vitro i zastąpić ją jednym mililitrem na studzienkę wstępnie podgrzanej, świeżej pożywki hodowlanej zawierającej 0,5 miligrama na mililitr LPC. Inkubować przez 15 do 17 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% dwutlenku węgla.Po inkubacji umyj wkładki, umieszczając je na 25-mililitrowej szalce Petriego zawierającej jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej. Następnie natychmiast przenieś wkładki hodowlane na nową, sześciodołkową płytkę, zawierającą świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę hodowlaną. Aby rozpocząć immunohistochemię, najpierw użyj kleszczy, aby podnieść wkładki hodowlane i usunąć pożywkę hodowlaną znajdującą się pod nimi.Następnie dodaj dwa mililitry 4% PFA w 1x PBS, ph 7,4, na wkładki membranowe, aby utrwalić plastry móżdżku. Po 30 minutach umyj plastry trzy razy dwoma mililitrami 1x PBS przez 10 minut przy każdym myciu. Następnie pod mikroskopem lornetkowym, przy powiększeniu od 25x do 30x, za pomocą skalpela lub szczoteczki delikatnie oderwij plastry od wkładów membranowych.Następnie za pomocą pędzla przenieś pływające plastry do dołków czterodołkowej płytki, zawierającej 1x PBS, aby ograniczyć zużycie przeciwciał. Następnie odessać PBS z każdej studzienki i inkubować plastry we wstępnie schłodzonym 100% etanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut. Po inkubacji odessać 100% etanol i krótko umyć plastry 1x PBS.Następnie umyj je dwa razy w temperaturze pokojowej z 1x PBS przez 10 minut przy każdym praniu. Aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał, odessać PBS i inkubować plastry w roztworze zawierającym 1x PBS, 5% NGS i 0,3% niejonowego detergentu w temperaturze pokojowej przez 30 do 45 minut. Następnie dodaj przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubuj plastry w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Po całonocnej inkubacji umyj plastry trzy razy 1x PBS przez 10 minut przy każdym myciu. Następnie dodać przeciwciała drugorzędowe, rozcieńczone w roztworze blokującym, w stosunku rozcieńczenia jeden do 500 i inkubować plastry w temperaturze pokojowej w ciemności przez trzy godziny. Po inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym umyj plastry trzy razy w 1x PBS w ciemności przez 10 minut przy każdym myciu.Następnie pod mikroskopem lornetkowym umieść 100 mikroletów 1x PBS na szkiełku podstawowym i za pomocą pędzla przenieś plastry do PBS i spłaszcz je na szkiełku. Usuń wszelki dostęp do Usługi książek telefonicznych. Na koniec umieść kroplę podłoża montażowego bezpośrednio na szkiełku nakrywkowym i delikatnie przykryj plastry.Barwienie immunologiczne mieliny w organotypowych wycinkach móżdżku, uzyskanych od 9 do 10 dni po urodzeniu C57 czarnych myszy typu dzikiego obserwowano po 11 dniach in vitro z węzłami ronviae wzbogaconymi w kanały sodowe bramkowane napięciem, otoczone domeną przywęzłowego połączenia aksogliowego. Takie same wyniki zaobserwowano dla myszy transgenicznych PLP-GFP. Mielinizacja komórek parkengy odbywa się najczęściej po tygodniu w hodowli.Leczenie LPC w pełni demielinizuje wycinki, które remielinizują się spontanicznie i są w pełni zmielinizowane sześć dni po demielinizacji. Ta procedura powinna zająć maksymalnie 25 minut. To jest naprawdę najbardziej krytyczny punkt.Organotypowe kultury warstwowe nadają się do obrazowego badania dynamiki mielinizacji na żywo. Może być również stosowany do ukierunkowanych eksperymentów przesiewowych leków. Technika ta pozwala na łatwe, ilościowe podejście do badania procesów mielinizacji i remielinizacji.Eksperymentatorzy mają przestrzegać podstawowych procedur bezpieczeństwa dotyczących dobrostanu zwierząt, nadmiernej i ostrej mielinizacji.

preparation-immunostaining-myelinating-organotypic-cerebellar-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejsza metoda opisuje generowanie organotypowych kultur móżdżku oraz wpływ określonych bodźców apoptotycznych na żywotność różnych typów komórek móżdżku.

