Zdalne zarządzanie laboratorium: diagnostyka wirusów układu oddechowego

Wzrost liczby niedawnych epidemii, takich jak wirus Zika i Ebola, uwypuklił potrzebę bardziej skoordynowanej i elastycznej reakcji w skali globalnej. Aby to osiągnąć, zaprojektowaliśmy innowacyjną, skalowalną, intramodalną jednostkę laboratoryjną, która może być używana na obszarach o ograniczonych zasobach na całym świecie podczas takich epidemii. Prezentujemy tutaj nasze intramodalne, rozbudowywalne, mobilne laboratoria kontenerów morskich.

W poniższym artykule przedstawiamy nasze podejście BSL-2 i BSL-3 do diagnostyki wirusa grypy układu oddechowego. Szybka diagnostyka wirusa grypy metodą RCT-PCR. Przed przygotowaniem się do wejścia do zainstalowanej jednostki laboratoryjnej należy pamiętać, że należy wziąć pod uwagę wszystkie wymagania bezpieczeństwa BSL-2.

Obejmuje to ubieranie się w odpowiednie środki ochrony osobistej, mycie rąk, noszenie rękawiczek i odkażanie wszelkich miejsc pracy, z których planujesz korzystać. Uwaga, jeśli używasz wybielacza do odkażania miejsca pracy i materiałów eksploatacyjnych, musisz również użyć 70% etanolu do czyszczenia wszystkich obszarów narażonych na działanie wybielacza, ponieważ wybielacz może mieszać się z innymi chemikaliami w miejscu pracy, tworząc toksyczne opary. Wszystkie wybielacze należy wyrzucić do wyznaczonego pojemnika na odpady.

Podczas pobierania wymazów od pacjentów, są one transportowane do placówki laboratoryjnej z terenu lub kliniki i przekazywane technikowi laboratoryjnemu przez okienko przejściowe. Tego okna nie można otworzyć z obu stron. W okienku przejściowym BSL-2 zewnętrzna powierzchnia probówek zawierających próbki musi być całkowicie zdezynfekowana wybielaczem i pozostawiona w spokoju na dwie minuty.

Otwórz okno przejściowe i zbierz próbki, które mają zostać zarejestrowane. Wytrzyj wszelkie próbki, które zawierają resztki wybielacza, i wytrzyj wnętrze okienka przepustowego wybielaczem, a następnie 70% roztworem etanolu. Dodaj kody kreskowe do każdej probówki z próbką i cztery puste probówki przeznaczone na podwielokrotności.

Przenieś próbki do okapu wentylacyjnego. Zeskanuj kod kreskowy na każdej probówce i upewnij się, że na ekranie tabletu lub laptopa pojawiają się właściwe informacje identyfikujące próbkę. Zakończ proces rejestracji.

Przykładowa podwielokrotność. Po oznakowaniu probówek należy użyć certyfikowanej i odkażonej komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II, aby pobrać porcje próbek. Podczas pobierania podwielokrotności należy używać świeżych, sterylnych lub jednorazowych pipet do każdej próbki i wyrzucać je do pojemników na odpady niebezpieczne biologicznie, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.

Upewnij się, że każda tuba jest szczelnie zamknięta i zamknięta. Wykorzystać jedną podwielokrotność na próbkę do natychmiastowej ekstrakcji. Przechowuj wszelkie inne porcje w zamrażarce do wykorzystania w przyszłości.

Przed przejściem do stanowiska pracy wyczyść wszystkie powierzchnie i sprzęt w miejscu pracy wybielaczem, a następnie 70% roztworem etanolu. Po podzieleniu próbek PCR z kodami kreskowymi przenieś je do stacji roboczej przeznaczonej do ekstrakcji. Przygotuj mieszaninę buforowego nośnika RNA AVL do etapu lizy.

Główna mieszanina próbki i buforu do lizy powinna być przechowywana w temperaturze pokojowej. Oznacz 1.5-mililitrową probówkę wirówkową. Ustaw końcówkę pipety na 560 mikrolitrów.

Nałóż czystą końcówkę do pipety. Dodaj bufor do lizy do każdej probówki. Wyrzuć końcówkę do pojemnika na odpady.

Następnie należy pobrać próbkę podwielokrotności PCR. Umieścić go w przygotowanej probówce buforowej do lizy przeznaczonej dla podwielokrotności pierwszej i powtórzyć tę czynność dla wszelkich dodatkowych próbek. Wyrzuć starą końcówkę do pipet i nałóż czystą końcówkę do pipety.

Nałóż czystą końcówkę do pipety. Dodać 140 mikrolitrów buforu do probówki kontrolnej. Dokładnie zamknij każdą rurkę.

Pulsacyjny wir przez 15 sekund. Powtórzyć te czynności z dowolnymi dodatkowymi podwielokrotnościami lub próbkami. Mikrowirować każdą próbkę przez pięć sekund.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po 10 minutach krótko odwiruj probówki, aby usunąć wszelkie krople z wnętrza pokrywki każdej probówki. Dodaj 560 mikrolitrów etanolu do próbki.

Wymień końcówkę pipety. Powtórzyć czynności z pozostałymi lub dodatkowymi próbkami. Zamknij dokładnie każdą probówkę z próbką.

Wir pulsacyjny każdej próbki przez 15 sekund. Mikrowirować próbki przez pięć sekund. Uzyskaj czystą dwumililitrową probówkę zbiorczą.

Dodaj kolumny pokrętła. Oznacz je tak, aby pasowały do Twoich próbek. Przenieść 630 mikrolitrów próbki, aby odpowiednio dopasować ją do kolumny.

Zabezpiecz swoje nakrętki. Przejdź do wirówki. Równomiernie rozprowadź próbki w wirówce.

Wirować przy 6000 g przez jedną minutę w celu usunięcia buforu do lizy. Wróć do stacji roboczej. Wymień probówki zbiorcze.

Dodać pozostały bufor do lizy i powtórzyć etap wirowania. Wyrzucić oryginalną podwielokrotną probówkę z próbką, po czym usunąć eluat i przemyć kolumnę wirową buforem AW1. Powtórzyć tę procedurę dla każdej próbki lub dowolnych dodatkowych próbek.

Zabezpiecz nakrętki na każdej próbce i odwiruj z prędkością sześciu g. Powtórzyć z drugim buforem do przemywania AW2 przy 20 g. Na koniec umieść kolumnę w czystej 1,5-mililitrowej probówce.

Otwórz kolumnę i dodaj 60 mikrolitrów buforu AVE. Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę i odwirowywać przy sześciu g przez jedną minutę. Próbka jest teraz gotowa do analizy PCR.

W warunkach BSL-3 protokół eksperymentalny pozostanie taki sam, ale środki bezpieczeństwa będą miały pierwszeństwo przed wszystkim innym. Przed wejściem do laboratorium BSL-3 spójrz przez przezroczyste okienko, aby upewnić się, że w schowku podręcznym wytworzyło się podciśnienie. Oczywiste będzie, że podciśnienie zostało ustalone, gdy kula w ścianie jest widoczna.

Po ustaleniu podciśnienia otwórz drzwi i wejdź do urządzenia. Natychmiast umyj ręce, a następnie przejdź do listy kontrolnej środków ochrony osobistej. Przystąp do zakładania środków ochrony indywidualnej w następującej kolejności: pod rękawiczkami, fartuchem, ochraniaczami na buty, maską, osłoną twarzy, drugą parą rękawiczek.

Włącz maszynę i poczekaj, aż ciśnienie w schowku podręcznym ustabilizuje się. Użyj roztworu wybielacza w sprayu, aby odkazić wszystkie obszary i materiały, których planujesz używać wewnątrz i na zewnątrz schowka. Wyrzuć wszelkie odpady wybielacza do pojemnika przeznaczonego tylko do wybielacza.

Użyj 70% roztworu etanolu do czyszczenia wszystkich obszarów, w których użyto wybielacza. Przenieś próbki przez okno przelotowe. Próbki należy spryskać roztworem wybielacza i pozostawić w spokoju na co najmniej jedną minutę w przejściu przed otrzymaniem ich do wnętrza jednostki BSL-3.

