Name: Pomiar cytometryczny przepływu produkcji ROS w makrofagach w odpowiedzi na sieciowanie FcγR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Poznaj cytometryczną metodę pomiaru produkcji ROS w makrofagach po aktywacji receptorów FcγR. Ta technika umożliwia dokładne badanie stresu oksydacyjnego i reakcji immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować innym członkom Laboratorium Tigno-Aranjuez, w tym Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy i Roopin Singh za pomoc w utrzymaniu laboratorium i kolonii myszy. Wsparcie dla tych badań zostało zapewnione przez grant R00 HL122365 i fundusze na rozpoczęcie działalności dla J.T.T-A.

<ol><li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li>
<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li>
<li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li>
<li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagocyte+respiratory+burst%3A+Historical+perspectives+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li>
<li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li>
<li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+signaling+and+respiratory+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li>
<li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li>
<li>Good, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+%28chronic%29+granulomatous+disease+of+childhood%3A+a+hereditary+defect+of+leukocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function.</a> Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).</li>
<li>Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+metabolic+activity+of+leukocytes+from+patients+with+a+genetic+abnormality+of+phagocytic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function.</a> Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).</li>
<li>Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pattern+of+genetic+transmission+of+the+leukocyte+defect+in+fatal+granulomatous+disease+of+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood.</a> Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).</li>
<li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species%3A+Measurement+of+ROS+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22White+Paper%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li>
<li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li>
<li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C7%27-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement%3A+Forty+years+of+application+and+controversy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li>
<li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation%3A+another+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Wykrywanie ROS oparte na DCFH,2-DA i DHE jest szeroko stosowaną techniką14,15. Łatwość użycia i zdolność adaptacji tych sond ROS do formatów kinetycznych mikropłytek, mikroskopii fluorescencyjnej lub analizy cytometrii przepływowej przyczyniły się do ich popularności. Jednak w naszych badaniach funkcji makrofagów, w których pośredniczy FcγR, nie wydaje się, aby istniał standardowy protokół wykonywania tego testu do analizy cytometrii przepływowej komór...

