Name: Wysokoprzepustowy test bakteriobójczy specyficzny dla Shigella (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowy test bakteriobójczy specyficzny dla Shigella do oceny aktywności przeciwciał w surowicy. Ta metoda umożliwia analizę wielu próbek przy zmniejszonym czasie pracy ręcznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu od PATH dla M.H.N. Badanie to zostało przeprowadzone w ramach umowy o współpracy badawczo-rozwojowej między Instytutem Badawczym Armii Waltera Reeda a Uniwersytetem Alabamy w Birmingham.

Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi WRAIR Human Subject’s Protection Board. Próbki wykorzystane w tym badaniu to próbki surowicy ludzkiej pobrane w ramach protokołu WRAIR numer 1328, zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi i federalnymi przepisami dotyczącymi ochrony uczestników badań. Próbki zostały zanonimizowane, a wykorzystanie tych anonimowych próbek zostało zaklasyfikowane jako badanie niewłączające ludzi przez UAB IRB (protokół numer N150115001).
1. Przygotowanie odczynników do analizy
<ol>
	<li>Przygotować 1% żelatynę, dodając 1 g żelatyny do 100 mL wody. Sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy 100 mg/mL TTC (chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolium) (1 000x), dodając 5 g TTC do 40 mL wody. Po całkowitym rozpuszczeniu TTC dopełnić objętość wody do 50 mL i przefiltrować sterylnie za pomocą filtra 0,2 µm. Roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem. 
	UWAGA: TTC barwi kolonie bakteryjne, co znacznie ułatwia ich liczenie. Roztwór TTC ma lekko żółty kolor. Jeśli roztwór TTC nabierze czerwonego koloru, należy go utylizować i przygotować świeży.</li>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy 10% azotku sodu (NaN3) (100x), dodając 5 g NaN3 do 40 mL wody. Po całkowitym rozpuszczeniu dopełnić wodą do 50 mL. Przechowywać w temperaturze pokojowej. 
	OSTROŻNIE: Azotek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Może reagować z ołowianymi i miedzianymi rurami kanalizacyjnymi, tworząc wysoce wybuchowe azotki metali. Podczas utylizacji odczynników zawierających azotek sodu należy przepłukać instalację dużą ilością wody, aby zapobiec gromadzeniu się azotków, lub wyrzucić je do worka na odpady biologiczne.</li>
	<li>Przygotować płytki LBA (płytki z agarem LB), dodając 35 g agaru LB do 1 L wody i sterylizując w autoklawie. Wlać po 25 mL do każdej kwadratowej szalki Petriego (120 x 120 mm2). Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 10-20 min, aby agar zastygł. Włożyć płytki z powrotem do plastikowych worków i przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.</li>
	<li>Przygotować agar nakładkowy (Overlay Agar), dodając 7,5 g agaru do 1 000 mL wody i sterylizując w autoklawie. Inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 56 °C do momentu użycia. Bezpośrednio przed użyciem dodać 1 mL TTC w stężeniu 100 mg/mL oraz 10 mL 10% NaN3 i dobrze wymieszać. 
	UWAGA: Na każdą płytkę LBA wymagane jest 25 mL agaru nakładkowego. Agar nakładkowy można przygotować z wyprzedzeniem do jednego miesiąca i topić w mikrofalówce lub na płycie grzejnej w zależności od potrzeb testu. Przed naniesieniem na płytki LBA należy upewnić się, że temperatura agaru wynosi ~55 °C.</li>
	<li>Przygotować bufor do testu (Assay Buffer), dodając 5 mL 10x zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) z Ca2+/Mg2+ oraz 5 mL 1% żelatyny do 40 mL wody. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie dopełniacza i bakterii docelowych
<ol>
	<li>Przygotowanie dopełniacza z krwi królika (BRC) 
	UWAGA: Szczegółowe kryteria wyboru partii dopełniacza można znaleźć tutaj: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
	<ol>
		<li>Należy pobrać zamrożony BRC i rozmrozić go pod bieżącą zimną wodą. BRC należy mieszać mechanicznie co ok. 10-20 min aż do całkowitego rozmrożenia. Nie wolno poddawać BRC wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania.</li>
		<li>Podczas rozmrażania BRC należy oznakować probówki wirówkowe o pojemności 1,5 mL, 5 mL lub 15 mL. Oznakowane probówki należy umieścić na lodzie w celu schłodzenia. Do schłodzonych probówek wirówkowych należy odmierzyć odpowiednią objętość BRC (po napełnieniu każdą probówkę należy natychmiast umieścić z powrotem na lodzie). Alikwoty należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze ≤ -70 °C. 
		UWAGA: Do każdej płytki testowej potrzeba około 1 mL dopełniacza. Alikwoty dopełniacza są przeznaczone do jednorazowego użycia i powinny być przygotowywane w objętościach dostosowanych do układu testu.</li>
		<li>Aby przygotować BRC inaktywowany termicznie, należy rozmrozić jedną alikwot aktywny BRC. Należy przygotować łaźnię wodną o temperaturze 56 °C. Po całkowitym rozmrożeniu BRC należy przenieść go do łaźni wodnej i inkubować przez 30 min.</li>
		<li>Po inkubacji BRC inaktywowany termicznie należy wyjąć z łaźni wodnej i pozostawić do ochłodzenia w temperaturze pokojowej (RT) przez 10-15 min. Następnie należy go energicznie wymieszać i rozdzielić alikwoty o objętości ok. 150 µL do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Alikwoty należy przechowywać w temperaturze ≤ -10 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zapasu bakterii docelowych 
	UWAGA: Poniższa procedura służy do przygotowania 48 alikwotów zapasu bakterii docelowych; w przypadku zapotrzebowania na większą liczbę alikwotów protokół można przeskalować.
	<ol>
		<li>Należy wyjąć fiolkę z głównym zapasem bakterii z zamrażarki i zeskrobać zamrożoną powierzchnię bakterii, aby przenieść niewielką ilość lodu z fiolki na płytkę z agarem krwawym. Fiolkę z głównym zapasem należy natychmiast zwrócić do zamrażarki.</li>
		<li>Tę niewielką alikwotę zapasu bakterii należy wysiać metodą kreskową na płytce z agarem krwawym i przykryć pokrywką płytki. Płytkę należy inkubować odwróconą do góry dnem przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C/5% CO2.</li>
		<li>Około 10 odizolowanych, gładkich kolonii należy przenieść do probówki 50 mL zawierającej 30 mL bulionu LB. Inkubować przez 3-5 h w 37 °C przy łagodnym wytrząsaniu, aż bulion hodowlany osiągnie OD600 na poziomie ok. 0,6-0,7.</li>
		<li>Należy zebrać górne 12,5 mL hodowli i przenieść do nowej probówki 50 mL. Hodowlę należy odwirować przy 15 000 x g przez 2 min w mikrocentry fudze stołowej. Należy odlać nadsącz, a osad zawiesić ponownie w 25 mL 15% sterylnego glicerolu-LB.</li>
		<li>Dobrze wymieszać i rozdzielić alikwoty po 0,5 mL do sterylnych probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL (ok. 48 probówek). Alikwoty przechowywać w zamrażarce w temperaturze ≤ -70 °C.</li>
		<li>Przed użyciem należy potwierdzić tożsamość bakterii za pomocą testu aglutynacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczenie optymalnego czynnika rozcieńczenia dla zapasu bakterii docelowych 
	UWAGA: Każda partia zapasu bakterii docelowych musi zostać miareczkowana w warunkach testowych, aby wyznaczyć rozcieńczenie niezbędne do uzyskania ok. 120 CFU/punkt na płytkach LB.
	<ol>
		<li>Należy przygotować płytkę mikrotitracyjną (płytkę do rozcieńczeń) i dodać 135 µL buforu testowego do dołka 1A. Do dołków 1B-1H należy dodać po 120 µL buforu testowego.</li>
		<li>Należy wyjąć fiolkę z zamrożonymi bakteriami docelowymi z zamrażarki i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Do dołka 1A należy dodać 15 µL rozmrożonego zapasu bakterii, aby przygotować 10-krotne rozcieńczenie zapasu bakterii.</li>
		<li>Należy przenieść 30 µL roztworu bakterii z dołka 1A do dołka 1B, aby wykonać 5-krotne rozcieńczenie seryjne. Rozcieńczenia seryjne 5-krotne należy kontynuować do dołka 1H, uzyskując łącznie 8 rozcieńczeń (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250).</li>
		<li>Należy przygotować kolejną płytkę mikrotitracyjną (płytkę testową) i dodać 20 µL buforu testowego do wszystkich dołków w kolumnach 1 i 2 płytki testowej.</li>
		<li>Należy przenieść 10 µL rozcieńczonych bakterii z każdego dołka w kolumnie 1 płytki do rozcieńczeń do odpowiadających im dołków w kolumnach 1 i 2 płytki testowej. Przykładowo, 10 µL bakterii z dołka 1A płytki do rozcieńczeń przenosi się do dołków 1A i 2A płytki testowej, itd.</li>
		<li>Należy kontynuować badanie zgodnie z opisem w sekcji Test bakteriobójczy surowicy (SBA) poniżej dla Kontroli A i Kontroli B, kroki 3.6-3.12.</li>
		<li>Po inkubacji płytek na lodzie, należy użyć pipety wielokanałowej z 8 końcówkami, aby nanieść po 10 µL z dołków w kolumnie 1 na płytkę LBA. Należy również nanieść zawartość dołków z kolumny 2 na płytkę LBA.</li>
		<li>Należy kontynuować badanie zgodnie z opisem w krokach 3.14-4.6 poniżej.</li>
