Izolowanie złośliwych i niezłośliwych komórek B od lekko: eGFP danio pręgowanego

Niedawno odkryliśmy, że wiele limfocytów B w LCK GFP zebry wyraża niski poziom GFP. To sprawia, że ta linia jest użytecznym narzędziem do badania limfocytów B, a także limfocytów T. Główną zaletą tej techniki jest to, że teraz możemy badać limfocyty B i limfocyty T z LCK GFP danio pręgowanego lub możemy badać komórki B-ALL i T-ALL od ryb z rakiem.

Metody te umożliwiają rozwój limfocytów B i badania B-ALL u danio pręgowanego. Które są istotne dla zrozumienia adaptacyjnego układu odpornościowego i jego nowotworów złośliwych powszechnych w nowotworach dziecięcych. Jeśli nigdy wcześniej nie wykonywałeś tych sekcji, możesz chcieć udoskonalić swoją technikę kilka razy, aż będziesz mógł uzyskać dobre próbki grasicy i szpiku.

Demonstracja wizualna pomoże widzom rozpoznać fluor i B-ALL u ryb oraz wybrać właściwe ustawienia do rozróżniania limfocytów B i T w celu ich izolacji. Po znieczuleniu 0,02% trikainą w wodzie systemu rybnego, użyj filtra GFP na mikroskopie epifluorescencyjnym, aby zbadać danio pręgowanego w wieku od dwóch do sześciu miesięcy pod kątem fluorescencyjnej thymi w grzbietowej przyśrodkowej części jamy skrzelowej. Po zlokalizowaniu grasicy umieść uśpioną rybę na szalce Petriego i użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby usunąć grasicę GFP.

I ustawienia mikroskopii jasnego pola do pobrania szpiku nerkowego i śledziony. Umieść każdy pobrany narząd w 1,5-mililitrowej probówce zawierającej 500 mikrolitrów zimnego podłoża sortującego i użyj homogenizatora z mikroprobówką do homogenizacji tkanek na lodzie. Następnie przecedź homogenizowaną tkankę przez filtr siatkowy o grubości 35 mikrometrów, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki i umieść komórki na lodzie.

Począwszy od dwóch do czterech miesięcy, użyj mikroskopu fluorescencyjnego do badania przesiewowego podwójnie transgenicznych ryb rag2:hMYC, LCK, EGFP, przy użyciu niskich ustawień ekspozycji, aby zidentyfikować jasną ostrą białaczkę limfoblastyczną z komórek T lub T-ALL i ustawień wysokiej ekspozycji, aby zidentyfikować słabe zwierzęta B-ALL. Ryby typu dzikiego i przedbiałaczkowego mają GFP zlokalizowany tylko w grasicy. Kategoryzuj ryby na podstawie stopnia fluorescencji GFP, korzystając z prostego systemu trzech kategorii.

Ryby pierwszego poziomu wykazują sygnał fluorescencyjny jako guz grasicy z ograniczonym lokalnym rozprzestrzenianiem się. Ryby poziomu drugiego wykazują sygnał fluorescencyjny poza grasicą, obejmujący mniej niż 50% ciała. A ryby poziomu trzeciego wykazują sygnał fluorescencyjny rozciągający się poza 50% ciała.

Oddziel ryby z ALL od tych bez raka. I monitoruj ryby w stanie przedbiałaczkowym bez guzów GFP dodatnich raz w miesiącu pod kątem rozwoju nowej ALL. Do izolacji komórek T lub B-ALL użyj żyletki, aby usunąć głowę i obszar grasicy uśpionej ryby trzeciego poziomu i umieścić ciało na szalce Petriego.

Za pomocą pipety P-1000 przemyć jamę otrzewnową ryby 500 mikrolitrami zimnego podłoża sortującego, zbierając komórki i pożywkę w pięciomililitrowej probówce. Używając świeżej końcówki pipety, wstrzyknij dwie do trzech dodatkowych objętości od 200 do 300 mikrolitrów zimnego medium sortującego do jamy ciała i użyj końcówki pipety, aby delikatnie wycisnąć ciało ryby, aby wytłoczyć komórki z jamy ciała do pięciomililitrowej probówki. Następnie przecedź zawiesinę komórkową przez filtr siatkowy o pojemności 35 mikrolitrów.