Reaktywne formy tlenu (ROS) to reaktywne cząsteczki lub wolne rodniki, które są produktami ubocznymi oddychania tlenowego (przejrzane w 1). Należą do nich między innymi anion ponadtlenkowy, nadtlenek, nadtlenek wodoru, rodnik hydroksylowy i jony hydroksylowe. W normalnych warunkach fizjologicznych ROS są wytwarzane głównie przez mitochondria i oksydazy fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH) i są szybko detoksykowane przez różne enzymy i białka, takie jak dysmutaza ponadtlenkowa i glutation. Nadmierna produkcja ROS lub defekt w zdolności do usuwania ROS może powodować stres oksydacyjny, w którym reaktywne formy tlenu sprzyjają uszkodzeniu białek, lipidów i DNA, prowadząc do stresu komórkowego lub śmierci i patologicznych stanów chorobowych. Jednak obecnie docenia się, że ROS może również działać jako cząsteczki sygnałowe (sygnalizacja redoks), a modyfikacja różnych cząsteczek i produktów pośrednich szlaku za pośrednictwem ROS może wpływać na metabolizm komórkowy, proliferację, przeżycie, sygnalizację zapalną i starzenie się2. W komórkach fagocytarnych ROS odgrywa zasadniczą rolę w zapewnianiu aktywności przeciwdrobnoustrojowej podczas tak zwanego "wybuchu oddechowego"1,3,4,5,6. Podczas odpowiedzi fagocytów na bodźce zewnętrzne składniki kompleksu oksydazy NADPH (p40phox, p47phox, p67phox) przemieszczają się z cytozolu do błony fagosomalnej zawierającej podjednostki gp91phox i p22phox i wraz z działaniem Rac1/2 tworzą w pełni funkcjonalny kompleks enzymatyczny oksydazy NADPH. Zmontowana oksydaza NADPH wykorzystuje następnie NADPH do redukcji tlenu do ponadtlenku w fagosomalnej wakuoli. Aniony ponadtlenkowe mogą bezpośrednio powodować uszkodzenia lub ulegać dysmutacji w nadtlenek wodoru. Zarówno nadtlenek wodoru, jak i nadtlenek wodoru mogą reagować z innymi cząsteczkami, tworząc wysoce reaktywne rodniki hydroksylowe. Uszkodzenie odbywa się za pośrednictwem reakcji tych ROS z klastrami żelazowo-siarkowymi na białkach lub poprzez utlenianie zasad DNA, co ostatecznie prowadzi do ograniczenia metabolizmu drobnoustrojów lub śmierci drobnoustroju5. Znaczenie kompleksu enzymatycznego oksydazy NADPH i ROS wytwarzanych podczas wybuchu oddechowego jest zilustrowane klinicznie u pacjentów z przewlekłą chorobą ziarniniakową (CGD)7,8,9,10. Osoby z CGD posiadają mutacje w gp91phox, co skutkuje brakiem produkcji ROS i podatnością na nawracające infekcje bakteriami i grzybami, które zwykle nie stanowią problemu u osób immunokompetentnych. Dlatego, niezależnie od tego, czy badasz stres oksydacyjny, sygnalizację redoks, czy obronę gospodarza, możliwość pomiaru produkcji ROS w czasie rzeczywistym jest użytecznym przedsięwzięciem.
Do pomiaru produkcji ROS lub wyników stresu oksydacyjnego wykorzystano wiele testów11,12,13. Wśród nich jednym z najczęściej stosowanych jest dioctan dichlorodihydrofluoresceiny 2',7' (DCFH2-DA)14. Cząsteczka ta jest bezbarwna i lipofilowa. Dyfuzja DCFH2-DA przez błonę komórkową pozwala na działanie na nią przez esterazy wewnątrzkomórkowe, które deacetylują go do DCFH2, czyniąc go nieprzepuszczalnym dla komórek. Działanie wielu rodzajów ROS (nadtlenek wodoru, nadtlenoazotyn, rodniki hydroksylowe, tlenek azotu i rodniki nadtlenowe) na DCFH2 utlenia go do DCF, który jest fluorescencyjny (zgłoszony Ex / Em: 485-500 nm / 515-530 nm) i może być wykryty za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w standardowy zestaw filtrów do fluoresceiny (kanał FL1). Ponadtlenek nie reaguje silnie z DCFH2, ale może reagować z inną sondą dihydroetydydą (DHE), aby otrzymać produkt fluorescencyjny 2-hydroksyyetyd (jak również inne fluorescencyjne produkty utleniania niezależne od ponadtlenków)<klasa sup = "xref">15. Fluorescencyjne produkty utleniania DHE można wykrywać za pomocą długości fali wzbudzenia 518 nm i długości fali emisji 605 nm (kanał FL2). Chociaż stosunkowo proste w użyciu, wykorzystanie tych sond do wykrywania ROS wymaga wiedzy na temat ich ograniczeń i starannego włączenia procedur barwienia i kontroli do konkretnego wykonywanego testu, aby uzyskać ważne wyniki i wnioski eksperymentalne. Poniższy protokół demonstruje użycie dostępnego na rynku zestawu wykorzystującego te 2 sondy przeznaczone do pomiaru ROS za pomocą cytometrii przepływowej. Za pomocą tych sond barwimy makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego i indukujemy produkcję ROS poprzez sieciowanie FcγR. Przedstawiamy reprezentatywne dane uzyskane przy użyciu tego protokołu i podkreślamy odpowiednie środki ostrożności, które należy podjąć, aby eksperymenty zakończyły się sukcesem.

<table><tbody><tr><td>Innowacyjne badania</td> <td>anty-BSA IgG1</td><td>IBSA9E2C2</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &kappa; Isotype Ctrl Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>400626</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom F4/80 skoniugowane z Alexa Fluor 647</td><td>BD Biosciences</td><td>565853</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie F4/80 sprzężone z FITC</td><td>BioLegend</td><td>123108</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie/ludzkie CD11b sprzężone z Alexa Fluor 647&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>101218</td><td></td></tr><tr><td>beta-merkaptoetanol (BME)</td><td>Sigma</td><td>M3148-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Frakcja V</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J&nbsp;</td><td>Jackson labs</td><td>Numer katalogowy 000664 CM-H2DCFDA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sondy molekularne</td><td>C6827</td><td>Może być substytutem odczynnika do wykrywania stresu oksydacyjnego w zestawie Enzo</td></tr> <tr><td>Sondy molekularne</td><td>Dihydroethidium (DHE)</td> <td>D11347</td><td>Może być substytutem odczynnika do wykrywania ponadtlenków w zestawie Enzo</td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>DMF bezwodny&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>61094-1000</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>FITC IgG2a szczura &kappa; Isotype Ctrl Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>400506</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>L glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Komórki LADMAC</td><td>ATCC</td><td>CRL-2420</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Mysz Corning</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>IFN-g</td><td>GoldBio</td><td>1360-06-100</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>EMD Milipore</td><td>106425</td><td>Może być substytutem inhibitora/zmiatacza ROS w zestawie Enzo</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Novocyte z autosamplerem</td><td>Acea</td><td>2060R</td><td></td></tr><tr><td>Pyocyanin (induktor ROS)</td><td>Kajman chemiczny</td><td>10009594</td><td>Może być substytutem induktora w zestawie Enzo</td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania całkowitego ROS/ponadtlenkowego ROS-ID</td><td>ENZO</td><td>ENZ-51010</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar cytometryczny przepływu produkcji ros w makrofagach w odpowiedzi na sieciowanie fcγr

