Name: Izolowanie złośliwych i niezłośliwych komórek B od lekko: eGFP danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metodę izolacji złośliwych i niezłośliwych komórek B od transgenicznych ryb danio pręgowanego lck:eGFP. Technika ta umożliwia badanie rozwoju komórek B oraz białaczek limfoblastycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Megan Malone-Perez za opiekę nad danio pręgowanym i rdzeń cytometrii przepływowej OUHSC. Prace te były wspierane przez granty z Hyundai Hope on Wheels, Oklahoma Center for the Advancement of Science and Technology (HRP-067), nagrodę za projekt pilotażowy NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF jest kierownikiem Katedry Hematologii i Onkologii Dziecięcej Fundacji Szpitala Dziecięcego im. E.L. i Thelmy Gaylord.

Wszystkie procedury dotyczące danio pręgowanego zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) przy Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu w Oklahomie.
1. Izolowanie niezłośliwych limfocytów B i T od transgenicznych ryb lck:eGFP
<ol>
	<li>Znieczulij ryby za pomocą 0,02% trikainy (MS-222) w wodzie z systemem rybnym.</li>
	<li>Zbadaj ryby w wieku 2–6 miesięcy pod kątem fluorescencyjnej grasicy, która znajduje się w grzbietowo-przyśrodkowej części jamy skrzelowej danio pręgowanego i innych teleostów14. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego (długość fali wzbudzenia 470/40 i filtr emisyjny 525/50), aby wykryć GFP.</li>
	<li>Przygotuj wcześniej 50 ml wysterylizowanego przez filtr 1x Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) zawierającego 1% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny (pożywka sortująca). Niewykorzystane media sortujące można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.</li>
	<li>Poddaj rybę eutanazji, umieszczając ją w zlewce zawierającej 0,2% trikainy na około 5 minut, a następnie zanurz w kąpieli lodowej. Potwierdź śmierć przez ustanie ruchu operkularnego (skrzela).</li>
	<li>Umieść uśpioną rybę na szalce Petriego i przeprowadź sekcję interesujących nas narządów limfatycznych, używając mikroskopu fluorescencyjnego do wypreparowania GFP+ thymi14 i ustawień mikroskopii jasnego pola, aby wypreparować szpik nerkowy i śledzionę15. Przedstawione wyniki uzyskano na 3-miesięcznych rybach. Proporcje limfocytów i liczby bezwzględne różnią się w zależności od wieku i genotypu (więcej szczegółów w dyskusji).</li>
	<li>Umieść każdy wypreparowany narząd w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl zimnego podłoża sortującego.</li>
	<li>Homogenizuj tkankę na lodzie za pomocą homogenizatora z mikrorurką tłuczkową.</li>
	<li>Przepuść homogenizowaną tkankę przez filtr siatkowy o wielkości 35 μm, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki. Trzymaj komórki na lodzie do czasu analizy.</li>
</ol>
2. Izolowanie złośliwych limfocytów z podwójnie transgenicznego rag2:hMYC; lck:eGFP Danio pręgowany
<ol>
	<li>Począwszy od 2-4 miesięcy, przesiewowo mikroskopowo rag2:hMYC; lck:ryba eGFP pod kątem nieprawidłowych wzorców GFP. 
	UWAGA: Limfocyty B są GFPlo w tle lck:eGFP, więc B-ALL wymaga praktyki, aby rozpoznać; T-ALL jest oczywisty, ponieważ limfocyty T sąGFP hi. W związku z tym podwójna linia transgeniczna rag2:hMYC, lck:eGFP ma dwa fenotypy: jasno fluorescencyjny T-ALL, który zwykle powstaje z grasicy i rozciąga się do organizmu, oraz słabo fluorescencyjny B-ALL.
	<ol>
		<li>Używając mikroskopu fluorescencyjnego, prześwietl ryby, używając ustawień "niskiej ekspozycji" (200 ms, wzmocnienie 2,4x), aby zidentyfikować jasny T-ALL (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) i "wysoką ekspozycję" (1,5 s, 3,4x wzmocnienie), aby zidentyfikować przyciemnione B-ALL (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Kontrole WT i ryby przedbiałaczkowe mają GFP zlokalizowane tylko w grasicy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulić i zbadać rybę zgodnie z opisem w krokach 1.1–1.2.</li>
	<li>Kategoryzuj ryby na podstawie stopnia fluorescencji GFP, korzystając z prostego systemu trzech kategorii: 
	nuta: Poziom 1: Fluorescencja objawia się jako guz grasicy z ograniczonym rozprzestrzenianiem się miejscowym. 
	Poziom 2: Fluorescencja pojawia się poza grasicą, obejmując <50% ciała. 
	Poziom 3: Fluorescencja rozciąga się poza 50% ciała.</li>
	<li>Oddziel ryby z ALL od tych bez raka. Monitoruj ryby w stanie przedbiałaczkowym (tj. Ryby bez guzów GFP+) raz w miesiącu pod kątem rozwoju nowej ALL. Do ~9 miesięcy wszystkie ryby rag2:hMYC, lck:eGFP rozwijają T-ALL, B-ALL lub oba.</li>