I umieść komórki na lodzie do czasu ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Do homogenizacji całego ciała użyj homogenizatora z mikroprobówką tłuczkową, aby homogenizować ciało ryby i dodaj dodatkowe 300 mikrolitrów zimnego środka sortującego do probówki. Przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr siatkowy o grubości 35 mikrometrów, w razie potrzeby myjąc filtr dodatkowym środkiem sortującym, aż na filtrze pozostaną tylko resztki tkanek.

Następnie umieść komórki na lodzie do czasu ich analizy. Do analizy cytometrii przepływowej izolowanych komórek należy ustawić parametry cytometru przepływowego zgodnie z wytycznymi producenta. I uzyskaj od 10 000 do 50 000 zdarzeń, aby ustawić parametry rozpraszania do przodu i rozpraszania bocznego w celu zdefiniowania bramek komórek limfocytów i progenitorów oraz wykluczenia resztek komórkowych.

Wyklucz dublety komórkowe i użyj bramek limfoidalnych i/lub prekursorowych do określenia liczby i procentu komórek dodatnich GFP. Używając fikoerytryny i intensywności GFP, zdefiniuj bramki dla komórek ujemnych GFP w porównaniu z niskimi GFP w porównaniu z wysokimi GFP. Nauczenie się, gdzie umieścić bramki do izolowania komórek o niskim i wysokim GFP, ma kluczowe znaczenie dla uzyskania czystych populacji komórek B i T.

Z grasicy można uzyskać dwie odrębne populacje GFP dodatnie, limfocyty B o niskiej zawartości GFP i limfocyty T o wysokiej zawartości GFP. Limfocyty B znajdujące się w szpiku nerkowym trzymiesięcznego danio pręgowanego wyrażają niski poziom GFP. Komórki o wysokiej zawartości GFP są jednak rzadkie, co wskazuje, że tylko niewielki procent limfocytów T jest obecny w szpiku w wieku trzech miesięcy.

Podobnie, próbki śledziony wykazują wyższy odsetek komórek o niskim poziomie GFP niż komórek o wysokim poziomie GFP. U ryb podwójnie transgenicznych, u których nie rozwinęła się jeszcze ostra białaczka limfoblastyczna, ekspresja GFP w grasicy, szpiku i śledzionie jest podobna do obserwowanej u ryb z pojedynczym transgenicznym LCK EGFP. Jednak liczba limfocytów na narząd jest zwiększona.

Przypuszczalnie z powodu napędzanej przez MYC ekspansji niedojrzałych populacji komórek B i T, w których aktywny jest promotor rag2. U podwójnie transgenicznych ryb z B i/lub T-ALL, u których rozwinął się rak fluorescencyjny w ciągu sześciu miesięcy, B-ALL są słabo fluorescencyjnymi nowotworami zawierającymi głównie niskie komórki GFP. W przeciwieństwie do tego, jaskrawo fluorescencyjne ryby mogą być nosicielami izolowanych T-ALL lub mieszanych populacji zarówno komórek o niskim poziomie B-ALL GFP, jak i o wysokim poziomie T-ALL GFP.

Rzeczywiście, jak oceniono za pomocą ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy, niskie komórki GFP wyrażają wyższe poziomy transkryptów komórek B. A komórki o wysokim poziomie GFP wyrażają wyższe poziomy genów limfocytów T, LCK i markera GFP. Bardzo ważne jest, aby nauczyć się rozpoznawać ryby z B-ALL za pomocą mikroskopii.

I jak prawidłowo zdefiniować bramki cytometrii przepływowej do oddzielania populacji o niskiej i wysokiej GFP. Zgodnie z tą procedurą można wyizolować DNA, RNA lub białko z komórek o niskim i wysokim GFP do PCR, sekwencjonowania, eksperymentów z krwią lub przeszczepów in vivo. Kiedy dowiedzieliśmy się, że ryby LCK GFB mają fluorescencyjne limfocyty B oprócz limfocytów T, mogliśmy zbadać oba typy komórek od tego samego zwierzęcia, aby ocenić B i T-ALL.