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Wybuch oksydacyjny lub oddechowy jest używany do opisania szybkiego zużycia tlenu i generowania reaktywnych form tlenu (ROS) przez fagocyty w odpowiedzi na różne bodźce immunologiczne. ROS powstający podczas aktywacji immunologicznej wywiera silne działanie przeciwdrobnoustrojowe głównie poprzez zdolność ROS do uszkadzania DNA i białek, powodując śmierć mikroorganizmów. Możliwość powtarzalnego i łatwego pomiaru produkcji ROS jest niezbędna, aby ocenić wkład różnych szlaków i cząsteczek w ten mechanizm obrony gospodarza. W tym artykule demonstrujemy zastosowanie sond fluorescencyjnych i cytometrii przepływowej do wykrywania produkcji ROS. Chociaż szeroko stosowany, fluorescencyjny pomiar ROS jest notorycznie problematyczny, zwłaszcza w odniesieniu do pomiaru ROS indukowanego przez specyficzne, a nie mitogenne bodźce. Przedstawiono szczegółową metodykę wykrywania ROS powstających w wyniku specyficznej stymulacji FcγR, począwszy od generacji makrofagów, gruntowania, barwienia, sieciowania FcγR, a skończywszy na analizie cytometrii przepływowej.

Stosując opisany w pracy protokół, przedstawiamy reprezentatywne dane wykazujące detekcję produkcji ROS metodą cytometrii przepływowej w wyniku stymulacji BMDM myszy WT C57BL/6J poprzez FcγR. Zgodnie z oczekiwaniami, w komórkach niestymulowanych obserwujemy minimalne zmiany fluorescencji w kanałach FL1 lub FL2 powyżej poziomu tła (Rysunek 3A, porównać wykresy kropkowe „stained, unstimulated” i „unstained, unstimulated”). Obserwujemy wyraźny wzrost fluorescencji FL1 i FL2, gdy komórki zostaną...

To badanie demonstruje użycie cytometrii przepływowej do wykrywania produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) wynikającej z aktywacji FcγR. Metoda ta może być stosowana do oceny zmian w funkcji sygnalizacji przeciwdrobnoustrojowej i redoks fagocytów w odpowiedzi na kompleksy immunologiczne, opsonizowane mikroorganizmy lub bezpośrednie sieciowanie FcγR.

Pomiar cytometryczny przepływu produkcji ROS w makrofagach w odpowiedzi na sieciowanie FcγR