	<li>Do izolacji komórek T- lub B-ALL wybierz ryby poziomu 3 (ALL obejmujące >50% ciała), które dają więcej niż 2 x 106 komórek ALL i zazwyczaj znacznie więcej.</li>
	<li>Poddaj rybę eutanazji zgodnie z krokiem 1.4. 
	nuta: Istnieją dwie metody uzyskania WSZYSTKICH komórek: homogenizacja całego ciała i technika płukania otrzewnej16. Metody różnią się bezwzględną liczbą komórek pobranych do sortowania, a co za tym idzie, ilością wymaganego czasu FACS i kosztem (więcej szczegółów można znaleźć w dyskusji).</li>
	<li>W przypadku każdej z tych metod najpierw umieść uśpioną rybę na szalce Petriego i za pomocą żyletki usuń głowę, w tym obszar grasicy. W razie potrzeby można to przetworzyć osobno lub wykorzystać do barwienia histologicznego.</li>
	<li>Metoda mycia otrzewnej
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety P1000 przemyć jamę otrzewnową ryby 500 μl zimnego podłoża sortującego, zbierając komórki i pożywkę w probówce o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Za pomocą świeżej końcówki pipety wstrzyknąć dodatkowe 200–300 μl zimnego podłoża sortującego do jamy ciała. Następnie, za pomocą końcówki pipety, delikatnie dociśnij ciało ryby, aby wyciągnąć komórki z jamy ciała. Zebrać tę pożywkę i dodać do probówki o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Powtórz krok 2.8.2 2–3 razy. Zebrane komórki należy przechowywać na lodzie w pożywce do sortowania.</li>
		<li>Przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr siatkowy 35 μm przed cytometrią przepływową/FACS i utrzymuj komórki na lodzie do czasu analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogenizacja całego ciała
	<ol>
		<li>Po wyjęciu głowy ryby umieść ciało w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl pożywki sortującej.</li>
		<li>Homogenizuj ciało za pomocą homogenizatora z mikrorurką tłuczkową.</li>
		<li>Dodać dodatkowe 300 μl podłoża do sortowania na zimno. Przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr siatkowy 35 μm. W razie potrzeby dodaj pożywkę sortującą, aby przepłukać wszystkie komórki przez filtr, aż na filtrze pozostaną tylko resztki tkanek. Trzymaj komórki na lodzie do czasu analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza cytometryczna prawidłowych lub złośliwych limfocytów B
<ol>
	<li>Ustaw parametry analizy cytometrii przepływowej i/lub FACS zgodnie z przewodnikiem producenta.</li>
	<li>Uzyskaj żądaną liczbę zdarzeń, aby wstępnie scharakteryzować próbkę. Analizuj zdarzenia 1 x 104 do 5 x 104 przed sortowaniem do określenia konkretnych bramek dla kolejnych kroków sortowania.
	<ol>
		<li>Określ bramki: Zdefiniuj bramki limfocytów i komórek progenitorowych za pomocą parametrów rozpraszania do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC), z wyłączeniem resztek komórkowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A-C)17. FSC i SSC odpowiadają odpowiednio wielkości/średnicy i ziarnistości komórki. 
		nuta: Komórki GFP-, GFPlo iGFP hi różnią się od 10 do 100 razy pod względem intensywności fluorescencji GFP, co ułatwia rozdzielenie tych populacji (ryc. 2-5). Dyskryminacja żywych żywych zwierząt może być oceniona na tym etapie za pomocą barwienia żywotności jodem propidyny (PI) lub 7-aminoaktynomycyną D (7-AAAD). Poprzednie eksperymenty z PI zazwyczaj wykazują >95% żywotność komórek GFP+ po FACS.</li>
		<li>Wyklucz dublety komórek, zgodnie z parametrami używanej maszyny FACS.</li>
		<li>W obrębie bramek limfoidalnych i/lub prekursorowych określ liczbę i procent komórek GFP+.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj intensywności fikoerytryny (PE) i GFP, zdefiniuj bramkę dla komórek GFP- vs. GFPlo vs. GFPhi. 
	nuta: Limfocyty B wykazują słabą fluorescencję GFP, a limfocyty T wykazują jasną GFP w liniach lck: eGFP. Wiele narządów limfatycznych lub próbek guza zawiera obie populacje GFP+. Komórki linii B/B-ALL to GFPlo, a komórki linii T/T-ALL to GFPhi. Zdefiniuj bramki, aby rozróżnić komórki GFP-,GFP lo iGFP hi, a następnie zbierz te populacje osobno (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2A-C, <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3A-C, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A i <silna klasa = "xfig"> Rysunek 5A).</li>
	<li>Posortuj każdą populację komórek do różnych probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml zawierających 2 ml pożywki sortującej lub bezpośrednio do różnych probówek o pojemności 1,5 ml zawierających odpowiedni bufor do dalszych analiz (np. ekstrakcji RNA, DNA lub białka, allotransplantacji itp.).</li>
	<li>Oczyszczone komórki należy przechowywać na lodzie przed dalszymi analizami.</li>
</ol>