		<li>Należy wyznaczyć rozcieńczenie bakterii, które daje ok. 120 CFU/punkt w Kontroli B; rozcieńczenie to zostanie zastosowane w teście.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test bakteriobójczy surowicy (SBA)
UWAGA: Poniższa procedura dotyczy jednej płytki analitycznej, jednak liczbę płytek analitycznych można zwiększyć.
<ol>
	<li>Próbki testowe należy inaktywować termicznie, inkubując je w łaźni wodnej w temperaturze 56 °C przez 30 min. 
	UWAGA: Próbki testowe muszą zostać poddane inaktywacji termicznej przed testem, aby zneutralizować wszelką endogenną aktywność dopełniacza. Można to zrobić z wyprzedzeniem, a inaktywowane próbki można ponownie zamrozić lub przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia testu.</li>
	<li>Należy przygotować płytkę do testu i dodać 20 µL buforu do testu (Assay Buffer) do kolumn od 1 do 12 w rzędach od A do G. Do kolumn 1 i 2 w rzędzie H należy dodać 20 µL buforu do testu, patrz Tabela 1.</li>
	<li>Należy nanieść 30 µL każdej próbki testowej, w duplikacie, do rzędu H płytki do testu. Na przykład 30 µL próbki 1 należy nanieść do dołków 3H i 4H, a 30 µL próbki 2 do dołków 5H i 6H itd.</li>
	<li>Przygotować 3-krotne rozcieńczenia seryjne próbek testowych przy użyciu pipety wielokanałowej.
	<ol>
		<li>Należy pobrać 10 µL próbki z dołków 3H-12H i przenieść do odpowiadających im dołków w rzędzie G, a następnie dokładnie wymieszać próbkę, pipetując ją w górę i w dół 8-10 razy.</li>
		<li>Następnie należy pobrać 10 µL z dołków 3G-12G, przenieść do odpowiadających im dołków w rzędzie F i dokładnie wymieszać.</li>
		<li>Kontynuować rozcieńczenia seryjne aż do rzędu A. Po wymieszaniu zawartości dołków w rzędzie A, należy usunąć i odrzucić 10 µL z dołków 3A-12A, tak aby we wszystkich dołkach pozostało 20 µL. 
		UWAGA: Ponieważ w całkowitej objętości testu wynoszącej 80 µL wykorzystuje się 20 µL surowicy, następuje dodatkowe 4-krotne rozcieńczenie w samym teście. Rozcieńczenie to musi zostać uwzględnione podczas obliczania miana SBA poprzez pomnożenie rozcieńczenia surowicy przez 4. Na przykład, jeśli zastosowano rozcieńczenie początkowe 1:2, faktycznie testowane rozcieńczenie wynosi 1:8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy wyjąć jedną fiolkę zamrożonego stoku bakterii docelowych (Target Bacteria Stock) i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Bakterie należy rozcieńczyć w 20 mL buforu do testu zgodnie z wcześniej określonym optymalnym współczynnikiem rozcieńczenia (współczynnik ten został wyznaczony w sekcji 2.3). Za pomocą pipety wielokanałowej należy dodać 10 µL rozcieńczonych bakterii do każdego dołka płytki do testu.</li>
	<li>Należy wyjąć jedną fiolkę zamrożonego BRC oraz jedną fiolkę zamrożonego BRC inaktywowanego termicznie i rozmrozić w temperaturze pokojowej pod bieżącą zimną wodą lub umieścić na kratce komory bezpieczeństwa biologicznego przy włączonym nadmuchu powietrza w celu szybkiego rozmrożenia.</li>
	<li>Przygotować 20% roztwór BRC inaktywowanego termicznie. Wymieszać 100 µL BRC inaktywowanego termicznie z 400 µL buforu do testu. Dodać 50 µL tego 20% roztworu BRC inaktywowanego termicznie do wszystkich dołków w kolumnie 1 (dołki Kontroli A). 
	UWAGA: BRC inaktywowany termicznie jest stosowany jako kontrola w celu monitorowania nieswoistego zabijania (NSK) w teście.</li>
	<li>Przygotować 20% roztwór natywnego BRC. Wymieszać 1 mL natywnego BRC z 4 mL buforu do testu. Dodać 50 µL tej mieszaniny do wszystkich dołków w kolumnach od 2 do 12 (dołki Kontroli B oraz dołki z próbkami testowymi). 
	UWAGA: Końcowe stężenie BRC w mieszaninie reakcyjnej wynosi 12,5%.</li>
	<li>Krótko wymieszać zawartość płytki do testu, wstrząsając nią delikatnie przez 10-15 s na wytrząsarce do płytek lub mieszając poprzez pipetowanie w górę i w dół 8 razy za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Umieścić płytkę do testu w inkubatorze mikrobiologicznym w temperaturze 37 °C na 2 h (bez wstrząsania).</li>
	<li>Osuszyć 2 płytki LBA, zdejmując pokrywki i ustawiając płytki stroną agaru do góry w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 40-60 min.</li>
	<li>Po zakończeniu 2-godzinnej inkubacji przenieść płytkę do testu na kruszony lód i inkubować przez 10-20 min w celu zatrzymania reakcji.</li>
	<li>Za pomocą pipety 12-kanałowej wymieszać zawartość dołków w rzędzie H, a następnie nanieść 10 µL mieszaniny reakcyjnej w formie kropel (spot plate) na dno płytki LBA. Natychmiast przechylić płytkę, aby krople spłynęły na odległość ok. 1,5-2 cm. Powtórzyć tę procedurę dla rzędów G, F i E, nanosząc je powyżej poprzedniego rzędu na płytce LBA. Rzędy E, F, G i H nanosi się na jedną płytkę LBA, a rzędy A, B, C i D w ten sam sposób na drugą płytkę LBA, patrz Rysunek 1.</li>
	<li>Inkubować płytki LBA w temperaturze pokojowej do czasu wchłonięcia roztworu przez agar LBA (10-15 min). Przykryć płytki LBA pokrywkami i umieścić je w inkubatorze mikrobiologicznym dnem do góry w celu inkubacji przez noc (~16-18 h). Inkubować S. flexneri 2a i 3a w temperaturze 29 °C oraz S. sonnei w temperaturze 26 °C. 
	UWAGA: Temperatury te pozwalają na uzyskanie mniejszych „mikrokolonii” o rozmiarach odpowiednich do dokładnego zliczania za pomocą licznika kolonii9.</li>
	<li>Po inkubacji nocnej na każdą płytkę LBA nalać 25 mL agaru nakładkowego (Overlay Agar, w temperaturze ~55 °C) zawierającego 100 µg/mL TTC i 0,1% NaN3.</li>
	<li>Inkubować płytki LBA w temperaturze 37 °C przez 2 h, aby przeżyłe bakterie wybarwiły się na czerwono, patrz Rysunek 1 poniżej.</li>
	<li>Wykonać zdjęcia płytek za pomocą aparatu cyfrowego i przenieść obrazy na komputer, na którym zainstalowano oprogramowanie NIST Integrated Colony Enumerating Software (NICE), patrz Rysunek 2. 
	UWAGA: Oprogramowanie NICE do zliczania kolonii jest dostępne bezpłatnie. Szczegóły oraz instrukcje instalacji znajdują się w Liście materiałów.</li>
</ol>
4. Liczenie kolonii bakterii
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie NICE i wprowadź Imię operatora, informacje o Eksperymencie oraz wszelkie Uwagi do testu w pustych polach. Po wprowadzeniu tych danych kliknij przycisk Done.</li>
	<li>Zaimportuj zdjęcia płytek, klikając przycisk Open i wybierając odpowiednie pliki z komputera.</li>
	<li>Dostosuj parametry testu, ustawiając liczbę Wierszy na 4 i liczbę Kolumn na 12. Ustaw parametr Background na -3 sigma, a Resolution na Low. Patrz Rysunek 2.</li>
	<li>Przesuwaj obszary zainteresowania (ROI), klikając i przeciągając je tak, aby każdy ROI znajdował się bezpośrednio nad jedną plamką próbki. Upewnij się, że wszystkie kolonie bakteryjne znajdują się wewnątrz ROI i nie nakładają się na siebie. Po zakończeniu konfiguracji jednej płytki dwukrotnie kliknij kolejną płytkę na liście obrazów w sekcji Stored data i dostosuj ROI. Patrz Rysunek 2.</li>
	<li>Po dostosowaniu wszystkich płytek kliknij zielony przycisk Count, patrz Rysunek 2 i Rysunek 3. Po zakończeniu liczenia kliknij przycisk Export, aby wyeksportować dane w formacie .xls/.xlsx. Nazwij i zapisz plik .xls/.xlsx do analizy danych.</li>
	<li>Uporządkuj wyeksportowane dane w formie tabeli, tak aby wyniki liczenia były zorganizowane w tabeli reprezentującej 96-dołkową płytkę testową, patrz Tabela 2.</li>
</ol>
5. Oblicz miano SBA (KI) oraz nieswoistą aktywność lizującą (NSK)
UWAGA: Miano SBA, czyli indeks zabijania (KI), definiuje się jako odwrotność rozcieńczenia surowicy, która zabija 50% bakterii docelowych.
<ol>
	<li>Oblicz wartość graniczną dla indeksu zabijania (KI) 50%, wyciągając średnią z CFU dla studni kontrolnych z aktywnym dopełniaczem (Kontrola B) i dzieląc ją przez 2. Oblicz średnią liczbę CFU dla każdego rozcieńczenia każdej próbki wykonanej w duplikacie, patrz Tabela 3.</li>
	<li>Ponieważ rozcieńczenie surowicy rzadko daje dokładnie taką wartość KI 50%, można ją wyznaczyć metodą interpolacji z dwóch kolejnych rozcieńczeń surowicy – jednego, w którym zabito mniej niż 50%, oraz drugiego, w którym zabito więcej niż 50%, patrz Rycina 4. Wzór do obliczania interpolowanego KI dla SBA przedstawiono poniżej: 
	<img alt="Wzór stanu statycznego, równanie SBA KI, wyrażenie matematyczne dla analizy równowagi." src="/files/ftp_upload/59164/59164eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie"> 
	UWAGA: Miano bakteriobójcze, czyli KI, można również obliczyć automatycznie za pomocą oprogramowania Opsotiter opracowanego przez UAB. Aby zamówić Opsotiter, należy skontaktować się z dr Moon Nahm lub panem Robem Burtonem. Informacje kontaktowe znajdują się na stronie https://www.vaccine.uab.edu.</li>
	<li>Oblicz wartość NSK, odejmując od 1 średnią z Kontroli B podzieloną przez średnią z Kontroli A.</li>
</ol>

