Name: Wysiew i implantacja biosyntetycznego przeszczepu tchawicy zmodyfikowanego tkankowo w modelu mysim (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj technikę wysiewu i implantacji biosyntetycznego przeszczepu tchawicy w modelu mysim. Metoda ta pozwala badać mechanizmy komórkowe regeneracji tkanek i oceniać wpływ komórek mononuklearnych szpiku kostnego na wyniki przeszczepu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Robertowi Strouse'owi i działowi Badań Informatycznych i Innowacji w Nationwide Children's Hospital za ich wsparcie w projektowaniu graficznym. Prace te zostały wsparte grantem z NIH (NHLBI K08HL138460).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Nationwide Children's Hospital.
1. Produkcja rusztowań
<ol>
	<li>Przygotować roztwór prekursora nanowłókien polimerowych poprzez: 1) rozpuszczenie 8% wag. PET w 1,1,1,3,3,3-heksafluoroizopropanolu i podgrzanie roztworu do temperatury 60 °C oraz 2) rozpuszczenie 3% wag. PU w 1,1,1,3,3,3-heksafluoroizopropanolu w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po schłodzeniu połączyć roztwory, aby stworzyć końcową mieszaninę polimerową PET i PU (20:80).</li>
	<li>Elektrowirować roztwór PET+ PU na pręcie ze stali nierdzewnej (średnica 1 mm) za pomocą igły o końcówce 20G na strzykawce o pojemności 60 ml wypełnionej roztworem PET:PU przy użyciu wysokonapięciowego zasilacza prądu stałego ustawionego na +14 kV na igle, innego wysokonapięciowego zasilacza prądu stałego ustawionego na -3 kV, natężenie przepływu 5 mL/h, i 20-centymetrowa odległość czubka od podłoża. Obracaj pręt z prędkością 350 obr./min podczas osadzania włókien.</li>
	<li>Kontynuuj elektrowirowanie, aż do uzyskania pożądanej grubości ścianki rusztowania 300 μm. Zsuń rusztowanie z pręta, a następnie trzymaj je przez noc w próżni, aby usunąć resztki rozpuszczalnika.</li>
	<li>Przed implantacją wysterylizuj rusztowanie za pomocą dawki światła ultrafioletowego 350 mJ/cm2</li>.
</ol>
2. Zbieranie komórek jednojądrzastych pochodzących ze szpiku kostnego (BM-MNC)
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji 6-8 tygodniową samicę myszy C57BL/6 koktajlem ketaminy (200 mg/kg), ksylazyny (20 mg/kg) i ketoprofenu (10 mg/kg). Sprawdź, czy eutanazja została zakończona metodą szczypania ogona. Pamiętaj, aby postępować zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi eutanazji. </li>
	<li>W sterylnych warunkach usuń skórę z kości udowych i piszczelowych, aby odsłonić kość za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy Micro-Adson. Użyj kleszczy Dumont #5 i kleszczy Dumont #5/45, aby usunąć powięź i ścięgna. Oddziel kości i odetnij każdą z nich na obu końcach. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i igły 25 G przepłukać szpik kostny na szalce Petriego zawierającej 30 ml pożywki Rosewell Park Memorial Institute (RPMI). Przefiltruj ten RPMI ze szpikiem kostnym przez sitko z nylonu o pojemności 70 μm do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego umieść 5 ml polisurkrozy i ditrizoinianu sodu w probówce o pojemności 15 ml. Delikatnie dodaj komórki jednojądrzaste RMMI zawierające szpik kostny z boku probówki, aby uniknąć mieszania się dwóch warstw. Wirować przy 461 x g przez 30 min z "Hamulcem 1" w temperaturze 24 °C. 
	UWAGA: W naszej wirówce hamulec 1 oznacza najdłuższy czas wybiegania podczas zwalniania.</li>
	<li>Z trzech utworzonych warstw odrzuć górną (różową) warstwę osocza i zbierz środkową (przezroczystą) warstwę składającą się z komórek jednojądrzastych szpiku kostnego. Odrzucić osad czerwonych krwinek.</li>
	<li>Rozcieńczyć jednojądrzaste komórki szpiku kostnego (BM-MNC) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w stosunku 1:1 i odwirować przy 461 x g przez 10 minut z "Hamulcem 9" w temperaturze 24 °C.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad i rozcieńczyć osad w 5 ml PBS. Wirować przy 461 x g przez 10 minut z "Hamulcem 9" w temperaturze 24 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i rozcieńczyć osad w ~10 ml RPMI.</li>
	<li>Rozcieńczyć 10 μl roztworu BM-MNC o równej objętości 0,4% błękitu trypanowego w probówce o pojemności 1 ml. Umieścić 10 μl roztworu w szkiełku komory do liczenia komórek. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Powtórz ten krok i oblicz średnią liczbę komórek. 
	UWAGA: Średnią liczbę komórek 1 X 108 komórek uzyskano przy użyciu dwóch myszy dawców. Byłoby to równoznaczne z dwiema kośćmi udowymi i dwiema piszczelami, z których izolowany jest szpik kostny.</li>
	<li>Odwirować roztwór BM-MNC o stężeniu 461 x g przez 10 minut z "Hamulcem 9" w temperaturze 24 °C. Usunąć supernatant i rozcieńczyć stężenie komórek do 107 komórek/przeszczep. 
	UWAGA: Badaliśmy wydajność wysiewu od 1, 10 do 100 milionów komórek i stwierdziliśmy, że 10 milionów komórek na przeszczep daje najwyższą wydajność wysiewu.</li>
</ol>
3. Wysiewanie komórek na przeszczepach
<ol>
	<li>Zmierz długości rusztowań i w razie potrzeby przytnij je na długość 5 mm.</li>
	<li>Wstępnie zwilż rusztowanie 5 μl RPMI przez 5 minut. Usuń RPMI.</li>
	<li>Dodać 5 μl roztworu BM-MNC do światła rusztowania na 10 minut.</li>
	<li>Przepuścić igłę 21G przez światło przeszczepu i inkubować przeszczep w 1000 μl RPMI przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze.</li>
</ol>
4. Implantacja przeszczepu
UWAGA: Należy zachować ostrożność w celu zachowania aseptycznej techniki podczas procedury implantacji przeszczepu.
<ol>
	<li>Użyj 6-8-tygodniowych samic myszy C57BL / 6 jako biorców przeszczepów wysiewanych komórek. Enrofloksacynę (10 mg/kg) wstrzyknąć podskórnie 24 godziny przed zabiegiem i tuż przed nacięciem.</li>