<ol><li>Paik, E. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic development in the zebrafish.</a> International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).</li>
<li>Kasheta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+T+reg-like+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+B+Cell+Development+without+a+Pre-B+Cell+Stage%2C+Revealed+by+CD79+Fluorescence+Reporter+Transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).</li>
<li>Schorpp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+functions+of+Ikaros+in+vertebrate+lymphocyte+development%3A+genetic+evidence+for+distinct+larval+and+adult+phases+of+T+cell+development+and+two+lineages+of+B+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish.</a> Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).</li>
<li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+T+cell+development%2C+ablation%2C+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).</li>
<li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li>
<li>Frazer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+T-cell+malignancy+models+established+in+a+zebrafish+phenotypic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen.</a> Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).</li>
<li>Rudner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+acquired+genomic+changes+in+zebrafish+and+human+T-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL.</a> Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).</li>
<li>Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+mediates+Myc+oncogene+dependence+in+a+conditional+zebrafish+model+of+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).</li>
<li>Borga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+B+and+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemias+in+zebrafish+driven+by+transgenic+MYC%3A+implications+for+oncogenesis+and+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Haferlach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+microarray-based+gene+expression+profiling+in+the+diagnosis+and+subclassification+of+leukemia%3A+report+from+the+International+Microarray+Innovations+in+Leukemia+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).</li>
<li>Novershtern, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densely+interconnected+transcriptional+circuits+control+cell+states+in+human+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis.</a> Cell. 144 (2), 296-309 (2011).</li>
<li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Side+Population+in+Myc-induced+T-cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li>
<li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+hematopoietic+and+renal+cell+heterogeneity+in+adult+zebrafish+at+single-cell+resolution+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opracowaliśmy i udostępniliśmy protokół izolacji komórek B z transgenicznego danio pręgowanego lck:eGFP, dodając go do innych modeli D. rerio z etykietami linii B 3,4. Nieco zaskakujące jest to, że identyfikacja komórek GFPlo B w tej linii pozostała niezauważona od czasu jej opisu w 2004 roku. Ogólnie rzecz biorąc, lck jest uważany za specyficzny dla limfocytów T6, ale ostatnie badania wykazały nieocze...