Organotypowe hodowle móżdżku: wyzwania apoptotyczne i ich detekcja

Przedstawiamy protokół umożliwiający obrazowanie i ilościową ocenę morfologii drzewa dendrytycznego pojedynczych komórek Purkinjego hodowanych w organotypowych kulturach skrawków móżdżku. Protokół ten ma na celu wspieranie badań nad mechanizmami rozwoju dendrytów komórek Purkinjego.

Analiza morfologii dendrytów komórek Purkinjego w organotypowych kulturach skrawków

Ten film opisuje metodę generowania wycinków tkanek z móżdżku myszy. Wycinki móżdżku mogą być używane do hodowli organotypowej, która zapewnia wgląd w mechanizmy neurorozwojowe, w tym dynamikę mielinizacji.

Rozwarstwienie móżdżku i przygotowanie plastrów: metoda generowania wycinków tkanek z móżdżku myszy

Ten film ilustruje technikę uzyskiwania organotypowych wycinków móżdżku z mózgu szczeniaka myszy i hodowania tych wycinków w pożywkach uzupełnionych składnikami odżywczymi i czynnikami wzrostu, aby naśladować rozwój móżdżku in vitro. Dodatkowo określone wycinki móżdżku są traktowane badanym związkiem, a zdolność neuroprotekcyjna związku jest analizowana przy użyciu techniki barwienia immunofluorescencyjnego.

Analiza przeżywalności komórek Purkiniego w organotypowych kulturach warstwowych móżdżku

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Podczas rozwoju móżdżku po urodzeniu, niedojrzałe komórki ziarniste pochodzące ze strefy zarodkowej wykazują różne sposoby migracji, aby dotrzeć do miejsca docelowego i ustanowić sieci neuronowe. Protokół ten opisuje przygotowanie wycinków móżdżku i konfokalne podejście makroskopowe stosowane do badania czynników regulujących migrację neuronów.

Ex vivo Obrazowanie pourodzeniowej migracji komórek ziarnistych móżdżku za pomocą makroskopii konfokalnej

Białka otoczki jądrowej odgrywają kluczową rolę w wielu podstawowych procesach biologicznych i są związane z różnymi chorobami ludzkimi.  Protokół ten opisuje nowy model myszy oparty na Cre/Lox, który pozwala na czasoprzestrzenną kontrolę zakłóceń kompleksów LINC.

Walidacja modelu mysiego w celu rozbicia kompleksów LINC w sposób specyficzny dla komórki

Zewnętrzna warstwa granulatu móżdżku jest miejscem największego wzmocnienia tranzytu w rozwijającym się mózgu. W tym miejscu przedstawiamy protokół ukierunkowany na modyfikację genetyczną tej warstwy w szczycie proliferacji przy użyciu elektroporacji ex vivo i hodowli plastrów móżdżku z embrionalnych zarodków piskląt dnia 14.

Ex vivo Hodowla wycinków móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych

Organotypowe kultury plastrów są potężnym narzędziem do badania procesów neurorozwojowych lub degeneracyjnych/regeneracyjnych. Tutaj opisujemy protokół, który modeluje śmierć neurorozwojową komórek Purkinjego w hodowlach warstw móżdżku myszy. Metoda ta może przynieść korzyści w badaniach nad odkrywaniem leków neuroprotekcyjnych.

Przeżywalność komórek Purkiniego w organtypowych kulturach warstwowych móżdżku

Poznaj metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych móżdżku myszy do badań mielinizacji i remielinizacji z zachowaniem architektury tkanek. Technika umożliwia obrazowanie na żywo oraz ilościową analizę dynamiki pochew mielinowych.

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

Przeglądaj więcej filmów