<ol><li>Riddle, M. S., Sanders, J. W., Putnam, S. D., Tribble, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence%2C+etiology%2C+and+impact+of+diarrhea+among+long-term+travelers+%28US+military+and+similar+populations%29%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Incidence, etiology, and impact of diarrhea among long-term travelers (US military and similar populations): a systematic review.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (5), 891-900 (2006).</li>
<li>Tickell, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+management+of+Shigella+infection+in+children+with+diarrhoea%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Identification and management of Shigella infection in children with diarrhoea: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), e1235-e1248 (2017).</li>
<li>Livio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+isolates+from+the+global+enteric+multicenter+study+inform+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Shigella isolates from the global enteric multicenter study inform vaccine development.</a> Clinical Infectious Diseases. 59 (7), 933-941 (2014).</li>
<li>Barry, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+pitfalls+in+Shigella+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Progress and pitfalls in Shigella vaccine research.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10 (4), 245-255 (2013).</li>
<li>Noriega, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+cross-protection+among+Shigella+flexneri+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Strategy for cross-protection among Shigella flexneri serotypes.</a> Infection and Immunity. 67 (2), 782-788 (1999).</li>
<li>Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+trials+of+Shigella+vaccines%3A+two+steps+forward+and+one+step+back+on+a+long%2C+hard+road%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (7), 540-553 (2007).</li>
<li>Sayem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+host+immune+responses+to+epidemic+and+endemic+strains+of+Shigella+dysenteriae+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Health+Population+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Differential host immune responses to epidemic and endemic strains of Shigella dysenteriae type I.</a> Journal of Health Population and Nutrition. 29 (5), 429-437 (2011).</li>
<li>Rahman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+zinc+supplementation+as+adjunct+therapy+on+the+systemic+immune+responses+in+shigellosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effects of zinc supplementation as adjunct therapy on the systemic immune responses in shigellosis.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (2), 495-502 (2005).</li>
<li>Nahm, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interlaboratory+evaluations%2C+and+application+of+a+simple%2C+high-throughput+Shigella+serum+bactericidal+assay%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">interlaboratory evaluations, and application of a simple, high-throughput Shigella serum bactericidal assay.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li>
<li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+fourfold+multiplexed+opsonization+assay+%28MOPA4%29+for+pneumococcal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 13 (9), 1004-1009 (2006).</li>
<li>Tribble, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+a+Shigella+flexneri+2a+Invaplex+50+intranasal+vaccine+in+adult+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of a Shigella flexneri 2a Invaplex 50 intranasal vaccine in adult volunteers.</a> Vaccine. 28 (37), 6076-6085 (2010).</li>
<li>Kim, H. W., Kim, K. H., Kim, J., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+serum+bactericidal+assay+for+antibodies+to+Haemophilus+influenzae+type+b%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A high throughput serum bactericidal assay for antibodies to Haemophilus influenzae type b.</a> BMC Infectious Diseases. 16, 473(2016).</li>
<li>Maslanka, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+and+a+multilaboratory+comparison+of+Neisseria+meningitidis+serogroup+A+and+C+serum+bactericidal+assays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Multilaboratory+Study+Group.+Clinical+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardization and a multilaboratory comparison of Neisseria meningitidis serogroup A and C serum bactericidal assays.</a> The Multilaboratory Study Group. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (2), 156-167 (1997).</li>
<li>Jang, M. S., Sahastrabuddhe, S., Yun, C. H., Han, S. H., Yang, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+bactericidal+assay+for+the+evaluation+of+typhoid+vaccine+using+a+semi-automated+colony-counting+method%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogeneis%22%5BJournal%5D)">Serum bactericidal assay for the evaluation of typhoid vaccine using a semi-automated colony-counting method.</a> Microbial Pathogeneis. 97, 19-26 (2016).</li>
<li>Necchi, F., Saul, A., Rondini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-throughput+method+to+evaluate+serum+bactericidal+activity+using+bacterial+ATP+measurement+as+survival+readout%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a high-throughput method to evaluate serum bactericidal activity using bacterial ATP measurement as survival readout.</a> PLoS One. 12 (2), e0172163(2017).</li>
<li>Riddle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+a+candidate+bioconjugate+vaccine+against+Shigella+flexneri+2a+administered+to+healthy+adults%3A+a+single+blind%2C+randomized+phase+I+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of a candidate bioconjugate vaccine against Shigella flexneri 2a administered to healthy adults: a single blind, randomized phase I study.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , (2016).</li>
<li>Shimanovich, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+Antigen-Specific+Serum+Antibody+Levels+as+Correlates+of+Protection+against+Shigellosis+in+a+Controlled+Human+Challenge+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functional and Antigen-Specific Serum Antibody Levels as Correlates of Protection against Shigellosis in a Controlled Human Challenge Study.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 24 (2), (2017).</li>
</ol>

R.W.K. jest pracownikiem rządu Stanów Zjednoczonych i w związku z tym poglądy wyrażone w tej publikacji są poglądami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają oficjalną politykę lub stanowisko Departamentu Armii, Departamentu Obrony ani rządu USA.