Danio pręgowany oferuje potężne atrybuty, takie jak manipulacja genetyczna, wysoka płodność, przezroczystość optyczna i szybki rozwój, które ułatwiają badanie rozwoju kręgowców za pomocą metod genetycznych. Te zalety, wraz ze wspólnymi cechami teleopoezy i hematopoezy ssaków, sprawiają, że D. rerio idealnie nadaje się do analiz in vivo limfopoezy i funkcji limfocytów, od ich najwcześniejszego pojawienia się u larw przez całą dorosłość. Rozwój krwi u danio pręgowanego opiera się na dobrze zachowanych procesach genetycznych, które są wspólne dla ssaków, a te rozciągają się na adaptacyjny układ odpornościowy. Dodatkowo, mechanizmy molekularne rządzące rozwojem limfoidalnym są niezwykle zachowane między danio pręgowanym a ssakami1.
W ciągu ostatnich 2 dekad powstały transgeniczne linie D. rerio, które oznaczają określone linie krwi i linie mutantów, których brakuje w tych liniach2,3,4,5. Jedna z nich, transgeniczna linia lck:eGFP, wykorzystuje promotor kinazy tyrozynowej białka limfocytów danio pręgowanego (lck) do napędzania ekspresji GFP6. Gen ten, który jest wysoce eksprymowany zarówno przez prekursory linii T, jak i dojrzałe limfocyty T, umożliwia śledzenie in vivo rozwoju limfocytów T grasicy i oczyszczanie ex vivo komórek linii T przez FACS7. Wcześniej używaliśmy tej linii w przesiewowym przesiewowym badaniu mutagenezy ENU do identyfikacji mutantów linii zarodkowej podatnych na T-ALL i do badania somatycznie nabytych zdarzeń genetycznych związanych z onkogenezą limfocytów T8,9.
Ostatnio nasze laboratorium jeszcze bardziej rozszerzyło użyteczność danio pręgowanego lck:eGFP. W podwójnie transgenicznych rag2:hMYC (ludzki MYC), lck:eGFP D. rerio, o których wiadomo, że rozwijają T-ALL 10, odkryliśmy, że występuje również linia B ALL11. W przeciwieństwie do T-ALL w tym modelu, które fluoryzują jasno ze względu na wysoką ekspresję GFP, B-ALL są słabo fluorescencyjne ze względu na niski poziom GFP, co pozwala na wyraźne odróżnienie ryb z B-ALL od tych z T-ALL za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ta różnicowa ekspresja GFP umożliwia również oddzielenie komórek GFPlo B-ALL od komórek GFPhi T-ALL za pomocą FACS11. Co więcej, niska ekspresja lck nie jest unikalna dla zebry B-ALL, ponieważ ludzki B-ALL również wyraża niskie poziomy LCK11,12. Podobnie, normalne komórki linii B D. rerio, myszy i ludzi również wyrażają niskie poziomy lck/Lck/LCK, przy czym niedojrzałe komórki B mają najwyższą ekspresję11,13. W przeliczeniu na komórkę, komórki linii B w danio pręgowanym lckeGFP lub liniach pochodnych wyrażają 1-10% więcej GFP niż limfocyty T. Te komórkilo GFP wyrażają charakterystyczne mRNA komórek B, takie jak pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighz i inne, i mogą być oczyszczane ze szpiku, grasicy, śledziony lub krwi obwodowej11. W związku z tym zarówno komórki linii B, jak i T mogą być izolowane z zebry lckeGFP, a w przypadku zwierząt rag2hMYC, lckeGFP, komórek B i T-ALL również11.
Tutaj prezentujemy nasz protokół skutecznego oczyszczania metodą FACS niezłośliwych komórek B z danio pręgowanego lck:eGFP oraz niezłośliwych lub złośliwych komórek B rag2hMYC; lck: eGFP ryb, przy użyciu różnych tkanek źródłowych. Takie komórki można również określić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej bez izolacji FACS, jeśli jest to pożądane. Odkrycie niskiej ekspresji lck - a co za tym idzie niskiej ekspresji GFP - przez limfocyty B otwiera nowe drzwi możliwości eksperymentalnych dla danio pręgowanego lckeGFP, takich jak badania rozwoju komórek B in vivo. Tak więc ta transgeniczna linia, po raz pierwszy opisana w 2004 roku, zyskuje nowe życie, ponieważ staramy się ją wykorzystać do zebrania nowych informacji na temat odporności adaptacyjnej danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>35 &mikro; m siatka</td><td>Sefar Technologia filtrów</td><td>7050-1220-000-13</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polistyrenowa rurka z okrągłym dnem z nasadką sitową</td><td>Falcon Corning Brand</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 50 ml</td><td>VWR international</td><td>525-0448</td><td></td></tr><tr><td>AZ APO 100 Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-Qi1MC camara</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu; MS-222</td><td>Sigma</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>FACSJazz</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Thermo Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td><</tr><tr><td>em>lck:eGFP</td><td></td><td></td><td>See Langeneu et al., 2004</td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>Version 4.13</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizatory mikrorurkowe Tłuczek</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>64788-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td></td><td></td><td></td> do transferu tworzyw sztucznych</tr><tr><td>rag2:hMYC-ER</td><td></td><td></td><td>Patrz Gutierrez et al., 2011</td></tr><tr><td>RPMI Media 1640 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr></tbody></table>