	<li>Zważyć mysz i podać dawkę 0,1 ml/10 g koktajlu znieczulającego składającego się z ketaminy (100 mg/kg), ksylazyny (10 mg/kg) i ketoprofenu (5 mg/kg) jako środka przeciwbólowego dootrzewnowo.</li>
	<li>Sprawdź, czy płaszczyzna znieczulenia została uzyskana metodą szczypania ogona. Po potwierdzeniu poziomu uspokojenia nałóż sterylną maść okulistyczną na oczy i przypnij włosy na miejscu operacyjnym od podbródka do obojczyków. Umieść zwierzę na podkładce w pozycji grzbietowej leżącej. Zdezynfekuj miejsce operowane za pomocą najpierw podkładki przygotowawczej z jodonem powidonu, następnie podkładki nasącej alkoholem (70% alkoholu) i ponownie podkładki przygotowawczej z jodonem powidonu.</li>
	<li>Umieść zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym z głową z dala od chirurga. Wykonaj nacięcie w linii środkowej, od obojczyków do kości gnykowej, za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy Micro-Adson. Wyczyść powięź za pomocą cienkich kleszczyków Dumont #5 i Dumont #7, w razie potrzeby wraz ze sterylnym bawełnianym wacikiem i włóż samozabezpieczający się retraktor Colibri.</li>
	<li>Otwórz mięśnie paska (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3A) za pomocą cienkich kleszczyków Dumont #5 i Dumont #7, aby odsłonić chrząstkę tarczycy, chrząstkę sercową i tchawicę. Tępo oddziel tchawicę od wstecznych nerwów krtaniowych biegnących równolegle po obu stronach, a następnie oddziel tchawicę obwodowo od przełyku (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3B).</li>
	<li>Za pomocą igły 20G i markera chirurgicznego zabarwić przednią część tchawicy.</li>
	<li>Zidentyfikuj tchawicę i wykonaj nacięcie poniżej trzeciego pierścienia chrząstki tchawicy i przeciąć tchawicę za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas-Tubingen i pary cienkich kleszczy Dumont #7. Trzymając go za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczy, przymocuj dystalną tchawicę do mostka za pomocą sterylnego nylonowego szwu 9-0, aby utworzyć tymczasową tracheostomię (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3C). UWAGA: Alternatywnym materiałem do szycia, który można zastosować, jest 9-0 PDS do implantacji tchawicy i reaproksymacji mięśni. </li>
	<li>Za pomocą igły 20G i markera chirurgicznego zabarwić przeszczep tak, aby reprezentował przednią część.</li>
	<li>Wszczepić przeszczep, wprowadzając szwy proksymalne-tylne, proksymalne-boczne i proksymalne-przednie, w tej kolejności, używając sterylnego nylonowego szwu 9-0 (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3D), cienkich kleszczyków Dumont #7 i uchwytu na igłę.</li>
	<li>Obróć zwierzę o 180°, aby odsunąć ogon od chirurga. Zwolnij tymczasową tracheostomię. Dystalna tchawica nie jest całkowicie przecięta, aby umożliwić użycie wyciętego segmentu jako kikuta do retrakcji. Gdy nie jest już potrzebny, segment tchawicy o średnicy 5 mm jest całkowicie usuwany.</li>
	<li>Uzupełnij zespolenie dystalne, zakładając szwy w podobny sposób, jak zespolenie proksymalne.</li>
	<li>Ponownie przybliż pozycję przeszczepu i mięśnie paska. Zamknij nacięcie za pomocą sterylnych nylonowych szwów 9-0 w układzie biegowym.</li>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie 0,1 ml buprenorfiny (0,1 mg/kg) i umieścić zwierzę w klatce ratunkowej umieszczonej na poduszce grzewczej, bez innych zwierząt w klatce.</li>
	<li>Obserwuj mysz, aż stanie się przytomna i będzie w stanie się poruszać, a następnie przenieś ją do nowej klatki z miękką ściółką, wilgotną karmą i wodą leczniczą (ibuprofen, 30 mg/kg) przez 48 godzin. Po tym czasie umieść mysz z powrotem w normalnej klatce z innymi myszami. 
	UWAGA: Myszy, które utrzymują niewydolność oddechową lub zmniejszoną aktywność po implantacji, są obserwowane przez personel laboratoryjny i/lub zwierzęcy w inkubatorze w temperaturze 32 °C. Jeśli trwa to dłużej niż 48 godzin, myszy powinny zostać poddane eutanazji.</li>
</ol>
5. Histologia i immunohistochemia
UWAGA: Barwienie hematoksyliną i eozyną zostało wykonane przy użyciu standardowej techniki przez Nationwide Children's Hospital Morphology Core. Immunohistochemię przeprowadzono zgodnie z poniższymi krokami.
<ol>
	<li>Odparafinować szkiełka za pomocą 1) ksylenu przez 5 min, 2) ksylenu przez 5 min, 3) 100% etanolu przez 5 min, 4) 90% etanolu przez 5 min, 5) 70% etanolu przez 5 min, 6) destylowanego H2O (dH2O) przez 5 min.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w buforze cytrynianowym i umieść w szybkowarze wypełnionym wodą. Podgrzewaj przez 10 minut, a następnie pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Przemyć 0,1% albuminą surowicy bydlęcej w PBS (BSA-PBS) przez 5 min. Płukać za pomocą dH2O. 
	UWAGA: Ogrzewanie można również wykonać za pomocą gorącej kąpieli wodnej lub kuchenki mikrofalowej przez 15 minut.</li>
	<li>Inkubować szkiełka z 3% normalną surowicą kozią w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Myć z 0,1% BSA-PBS przez 5 min. Inkubować w pierwotnym przeciwciałie o stężeniach keratyny 5 (1:1000)6, keratyna 14 (1:250)6 i F4/80 (1:100)7 przez 18 godzin przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć 0,1% BSA-PBS dwa razy przez 10 minut każde pranie. Inkubować z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym w stężeniu 1:500 dla K5/K14 i 1:300 F4/80 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyć 0,1% BSA-PBS dwa razy przez 10 minut każde pranie.</li>
	<li>Mocować za pomocą 4', 6-diamidino-2-fenolindolu (DAPI) zawierającego media montażowe i szkiełka nakrywkowe. Pozostaw na 30 minut przed obrazowaniem.</li>
</ol>

<ol><li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li>
<li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite%3A+A+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li>
<li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based%2C+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child%3A+A+2-year+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li>
<li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li>
<li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li>
<li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+basal+cells%3A+A+facultative+progenitor+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li>
<li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li>
<li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Otolaryngology+-+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li>
<li>Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+in+a+canine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology+-+Head+and+Neck+Surgery+%28United+States%29%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction in a canine model.</a> Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).</li>
<li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li>
<li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pediatric+Otorhinolaryngology%22%5BJournal%5D)">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Opracowanie mysiego modelu tchawicy inżynierii tkankowej ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia czynników, które ograniczyły kliniczne tłumaczenie TETG; mianowicie zapadnięcie się przeszczepu, zwężenie i opóźniona epitelializacja4. Kilka czynników, które przyczyniają się do tych ograniczeń, to wybór materiału do przeszczepu, proces produkcyjny, konstrukcja rusztowania i protokoły wysiewu komórek. Model ten pozwala na szybszą ocenę tych czynników w celu zrozumienia wpływających na nie mechanizmów ...

Długosegmentowe wady tchawicy mogą występować jako rzadkie choroby wrodzone, takie jak pełne pierścienie tchawicy i agenezja tchawicy, a także uraz, nowotwór złośliwy i infekcja. W przypadku przekroczenia 6 cm u dorosłych lub 30% długości tchawicy u dzieci wady te nie mogą być leczone za pomocą rekonstrukcji chirurgicznej. Próby zastąpienia dróg oddechowych tkankami autologicznymi, przeszczepami zwłok i sztucznymi konstruktami były nękane przewlekłymi infekcjami, ziarninacją, awariami mechanicznymi i zwężeniem.
Przeszczepy tchawicy wykonane inżynierią tkankową (TETG) mogą potencjalnie rozwiązać te problemy, unikając jednocześnie konieczności dożywotniej immunosupresji. W ciągu ostatniej dekady TETG były testowane na modelach zwierzęcych i wykorzystywane klinicznie w rzadkich przypadkach stosowania ze względów humanitarnych1,2,3. Zarówno w badaniach klinicznych, jak i na dużych zwierzętach, rekonwalescencja pooperacyjna po wymianie dróg oddechowych za pomocą inżynierii tkankowej wymagała licznych interwencji w celu zwalczania zwężenia (zdefiniowanego jako zwężenie światła o >50%) i utrzymania drożności dróg oddechowych. Dodatkowe prace TETG miały na celu zmniejszenie tego zwężenia poprzez ocenę roli wyboru wysiewu komórek, unaczynienia i konstrukcji rusztowania. Wybór wysiewu komórek i projektowanie rusztowań mających na celu przywrócenie natywnej struktury/funkcji tchawicy koncentrowało się głównie na komórkach nabłonka oddechowego i chondrocytach wysiewanych na różnych resorbowalnych, nieresorbowalnych i bezkomórkowych rusztowaniach. Ponieważ unaczynienie prawdopodobnie odgrywa główną rolę w rozwoju zwężenia, inne grupy skupiły się na optymalizacji modeli in vitro lub heterotopowych w celu przyspieszenia rewaskularyzacji lub neoangiogenezy4. Niemniej jednak osiągnięcie udanego unaczynienia przy jednoczesnym utrzymaniu kompetentnego mechanicznie i funkcjonalnego TETG pozostaje wyzwaniem. Pomimo najnowszych postępów, minimalizacja zwężenia pozostaje krytyczną przeszkodą w translacji klinicznej.
Aby zbadać tę histopatologiczną odpowiedź na implantację TETG in vivo, opracowaliśmy owczy model wymiany tchawicy metodą inżynierii tkankowej. Przeszczep składał się z mieszanego rusztowania elektroprzędzonego z politereftalanu etylenu (PET) i poliuretanu (PU) obsianego komórkami jednojądrzastymi pochodzącymi ze szpiku kostnego (BM-MNC). W tej małej kohorcie wykazaliśmy, że wysiewane autologiczne BM-MNC przyspieszają reepitelializację i opóźniają zwężenie5. Chociaż wysiewanie autologicznymi BM-MNC poprawiło przeżywalność, mechanizm komórkowy, za pomocą którego BM-MNC modulują tworzenie funkcjonalnej tkanki nowotworowej, pozostaje niejasny.
Badanie na poziomie komórkowym wymagało opracowania mysiego modelu wymiany tchawicy za pomocą inżynierii tkankowej. Podobnie jak w badaniu owiec, wykorzystaliśmy rusztowanie elektroprzędzone PET:PU wysiane BM-MNC. Zgodnie z modelem owczym, zwężenie TETG rozwinęło się w ciągu pierwszych dwóch tygodni po implantacji1,2,3,5. Sugerowało to, że mysi model podsumowuje zaobserwowaną wcześniej patologię, umożliwiając nam dalsze badanie mechanizmów komórkowych leżących u podstaw zwężenia dróg oddechowych.
W tym raporcie szczegółowo opisujemy nasz protokół wymiany tchawicy metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim, w tym produkcję rusztowań, izolację BM-MNC, wysiewanie przeszczepów i implantację (Rysunek 1, Rysunek 2).

<table><tbody><tr><td>0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-186-10</td><td></td></tr><tr><td>10cc pipeta serologiczna</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>18G 1,5 cala. Igła</td><td>BD</td><td>305190</td><td></td></tr><tr><td>1mL Strzykawka</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa Corning</td><td></td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>25cc pipeta serologiczna</td><td>Falcon</td><td>356535</td><td></td></tr><tr><td>25G 1in. Igła</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>rurka 50cc</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki nasączone alkoholem</td><td>Fisher Healthcare</td><td>NDC 69250-661-02</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Baytrilu (enrofloksacyna)</td><td>Bayer Healthcare, LLC</td><td>NDC 0859-2267-01</td><td></td></tr><tr><td>poliamidowy szew monofilamentowy, 9-0</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>T05A09N10-13</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/ 6, żeńskie</td><td>laboratoria Jacksona</td><td>664</td><td>6-8 tygodni</td></tr><tr><td>Bufor cytrynianowy pH 6,0 20x koncentrat</td><td>ThermoFisher</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Retraktory Colibri</td><td>FST</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Fisher scientific</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratyna 14 Przeciwciało monoklonalne</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-11599</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Kleszcze</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 - Kleszcze cienkie</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 Szczurze przeciwciało przeciw myszom</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA497R</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma</td><td>10831-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki - ostre-</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Okulary ochronne Fisherbrand Premium</td><td>ThermoFisher</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield Media montażowe z DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td></td></tr><tr><td>Kozio-anty myszy IgG Wtórne przeciwciało Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Kozio-anty królik IgG Przeciwciało wtórne Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Kozio-anty szczury IgG wtórne Przeciwciało Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofen</td><td>Precision Dose, Inc</td><td>NDC 68094-494-59</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki do przygotowania jodu</td><td>Profesjonalne jednorazówki międzynarodowe, Inc.</td><td>NDC 10819-3883-1</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne keratyny 5, oczyszczone</td><td>BioLegend</td><td>905501</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwań</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Micro-Adson</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Gąbki włókninowe</td><td>Covidien</td><td>441401</td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Dechra Produkty weterynaryjne</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PET/PU (polietylen Tereftalan & Rusztowania poliuretanowe)</td> Rozwiązania <td></td><td>z nanowłókien</td><td>Na zamówienie</td></tr> szalka <tr><td>Petriego</td><td>BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>TISH Uchwyt na igły/kleszcze</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>Trymer</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; Nożyczki sprężynowe bingen</td><td>FST</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>Recyrkulator ciepłej wody</td><td>Gaymar</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny roztwór ksylazyny</td><td>Akorn zdrowie zwierząt</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

wysiew i implantacja biosyntetycznego przeszczepu tchawicy zmodyfikowanego tkankowo w modelu mysim

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Opcje leczenia wrodzonych lub wtórnych wad tchawicy długosegmentowej były historycznie ograniczone z powodu niemożności zastąpienia funkcjonalnej tkanki. Inżynieria tkankowa jest bardzo obiecująca jako potencjalne rozwiązanie dzięki swojej zdolności do integracji komórek i cząsteczek sygnałowych w trójwymiarowym rusztowaniu. Niedawne prace nad przeszczepami tchawicy (TETG) odniosły pewien sukces, ale ich translacja była ograniczona przez zwężenie przeszczepu, zapadanie się przeszczepu i opóźnioną epitelializację. Aby zbadać mechanizmy napędzające te problemy, opracowaliśmy mysi model do implantacji przeszczepu tchawicy za pomocą inżynierii tkankowej. TETG zostały zbudowane z elektroprzędzonych polimerów: politereftalanu etylenu (PET) i poliuretanu (PU) w mieszaninie PET i PU (20:80 procent masy). Rusztowania wysiewano następnie przy użyciu komórek jednojądrzastych szpiku kostnego wyizolowanych od 6-8 tygodniowych myszy C57BL/6 przez wirowanie gradientowe. Dziesięć milionów komórek na przeszczep wysiewano na światło rusztowania i pozostawiono do inkubacji przez noc przed implantacją między trzecim a siódmym pierścieniem tchawicy. Przeszczepy te były w stanie podsumować wyniki zwężenia i opóźnionej epitelializacji, jak wykazano w analizie histologicznej i braku Keratyny 5 i Keratyny 14 podstawowych komórek nabłonka w immunofluorescencji. Model ten posłuży jako narzędzie do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych zaangażowanych w przebudowę gospodarza.

Rysunek 1 przedstawia schemat zasiewania i implantacji TETG. Szpik kostny pobrano od myszy C57BL/6 i hodowano in vitro. Mononuklearne komórki szpiku kostnego (BM-MNCs) wyizolowano metodą wirowania gęstościowego i zasiano na TETG. Zasiane TETG zaimplantowano syngeneicznej myszy biorcy C57BL/6.
Rysunek 2 przedstawia schemat procesu produkcji rusztowania TETG z PE...

Zwężenie przeszczepu stanowi krytyczną przeszkodę w wymianie dróg oddechowych za pomocą inżynierii tkankowej. Aby zbadać mechanizmy komórkowe leżące u podstaw zwężenia, wykorzystujemy mysi model wymiany tchawicy za pomocą inżynierii tkankowej z wysiewanymi komórkami jednojądrzastymi szpiku kostnego (BM-MNC). Tutaj szczegółowo opisujemy nasz protokół, w tym produkcję rusztowań, izolację BM-MNC, siew przeszczepu i implantację.

Wysiew i implantacja biosyntetycznego przeszczepu tchawicy zmodyfikowanego tkankowo w modelu mysim

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Kliniczne zastosowania tchawicy inżynierii tkankowej były ograniczone ze względu na zwężenie przeszczepu i opóźnioną epitelializację. Mysi model ortotopowej wymiany tchawicy pozwala na badanie mechanizmów komórkowych napędzających regenerację. Długoodcinkowe wady dróg oddechowych mogą przekraczać to, co obecne terapie są w stanie wyleczyć.Tchawica wykonana metodą inżynierii tkankowej daje możliwość stworzenia narządu zastępczego dla tych schorzeń. Model ten można zastosować do zwierząt o właściwościach transgenicznych i śledzeniu linii. Następnie możemy modulować czynniki gospodarza przyczyniające się do regeneracji przeszczepu.Jednym z kluczowych wyzwań przy produkcji rusztowań będzie pomiar i określenie, czy parametry elektroprzędzenia są za każdym razem takie same. Dlatego za każdym razem, gdy produkujesz rusztowanie, musisz zmierzyć odległość od końcówki do kolektora, wilgotność i temperaturę, aby upewnić się, że rusztowania są takie same za każdym razem. Kluczowe znaczenie dla sukcesu tego modelu ma udoskonalenie technik mikrochirurgicznych i utrzymanie prawidłowej płaszczyzny znieczulenia, aby umożliwić spontaniczną wentylację podczas całego zabiegu.Ponieważ tchawica gospodarza ma średnicę wewnętrzną około jednego milimetra, obchodzenie się z przeszczepem i tkanką natywną oraz zakładanie szwów są ważne i najlepiej pokazane wizualnie. Zacznij od rozpuszczenia ośmioprocentowego politereftalanu etylenu lub PET w heksafluoroizopropanolu i podgrzania powstałego roztworu do 60 stopni Celsjusza. Podczas podgrzewania roztworu rozpuść trzy procent wagowe poliuretanu lub PU w heksafluoroizopropanolu, łącząc roztwory po ostygnięciu roztworu PET.Załaduj 60-mililitrową strzykawkę wyposażoną w igłę o końcówce w rozmiarze 20 z mieszanką polimerów. Użyj strzykawki i zasilacza prądu stałego wysokiego napięcia ustawionego na dodatnie 14 kilowoltów na igle, innego zasilacza prądu stałego wysokiego napięcia ustawionego na minus trzy kilowolty, natężenie przepływu pięć mililitrów na godzinę i 20-centymetrową odległość od końcówki do podłoża, aby elektrowirować polimer na pręcie ze stali nierdzewnej o średnicy jednego milimetra, obracanym z prędkością 350 obrotów na minutę. Kontynuuj elektroprzędzenie, aż do uzyskania grubości ścianki rusztowania wynoszącej 300 mikrometrów.Następnie zsuń rusztowanie z pręta, umieść rusztowanie pod próżnią na noc, aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika i wysterylizuj rusztowanie światłem ultrafioletowym w dawce 350 milidżuli na centymetr kwadratowy przez około 15 minut. W sterylnych warunkach usuń skórę z tylnych kończyn sześcio- do ośmiotygodniowej samicy myszy C57-Black/6 za pomocą cienkich nożyczek i kleszczyków Micro-Adson, a następnie użyj kleszczyków Dumont numer pięć i kleszczy Dumont numer 5/45 do usunięcia powięzi i ścięgien. Oddziel kości, aby umożliwić przecięcie każdej z nich na obu końcach, i użyj pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25, aby przepłukać szpik kostny na szalkę Petriego zawierającą 30 mililitrów pożywki RPMI.Kiedy wszystkie kości zostaną przepłukane, przefiltruj szpik kostny przez 70-mikrometrowe nylonowe sitko do komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki i przenieś probówkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie dodaj przefiltrowany roztwór komórek jednojądrzastych wzdłuż boku 15-mililitrowej probówki zawierającej pięć mililitrów polisacharozy i ditrizoinianu sodu bez mieszania warstw i oddziel osocze od białych i czerwonych krwinek przez separację gradientu gęstości. Pod koniec wirowania zebrać środkową przezroczystą warstwę składającą się z komórek jednojądrzastych szpiku kostnego i przepłukać komórki jednojądrzaste szpiku kostnego w stosunku jeden do jednego w PBS przez odwirowanie.Ponownie zawiesić granulkę w pięciu mililitrach PBS do drugiego prania, a następnie ponownie zawiesić w 10 mililitrach świeżej pożywki RPMI w celu policzenia. Następnie zbierz komórki za pomocą dodatkowego odwirowania i rozcieńcz komórki do jednego razy 10 do siedmiu komórek na pięć mikrolitrów świeżego stężenia RPMI. Przed wysianiem rusztowania przytnij polimer do długości pięciu milimetrów, jeśli to konieczne, i zwilż rusztowanie pięcioma mikrolitrami pożywki RPMI przez pięć minut.Pod koniec inkubacji usunąć nadmiar pożywki i obciążyć światło rusztowania pięcioma mikrolitrami roztworu komórek jednojądrzastych szpiku kostnego na 10 minut. Następnie włóż igłę o rozmiarze 21 przez światło rusztowania i umieść przeszczep w jednym mililitrze pożywki RPMI na noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po indukcji znieczulenia ogólnego należy potwierdzić brak reakcji na uszczypnięcie palca u zwierzęcia biorcy i nałożyć maść na oczy zwierzęcia.Przytnij włosy na miejscu operacji od podbródka do obojczyków i umieść zwierzę na podkładce chirurgicznej w pozycji grzbietowej leżącej. Stosując technikę aseptyczną, zdezynfekuj miejsce operacyjne sekwencyjną serią chusteczek z powidonem-jodem, 70% etanolem, powidonem i jodem i przesuń mysz pod mikroskopem preparacyjnym z głową na godzinie 12. Użyj cienkich nożyczek i kleszczyków Micro-Adson, aby wykonać nacięcie linii środkowej od obojczyków do kości gnykowej, a także użyj cienkich kleszczy Dumont numer pięć i numer siedem oraz sterylnego bawełnianego wacika do oczyszczenia powięzi przed włożeniem samozabezpieczającego się retraktora Colibri do nacięcia.Użyj kleszczy, aby otworzyć mięśnie paska, aby odsłonić chrząstkę tarczycy, chrząstkę sercowatą i tchawicę, a następnie tępo oddzielić tchawicę od wstecznych nerwów krtaniowych biegnących równolegle po obu stronach tkanki, a następnie obwodowe oddzielenie tchawicy od przełyku. Za pomocą igły o rozmiarze 20 i markera chirurgicznego zabarwić przednią część tchawicy. Wykonaj nacięcie poniżej trzeciego pierścienia chrząstki tchawicy za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas-Tubingen i pary cienkich kleszczy Dumonta numer siedem, aby wyciąć trzypierścieniowy odcinek tchawicy.Trzymając tchawicę za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczy, użyj sterylnego nylonowego szwu 9-0, aby przymocować dystalny koniec tchawicy do mostka, aby utworzyć tymczasową tracheostomię, a następnie użyj igły o rozmiarze 20 i markera chirurgicznego, aby zabarwić przednią część przeszczepu. Aby wszczepić przeszczep, użyj sterylnego nylonowego szwu 9-0, siedmiu cienkich kleszczy Dumonta i uchwytu igły, aby wprowadzić szwy proksymalno-tylne, proksymalne-boczne i proksymalno-przednie i obrócić zwierzę o 180 stopni. Gdy mysz znajdzie się na swoim miejscu, zwolnij tymczasową tracheostomię i wykonaj boczne nacięcie w odległości pięciu milimetrów od przedniej części przeszczepu, aby ułatwić zespolenie dystalne.Aby wykonać zespolenie dystalne, należy założyć szwy w podobny sposób jak zespolenie proksymalne, a następnie ponownie przybliżyć pozycję przeszczepu i mięśnie paska. Następnie zamknij nacięcie sterylnymi nylonowymi szwami 9-0 w układzie biegowym i umieść zwierzę samo w klatce regeneracyjnej umieszczonej na poduszce grzewczej z monitorowaniem do pełnego wyzdrowienia. Dwa tygodnie po implantacji można zaobserwować kilka komórek nabłonka podstawnego poprzez barwienie keratyną podstawnokomórkową 5 i 14 w skrawkach tkanki przeszczepu tchawicy.Komórki podstawne są również wykrywane na powierzchni światła przeszczepu po siedmiu dniach od implantacji. Po eksplantacji i analizie histologicznej zwężenie przeszczepu zostało zidentyfikowane jako główny czynnik przyczyniający się do myszy z implantem przeszczepu wykazujących oznaki niewydolności oddechowej i stridoru. Należy pamiętać, że teleskopowanie przeszczepu i natywnej tchawicy jest częstym zjawiskiem w wyniku techniki chirurgicznej.Barwienie dla F4/80 ujawnia makrofagi gospodarza w obszarze zwężenia przeszczepu w połączeniu z obecnością komórek nabłonka podstawnego. Unikaj manipulacji nerwami krtaniowymi wstecznymi i upewnij się, że szwy proksymalne i dystalne są na swoim miejscu, aby umożliwić hermetyczne uszczelnienie w zespoleniu. Ponieważ protokół ten dotyczy komórek jednojądrzastych szpiku kostnego pochodzących od myszy z czynnikiem bezpieczeństwa biologicznego pierwszego, ważne jest, aby nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, aby uniknąć zanieczyszczenia.

seeding-implantation-biosynthetic-tissue-engineered-tracheal-graft

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Stale dokonuje się znaczących przełomów w identyfikacji komórek macierzystych. Aby jednak przełożyć te odkrycia na praktykę, konieczne jest opracowanie nowych metod dostarczania komórek. W niniejszej pracy wykazuję, że drogi oddechowe stanowią bezpieczną drogę transplantacji komórek macierzystych do płuc.

Tracheotomia: Metoda transplantacji komórek macierzystych do płuc

W niniejszym filmie przedstawiono i porównano dwa modele eksperymentalne służące do badania rozwoju obliteracyjnej choroby dróg oddechowych (OAD) u myszy: model heterotopowej oraz ortotopowej transplantacji tchawicy.

Heterotopowe i ortotopowe przeszczepy tchawicy u myszy wykorzystywane jako modele do badania rozwoju obliteracyjnej choroby dróg oddechowych

Aby poszerzyć naszą wiedzę na temat komórkowego i molekularnego tworzenia się nowotworów, niedawno opracowano mysi model TEVG. Przeszczepy wszczepiono jako przeszczepy z interpozycją żyły głównej podnerkowej u myszy C57BL/6. Model ten osiąga wyniki podobne do tych osiągniętych w naszym badaniu klinicznym, ale w znacznie krótszym czasie.

Implantacja przeszczepu interpozycji żyły głównej dolnej w modelu mysim

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Zwężenie krtani i tchawicy wynika z patologicznego osadzania się blizn, które krytycznie zwężają drogi oddechowe tchawicy i nie mają skutecznych terapii medycznych. Stosując stent PLLA-PCL (70% poli-L-laktydu i 30% polikaprolaktonu) jako miejscowy system dostarczania leków, można badać potencjalne terapie mające na celu zmniejszenie proliferacji blizn w tchawicy.

Projekt biokompatybilnego stentu tchawicy uwalniającego leki u myszy ze zwężeniem krtani i tchawicy

Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

Celem tego manuskryptu jest opisanie mikrochirurgicznych kroków wymaganych do przeprowadzenia heterotopowego przeszczepu krtani u myszy. Zaletami tego mysiego modelu w porównaniu z innymi zwierzęcymi modelami przeszczepu krtani są jego opłacalność oraz dostępność testów i danych immunologicznych.

Heterotopowy model myszy do badania przeszczepu krtani

Model mysiego przeszczepu wewnątrzpłucnego tchawicy (IPTT) jest cenny do badania choroby zarostowej dróg oddechowych (OAD) po przeszczepie płuc. Oferuje wgląd w specyficzne dla płuc zachowania immunologiczne i angiogenne w znoszeniu dróg oddechowych po allotransplantacji z wysoką odtwarzalnością. W tym miejscu opisujemy procedurę IPTT i jej oczekiwane efekty.

Mysi przeszczep wewnątrzpłucnej tchawicy: model do badania choroby zarostowej dróg oddechowych po przeszczepie płuc

Ten artykuł opisuje, jak stworzyć bioinżynieryjne płuca myszy za pomocą metod decelularyzacji i recelularyzacji. Zawiera również szczegółowe informacje na temat późniejszego ortotopowego przeszczepu płuc.

Przeszczep bioinżynieryjnego płuca przy użyciu pozbawionych komórek płuc myszy i pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka

Tutaj przedstawiono protokół implantacji przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej do tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej, dostarczając odpowiedniego modelu zwierzęcego do badania mechanizmów regeneracji tkanki naczyniowej.

Implantacja przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej

Poznaj technikę wysiewu i implantacji biosyntetycznego przeszczepu tchawicy w modelu mysim. Metoda ta pozwala badać mechanizmy komórkowe regeneracji tkanek i oceniać wpływ komórek mononuklearnych szpiku kostnego na wyniki przeszczepu.

Wysiew i implantacja biosyntetycznego przeszczepu tchawicy zmodyfikowanego tkankowo w modelu mysim

Przeglądaj więcej filmów