Wysiew i implantacja biosyntetycznego przeszczepu tchawicy zmodyfikowanego tkankowo w modelu mysim

Kliniczne zastosowania tchawicy inżynierii tkankowej były ograniczone ze względu na zwężenie przeszczepu i opóźnioną epitelializację. Mysi model ortotopowej wymiany tchawicy pozwala na badanie mechanizmów komórkowych napędzających regenerację. Długoodcinkowe wady dróg oddechowych mogą przekraczać to, co obecne terapie są w stanie wyleczyć.

Tchawica wykonana metodą inżynierii tkankowej daje możliwość stworzenia narządu zastępczego dla tych schorzeń. Model ten można zastosować do zwierząt o właściwościach transgenicznych i śledzeniu linii. Następnie możemy modulować czynniki gospodarza przyczyniające się do regeneracji przeszczepu.

Jednym z kluczowych wyzwań przy produkcji rusztowań będzie pomiar i określenie, czy parametry elektroprzędzenia są za każdym razem takie same. Dlatego za każdym razem, gdy produkujesz rusztowanie, musisz zmierzyć odległość od końcówki do kolektora, wilgotność i temperaturę, aby upewnić się, że rusztowania są takie same za każdym razem. Kluczowe znaczenie dla sukcesu tego modelu ma udoskonalenie technik mikrochirurgicznych i utrzymanie prawidłowej płaszczyzny znieczulenia, aby umożliwić spontaniczną wentylację podczas całego zabiegu.

Ponieważ tchawica gospodarza ma średnicę wewnętrzną około jednego milimetra, obchodzenie się z przeszczepem i tkanką natywną oraz zakładanie szwów są ważne i najlepiej pokazane wizualnie. Zacznij od rozpuszczenia ośmioprocentowego politereftalanu etylenu lub PET w heksafluoroizopropanolu i podgrzania powstałego roztworu do 60 stopni Celsjusza. Podczas podgrzewania roztworu rozpuść trzy procent wagowe poliuretanu lub PU w heksafluoroizopropanolu, łącząc roztwory po ostygnięciu roztworu PET.

Załaduj 60-mililitrową strzykawkę wyposażoną w igłę o końcówce w rozmiarze 20 z mieszanką polimerów. Użyj strzykawki i zasilacza prądu stałego wysokiego napięcia ustawionego na dodatnie 14 kilowoltów na igle, innego zasilacza prądu stałego wysokiego napięcia ustawionego na minus trzy kilowolty, natężenie przepływu pięć mililitrów na godzinę i 20-centymetrową odległość od końcówki do podłoża, aby elektrowirować polimer na pręcie ze stali nierdzewnej o średnicy jednego milimetra, obracanym z prędkością 350 obrotów na minutę. Kontynuuj elektroprzędzenie, aż do uzyskania grubości ścianki rusztowania wynoszącej 300 mikrometrów.

Następnie zsuń rusztowanie z pręta, umieść rusztowanie pod próżnią na noc, aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika i wysterylizuj rusztowanie światłem ultrafioletowym w dawce 350 milidżuli na centymetr kwadratowy przez około 15 minut. W sterylnych warunkach usuń skórę z tylnych kończyn sześcio- do ośmiotygodniowej samicy myszy C57-Black/6 za pomocą cienkich nożyczek i kleszczyków Micro-Adson, a następnie użyj kleszczyków Dumont numer pięć i kleszczy Dumont numer 5/45 do usunięcia powięzi i ścięgien. Oddziel kości, aby umożliwić przecięcie każdej z nich na obu końcach, i użyj pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25, aby przepłukać szpik kostny na szalkę Petriego zawierającą 30 mililitrów pożywki RPMI.

Kiedy wszystkie kości zostaną przepłukane, przefiltruj szpik kostny przez 70-mikrometrowe nylonowe sitko do komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki i przenieś probówkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie dodaj przefiltrowany roztwór komórek jednojądrzastych wzdłuż boku 15-mililitrowej probówki zawierającej pięć mililitrów polisacharozy i ditrizoinianu sodu bez mieszania warstw i oddziel osocze od białych i czerwonych krwinek przez separację gradientu gęstości. Pod koniec wirowania zebrać środkową przezroczystą warstwę składającą się z komórek jednojądrzastych szpiku kostnego i przepłukać komórki jednojądrzaste szpiku kostnego w stosunku jeden do jednego w PBS przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić granulkę w pięciu mililitrach PBS do drugiego prania, a następnie ponownie zawiesić w 10 mililitrach świeżej pożywki RPMI w celu policzenia. Następnie zbierz komórki za pomocą dodatkowego odwirowania i rozcieńcz komórki do jednego razy 10 do siedmiu komórek na pięć mikrolitrów świeżego stężenia RPMI. Przed wysianiem rusztowania przytnij polimer do długości pięciu milimetrów, jeśli to konieczne, i zwilż rusztowanie pięcioma mikrolitrami pożywki RPMI przez pięć minut.

Pod koniec inkubacji usunąć nadmiar pożywki i obciążyć światło rusztowania pięcioma mikrolitrami roztworu komórek jednojądrzastych szpiku kostnego na 10 minut. Następnie włóż igłę o rozmiarze 21 przez światło rusztowania i umieść przeszczep w jednym mililitrze pożywki RPMI na noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po indukcji znieczulenia ogólnego należy potwierdzić brak reakcji na uszczypnięcie palca u zwierzęcia biorcy i nałożyć maść na oczy zwierzęcia.

Przytnij włosy na miejscu operacji od podbródka do obojczyków i umieść zwierzę na podkładce chirurgicznej w pozycji grzbietowej leżącej. Stosując technikę aseptyczną, zdezynfekuj miejsce operacyjne sekwencyjną serią chusteczek z powidonem-jodem, 70% etanolem, powidonem i jodem i przesuń mysz pod mikroskopem preparacyjnym z głową na godzinie 12. Użyj cienkich nożyczek i kleszczyków Micro-Adson, aby wykonać nacięcie linii środkowej od obojczyków do kości gnykowej, a także użyj cienkich kleszczy Dumont numer pięć i numer siedem oraz sterylnego bawełnianego wacika do oczyszczenia powięzi przed włożeniem samozabezpieczającego się retraktora Colibri do nacięcia.

Użyj kleszczy, aby otworzyć mięśnie paska, aby odsłonić chrząstkę tarczycy, chrząstkę sercowatą i tchawicę, a następnie tępo oddzielić tchawicę od wstecznych nerwów krtaniowych biegnących równolegle po obu stronach tkanki, a następnie obwodowe oddzielenie tchawicy od przełyku. Za pomocą igły o rozmiarze 20 i markera chirurgicznego zabarwić przednią część tchawicy. Wykonaj nacięcie poniżej trzeciego pierścienia chrząstki tchawicy za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas-Tubingen i pary cienkich kleszczy Dumonta numer siedem, aby wyciąć trzypierścieniowy odcinek tchawicy.

Trzymając tchawicę za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczy, użyj sterylnego nylonowego szwu 9-0, aby przymocować dystalny koniec tchawicy do mostka, aby utworzyć tymczasową tracheostomię, a następnie użyj igły o rozmiarze 20 i markera chirurgicznego, aby zabarwić przednią część przeszczepu. Aby wszczepić przeszczep, użyj sterylnego nylonowego szwu 9-0, siedmiu cienkich kleszczy Dumonta i uchwytu igły, aby wprowadzić szwy proksymalno-tylne, proksymalne-boczne i proksymalno-przednie i obrócić zwierzę o 180 stopni. Gdy mysz znajdzie się na swoim miejscu, zwolnij tymczasową tracheostomię i wykonaj boczne nacięcie w odległości pięciu milimetrów od przedniej części przeszczepu, aby ułatwić zespolenie dystalne.

Aby wykonać zespolenie dystalne, należy założyć szwy w podobny sposób jak zespolenie proksymalne, a następnie ponownie przybliżyć pozycję przeszczepu i mięśnie paska. Następnie zamknij nacięcie sterylnymi nylonowymi szwami 9-0 w układzie biegowym i umieść zwierzę samo w klatce regeneracyjnej umieszczonej na poduszce grzewczej z monitorowaniem do pełnego wyzdrowienia. Dwa tygodnie po implantacji można zaobserwować kilka komórek nabłonka podstawnego poprzez barwienie keratyną podstawnokomórkową 5 i 14 w skrawkach tkanki przeszczepu tchawicy.

Komórki podstawne są również wykrywane na powierzchni światła przeszczepu po siedmiu dniach od implantacji. Po eksplantacji i analizie histologicznej zwężenie przeszczepu zostało zidentyfikowane jako główny czynnik przyczyniający się do myszy z implantem przeszczepu wykazujących oznaki niewydolności oddechowej i stridoru. Należy pamiętać, że teleskopowanie przeszczepu i natywnej tchawicy jest częstym zjawiskiem w wyniku techniki chirurgicznej.

Barwienie dla F4/80 ujawnia makrofagi gospodarza w obszarze zwężenia przeszczepu w połączeniu z obecnością komórek nabłonka podstawnego. Unikaj manipulacji nerwami krtaniowymi wstecznymi i upewnij się, że szwy proksymalne i dystalne są na swoim miejscu, aby umożliwić hermetyczne uszczelnienie w zespoleniu. Ponieważ protokół ten dotyczy komórek jednojądrzastych szpiku kostnego pochodzących od myszy z czynnikiem bezpieczeństwa biologicznego pierwszego, ważne jest, aby nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, aby uniknąć zanieczyszczenia.