Opisany tutaj protokół demonstruje funkcjonalny test immunologiczny w celu oceny aktywności kwasowo-shigellacidowej przeciwciał w surowicy. W teście wykazanym dla tego protokołu zastosowano przeciwciała monoklonalne specyficzne dla S. flexneri 3a9 wraz z surowicami ludzkimi z poprzedniego badania szczepionki Shigella 11. Źródło surowicy badanej w tym teście może się znacznie różnić od przedklinicznych próbek zwierzęcych do ludzkich próbek klinicznych, a na aktywność kwasowo-shigellacidową próbki surowicy będą miały wpływ szczepienia i ekspozycje, których doświadczyła dana osoba. Można spodziewać się pewnej reaktywności krzyżowej między blisko spokrewnionymi serotypami, w szczególności S. flexneri 2a i S. flexneri 3a, ale w tych szczepach zaobserwowano niewielką reaktywność krzyżową w porównaniu z S. sonnei9. Podstawa SBA koncentruje się na aktywacji kaskady dopełniacza poprzez wiązanie przeciwciało-antygen. Dlatego obchodzenie się z odczynnikiem BRC jest jednym z wielu krytycznych kroków związanych z wykonaniem tego protokołu. BRC został wybrany do zastosowania w tym teście ze względu na jego stałą wydajność i niski poziom NSK w innych testach bakteriobójczych 12,13,14. Aktywność BRC jest wrażliwa na temperaturę i należy podjąć odpowiednie środki w celu zapewnienia, że cykle zamrażania i rozmrażania są zminimalizowane, że BRC jest rozdzielany na objętości jednorazowego użytku oraz że podwielokrotności BRC są szybko rozmrażane, bezpośrednio przed użyciem w teście. Spójność aktywności dopełniacza będzie miała wpływ na odtwarzalność tego testu. Kolejnym krytycznym krokiem, który ma wpływ na odtwarzalność testu, jest produkcja i rozcieńczanie zapasów bakterii. Ważne jest, aby przed rozpoczęciem badania określić odpowiednie rozcieńczenie stad bakterii, ponieważ powodzenie testu zależy od konsekwentnego wytwarzania kontroli A i B, w których liczba CFU wynosi średnio ~120 CFU na plamkę. Aby uzyskać plamy, które są policzalne przez oprogramowanie, konieczne jest również, aby technika stosowana do płytki bakterii została pomyślnie wykonana. Osadzanie roztworu bakteryjnego i przechylanie płytki tak, aby plamki przebiegały na ~2-3 cm, ma kluczowe znaczenie dla wytworzenia kolonii o odpowiedniej wielkości i prawidłowym rozmieszczeniu w celu dokładnego zliczenia przez oprogramowanie NICE. Opanowanie wszystkich tych kroków zapewni, że ten protokół zapewni dokładne, spójne wyniki
Nawet jeśli wszystkie krytyczne kroki zostaną wykonane prawidłowo, nadal mogą wystąpić przypadki, w których konieczna będzie modyfikacja lub rozwiązanie problemów z tym protokołem. Modyfikacje tego protokołu w celu oceny innych bakterii mogą wymagać optymalizacji temperatury inkubacji płytki LBA przez noc, aby zapewnić tworzenie mikrokolonii. Inne szczepy bakterii lub źródła przeciwciał, inne niż surowica, mogą wymagać optymalizacji stężenia dopełniacza. Wartości NSK i KI surowic kontrolnych powinny być również monitorowane, aby upewnić się, że test działa prawidłowo. NSK nie powinna wzrosnąć powyżej 70%. KI surowic kontrolnych nie powinno różnić się więcej niż średnia ± 2SD. Aby osiągnąć pomyślne i spójne wyniki podczas korzystania z tego protokołu, konieczne będzie wykonanie wszystkich kroków zgodnie z opisem tutaj, ze szczególnym uwzględnieniem krytycznych kroków opisanych powyżej.
Chociaż protokół ten zaspokaja ważną potrzebę w społeczności badawczej Shigella , nie jest pozbawiony ograniczeń. Protokół ten opiera się na materiale biologicznym i dlatego zawsze będzie istniała pewna zmienność, którą trudno kontrolować. Różnice w aktywności dopełniacza z różnych partii i źródeł mogą przyczyniać się do zmienności testów. Aby temu zapobiec, ważne jest, aby odpowiednio obchodzić się z uzupełnieniem i testować nowe partie suplementu pod kątem aktywności przed zakupem. Pomocne może być również utworzenie puli partii dopełniacza o znanej aktywności, aby mieć jednorodną podaż. Protokół ten jest prosty z założenia i nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu, a oprogramowanie do automatycznego liczenia kolonii jest swobodnie dostępne. Chociaż ta prostota jest zaletą, pozwalającą na stosowanie tego protokołu w praktycznie każdym laboratorium, nadal wymaga on inkubacji przez noc. Opisano ostatnie testy, które mają znacznie krótszy czas inkubacji, ale wymagają specjalistycznych, przygotowawczych odczynników15. Innym ograniczeniem tego testu jest to, że w swojej obecnej formie jest on w stanie badać tylko jeden gatunek bakterii na raz. W dziedzinie Shigella istnieje pragnienie stworzenia szczepionki wielowalentnej, a posiadanie testów immunologicznych, które mogą oceniać patogeny w sposób multipleksowy, ma wielką wartość. Test ten może zostać zmodyfikowany w przyszłości, aby zaspokoić tę potrzebę, ale w obecnej formie jest to test single-plex.
Chociaż test ten ma pewne ograniczenia, nadal ma wiele zalet w porównaniu z istniejącymi lub alternatywnymi metodami. Zalety te obejmują wiele ulepszeń, które sprawiają, że wykonanie tej metody jest znacznie mniej pracochłonne i ma większą przepustowość niż tradycyjne SBA. Zastosowanie zamrożonych szczepów bakteryjnych, format testu z 96 dołkami, posiew na większych kwadratowych szalkach Petriego, zabarwienie kolonii, które pozwala na fotografowanie i automatyczne liczenie kolonii, wszystko to pomaga zmniejszyć ilość materiałów i czas potrzebny do wykonania tego testu. Test ten ma również zalety w porównaniu z innymi metodami wysokoprzepustowymi, ponieważ nie wymaga żadnych specjalistycznych odczynników ani sprzętu. Opisany protokół może być wykonywany przy użyciu podstawowych odczynników i ogólnodostępnego oprogramowania, co pozwala na jego zastosowanie w każdych warunkach laboratoryjnych.
Wszystkie zalety, jakie zapewnia ten protokół, przemawiają za jego wykorzystaniem w wielu przyszłych badaniach. Test idealnie nadaje się do badania odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu lub naturalnej infekcji. To zastosowanie pozwala SBA być cennym narzędziem w badaniach nad szczepionką Shigella i zostało już wykorzystane do oceny immunogenności szczepionki w bioskoniugowanych szczepionkach Shigella , gdzie wykazano zdolność tych szczepionek do indukowania produkcji funkcjonalnych przeciwciał16. Protokół ten został gruntownie przetestowany przez wiele laboratoriów i wykazano, że daje wiarygodne, powtarzalne wyniki9. Protokół ten daje również porównywalne wyniki, gdy te same próbki są testowane przy użyciu innych testów bakteriobójczych17. Spójność danych generowanych przez ten test i jego kompatybilność z innymi starszymi metodami sprawiają, że jest to solidne narzędzie do dokładnej oceny aktywności bakteriobójczej w próbkach surowicy. Test można również łatwo dostosować do oceny dodatkowych typów próbek. Podczas gdy surowica jest łatwo dostępna w badaniach klinicznych dla dorosłych, uzyskanie wystarczającej ilości surowicy w badaniach koncentrujących się na niemowlętach i małych dzieciach może być trudne; jedną z ostatecznych populacji docelowych szczepionek przeciwko Shigella . W tych badaniach krew pełna jest rutynowo pobierana na bibułę filtracyjną i suszona. Osiągnięto pewne wstępne sukcesy z tego typu formatem próbki przy użyciu SBA. Oprócz krwi pełnej, próbki błony śluzowej (takie jak ślina, ekstrakty kałowe i mocz) są również celem, który jest istotny w badaniach nad szczepionką Shigella . Obecnie protokół ten został oceniony pod kątem trzech najbardziej istotnych klinicznie serotypów Shigella , ale można go również dostosować do dodatkowych Shigella spp., a także innych patogenów bakteryjnych. Przyszłe prace będą koncentrować się na produkcji testu multipleksowego o wielu takich samych cechach, jak test opisany w niniejszym protokole. Test multipleksowy pozwoli na jednoczesną ocenę wielu serotypów Shigella , co jeszcze bardziej pozwoli zaoszczędzić objętość próbki i czas testu. Trwają również prace nad przeniesieniem tego testu do laboratoriów na całym świecie. Te globalne oceny wygenerują więcej danych w celu zakwalifikowania testu na większą skalę badawczą, jednocześnie zwiększając liczbę laboratoriów mikrobiologicznych i immunologicznych, które mają dostęp do tego SBA w celu oceny bakterii i próbek surowicy pobranych z różnych lokalizacji endemicznych. Opisany tutaj test jest prosty i wysokoprzepustowy i może poprawić ocenę immunologiczną w dziedzinie Shigella , a także szersze zastosowania do oceny innych patogenów bakteryjnych.

