Wysokoprzepustowy test bakteriobójczy specyficzny dla Shigella

W dziedzinie badań nad Shigella brakuje obecnie dobrze zdefiniowanych testów do badania funkcjonalnej roli przeciwciał wytwarzanych przez szczepienie lub infekcję. Test ten stanowi dobrze zdefiniowaną metodę kwalifikacji tych odpowiedzi immunologicznych i pomiaru aktywności bakteriobójczej specyficznych przeciwciał Shigella. Główną zaletą tego testu jest to, że pozwala na wysokoprzepustową analizę wielu próbek.

Techniki zastosowane w tym protokole znacznie skracają czas pracy i ogólny czas testu w celu zmierzenia bezpośredniego zabijania bakteryjnego przeciwciał i próbek surowicy. Na początek inkubuj próbki w ciepłej łaźni wodnej w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby podgrzać i aktywować próbki testowe. Uzyskać płytkę do oznaczania i 20 mikrolitrów buforu do oznaczania w kolumnach od pierwszej do dwunastej w wierszach od A do G. Dodać 20 mikrolitrów buforu do testu do kolumn pierwszej i drugiej wiersza H. Załadować 30 mikrolitrów każdej próbki testowej i powielić w wierszu H płytki do oznaczania.

Aby rozpocząć wykonywanie trzykrotnych seryjnych rozcieńczeń badanych próbek, należy użyć pipety wielokanałowej, aby usunąć 10 mikrolitrów z dołków od 3H do 12H. Przenieść próbki do odpowiednich dołków w rzędzie G i pipetować w górę iw dół 8 do 10 razy, aby dobrze wymieszać próbkę. Następnie usuń 10 mikrolitrów z tych studzienek.

Przenieś do odpowiednich studzienek w rzędzie F i pipetuj w górę i w dół 8 do 10 razy, aby wymieszać. Kontynuuj ten proces seryjnego rozcieńczania w rzędzie A. Po wymieszaniu studzienek w rzędzie A, wyjmij i wyrzuć 10 mikrolitrów z dołków od 3A do 12A, tak aby końcowa objętość we wszystkich studzienkach wynosiła 20 mikrolitrów. Pobrać jedną fiolkę z zamrożonym docelowym bulionem bakteryjnym i rozmrozić ją w temperaturze pokojowej.

Następnie rozcieńczyć bakterie w 20 mililitrach buforu testowego. zgodnie z wcześniej ustalonym optymalnym współczynnikiem rozcieńczenia. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczonych bakterii do każdego dołka płytki testowej.

Pobrać jedną fiolkę zamrożonego Baby Rabbit Compliment i jedną fiolkę zamrożonego BRC aktywowanego ciepłem. Użyj zimnej bieżącej wody, aby rozmrozić fiolki do temperatury pokojowej. Następnie wymieszaj 100 mikrolitrów aktywowanego termicznie BRC z 400 mikrolitrami buforu testowego.

Dodaj 50 mikrolitrów tego 20-procentowego roztworu BRC aktywowanego ciepłem do wszystkich studzienek w kolumnie pierwszej. Wymieszaj jeden mililitr natywnego BRC z czterema mililitrami buforu testowego. Dodaj 50 mikrolitrów tej 20-procentowej mieszaniny do wszystkich studzienek w kolumnach od drugiej do dwunastej.

Umieść płytkę w wytrząsarce na 10 do 15 sekund, aby delikatnie wymieszać płytkę testową. Inkubować płytkę testową w inkubatorze mikrobiologicznym przez dwie godziny. W międzyczasie zdejmij pokrywki z dwóch płytek agarowych LB i umieść płytki stroną zadrukowaną do góry w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 40 do 60 minut do wyschnięcia.

Po zakończeniu inkubacji przenieść płytkę testową na mokry lód i inkubować przez 10 do 20 minut, aby zatrzymać reakcję. Za pomocą pipety dwunastokanałowej wymieszać studzienki w rzędzie H i umieścić na płytce punktowej 10 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej na dnie płytki LBA. Natychmiast przechyl płytkę i pozwól plamom przesuwać się przez około 1,5 do 2 centymetrów.

Powtórz tę procedurę dla rzędów G, F i E, dostrzegając je powyżej poprzedniego rzędu. Inkubować płytki LBA w temperaturze pokojowej, aż roztwór zostanie wchłonięty przez płytki LBA. Następnie połóż pokrywki na płytkach i przenieś je do góry nogami do inkubatora mikrobiologicznego w celu inkubacji przez noc.

Następnego dnia dodaj 25 mililitrów agaru nakładkowego w temperaturze 55 stopni Celsjusza, zawierającego 100 mikrogramów na mililitr TTC i 0,1 procent azydku sodu do każdej płytki LBA. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby bakterie, które przeżyły, mogły rozwinąć czerwony kolor. Następnie użyj aparatu cyfrowego, aby sfotografować płyty.

Przenieś obrazy do komputera i użyj oprogramowania NIST Integrated Colony Enumerating do analizy obrazów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Reprezentatywne płytki LBA pokazują, że rozwój koloru nastąpił po całonocnej inkubacji i dodaniu nakładki, przy czym wszystkie kolonie, które przeżyły, są widoczne na czerwono. Zabijanie przez bakterie jest wyraźnie widoczne we wszystkich próbkach badanych w pierwszych trzech rozcieńczeniach.

Spadek zabijania bakterii obserwuje się, gdy próbki są rozcieńczane dalej w górę płytki, a surowica jest mniej skoncentrowana. Zliczanie mikrokolonii jest następnie przeprowadzane za pomocą oprogramowania NIST. Następnie obliczana jest średnia liczba CFU dla każdego rozcieńczenia każdej próbki, podobnie jak 50-procentowa wartość zabijania.

Ta 50-procentowa wartość zabijania jest następnie stosowana do średnich CFU dla każdego rozcieńczenia surowicy w celu określenia wartości potrzebnych do obliczenia SBA KI. Protokół ten opiera się na spójnym i jednolitym posiewie bakteryjnym na LB Auger. Dobra technika posiewu punktowego i pochylania pozwoli na wzrost dyskretnych mikrokolonii i dokładne zliczanie kolonii. Technika ta wykorzystuje żywą, zjadliwą Shigellę i wymaga odpowiedniej techniki aseptyki oraz środków ochrony osobistej, aby zapewnić bezpieczne obchodzenie się z bakteriami zgodnie z procedurami BSL 2.