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Pomiar reaktywnych form tlenu lub ROS jest notorycznie problematyczny. W tym filmie zademonstrujemy powtarzalny pomiar ROS w odpowiedzi na sieciowanie receptora FC-gamma za pomocą sond fluorescencyjnych i cytometrii przepływowej. Głównymi zaletami tej techniki jest powtarzalność testu oraz zastosowanie tej metody ze specyficznymi bodźcami antygenowymi, a nie tylko mitogenami czy znanymi induktorami ROS.Rozregulowana produkcja ROS ma kluczowe znaczenie dla rozwoju wielu chorób, takich jak przewlekła choroba ziarniniakowa lub CGD. Dokładny pomiar ROS może stanowić jeden z elementów diagnostyki molekularnej CGD. Badanie produkcji ROS za pośrednictwem FC jest ważne w badaniu niedoborów odporności, takich jak CGD, ale także w badaniu chorób autoimmunologicznych lub chorób neurodegeneracyjnych, w których zbyt duża ilość ROS prowadzi do stresu oksydacyjnego i stanu zapalnego.Czas wykonania testu ma kluczowe znaczenie. Radziłbym komuś, kto próbuje tego protokołu po raz pierwszy, aby dokładnie się przygotował i przeprowadził próbny eksperyment, jeśli to możliwe. Wizualne zademonstrowanie tej metody ma kluczowe znaczenie dla podkreślenia etapów testu, które wymagają szczególnej uwagi, takich jak czas przeprowadzenia testu.Na początek przygotuj makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego przy użyciu kondycjonowanych pożywek, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. Po zalaniu makrofagów przez noc, odessać supernatant i raz przemyć komórki PBS. Surowica głodzy komórki, zastępując pożywkę tą samą objętością DMEM o niskiej surowicy.Dla każdej myszy jedna płytka zostanie potraktowana anty-BSA IgG1 podczas głodu surowicy, podczas gdy druga pozostanie nieleczona. Dodać tylko DMEM o niskiej surowicy do nieleczonych płytek i dodać DMEM o niskiej surowicy zawierającej 2,5 mikrograma na mililitr mysiego anty-BSA IgG1 do poddanych działaniu substancji płytki. Należy pamiętać o dołączeniu jednej dodatkowej płytki niepoddanej działaniu metody do każdego eksperymentu, która będzie pełnić funkcję kontrolnej kompensacji cytometrii przepływowej.Inkubuj płytki przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2. Podczas czterogodzinnej inkubacji przygotuj 2X roztwór sond reaktywnych form tlenu. Na każde potrzebne 10 mililitrów DMEM o niskiej surowicy dodaj cztery mikrolitry odczynnika do wykrywania stresu oksydacyjnego i cztery mikrolitry odczynnika do wykrywania ponadtlenków.Następnie przygotuj roztwory sondy 2X zawierające tylko odczynnik do wykrywania stresu oksydacyjnego lub zawierające tylko odczynnik do wykrywania ponadtlenkowego. Po czterogodzinnej inkubacji zbierz komórki, delikatnie zeskrobując płytki, zbierając je w oznakowanych, pięciomililitrowych probówkach z okrągłym dnem. Odwirować probówki z prędkością 750 razy g przez pięć minut.Pamiętaj, aby śledzić, które komórki były traktowane mysim anty-BSA IgG1. Następnie umyj granulki komórek dwoma mililitrami PBS, aby pozbyć się wszelkich pozostałości anty-BSA z leczonych komórek. Odwirować probówki z prędkością 750 razy g przez pięć minut.Następnie odessać PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy w 600 mikrolitrach DMEM o niskiej surowicy. Z zawiesiny ogniw o pojemności 600 mikrolitrów wlej 200 mikrolitrów do wstępnie oznaczonych pięciomililitrowych probówek z okrągłym dnem. Z nieleczonych komórek weź 200 mikrolitrów dla probówek oznaczonych jako niestymulowane, 200 mikrolitrów dla probówek oznaczonych jako dodatni induktor i 200 mikrolitrów dla probówek oznaczonych jako dodatni induktor plus inhibitor.Następnie, z komórek traktowanych anty-BSA IgG1, weź 200 mikrolitrów dla probówek oznaczonych jako sieciowanie receptora FC-gamma i 200 mikrolitrów dla probówek oznaczonych FC-gamma receptor sieciowania plus inhibitor. Z nieleczonych komórek, które mają być użyte do kontroli kompensacji, weź 200 mikrolitrów na probówkę oznaczoną jako niebarwiona niestymulowana, 200 mikrolitrów na kontrolę zielonego induktora plus i 200 mikrolitrów na pomarańczową kontrolę induktora. Przygotuj roztwór 2X dodatniego induktora, rozcieńczając pyocyjaninę od 1 do 100 w każdym z 2X roztworów sondy do stężenia 500 mikromolowych.Następnie przygotuj roztwór 2X BSA, rozcieńczając roztwór podstawowy BSA w roztworze sondy 2X, aby uzyskać stężenie 2X wynoszące dwa mikrogramy na mililitr. Przed rozpoczęciem specyficznej stymulacji, takiej jak sieciowanie receptora FC-gamma, upewnij się, że wszystkie odczynniki i komórki są gotowe i umieść probówki na lodzie w kolejności, w jakiej będą stymulowane. W przypadku cytometrów przepływowych z automatycznym podajnikiem próbek należy zwrócić uwagę na czas, w którym cytometr analizuje jedną próbkę i przechodzi do następnej.Pamiętaj, aby uwzględnić wszystkie etapy mieszania i mycia sondy. Czas jest bardzo ważny dla tego testu. Aby każdy stan był dobrze kontrolowany, stymulacja musi być przeprowadzona dokładnie w ciągu 30 minut dla każdego stanu.Stymulować komórki w kolejności i uwzględnić czas opóźnienia między pobraniem próbki za pomocą cytometru przepływowego. Jeśli w tym momencie wykonujesz ręczną kompensację, stymuluj probówki kontrolne, które mają być używane do kompensacji, dodając 200 mikrolitrów roztworu sondy 2X zawierającego odczynnik do wykrywania stresu oksydacyjnego i induktor do probówek oznaczonych na zielono plus induktor. Następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu sondy 2X zawierającego odczynnik do wykrywania ponadtlenków i induktor do probówek oznaczonych na pomarańczowo plus induktor.Inkubuj komórki przez 30 minut w ciemności. Korzystając z oprogramowania do cytometrii przepływowej, wygeneruj i oznacz trzy pliki próbek dla próbek kontrolnych, niebarwionych, niepoddanych obróbce, induktora zielonego plus i induktora pomarańczowego plus, upewniając się, że wskazano kanały i parametry do analizy. Wprowadź również żądane warunki zatrzymania.Po skonfigurowaniu próbek kontrolnych wygeneruj i oznacz podobny zestaw plików dla próbek eksperymentalnych. Teraz uruchom niebarwioną, nieprzetworzoną próbkę. Otwórz wykres punktowy dla rozproszenia do przodu na osi X w porównaniu z rozproszeniem bocznym na osi Y i narysuj bramkę wokół interesujących komórek, z wyłączeniem martwych komórek i szczątków.Następnie użyj bramki tej komórki, aby otworzyć kolejny wykres punktowy pierwszego markera fluorescencji, FL1, na osi X, w porównaniu z drugim markerem fluorescencji, FL2, na osi Y. Narysuj początkową bramkę kwadrantową, a następnie dostosuj bramkę kwadrantu tak, aby zdarzenia pojawiały się w lewym dolnym kwadrancie wykresu FL1 i FL2. Po zakończeniu uruchom próbkę zielonego induktora i induktora.Dostosuj napięcie tak, aby zdarzenia pojawiały się w lewym i prawym dolnym kwadrancie wykresu FL1 i FL2. Następnie zastosuj tę macierz wynagrodzeń do wszystkich trzech przykładowych plików. Teraz uruchom próbkę pomarańczy i induktora.Dostosuj napięcie tak, aby zdarzenia pojawiały się w lewym górnym i dolnym kwadrancie wykresu FL1 w porównaniu z FL2, a następnie zastosuj tę macierz kompensacji do wszystkich trzech przykładowych plików. Sprawdź każdy plik kompensacji i upewnij się, że niezabarwione, nieleczone zdarzenia pojawiają się w lewym dolnym kwadrancie, zielone zdarzenia induktora plus pojawiają się w lewym dolnym i prawym kwadrancie, a pomarańczowe zdarzenia induktora plus pojawiają się w lewym górnym i dolnym kwadrancie wykresu FL1 w porównaniu z FL2. Następnie zastosuj macierz kompensacji do wszystkich plików próbek eksperymentalnych.Po wykonaniu ręcznej kompensacji i uzyskaniu szablonu eksperymentalnego przejdź do próbek eksperymentalnych. Przed potraktowaniem komórek dodatnim induktorem lub przeprowadzeniem stymulacji komórek receptora FC-gamma należy zaznaczyć, które probówki otrzymają inhibitor ROS. Potraktuj te komórki inhibitorem ROS co najmniej 30 minut przed dodatnim induktorem lub stymulacją receptora FC-gamma, dodając jeden mikrolitr inhibitora do 200 mikrolitrów zawieszonych komórek, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu milimolów.W przypadku komórek niestymulowanych należy potraktować komórki 200 mikrolitrami roztworu sondy 2X bez dodawania bodźca do 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej oznaczonej jako barwione, niestymulowane. W przypadku kontroli pozytywnej należy potraktować komórki 200 mikrolitrami roztworu 2X dodatniego induktora do 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej oznaczonej jako dodatni induktor lub dodatni induktor plus inhibitor. Wreszcie, w przypadku komórek stymulowanych sieciowaniem receptora FC-gamma, potraktuj je 200 mikrolitrami roztworu 2X BSA dodanego do 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej oznaczonej sieciowaniem receptora FC-gamma lub sieciowaniem receptora FC-gamma plus inhibitorem.Inkubuj komórki przez 30 minut w ciemności. Po inkubacji należy przeanalizować próbki w kolejności, w jakiej zostały pobudzone, używając cytometru przepływowego i szablonów analitycznych wygenerowanych podczas początkowych etapów kompensacji. Przedstawione dane pokazują cytometryczną detekcję produkcji reaktywnych form tlenu w wyniku stymulacji makrofagów przez receptor FC-gamma.Obserwuje się wyraźny wzrost fluorescencji FL1 i FL2, gdy komórki są stymulowane środkiem sieciującym receptor FC-gamma. Gdy komórki były traktowane inhibitorem reaktywnych form tlenu przed sieciowaniem receptora FC-gamma, ta zwiększona fluorescencja jest przywracana do poziomu podstawowego. W przeciwieństwie do tego, te wykresy punktowe przedstawiają nieudany eksperyment, w którym zaobserwowano nieoptymalną produkcję reaktywnych form tlenu w wyniku stymulacji receptora FC-gamma.Aby podkreślić duże różnice między oczekiwanymi wartościami procentowymi lub wzrostami MIF, dane te pokazują, jak wyglądają próbki z minimalnym wzrostem fluorescencji FL1 i FL2. Obecny protokół wykorzystuje 24-godzinny krok zalewania. Porównując 24-godzinny i 48-godzinny czas zalewania, nie stwierdzono wyraźnej różnicy w odsetku komórek z dodatnim wynikiem dla zielonego odczynnika stresu oksydacyjnego.Jednak wydłużenie czasu przygotowania do 48 godzin zwiększyło odsetek komórek dodatnich dla pomarańczowej fluorescencji. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest planowanie z wyprzedzeniem i konsekwentne określanie czasu testu, aby uzyskać powtarzalne wyniki.

flow-cytometric-measurement-ros-production-macrophages-response-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy użyteczność wielokolorowej cytometrii przepływowej w szczegółowej charakterystyce fenotypowej i funkcjonalnej całkowitych populacji, a także podzbiorów komórek pamięci limfocytów T CD4+ i CD8+ u makaków rhesus, które stanowią idealny model w badaniach nad szczepionkami przeciwko HIV/AIDS.

Wielokolorowe analizy cytometryczne odpowiedzi immunologicznej komórkowej u makaków rezus

Opisano wydajną metodę pozwalającą na wizualizację indukcji sygnalizacji Ca2+ w komórkach śródbłonka wywołanej przez pochodne parakrynne ROS. Metoda ta wykorzystuje pomiar mobilizacji Ca2+ wyzwalanej przez pochodne parakrynne ROS w komórkach śródbłonka naczyniowego w modelu kokultury.

Wizualizacja sygnalizacji wazkularnego Ca2+ wywołanej przez ROS pochodzenia parakrynnego

Ten film prezentuje jednowarstwowy test monocytów wykorzystujący pierwotne monocyty z krwi obwodowej do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ z opsonizowanymi przeciwciałami poli D czerwonych krwinek R2R2.

Test do badania fagocytozy sterowanej receptorem fcγ w monowarstwach monocytów

Tutaj pokazujemy, jak cytometria obrazowa może być wykorzystana do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza w hodowli.  Ta technika może być używana jako alternatywa dla wyliczania CFU.

Zastosowanie cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej.

Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

Ten protokół zapewnia metodę trawienia całych oczu do pojedynczej zawiesiny komórkowej w celu wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływu w celu identyfikacji specyficznych jednojądrzastych populacji fagocytarnych oczu, w tym monocytów, mikrogleju, makrofagów i komórek dendrytycznych.

Trawienie całych oczu myszy do wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływowej fagocytów jednojądrzastych

Ten protokół zapewnia efektywną metodę trawienia kolagenazy do izolacji żywotnych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu - SVF z ludzkiego tłuszczu trzewnego w jednym procesie, w tym metodologię uzyskiwania wysokiej jakości RNA z adipocytów i fenotypyfikację makrofagów SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Praca ta opisuje ustandaryzowany protokół in vitro służący do ilościowego określenia i porównania wskaźników fagocytozy ksenogenicznych (ludzkich) i allogenicznych (szczurów) czerwonych krwinek przez izolowane makrofagi szczurów.

Ilościowa ocena fagocytozy erytrocytów allogenicznych i ksenogenicznych przez makrofagi szczurów in vitro

Poznaj cytometryczną metodę pomiaru produkcji ROS w makrofagach po aktywacji receptorów FcγR. Ta technika umożliwia dokładne badanie stresu oksydacyjnego i reakcji immunologicznych.

Pomiar cytometryczny przepływu produkcji ROS w makrofagach w odpowiedzi na sieciowanie FcγR

Przeglądaj więcej filmów