izolowanie złośliwych i niezłośliwych komórek b od lekko: egfp danio pręgowanego

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Danio pręgowany (Danio rerio) to potężny model do badania rozwoju limfocytów. Podobnie jak ssaki, D. rerio posiada adaptacyjny układ odpornościowy, który obejmuje limfocyty B i T. Badania limfopoezy danio pręgowanego są trudne, ponieważ przeciwciała rozpoznające markery powierzchniowe komórek D. rerio są na ogół niedostępne, co komplikuje izolację i charakterystykę różnych populacji limfocytów, w tym komórek linii B. Linie transgeniczne z ekspresją fluoroforu specyficzną dla linii są często używane do obejścia tego wyzwania. Transgeniczna linia lck:eGFP została wykorzystana do badania rozwoju limfocytów T D. rerio, a także do modelowania rozwoju limfocytów T i ostrej białaczki limfoblastycznej (T-ALL). Chociaż ryby lck:eGFP były szeroko stosowane do analizy linii T, nie były używane do badania limfocytów B. Niedawno odkryliśmy, że wiele limfocytów B danio pręgowanego również ulega ekspresji lck, choć na niższych poziomach. W związku z tym limfocyty B lck: eGFP również wyrażają niski poziom GFP. Na podstawie tego odkrycia opracowaliśmy protokół oczyszczania komórek linii B z danio pręgowanego lck:eGFP, o którym informujemy tutaj. Nasza metoda opisuje, jak wykorzystać aktywowany fluorescencyjnie sorter komórek (FACS) do oczyszczania komórek B z ryb lck: eGFP lub pokrewnych linii, takich jak podwójnie transgeniczny rag2: hMYC; lck:ryba eGFP. W tych liniach limfocyty B, szczególnie niedojrzałe limfocyty B, wyrażają GFP na niskich, ale wykrywalnych poziomach, co pozwala odróżnić je od limfocytów T, które wykazują wysoką ekspresję GFP. Limfocyty B można wyizolować ze szpiku, grasicy, śledziony, krwi lub innych tkanek. Protokół ten zapewnia nową metodę oczyszczania limfocytów B D. rerio, umożliwiając badania koncentrujące się na takich tematach, jak rozwój komórek B i nowotwory złośliwe limfocytów B.

Do analizy wykorzystaliśmy cytometrię przepływową, a do izolacji GFP system FACS.lo oraz GFPcześć komórki z grasicy, szpiku nerkowego i śledziony lck:eGFP transgeniczne rybki danio prążkowane. Analiza ryb w wieku 3 miesięcy wykazała, że grasica składała się głównie z GFP+ limfocyty. GFP+ komórki znajdowały się głównie w bramce limfocytów opisanej wcześniej przez Traver i współpracowników.17Dwa odrębne GFP+</...