Serotypy Shigella, Shigella flexneri 2a, S. flexneri 3a i S. sonnei, wykazują globalne rozpowszechnienie epidemiologiczne. Choroba biegunkowa wywoływana przez te gatunki Shigella dotyka wojsko, podróżników1 i jest główną przyczyną zgonów z powodu biegunki wśród dzieci poniżej 5 roku życia w krajach rozwijających się2. Obecnie nie ma licencjonowanych szczepionek chroniących przed Shigella, jednak istnieje wiele potencjalnych szczepionek na różnych etapach rozwoju. Wiele z tych szczepionek i innych środków profilaktycznych, które są obecnie opracowywane, koncentruje się na przeciwciałach wytwarzanych przeciwko lipopolisacharydowi Shigella (LPS). LPS jest atrakcyjnym kandydatem na szczepionkę, ponieważ jest głównym antygenem powierzchniowym, a naturalne zakażenie Shigella indukuje przeciwciała specyficzne dla LPS, które mogą chronić przed ponownym zakażeniem w sposób specyficzny dla serotypu. Dlatego skuteczna szczepionka Shigella prawdopodobnie będzie musiała być wielowalentna i ukierunkowana na 3-4 serotypy Shigella, aby wywołać odporność przeciwko 70-80% globalnie krążących szczepów3,4,5,6. Wymaga to, aby testy oceniające kandydatów na szczepionkę Shigella były specyficzne dla wielu różnych serotypów.
Obecne testy immunologiczne do oceny kandydatów na szczepionki koncentrują się na ilościowym określaniu poziomów mian przeciwciał, ale istnieje niewiele dobrze scharakteryzowanych testów do oceny funkcjonalnych przeciwciał. Badanie zdolności funkcjonalnej przeciwciał jest ważne, ponieważ przeciwciała specyficzne dla patogenu są odpowiedzialne za zwalczanie infekcji poprzez szereg mechanizmów funkcjonalnych, w tym wiązanie antygenów powierzchniowych bakterii oraz zapobieganie adhezji i infekcji komórek nabłonkowych, celowanie w komórki bakteryjne lub opsonizację i fagocytozę oraz bezpośrednie zabijanie patogenów poprzez wiązanie i inicjowanie kaskady dopełniacza. Bezpośrednie zabijanie bakterii przez przeciwciała następuje, gdy przeciwciała wiążą się ze składnikami powierzchniowymi bakterii docelowych i inicjują kaskadę dopełniacza, prowadząc do aktywacji wielu zymogenów, które ostatecznie prowadzą do tworzenia się porów w komórce bakteryjnej, co powoduje lizę i śmierć bakterii. To bezpośrednie zabijanie bakterii przez krążące przeciwciała i dopełniacz może być kluczową wczesną linią obrony podczas infekcji. 
Osoby, które są naturalnie zakażone, mają przeciwciała o działaniu kwasowo-szigowym w swoich surowicach. Te specyficzne dla Shigella przeciwciała wykryto za pomocą tradycyjnych testów zabijania za pośrednictwem dopełniacza 7,8. Wskazuje to, że przeciwciała bakteriobójcze mogą odgrywać rolę w ochronie przed Shigella. Tradycyjne testy bakteriobójcze są proste w wykonaniu: surowica jest inaktywowana termicznie (w celu zniszczenia endogennej aktywności dopełniacza) i mieszana z interesującymi bakteriami. Egzogenny dopełniacz dodaje się do tej mieszaniny w określonym stężeniu. Mieszaninę reakcyjną inkubuje się, aby umożliwić zabicie bakterii, a następnie posiewa w celu potwierdzenia jednostek tworzących kolonie (CFU). Po zliczeniu CFU można obliczyć 50% wskaźnik zabijania (KI) i określić miano SBA. Chociaż procedura ta jest stosunkowo prosta, testy te mogą być pracochłonne i czasochłonne, a wyniki mogą być bardzo zmienne. Oprócz tych ograniczeń, obecnie nie istnieją dobrze scharakteryzowane testy funkcjonalne dla Shigella. Dlatego z powodzeniem opracowaliśmy i zakwalifikowaliśmy prosty, wysokoprzepustowy test do pomiaru aktywności bakteriobójczej Shigella dla trzech najbardziej istotnych klinicznie szczepów9. Protokół ten opisuje SBA z modyfikacjami, które poprawiają wydajność i odtwarzalność testu. Pierwszą z tych modyfikacji jest zastosowanie mrożonych zapasów bakteryjnych. Produkcja zapasów jednorazowego użytku eliminuje potrzebę hodowli świeżych bakterii dla każdego testu, jednocześnie zmniejszając zmienność między testami. Kolejną zaletą tego protokołu pozwalającą zaoszczędzić czas i pracę, jest zastosowanie 96-dołkowego formatu testu płytkowego. Pozwala to na seryjne rozcieńczanie próbek, dzięki czemu można badać zakres stężeń. Pozwala również na stosowanie pipet wielokanałowych do posiewu próbek na kwadratowych szalkach Petriego. Kiedy te kwadratowe szalki Petriego są używane w połączeniu z systemem hodowli, który wytwarza mikrokolonie, liczba płytek agarowych wymaganych do testu jest zmniejszona. To, w połączeniu z ogólnodostępnym oprogramowaniem do zliczania kolonii, pierwotnie opracowanym dla pneumokokowego multipleksowanego testu zabijania opsonofagocytów (MOPA)10, pozwala na szybkie, zautomatyzowane i niezawodne liczenie kolonii. Wszystkie te ulepszenia znacznie skracają czas wykonywania testów i tworzą system o wysokiej przepustowości, który umożliwia jednoczesne uruchamianie wielu płytek.
Chociaż ten protokół został zoptymalizowany dla trzech najbardziej istotnych klinicznie serotypów Shigella, opisany tutaj SBA może być łatwo zastosowany do wielu innych patogenów bakteryjnych. Oprócz potencjalnego zastosowania tego protokołu w odniesieniu do innych bakterii, protokół ten ma potencjał, aby rozszerzyć się poza stosowanie wyłącznie surowicy jako materiału wyjściowego, co może obejmować analizę przeciwciał w innych istotnych typach próbek, takich jak próbki błony śluzowej, w tym próbki śliny i kału. Zastosowanie tego testu do zbadania odpowiedzi immunologicznych po szczepieniu może dać szerszy wgląd w odpowiedzi immunologiczne generowane przez szczepienie, prowadząc do racjonalnego projektowania szczepionek i pomóc w zrozumieniu, w jaki sposób rozwija się naturalna odporność.