Następnie odbierz próbki do jednostki BSL-3 i dokładnie je wyczyść przed przejściem do etapu rejestracji i etykietowania. Po zarejestrowaniu próbek i oznaczeniu probówek należy umieścić je w schowku podręcznym za pośrednictwem tacki śluzy powietrznej. Nie otwieraj obu drzwi jednocześnie.

Otwieraj i zamykaj każde drzwi w dwóch różnych krokach dla środków ostrożności. Po bezpiecznym przeniesieniu próbek do wnętrza schowka należy wykonać te same czynności, które opisano wcześniej, aby utworzyć porcje próbek w schowku. Po podzieleniu próbek na porcje przenieść je do hermetycznego pojemnika.

Rozpyl roztwór wybielacza w komorze podręcznej, aby odkazić probówki i wszystkie inne powierzchnie. Odczekaj pięć minut, a następnie nałóż 70% roztwór etanolu, aby umyć wybielacz. Po dokładnej dekontaminacji przenieś z powrotem do komory rękawicowej tylko próbki potrzebne do analizy PCR do lizy.

W komorze rękawicowej należy wykonać tylko etap lizy procedury ekstrakcji. Po lizie komórek szczelnie zamknij nakrętki na każdej próbce i umieść je w korytarzu śluzy powietrznej pod ciśnieniem. Ponownie odkaż komorę rękawicową wybielaczem, a następnie 70% roztworem etanolu.

Wyjąć próbki z komory rękawicowej i przenieść je do stacji roboczej w celu wykonania pozostałych etapów procedury ekstrakcji. Po ekstrakcji przenieś próbki do okienka przejściowego w celu analizy PCR. Po wyjęciu i przeniesieniu próbek należy odkazić przestrzeń roboczą laboratorium poza komorą podręczną.

Przed zdjęciem środków ochrony osobistej poczekaj, aż cyrkulacja powietrza w urządzeniu bezpiecznie osiągnie odpowiednią liczbę cykli filtrowania, zanim zaczniesz zdejmować środki ochrony osobistej. Natychmiast po wyjęciu i wyrzuceniu wszystkich środków ochrony indywidualnej do pojemnika na odpady środków ochrony indywidualnej, przed wyjściem z urządzenia należy umyć ręce w zlewie laboratoryjnym wodą z mydłem. Amplifikacja i detekcja PCR.

Usunąć wyekstrahowane próbki RNA z okienka przepustowego. Przygotuj mieszankę wzorcową w 1,5-mililitrowej probówce z następującymi składnikami dla każdego docelowego testu: woda, startery i sondy, mieszanina atakująca i bufor 2X. Zwiruj i odwiruj mieszankę główną, po czym podnieś ją do każdej z probówek paskowych.

Po przygotowaniu mieszanki wzorcowej należy umieścić zestaw PCR z powrotem w zalecanej temperaturze do przechowywania. Dodaj próbki do każdej z probówek paskowych, używając oddzielnej końcówki między każdą probówką paskową. Obracać próbki z prędkością 1 500 obr./min przez jedną minutę, po czym próbki są gotowe do załadowania do jednostki PCR w czasie rzeczywistym.

Po załadowaniu próbek do urządzenia do PCR wykonanie jednego cyklu zajmuje około 90 minut. Test PCR w czasie rzeczywistym jest czułą metodą niezawodnego wykrywania wirusa. Można to zobaczyć w tabeli oznaczonej: Wyniki analizy PCR.

Przed odebraniem wyników i opuszczeniem laboratorium należy zdjąć środki ochrony osobistej i odpowiednio odkazić każde stanowisko pracy, przygotowując się do następnego testu diagnostycznego. Reprezentatywne wyniki. Przebieg pracy w laboratorium jest przedstawiony na schemacie, który kładzie nacisk na ochronę osobistą.

Szybki test diagnostyczny na grypę odbywa się za pomocą analizy RT-PCR. Procedura składa się z czterech głównych kroków, a do każdego etapu protokołu przypisane są indywidualne obszary robocze. Celem tego projektu jest walidacja nowatorskiego, modułowego, szybko wdrażalnego obiektu laboratoryjnego i udało nam się to osiągnąć, a także opracowanie programów szkoleniowych dla personelu laboratoryjnego pracującego w środowiskach o niskich zasobach podczas epidemii i epidemii.