Transgeniczne lck:eGFP danio pręgowane silnie wyrażają GFP w limfocytach T i były używane do badania rozwoju limfocytów T i ostrej białaczki limfoblastycznej. Linia ta może być wykorzystana do badania limfocytów B, które wyrażają lck na niższych poziomach. Protokół ten opisuje oczyszczanie złośliwych i niezłośliwych komórek B z danio pręgowanego lck:eGFP.

Izolowanie złośliwych i niezłośliwych komórek B od lekko: eGFP danio pręgowanego

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

Niedawno odkryliśmy, że wiele limfocytów B w LCK GFP zebry wyraża niski poziom GFP. To sprawia, że ta linia jest użytecznym narzędziem do badania limfocytów B, a także limfocytów T. Główną zaletą tej techniki jest to, że teraz możemy badać limfocyty B i limfocyty T z LCK GFP danio pręgowanego lub możemy badać komórki B-ALL i T-ALL od ryb z rakiem.Metody te umożliwiają rozwój limfocytów B i badania B-ALL u danio pręgowanego. Które są istotne dla zrozumienia adaptacyjnego układu odpornościowego i jego nowotworów złośliwych powszechnych w nowotworach dziecięcych. Jeśli nigdy wcześniej nie wykonywałeś tych sekcji, możesz chcieć udoskonalić swoją technikę kilka razy, aż będziesz mógł uzyskać dobre próbki grasicy i szpiku.Demonstracja wizualna pomoże widzom rozpoznać fluor i B-ALL u ryb oraz wybrać właściwe ustawienia do rozróżniania limfocytów B i T w celu ich izolacji. Po znieczuleniu 0,02% trikainą w wodzie systemu rybnego, użyj filtra GFP na mikroskopie epifluorescencyjnym, aby zbadać danio pręgowanego w wieku od dwóch do sześciu miesięcy pod kątem fluorescencyjnej thymi w grzbietowej przyśrodkowej części jamy skrzelowej. Po zlokalizowaniu grasicy umieść uśpioną rybę na szalce Petriego i użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby usunąć grasicę GFP.I ustawienia mikroskopii jasnego pola do pobrania szpiku nerkowego i śledziony. Umieść każdy pobrany narząd w 1,5-mililitrowej probówce zawierającej 500 mikrolitrów zimnego podłoża sortującego i użyj homogenizatora z mikroprobówką do homogenizacji tkanek na lodzie. Następnie przecedź homogenizowaną tkankę przez filtr siatkowy o grubości 35 mikrometrów, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki i umieść komórki na lodzie.Począwszy od dwóch do czterech miesięcy, użyj mikroskopu fluorescencyjnego do badania przesiewowego podwójnie transgenicznych ryb rag2:hMYC, LCK, EGFP, przy użyciu niskich ustawień ekspozycji, aby zidentyfikować jasną ostrą białaczkę limfoblastyczną z komórek T lub T-ALL i ustawień wysokiej ekspozycji, aby zidentyfikować słabe zwierzęta B-ALL. Ryby typu dzikiego i przedbiałaczkowego mają GFP zlokalizowany tylko w grasicy. Kategoryzuj ryby na podstawie stopnia fluorescencji GFP, korzystając z prostego systemu trzech kategorii.Ryby pierwszego poziomu wykazują sygnał fluorescencyjny jako guz grasicy z ograniczonym lokalnym rozprzestrzenianiem się. Ryby poziomu drugiego wykazują sygnał fluorescencyjny poza grasicą, obejmujący mniej niż 50% ciała. A ryby poziomu trzeciego wykazują sygnał fluorescencyjny rozciągający się poza 50% ciała.Oddziel ryby z ALL od tych bez raka. I monitoruj ryby w stanie przedbiałaczkowym bez guzów GFP dodatnich raz w miesiącu pod kątem rozwoju nowej ALL. Do izolacji komórek T lub B-ALL użyj żyletki, aby usunąć głowę i obszar grasicy uśpionej ryby trzeciego poziomu i umieścić ciało na szalce Petriego.Za pomocą pipety P-1000 przemyć jamę otrzewnową ryby 500 mikrolitrami zimnego podłoża sortującego, zbierając komórki i pożywkę w pięciomililitrowej probówce. Używając świeżej końcówki pipety, wstrzyknij dwie do trzech dodatkowych objętości od 200 do 300 mikrolitrów zimnego medium sortującego