Ulepszone badania przesiewowe hybryd drożdży w celu identyfikacji powiązania czynnika transkrypcyjnego z sekwencjami ludzkiego DNA

Celem ulepszonych testów jednohybrydowych drożdży jest zidentyfikowanie zestawu czynników transkrypcyjnych, które wiążą się z interesującą sekwencją DNA. Zaletą tej techniki jest to, że ulepszone testy jednohybrydowe drożdży mogą ocenić ponad 1000 czynników transkrypcyjnych w jednym eksperymencie. I odwrotnie, immunoprecypitacja chromatyny ocenia tylko jeden czynnik transkrypcyjny na raz.

Metoda ta stanowi kluczowe narzędzie genomiki funkcjonalnej do identyfikacji repertuaru czynników transkrypcyjnych, które wiążą się z promotorami i wzmacniaczami genów oraz do identyfikacji zmienionego wiązania czynnika transkrypcyjnego z wariantami niekodującymi. Procedurę zademonstruje dr Xing Liu, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Rozmrozić na lodze talerze buliołowe z glicerolem drożdży za pomocą zestawu zdobyczy TF.

Ponownie zawiesić drożdże za pomocą 12-kanałowej pipety i przejść do następnego kroku w ciągu 1 do 3 minut. Aby dostrzec drożdże w prostokątnych płytkach Sc minus tryptofanu, użyj robota matrycowego o wysokiej gęstości, aby wybrać wielodołkowe 96 płytek jako źródło, 96 płytek agarowych jako cel i 96 długich podkładek na szpilki. Podkładki pod szpilki nie nadają się do wielokrotnego użytku i należy je wyrzucić.

Wybierz program Spot Many (Wykrywaj wiele), aby wykonać dwie kopie na płytkę 96-dołkową. Nie korzystaj z opcji recyklingu lub rewizyty, aby uniknąć zanieczyszczenia wstecznego zamrożonych zapasów. Wybierz także opcję wirowania w górę iw dół w źródle, aby wymieszać drożdże.

Postępuj zgodnie z instrukcjami, gdzie i kiedy umieścić płytki i pozwól robotowi dostrzec drożdże na prostokątnych płytkach Sc minus tryptofan. Zapakuj nakrapianą tablicę i inkubuj ją agarem do góry w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 2 do 3 dni. Aby wygenerować 384 tablice kolonii w Sc minus prostokątne płytki tryptofanu, wybierz 96 płytek agarowych jako źródło, 384 płytki agarowe jako cel i 96 krótkich podkładek na szpilki.

Następnie wybierz program z pojedynczym źródłem z tablicą 1:4. W ten sposób cztery 96 płytek kolonijnych zostaną skonsolidowane w jedną płytkę kolonijną 384. Nie korzystaj z opcji recyklingu lub rewizyty, aby uniknąć zanieczyszczenia między różnymi płytami.

Zapakuj płytki i inkubuj nakrapianą matrycę kolonijacyjną 384 stroną z agarem do góry w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 2 dni. Aby wygenerować 1536 tablic kolonijnych w Sc minus prostokątne płytki tryptofanu, wybierz 384 płytki agarowe jako źródło, 1536 płytek agarowych jako cel i 384 krótkie podkładki na szpilki. Następnie wybierz program do oznaczania metodą 1:4 z jednym źródłem.

Celem jest skopiowanie każdej kolonii do czterech kolonii, aby uzyskać poczwórne duplikaty. Skorzystaj z opcji recyklingu i ponownej wizyty, ponieważ wiąże się to z 4-krotnym kopiowaniem każdej kolonii. Postępuj zgodnie z instrukcjami robota i pozwól robotowi dostrzec drożdże na płytkach przed zapakowaniem i inkubacją nakrapianej tablicy kolonii 1536 stroną agarową do góry w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 3 dni.

Aby wzmocnić tablicę kolonii 1536 w prostokątnych płytkach Sc minus tryptofan, wybierz 1536 płytek agarowych jako źródło, 1536 płytek agarowych jako cel i 1536 krótkich podkładek szpilkowych. Wybierz program Replikuj wiele, aby replikować od 3 do 4 kopii. Użyj opcji recyklingu i ponownej wizyty, ale wyrzuć podkładkę podczas przełączania na inną płytę tablicy, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.

Pozwól robotowi wzmocnić tablicę kolonii 1536 w Sc minus prostokątne płytki tryptofanu. Na koniec zapakuj płytki i inkubuj nakrapianą tablicę kolonii 1536 stroną z agarem do góry w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 3 dni, aby użyć do etapów krycia. Aby przygotować trawniki z przynętą DNA do krycia, umieść szczepy przynęty drożdżowej DNA na płytce Sc minus uracyl i histydyna i rosnąć przez 3 dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Rozłóż drożdże na 15-centymetrowej płytce Sc minus uracyl i histydyna za pomocą sterylnej wykałaczki, tak aby każda płytka pasowała do 12 do 16 różnych szczepów. Inkubuj płytkę jednego dnia w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego dnia rozłóż drożdże na 15-centymetrowej płytce Sc minus uracyl i histydyna za pomocą sterylnej wykałaczki, tak aby każda płytka pasowała do 4 różnych szczepów.

Inkubuj płytkę przez jeden dzień w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po inkubacji zeskrob drożdże sterylną wykałaczką, uważając, aby nie zeskrobać agaru. Dodaj drożdże do 1,5 mililitrowej probówki z 500 mikrolitrami sterylnej wody.

Teraz dodaj 10 do 15 sterylnych szklanych kulek i zawiesinę drożdży na prostokątną płytkę YAPD. Wstrząsaj dokładnie we wszystkich kierunkach przez jedną minutę, aby upewnić się, że drożdże rozprowadzą się po całej płycie. Natychmiast odwróć talerz i postukaj, aby koraliki trafiły do pokrywki.

Usuń koraliki i poddaj je recyklingowi. Zapakuj płytki i inkubuj je stroną agarową do dołu przez 1 do 2 dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnie przejdź do etapu krycia.

Aby połączyć przynętę DNA drożdży i szczepy macierzy TF, przenieś macierz TF na prostokątną płytkę YAPD za pomocą robota. Wybierz płytkę agarową 1536 jako źródło i cel oraz krótką podkładkę z 1536. Wybierz program Replikuj wiele.

Wybierz 4 płyty źródłowe oraz opcje recyklingu i ponownego przeglądu. Każda płyta matrycy TF może być używana do przenoszenia od 3 do 4 płyt YAPD. Płytki matrycowe TF używane do krycia muszą mieć od 2 do 3 dni, ale nie więcej, ponieważ krycie może być nieefektywne.

Aby przenieść trawnik szczepu przynęty DNA na płytki YAPD już zawierające matrycę TF, wybierz płytkę agarową 1536 jako źródło i cel oraz krótką podkładkę 1536. Wybierz program Replikuj wiele. Użyj losowego przesunięcia w źródle o promieniu około 0,6 milimetra, aby uniknąć pobierania drożdży z tego samego miejsca i wybierz opcję Mix on Target, aby ułatwić kontakt między szczepami drożdży.

Użyj trawnika zawierającego szczepy przynęty DNA jako źródła oraz płytek YAPD zawierających nakrapianą matrycę TF jako celu przed zapakowaniem płytek i inkubacją ich stroną agarową do góry w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jeden dzień. Aby wybrać drożdże diploidalne, wybierz płytkę agarową 1536 jako źródło i cel, a następnie wybierz krótką podkładkę z 1536. Wybierz program Replikuj.

Wybierz opcję Mix on Source (Mieszaj) i on Target (Mieszaj w miejscu) i On Target (Celowe). Pozwól robotowi przenieść połączone drożdże z płytek YAPD na płytki Sc minus uracyl i tryptofan przed zapakowaniem płytek i inkubacją ich agarem do góry w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 2 do 3 dni. Teraz wybierz płytki agarowe 1536 jako źródło i cel oraz krótką podkładkę z 1536 szpilkami.

Wybierz program Replikuj. Przenieść diploidalne drożdże z płytek Sc minus uracylu i tryptofanu na prostokątne płytki zawierające 3-AT i X-gal do odczytu za pomocą robota. Zapakuj płytki i inkubuj je stroną agarową do góry w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez okres do 7 dni.

W przypadku szczepów przynęty DNA o wysokiej aktywności reporterowej tła zrób zdjęcia w dniach 2, 3 i 4. W przeciwnym razie rób zdjęcia w 4 i 7 dniu. Przechowuj płytki matrycy TF w temperaturze pokojowej i skopiuj ponownie po 7 dniach w celu przeprowadzenia nowej rundy badań przesiewowych.

Aby zilustrować rodzaj wyników, które można uzyskać za pomocą ulepszonych testów jednohybrydowych drożdży, regiony promotorowe genów CCL15 i IL17F zostały przebadane pod kątem macierzy 1086 ludzkich TF. Promotor CCL15 jest przykładem nieautoaktywnej przynęty DNA, w której interakcje, nawet słabe, można łatwo wykryć. Promotor IL17F jest przykładem autoaktywnej przynęty DNA z nierównomierną aktywnością reporterową tła, w której można wykryć pewne interakcje, podczas gdy w przypadku kilku TF nie jest pewne, czy aktywność reporterowa jest wyższa niż tło.

Istnieje kilka problemów, które mogą wystąpić podczas wykonywania ulepszonych testów jednohybrydowych drożdży. W takim przypadku kolonie są zbyt małe i nie można ich przenieść. Zazwyczaj około 95% kolonii ofiar TF wykazuje normalny wzrost.

W tym przykładzie nie ma wzrostu drożdży w części talerza. Ten problem jest ogólnie związany z awarią na etapie krycia, jeśli podkładka z kołkiem 1536 nie ma kontaktu z drożdżami na trawniku z przynętą DNA, w układzie TF lub na płytce współpracującej. W tych dwóch przykładach nie wykryto żadnych interakcji.

Problem ten jest często związany albo z niezamierzonymi mutacjami inaktywującymi w genach reporterowych, w szczególności LacZ, albo ze zbyt wysoką autoaktywnością, która maskuje interakcje. W tym przypadku na płytce pojawiają się losowe niebieskie plamki, które często są związane z zanieczyszczeniem bakteryjnym. Najważniejszą rzeczą do rozważenia jest odpowiednie przygotowanie talerza.

Upewnij się, że wszystkie składniki są dodane i że wysokość agaru jest jednolita, ponieważ od tego zależą wszystkie kolejne kroki. Chociaż większość odczynników nie jest niebezpieczna, ważne jest, aby przez cały czas nosić rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek i płytek. Podobnie jak w przypadku każdego testu wiązania DNA, ważne jest, aby zweryfikować interakcje zidentyfikowane za pomocą testów funkcjonalnych, takich jak testy reporterowe, knockdown lub knockout czynnika transkrypcyjnego, a następnie pomiar ekspresji docelowego genu.

Metoda ta pozwoliła na identyfikację czynników transkrypcyjnych, które regulują geny zaangażowane w poszczególne procesy biologiczne, a także czynników transkrypcyjnych wiążących się naprzemiennie z niekodującymi wariantami związanymi z chorobą.