<table><tbody><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>Typ B, proszek, Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>TTC (chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu)</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td>&ge; 98,0% (HPLC)</td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>&ge; 99,5%</td></tr><tr><td>Mały królik</td><td>PelFreez</td><td>31061-3</td><td>3-4 tygodniowy</td></tr><tr><td>HBSS z Ca2+/Mg2+</td><td>Invitrogen</td><td>14065-56</td><td>Bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>LB Agar (Lennox)</td><td>Sigma</td><td>L2897</td><td>Proszek pożywka do wzrostu mikroorganizmów</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Sproszkowany, (C12H18O9)n</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Dla biologii molekularnej, &ge; 99%</td></tr><tr><td>LB Rosół (Lennox)</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>Proszek do wzrostu drobnoustrojów</td></tr><tr><td>Kwadratowa szalka</td><td>Petriego Sigma</td><td>Z617679-240EA</td> Płytka testowa <td>120 mm x 120 mm</td></tr><tr><td>Costar</td><td></td><td>3799</td><td>96-dołkowa płyta dolna w kształcie litery U z pokrywką</td></tr><tr><td>NICE Software</td><td>University of Alabama w Birmingham</td><td></td><td>ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy test bakteriobójczy specyficzny dla shigella

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Testy bakteriobójcze (SBA) mierzą aktywność funkcjonalną przeciwciał i są stosowane od wielu dziesięcioleci. SBA bezpośrednio mierzą aktywność zabijania przeciwciał, oceniając zdolność przeciwciał w surowicy do wiązania się z bakteriami i aktywacji dopełniacza. Ta aktywacja dopełniacza powoduje lizę i zabicie docelowych bakterii. Testy te są cenne, ponieważ wykraczają poza ilościowe określenie produkcji przeciwciał, aby wyjaśnić funkcje biologiczne, jakie pełnią te przeciwciała, umożliwiając naukowcom zbadanie roli, jaką przeciwciała mogą odgrywać w zapobieganiu infekcji. SBA były wykorzystywane do badania odpowiedzi immunologicznej na wiele ludzkich patogenów, ale obecnie nie ma powszechnie akceptowanej metodologii dla Shigella. Historycznie rzecz biorąc, SBA były bardzo pracochłonne, wymagały wielu czasochłonnych kroków w celu dokładnego ilościowego określenia bakterii, które przeżyły. Protokół ten opisuje prosty, solidny i wysokoprzepustowy test, który mierzy funkcjonalne przeciwciała specyficzne dla Shigella w surowicy in vitro. Opisana tutaj metoda ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi SBA, w tym wykorzystanie zamrożonych zapasów bakteryjnych, 96-dołkowych płytek testowych, systemu mikrohodowli i automatycznego liczenia kolonii. Wszystkie te modyfikacje sprawiają, że test ten jest mniej pracochłonny i ma większą przepustowość. Protokół ten jest prostszy i szybszy do wykonania niż tradycyjne SBA, a jednocześnie wykorzystuje proste technologie i łatwo dostępne odczynniki. Protokół został z powodzeniem zastosowany w wielu niezależnych laboratoriach, a test jest solidny i powtarzalny. Test może być stosowany do oceny odpowiedzi immunologicznej zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych. Ilościowe określenie miana przeciwciał przeciwko kwasowi shigelacidalnemu zarówno przed, jak i po ekspozycji na antygen (zarówno przez immunizację, jak i zakażenie) pozwala na szersze zrozumienie, w jaki sposób generowane są funkcjonalne odpowiedzi przeciwciał i ich wkład w odporność ochronną. Opracowanie tego ustandaryzowanego, dobrze scharakteryzowanego testu może znacznie ułatwić projektowanie szczepionki Shigella.

Układ płytki 96-dołkowej stosowany w typowym teście przedstawiono w Tabeli 1. Układ ten obejmuje dołki kontrolne z aktywnym dopełniaczem (Kontrola B), dołki kontrolne z dopełniaczem inaktywowanym termicznie (Kontrola A) oraz pięć próbek w duplikacie. Próbki są rozcieńczane seryjnie 3-krotnie w górę płytki od rzędu H do rzędu A, co pozwala na jednoczesne przetestowanie 8 rozcieńczeń każdej próbki. Na Rysunku 1 przedstawiono dwie płytki LBA po inkubacji nocnej i dodaniu warstwy przypowierzchniej. Nastąpił rozwój barwy i wszystkie przeżyłe kolonie są widoczne na czerwono. Zabijanie bakterii jest wyraźnie widoczne dla wszystkich próbek przetestowanych w trzech pierwszych rozcieńczeniach (rzędy F-H), a w miarę dalszego rozcieńczania próbek w górę płytki obserwuje się spadek zabijania bakterii w miejscach, gdzie surowica jest mniej skoncentrowana. Interfejs oprogramowania NICE przedstawiono na Rysunku 2. Liczba mikrokolon z oprogramowania NICE widoczna jest na Rysunku 3, a dane te zostały zestawione w Tabeli 2. W Tabeli 3 obliczono średnią liczbę CFU dla każdego rozcieńczenia każdej próbki oraz wyznaczono wartość KI 50%. Tę wartość KI 50% można odnieść do uśrednionych wartości CFU dla każdego rozcieńczenia surowicy, aby określić wartości niezbędne do obliczenia SBA KI zgodnie ze wzorem opisanym na Rysunku 4. Końcowy wynik testu przedstawiono w Tabeli 4.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>Kontrola A</td>
			<td>Kontrola B</td>
			<td>Rozcieńczenie 8</td>
			<td>Rozcieńczenie 8</td>
			<td>Rozcieńczenie 8</td>
			<td>Rozcieńczenie 8</td>
			<td>Rozcieńczenie 8</td>
			<td>Rozcieńczenie 8</td>
			<td>Rozcieńczenie 8</td>
			<td>Rozcieńczenie 8</td>
			<td>Rozcieńczenie 8</td>
			<td>Rozcieńczenie 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>Kontrola A</td>
			<td>Kontrola B</td>
			<td>Rozcieńczenie 7</td>
			<td>Rozcieńczenie 7</td>
			<td>Rozcieńczenie 7</td>
			<td>Rozcieńczenie 7</td>
			<td>Rozcieńczenie 7</td>
			<td>Rozcieńczenie 7</td>
			<td>Rozcieńczenie 7</td>
			<td>Rozcieńczenie 7</td>
			<td>Rozcieńczenie 7</td>
			<td>Rozcieńczenie 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td>Kontrola A</td>
			<td>Kontrola B</td>
			<td>Rozcieńczenie 6</td>
			<td>Rozcieńczenie 6</td>
			<td>Rozcieńczenie 6</td>
			<td>Rozcieńczenie 6</td>
			<td>Rozcieńczenie 6</td>
			<td>Rozcieńczenie 6</td>
			<td>Rozcieńczenie 6</td>
			<td>Rozcieńczenie 6</td>
			<td>Rozcieńczenie 6</td>
			<td>Rozcieńczenie 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>Kontrola A</td>
			<td>Kontrola B</td>
			<td>Rozcieńczenie 5</td>
			<td>Rozcieńczenie 5</td>
			<td>Rozcieńczenie 5</td>
			<td>Rozcieńczenie 5</td>
			<td>Rozcieńczenie 5</td>
			<td>Rozcieńczenie 5</td>
			<td>Rozcieńczenie 5</td>
			<td>Rozcieńczenie 5</td>
			<td>Rozcieńczenie 5</td>
			<td>Rozcieńczenie 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>Kontrola A</td>
			<td>Kontrola B</td>
			<td>Rozcieńczenie 4</td>
			<td>Rozcieńczenie 4</td>
			<td>Rozcieńczenie 4</td>
			<td>Rozcieńczenie 4</td>
			<td>Rozcieńczenie 4</td>
			<td>Rozcieńczenie 4</td>
			<td>Rozcieńczenie 4</td>
			<td>Rozcieńczenie 4</td>
			<td>Rozcieńczenie 4</td>
			<td>Rozcieńczenie 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>Kontrola A</td>
			<td>Kontrola B</td>
			<td>Rozcieńczenie 3</td>
			<td>Rozcieńczenie 3</td>
			<td>Rozcieńczenie 3</td>
			<td>Rozcieńczenie 3</td>
			<td>Rozcieńczenie 3</td>
			<td>Rozcieńczenie 3</td>
			<td>Rozcieńczenie 3</td>
			<td>Rozcieńczenie 3</td>
			<td>Rozcieńczenie 3</td>
			<td>Rozcieńczenie 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td>Kontrola A</td>
			<td>Kontrola B</td>
			<td>Rozcieńczenie 2</td>
			<td>Rozcieńczenie 2</td>
			<td>Rozcieńczenie 2</td>
			<td>Rozcieńczenie 2</td>
			<td>Rozcieńczenie 2</td>
			<td>Rozcieńczenie 2</td>
			<td>Rozcieńczenie 2</td>
			<td>Rozcieńczenie 2</td>
			<td>Rozcieńczenie 2</td>
			<td>Rozcieńczenie 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td>Kontrola A</td>
			<td>Kontrola B</td>
			<td>Rozcieńczenie 1</td>
			<td>Rozcieńczenie 1</td>
			<td>Rozcieńczenie 1</td>
			<td>Rozcieńczenie 1</td>
			<td>Rozcieńczenie 1</td>
			<td>Rozcieńczenie 1</td>
			<td>Rozcieńczenie 1</td>
			<td>Rozcieńczenie 1</td>
			<td>Rozcieńczenie 1</td>
			<td>Rozcieńczenie 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Próbka 1 </td>
			<td colspan="2">Próbka 2</td>
			<td colspan="2">Próbka 3</td>
			<td colspan="2">Próbka 4</td>
			<td colspan="2">Próbka 5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Układ płytki testowej. Kolumny 1 i 2 zawierają studzienki kontrolne dopełniacza. Kontrola A znajduje się w kolumnie 1 i jest kontrolą dopełniacza inaktywowanego termicznie, zawierającą bufor SBA, bakterie oraz dopełniacz inaktywowany termicznie. Kontrola B znajduje się w kolumnie 2 i jest kontrolą dopełniacza aktywnego, zawierającą bufor SBA, bakterie oraz dopełniacz. Kolumny 3-12 zawierają próbki surowicy. Każda próbka jest analizowana w duplikacie i rozcieńczana seryjnie 3-krotnie od rzędu H do rzędu A
<img alt="Wzrost kolonii bakteryjnych, płytki LBA, wynik eksperymentu, analiza hodowli mikrobowej, układ siatki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59164/59164fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Płytki LBA po wybarwieniu. Reprezentatywne mikrokolonie bakteryjne S. flexneri 3a urosły przez noc do odpowiedniego rozmiaru. Dodano agar nakładkowy, a kolonie przybrały czerwony kolor w wyniku redukcji związku TTC zawartego w agarze nakładkowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59164/59164fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat liczenia kolonii bakteryjnych przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, przedstawiający segmentację płytki i dane." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59164/59164fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Interfejs oprogramowania NIST's Integrated Colony Enumerator (NICE). Graficzna prezentacja interfejsu oprogramowania NICE. Obszary zainteresowania (ROI) są centrowane nad koloniami dla każdego punktu przed rozpoczęciem liczenia. Dane mogą być eksportowane bezpośrednio z okna NICE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59164/59164fig2large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wzrost kolonii bakteryjnych na płytkach LBA; wynik eksperymentalny; porównanie dwóch płytek z siatką 12x8." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59164/59164fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Płytki LBA zliczone w oprogramowaniu NICE. Kolorowe zdjęcia fotograficzne są ładowane do oprogramowania NICE, a jednostki tworzące kolonie (CFU) są liczone automatycznie. Na obrazie przedstawiono dwie reprezentatywne płytki LBA wraz z informacjami o liczbie kolonii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59164/59164fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>185</td>
			<td>167</td>
			<td>145</td>
			<td>151</td>
			<td>122</td>
			<td>134</td>
			<td>119</td>
			<td>142</td>
			<td>124</td>
			<td>115</td>
			<td>113</td>
			<td>123</td>
			<td>1:17496</td>
			<td>Rozcieńczenie 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>186</td>
			<td>152</td>
			<td>145</td>
			<td>138</td>
			<td>132</td>
			<td>135</td>
			<td>108</td>
			<td>116</td>
			<td>100</td>
			<td>119</td>
			<td>105</td>
			<td>109</td>
			<td>1:5832</td>
			<td>Rozcieńczenie 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>179</td>
			<td>160</td>
			<td>145</td>
			<td>135</td>
			<td>109</td>
			<td>120</td>
			<td>54</td>
			<td>55</td>
			<td>71</td>
			<td>75</td>
			<td>79</td>
			<td>89</td>
			<td>1:1944</td>
			<td>Rozcieńczenie 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>193</td>
			<td>153</td>
			<td>146</td>
			<td>138</td>
			<td>87</td>
			<td>105</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>9</td>
			<td>19</td>
			<td>30</td>
			<td>1:648</td>
			<td>Rozcieńczenie 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>184</td>
			<td>129</td>
			<td>121</td>
			<td>143</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1:216</td>
			<td>Rozcieńczenie 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>180</td>
			<td>145</td>
			<td>22</td>
			<td>24</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1:72</td>
			<td>Rozcieńczenie 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>207</td>
			<td>129</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>1:24</td>
			<td>Rozcieńczenie 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>201</td>
			<td>140</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>1:8</td>
			<td>Rozcieńczenie 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> Kontrola A</td>
			<td> Kontrola B</td>
			<td colspan="2">Próbka 1</td>
			<td colspan="2">Próbka 2</td>
			<td colspan="2">Próbka 3</td>
			<td colspan="2">Próbka 4</td>
			<td colspan="2">Próbka 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Liczba kolonii bakteryjnych. Liczby CFU są eksportowane z oprogramowania NICE do formatu excel. Liczby te można zestawić w tabeli przedstawiającej liczbę bakterii dla wszystkich próbek powtórzonych i studzienek kontrolnych.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td > Kontrola A</td >
			<td > Kontrola B</td >
			<td >148</td >
			<td >128</td >
			<td >131</td >
			<td >120</td >
			<td >118</td >
			<td >1:17496</td >
			<td >Rozcieńczenie 8</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >189</td >
			<td >147</td >
			<td >142</td >
			<td >134</td >
			<td >112</td >
			<td >110</td >
			<td >107</td >
			<td >1:5832</td >
			<td >Rozcieńczenie 7</td >
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2" >NSK (1-CtrB/CtrA):   22%</td >
			<td >140</td >
			<td >115</td >
			<td >55</td >
			<td >73</td >
			<td >84</td >
			<td >1:1944</td >
			<td >Rozcieńczenie 6</td >
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2" >50% KI (CtrB/2):        73 </td >
			<td >142</td >
			<td >96</td >
			<td >6</td >
			<td >8</td >
			<td >25</td >
			<td >1:648</td >
			<td >Rozcieńczenie 5</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td ></td >
			<td >132</td >
			<td >7</td >
			<td >1</td >
			<td >1</td >
			<td >1</td >
			<td >1:216</td >
			<td >Rozcieńczenie 4</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td ></td >
			<td >23</td >
			<td >3</td >
			<td >2</td >
			<td >1</td >
			<td >0</td >
			<td >1:72</td >
			<td >Rozcieńczenie 3</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td ></td >
			<td >1</td >
			<td >2</td >
			<td >1</td >
			<td >3</td >
			<td >1</td >
			<td >1:24</td >
			<td >Rozcieńczenie 2</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td ></td >
			<td >0</td >
			<td >0</td >
			<td >1</td >
			<td >1</td >
			<td >4</td >
			<td >1:8</td >
			<td >Rozcieńczenie 1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td ></td >
			<td >Próbka 1</td >
			<td >Próbka 2</td >
			<td >Próbka 3</td >
			<td >Próbka 4</td >
			<td >Próbka 5</td >
			<td ></td >
			<td ></td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 3: Obliczanie wartości odcięcia 50% KI oraz średnich dla próbek powtórzonych. Wartość odcięcia 50% KI obliczono, wyciągając średnią ze wszystkich dołków Kontroli B i dzieląc ją przez 2. Średnie z powtórzeń obliczono dla każdego rozcieńczenia każdej próbki analizowanej w duplikacie. Obliczona została również wartość NSK.
<img alt="Wykres przeżywalności drobnoustrojów; rozcieńczenie surowicy vs. CFU/spot; oporność bakteryjna; analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59164/59164fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Schemat interpolacji liniowej. Liczba przeżyłych bakterii (oś y) dla każdego przetestowanego rozcieńczenia surowicy (oś x) jest naniesiona na wykres (czarne romby), a poszczególne punkty są połączone cienką, przerywaną czarną linią. Ciągła i przerywana linia pozioma wskazują odpowiednio 0% i 50% śmiertelności. Rozcieńczenia surowicy powyżej (Rozcieńczenie 5) i poniżej (Rozcieńczenie 4) linii 50% śmiertelności są połączone czerwoną linią, co wskazuje miano bakteriobójcze (KI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59164/59164fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SBA KI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbka 1</td>
			<td>72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbka 2</td>
			<td>216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbka 3</td>
			<td>1994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbka 4</td>
			<td>1994</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbka 5</td>
			<td>648</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Wyniki SBA wykazujące miano bakteriobójcze (KI). Wyznaczono i przedstawiono końcowe wartości SBA KI dla każdej próbki. Wartości te obliczono przy użyciu średnich liczb CFU, wartości odcięcia 50% KI oraz formuły interpolacji liniowej.

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru aktywności Shigellacidal przeciwciał w surowicy. Surowicę miesza się z bakteriami i egzogennym dopełniaczem, inkubuje, a mieszaninę reakcyjną posiewa się na płytkach agarowych. Żywe bakterie tworzą kolonie, które są zliczane za pomocą automatycznego enumeratora kolonii i wykorzystywane do określenia miana bakteriobójczego.

Wysokoprzepustowy test bakteriobójczy specyficzny dla Shigella

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

W dziedzinie badań nad Shigella brakuje obecnie dobrze zdefiniowanych testów do badania funkcjonalnej roli przeciwciał wytwarzanych przez szczepienie lub infekcję. Test ten stanowi dobrze zdefiniowaną metodę kwalifikacji tych odpowiedzi immunologicznych i pomiaru aktywności bakteriobójczej specyficznych przeciwciał Shigella. Główną zaletą tego testu jest to, że pozwala na wysokoprzepustową analizę wielu próbek.Techniki zastosowane w tym protokole znacznie skracają czas pracy i ogólny czas testu w celu zmierzenia bezpośredniego zabijania bakteryjnego przeciwciał i próbek surowicy. Na początek inkubuj próbki w ciepłej łaźni wodnej w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby podgrzać i aktywować próbki testowe. Uzyskać płytkę do oznaczania i 20 mikrolitrów buforu do oznaczania w kolumnach od pierwszej do dwunastej w wierszach od A do G. Dodać 20 mikrolitrów buforu do testu do kolumn pierwszej i drugiej wiersza H. Załadować 30 mikrolitrów każdej próbki testowej i powielić w wierszu H płytki do oznaczania.Aby rozpocząć wykonywanie trzykrotnych seryjnych rozcieńczeń badanych próbek, należy użyć pipety wielokanałowej, aby usunąć 10 mikrolitrów z dołków od 3H do 12H. Przenieść próbki do odpowiednich dołków w rzędzie G i pipetować w górę iw dół 8 do 10 razy, aby dobrze wymieszać próbkę. Następnie usuń 10 mikrolitrów z tych studzienek.Przenieś do odpowiednich studzienek w rzędzie F i pipetuj w górę i w dół 8 do 10 razy, aby wymieszać. Kontynuuj ten proces seryjnego rozcieńczania w rzędzie A. Po wymieszaniu studzienek w rzędzie A, wyjmij i wyrzuć 10 mikrolitrów z dołków od 3A do 12A, tak aby końcowa objętość we wszystkich studzienkach wynosiła 20 mikrolitrów. Pobrać jedną fiolkę z zamrożonym docelowym bulionem bakteryjnym i rozmrozić ją w temperaturze pokojowej.Następnie rozcieńczyć bakterie w 20 mililitrach buforu testowego. zgodnie z wcześniej ustalonym optymalnym współczynnikiem rozcieńczenia. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczonych bakterii do każdego dołka płytki testowej.Pobrać jedną fiolkę zamrożonego Baby Rabbit Compliment i jedną fiolkę zamrożonego BRC aktywowanego ciepłem. Użyj zimnej bieżącej wody, aby rozmrozić fiolki do temperatury pokojowej. Następnie wymieszaj 100 mikrolitrów aktywowanego termicznie BRC z 400 mikrolitrami buforu testowego.Dodaj 50 mikrolitrów tego 20-procentowego roztworu BRC aktywowanego ciepłem do wszystkich studzienek w kolumnie pierwszej. Wymieszaj jeden mililitr natywnego BRC z czterema mililitrami buforu testowego. Dodaj 50 mikrolitrów tej 20-procentowej mieszaniny do wszystkich studzienek w kolumnach od drugiej do dwunastej.Umieść płytkę w wytrząsarce na 10 do 15 sekund, aby delikatnie wymieszać płytkę testową. Inkubować płytkę testową w inkubatorze mikrobiologicznym przez dwie godziny. W międzyczasie zdejmij pokrywki z dwóch płytek agarowych LB i umieść płytki stroną zadrukowaną do góry w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 40 do 60 minut do wyschnięcia.Po zakończeniu inkubacji przenieść płytkę testową na mokry lód i inkubować przez 10 do 20 minut, aby zatrzymać reakcję. Za pomocą pipety dwunastokanałowej wymieszać studzienki w rzędzie H i umieścić na płytce punktowej 10 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej na dnie płytki LBA. Natychmiast przechyl płytkę i pozwól plamom przesuwać się przez około 1,5 do 2 centymetrów.Powtórz tę procedurę dla rzędów G, F i E, dostrzegając je powyżej poprzedniego rzędu. Inkubować płytki LBA w temperaturze pokojowej, aż roztwór zostanie wchłonięty przez płytki LBA. Następnie połóż pokrywki na płytkach i przenieś je do góry nogami do inkubatora mikrobiologicznego w celu inkubacji przez noc.Następnego dnia dodaj 25 mililitrów agaru nakładkowego w temperaturze 55 stopni Celsjusza, zawierającego 100 mikrogramów na mililitr TTC i 0,1 procent azydku sodu do każdej płytki LBA. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby bakterie, które przeżyły, mogły rozwinąć czerwony kolor. Następnie użyj aparatu cyfrowego, aby sfotografować płyty.Przenieś obrazy do komputera i użyj oprogramowania NIST Integrated Colony Enumerating do analizy obrazów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Reprezentatywne płytki LBA pokazują, że rozwój koloru nastąpił po całonocnej inkubacji i dodaniu nakładki, przy czym wszystkie kolonie, które przeżyły, są widoczne na czerwono. Zabijanie przez bakterie jest wyraźnie widoczne we wszystkich próbkach badanych w pierwszych trzech rozcieńczeniach.Spadek zabijania bakterii obserwuje się, gdy próbki są rozcieńczane dalej w górę płytki, a surowica jest mniej skoncentrowana. Zliczanie mikrokolonii jest następnie przeprowadzane za pomocą oprogramowania NIST. Następnie obliczana jest średnia liczba CFU dla każdego rozcieńczenia każdej próbki, podobnie jak 50-procentowa wartość zabijania.Ta 50-procentowa wartość zabijania jest następnie stosowana do średnich CFU dla każdego rozcieńczenia surowicy w celu określenia wartości potrzebnych do obliczenia SBA KI. Protokół ten opiera się na spójnym i jednolitym posiewie bakteryjnym na LB Auger. Dobra technika posiewu punktowego i pochylania pozwoli na wzrost dyskretnych mikrokolonii i dokładne zliczanie kolonii. Technika ta wykorzystuje żywą, zjadliwą Shigellę i wymaga odpowiedniej techniki aseptyki oraz środków ochrony osobistej, aby zapewnić bezpieczne obchodzenie się z bakteriami zgodnie z procedurami BSL 2.

a-high-throughput-shigella-specific-bactericidal-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

Ten film demonstruje technikę oceny działania bakteriobójczego przeciwciał obecnych w surowicy, w którym pośredniczy dopełniacz. Podejście to łączy wyizolowaną surowicę z bakteriami chorobotwórczymi i egzogennymi białkami dopełniacza. Podczas inkubacji bakterie są hodowane na płytce agarowej, a wytworzone kolonie są oznaczane ilościowo w celu zmierzenia miana bakteriobójczego surowicy.

Test bakteriobójczy surowicy na działanie bakteriobójcze przeciwciał za pośrednictwem dopełniacza

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Ten protokół umożliwia czytelnikowi analizę powstawania biofilmu wywołanego solą żółciową w patogenach jelitowych przy użyciu wieloaspektowego podejścia do uchwycenia dynamicznej natury biofilmów bakteryjnych poprzez ocenę przylegania, tworzenia matrycy substancji polimerowej zewnątrzkomórkowej i dyspersji.

Tworzenie biofilmu wywołanego solą żółciową w patogenach jelitowych: techniki identyfikacji i kwantyfikacji

Tutaj prezentujemy protokoły wizualizacji odpowiedzi wapnia (Ca2+) wywołanych przez komórki HeLa zakażone przez Shigella. Optymalizując parametry infekcji bakteryjnej i obrazując za pomocą sond fluorescencyjnychCa2+, scharakteryzowano nietypowe globalne i lokalne sygnały Ca2+ indukowane przez bakterie w szerokim zakresie kinetyki infekcji.

Obrazowanie odpowiedzi Ca2+ podczas zakażenia komórek nabłonkowych Shigella

Salmonella spp./Shigella spp. są częstymi patogenami przypisywanymi biegunce. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym w połączeniu z hodowlą sterowaną.

Wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp.

Obecny protokół opisuje testy infekcji do badania przestrzegania Shigella, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej przy użyciu linii komórkowych nabłonka in vitro.

Analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem Shigella

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Poznaj wysokoprzepustowy test bakteriobójczy specyficzny dla Shigella do oceny aktywności przeciwciał w surowicy. Ta metoda umożliwia analizę wielu próbek przy zmniejszonym czasie pracy ręcznej.

Wysokoprzepustowy test bakteriobójczy specyficzny dla Shigella

Przeglądaj więcej filmów