do jamy ciała i użyj końcówki pipety, aby delikatnie wycisnąć ciało ryby, aby wytłoczyć komórki z jamy ciała do pięciomililitrowej probówki. Następnie przecedź zawiesinę komórkową przez filtr siatkowy o pojemności 35 mikrolitrów.I umieść komórki na lodzie do czasu ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Do homogenizacji całego ciała użyj homogenizatora z mikroprobówką tłuczkową, aby homogenizować ciało ryby i dodaj dodatkowe 300 mikrolitrów zimnego środka sortującego do probówki. Przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr siatkowy o grubości 35 mikrometrów, w razie potrzeby myjąc filtr dodatkowym środkiem sortującym, aż na filtrze pozostaną tylko resztki tkanek.Następnie umieść komórki na lodzie do czasu ich analizy. Do analizy cytometrii przepływowej izolowanych komórek należy ustawić parametry cytometru przepływowego zgodnie z wytycznymi producenta. I uzyskaj od 10 000 do 50 000 zdarzeń, aby ustawić parametry rozpraszania do przodu i rozpraszania bocznego w celu zdefiniowania bramek komórek limfocytów i progenitorów oraz wykluczenia resztek komórkowych.Wyklucz dublety komórkowe i użyj bramek limfoidalnych i/lub prekursorowych do określenia liczby i procentu komórek dodatnich GFP. Używając fikoerytryny i intensywności GFP, zdefiniuj bramki dla komórek ujemnych GFP w porównaniu z niskimi GFP w porównaniu z wysokimi GFP. Nauczenie się, gdzie umieścić bramki do izolowania komórek o niskim i wysokim GFP, ma kluczowe znaczenie dla uzyskania czystych populacji komórek B i T.Z grasicy można uzyskać dwie odrębne populacje GFP dodatnie, limfocyty B o niskiej zawartości GFP i limfocyty T o wysokiej zawartości GFP. Limfocyty B znajdujące się w szpiku nerkowym trzymiesięcznego danio pręgowanego wyrażają niski poziom GFP. Komórki o wysokiej zawartości GFP są jednak rzadkie, co wskazuje, że tylko niewielki procent limfocytów T jest obecny w szpiku w wieku trzech miesięcy.Podobnie, próbki śledziony wykazują wyższy odsetek komórek o niskim poziomie GFP niż komórek o wysokim poziomie GFP. U ryb podwójnie transgenicznych, u których nie rozwinęła się jeszcze ostra białaczka limfoblastyczna, ekspresja GFP w grasicy, szpiku i śledzionie jest podobna do obserwowanej u ryb z pojedynczym transgenicznym LCK EGFP. Jednak liczba limfocytów na narząd jest zwiększona.Przypuszczalnie z powodu napędzanej przez MYC ekspansji niedojrzałych populacji komórek B i T, w których aktywny jest promotor rag2. U podwójnie transgenicznych ryb z B i/lub T-ALL, u których rozwinął się rak fluorescencyjny w ciągu sześciu miesięcy, B-ALL są słabo fluorescencyjnymi nowotworami zawierającymi głównie niskie komórki GFP. W przeciwieństwie do tego, jaskrawo fluorescencyjne ryby mogą być nosicielami izolowanych T-ALL lub mieszanych populacji zarówno komórek o niskim poziomie B-ALL GFP, jak i o wysokim poziomie T-ALL GFP.Rzeczywiście, jak oceniono za pomocą ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy, niskie komórki GFP wyrażają wyższe poziomy transkryptów komórek B. A komórki o wysokim poziomie GFP wyrażają wyższe poziomy genów limfocytów T, LCK i markera GFP. Bardzo ważne jest, aby nauczyć się rozpoznawać ryby z B-ALL za pomocą mikroskopii.I jak prawidłowo zdefiniować bramki cytometrii przepływowej do oddzielania populacji o niskiej i wysokiej GFP. Zgodnie z tą procedurą można wyizolować DNA, RNA lub białko z komórek o niskim i wysokim GFP do PCR, sekwencjonowania, eksperymentów z krwią lub przeszczepów in vivo. Kiedy dowiedzieliśmy się, że ryby LCK GFB mają fluorescencyjne limfocyty B oprócz limfocytów T, mogliśmy zbadać oba typy komórek od tego samego zwierzęcia, aby ocenić B i T-ALL.

isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Testy transplantacji komórek z rozcieńczeniem ograniczającym są stosowane do określania częstości występowania komórek propagujących nowotwór. Niniejszy protokół opisuje metodę generowania syngeneicznych rybek zebrafish, u których rozwija się białaczka z oznakowaniem fluorescencyjnym, oraz szczegółowo wyjaśnia, jak izolować i transplantować te komórki białaczkowe z rozcieńczeniem ograniczającym do jamy otrzewnej dorosłych rybek zebrafish.

Kwantyfikacja częstotliwości komórek propagujących guz za pomocą transplantacji komórek w rozcieńczeniu ograniczającym u syngeneicznych rybek zebrafish

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Ten protokół opisuje technikę izolowania fluorescencyjnie znakowanych komórek nowotworowych ostrej białaczki limfoblastycznej (T-ALL) komórek nowotworowych z dorosłego danio pręgowanego i ilościowego oznaczania ich za pomocą niebieskiego barwnika trypanowego.

Fluorescencyjnie znakowana izolacja komórek T-ALL: metoda izolacji komórek T-ALL od dorosłych danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu komórek mięśni szkieletowych danio pręgowanego i embrionalnego mięsaka prążkowanokomórkowego (ERMS) do dorosłego homozygotycznego mutanta rag2E450fs z obniżoną odpornością. Protokół ten pozwala na sprawną analizę regeneracji i przemian złośliwych komórek mięśniowych.

Normalny i złośliwy przeszczep komórek mięśniowych dorosłym danio pręgowanym z obniżoną odpornością

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Tutaj opisujemy technikę izolowania komórek populacji bocznej z modelu danio pręgowanego z indukowaną przez myc ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej (T-ALL). Ten boczny test populacyjny jest bardzo czuły i jest opisany dla T-ALL danio pręgowanego, ale może mieć zastosowanie do innych złośliwych i niezłośliwych typów komórek danio pręgowanego.

Izolacja populacji bocznej w ostrej białaczce limfoblastycznej indukowanej przez limfokomórki T indukowanej przez Myc u danio pręgowanego

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Ten artykuł przedstawia metodę opracowywania, charakteryzowania i śledzenia w czasie rzeczywistym przerzutów nowotworowych w modelu nerwiaka zarodkowego danio pręgowanego, szczególnie w transgenicznej linii danio pręgowanego z nadekspresją MYCN i LMO1, która rozwija przerzuty spontanicznie.

Model danio pręgowanego z przerzutami nerwiaka zarodkowego

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Użyliśmy barwienia proliferacji komórek, aby zidentyfikować komórki w stanie spoczynku w modelu T-ostrej białaczki limfoblastycznej u danio pręgowanego. Barwnik jest zatrzymywany w komórkach niedzielących się i redukowany podczas proliferacji komórek, co umożliwia selekcję uśpionych komórek do dalszego badania. Protokół ten zapewnia funkcjonalne narzędzie do badania samoodnowy w kontekście spoczynku komórkowego.

Identyfikacja komórek w stanie spoczynku w modelu ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej limfocytów T danio pręgowanego za pomocą barwienia proliferacji komórek

Poznaj metodę izolacji złośliwych i niezłośliwych komórek B od transgenicznych ryb danio pręgowanego lck:eGFP. Technika ta umożliwia badanie rozwoju komórek B oraz białaczek limfoblastycznych.

Izolowanie złośliwych i niezłośliwych komórek B od lekko: eGFP danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów