Name: Ulepszone badania przesiewowe hybryd drożdży w celu identyfikacji powiązania czynnika transkrypcyjnego z sekwencjami ludzkiego DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę hybryd drożdży do identyfikacji czynników transkrypcyjnych wiążących DNA ludzkie. Technika umożliwia przesiewanie ponad 1000 TF jednocześnie w genomice funkcjonalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health [R35-GM128625 do J.I.F.B.].

1. Przygotowania
<ol>
	<li>Płytki Sc −U −H (szalki Petriego 150 mm) 
	nuta: Płytki te zostaną wykorzystane do hodowli szczepów drożdży przynęty DNA.
	<ol>
		<li>Rozpuścić mieszaninę drop-out, bazę azotową drożdży (YNB), półsiarczan adeniny i siarczan amonu w 920 ml wody i pH do 5,9 za pomocą 5 M NaOH (około 1 ml na litr pożywki; patrz tabela 2 dla składu). Wlać do kolby o pojemności 2 litrów i dodać mieszadło.</li>
		<li>W drugiej kolbie o pojemności 2 l dodaj agar do 950 ml wody (nie dodawaj kostki mieszania, ponieważ spowoduje to wykipienie agaru w autoklawie). </li>
		<li>Autoklaw przez 40 minut przy ciśnieniu 15 psi w cyklu cieczowym. </li>
		<li>Natychmiast wlać zawartość pierwszej kolby, łącznie z mieszadłem, do kolby zawierającej agar. Dodać glukozę, dobrze wymieszać na talerzu mieszającym i schłodzić do 55 °C w łaźni wodnej. </li>
		<li>Dodaj leucynę i tryptofan do pożywki. Dobrze wymieszaj na talerzu mieszającym i przelej do sterylnych szalek Petriego o średnicy 150 mm (~80 ml na szalkę). Suszyć przez 3–5 dni w temperaturze pokojowej, zawinąć w plastikowe torby i przechowywać w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płyty prostokątne YAPD 
	nuta: Płytki te będą używane do uprawy trawnika dla szczepu przynęty DNA oraz do krycia z kolekcją TF Array.
	<ol>
		<li>Rozpuścić proszki (patrz tabela 3 dla składu), z wyjątkiem agaru, w 950 ml wody w kolbie o pojemności 2 litrów i dodać mieszadło.</li>
		<li>W drugiej kolbie o pojemności 2 l dodaj agar do 950 ml wody (nie dodawaj kostki mieszania, ponieważ spowoduje to wykipienie agaru w autoklawie).</li>
		<li>Autoklaw przez 40 minut przy ciśnieniu 15 psi w cyklu cieczowym.</li>
		<li>Natychmiast wlać zawartość pierwszej kolby, łącznie z mieszadłem, do kolby zawierającej agar.</li>
		<li>Dodać glukozę, dobrze wymieszać na płytce mieszającej i ostudzić do temperatury 55 °C. Wlać pożywkę do prostokątnych płytek (patrz Tabela materiałów; ~70 ml na płytkę) za pomocą pompy perystaltycznej (5 ml/s) i rurki 6 mm. Suszyć przez 1 dzień w temperaturze pokojowej, zawinąć w plastikowe torby i przechowywać w chłodni do 6 miesięcy. 
		UWAGA: Chociaż sugerowana objętość podłoża wynosi 70 ml na płytkę, można użyć 50–80 ml na płytkę. Trzy krytyczne kwestie, które należy wziąć pod uwagę podczas nalewania płytek, to: 1) czy są one wypoziomowane tak, aby podłoże agarowe miało taką samą grubość na całej płytce (do nalewania płytek należy używać wypoziomowanego stołu lub powierzchni i nie wlewać stosów większych niż siedem płytek), 2) aby zapewnić brak pęcherzyków w podłożu agarowym (pęcherzyki należy przebijać za pomocą sterylnej igły), oraz 3) suszenie płytek tylko przez jeden dzień i zawijanie płytek w plastikowe torby, aby uniknąć niepowodzeń w przypinaniu drożdży.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płyty prostokątne Sc −Trp i Sc −U −Trp 
	nuta: Płytki te będą używane do hodowli kolekcji macierzy TF (Sc −Trp) oraz do selekcji drożdży diploidalnych po kryciu (Sc −U −Trp).
	<ol>
		<li>Rozpuścić mieszaninę drop-out, YNB, półsiarczan adeniny i siarczan amonu w 920 ml wody i pH do 5,9 za pomocą NaOH 5M (około 1 ml na litr pożywki) (patrz tabela 4 dla składu). Wlać do kolby o pojemności 2 litrów i dodać mieszadło. </li>
		<li>W drugiej kolbie o pojemności 2 l dodaj agar do 950 ml wody (nie dodawaj kostki mieszania, ponieważ spowoduje to wykipienie agaru w autoklawie). </li>
		<li>Autoklaw przez 40 minut przy ciśnieniu 15 psi w cyklu cieczowym. </li>
		<li>Natychmiast wlać zawartość pierwszej kolby, łącznie z mieszadłem, do kolby zawierającej agar. Dodać glukozę, dobrze wymieszać na talerzu mieszającym i ostudzić do temperatury 55 °C. </li>
		<li>Dodaj leucynę, histydynę i uracyl (pomiń uracyl dla płytek Sc −U −Trp). </li>
		<li>Dobrze wymieszaj na płytce mieszającej i przelej do prostokątnych płytek (~70 ml na płytkę) za pomocą pompy perystaltycznej (5 ml / s) i rurki 6 mm. Suszyć przez 1 dzień w temperaturze pokojowej, zawinąć talerze w plastikowe torby i przechowywać w chłodni do 3 miesięcy. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sc −U −H −Trp + 3AT + X-gal płyty prostokątne 
	UWAGA: Płytki te będą używane jako płytki odczytowe do testów eY1H.
	<ol>
		<li>Rozpuścić mieszaninę drop-out, YNB, półsiarczan adeniny i siarczan amonu w 850 ml wody (patrz tabela 5 dla składu). Nie stosować pH. Wlać do kolby o pojemności 2 litrów i dodać mieszadło. </li>
		<li>W drugiej kolbie o pojemności 2 l dodaj agar do 850 ml wody (nie dodawaj kostki mieszania, ponieważ spowoduje to wykipienie agaru w autoklawie). </li>
		<li>Autoklaw przez 40 minut przy ciśnieniu 15 psi w cyklu cieczowym.</li>
		<li>Przygotuj 10 soli BU (1L), łącząc 900 ml wody, 70 g Na2HPO4∙7H2O i 34,5 g NaH2PO4∙H2O. Wymieszaj za pomocą mieszadła, aby rozpuścić proszki i dostosuj pH do 7,0 za pomocą 5 M NaOH. Dodaj wodę, aby uzyskać 1 l i autoklaw.</li>
		<li>Przygotować roztwór X-gal, dodając 3,5 g proszku X-gal do 50 ml plastikowej probówki zawierającej 42,5 ml dimetyloformamidu. Dodaj proszek X-gal do dimetyloformamidu, aby łatwiej się rozpuścił (zajmuje to 30 minut). Roztwór podstawowy należy przechowywać w ciemności (użyć nieprzezroczystej probówki o pojemności 50 ml lub przykryć folią). Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Natychmiast wlać zawartość pierwszej kolby, łącznie z mieszadłem, do kolby zawierającej agar. Dodać glukozę i 10 soli BU (patrz Tabela 5 dla składu), dobrze wymieszać na talerzu mieszającym i ostudzić do 55 °C. </li>
		<li>Dodać leucynę, 3AT i X-gal (skład znajduje się w Tabeli 5). </li>
		<li>Dobrze wymieszaj na płytce mieszającej i przelej do prostokątnych płytek (~70 ml na płytkę) za pomocą pompy perystaltycznej (5 ml / s) i rurki 6 mm. Suszyć przez 1 dzień w temperaturze pokojowej, zawinąć w plastikowe torby i przechowywać w chłodni przykrytej folią aluminiową (3AT i X-gal są wrażliwe na światło) do 1 miesiąca. </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wykrywanie tablicy TF
<ol>
	<li>Rozmrażanie szyku TF-prey
	<ol>
		<li>Rozmrozić na lodzie płytki wyjściowe z glicerolem drożdżowym za pomocą zestawu TF-prey. 
		nuta: Tablice TF-prey mogą być generowane w sposób wcześniej opublikowany10,12,13,18.</li>
		<li>Ponownie zawiesić drożdże za pomocą 12-kanałowej pipety w ciągu 1–3 minut przed następnym krokiem. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Plamienie drożdży na prostokątnych płytkach Sc −Trp
	<ol>
		<li>W robocie HDA (patrz Tabela materiałów) wybierz wielodołkowe 96 płytek jako źródło, 96 płytek agarowych jako cel i 96 długich podkładek na szpilki. 
		nuta: Podkładki pod szpilki nie nadają się do wielokrotnego użytku i należy je wyrzucić.</li>
		<li>Wybierz program Replikuj wiele, aby wykonać dwie kopie na płytkę 96-dołkową. Nie korzystaj z opcji recyklingu lub rewizyty, aby uniknąć ponownego zanieczyszczenia zamrożonych zapasów. </li>
		<li>Wybierz opcję, aby wirować w górę iw dół w źródle, aby wymieszać drożdże.</li>
		<li>Umieścić plamistą matrycę w worku i inkubować agarem do góry w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie 384 tablic kolonii w płytach prostokątnych Sc −Trp
	<ol>
		<li>W robocie wybierz 96 płytek agarowych jako źródło, 384 płytki agarowe jako cel i 96 krótkich podkładek na szpilki. </li>
		<li>Wybierz program Array 1:4. W ten sposób cztery 96 płytek kolonijnych (każda zawierająca inny TF) zostaną skonsolidowane w jedną płytkę kolonijną 384. Nie korzystaj z opcji recyklingu lub rewizyty, aby uniknąć zanieczyszczenia między różnymi płytami.</li>
		<li>Umieścić płytki w worku i inkubować plamistą matrycę 384-kolonijną agarową do góry w temperaturze 30 °C przez 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie 1 536 tablic kolonii w płytach prostokątnych Sc −Trp 
	nuta: Spowoduje to powstanie tablic zawierających cztery kolonie dla każdej ofiary TF.
	<ol>
		<li>W robocie wybierz 384 płytki agarowe jako źródło, 1 536 płytek agarowych jako cel i 384 krótkie podkładki na szpilki. </li>
		<li>Wybierz program do oznaczania metodą 1:4 z jednym źródłem. Celem jest skopiowanie każdej kolonii do czterech kolonii, aby uzyskać poczwórne duplikaty. Skorzystaj z opcji recyklingu i ponownej wizyty, ponieważ wiąże się to z kopiowaniem czterech razy każdej kolonii. </li>
		<li>Zapakować płytki i inkubować plamistą matrycę 1536-colony agarową do góry w temperaturze 30 °C przez 3 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzmacnianie macierzy 1,536 kolonii w prostokątnych płytkach Sc −Trp
	<ol>
		<li>W robocie wybierz 1 536 płytek agarowych jako źródło, 1 536 płytek agarowych jako cel i 1 536 krótkich podkładek na szpilki. </li>
		<li>Wybierz program Replikuj wiele, aby replikować 3–4 kopie. Użyj opcji recyklingu i ponownej wizyty, ale wyrzuć podkładkę podczas przełączania na inną płytę tablicy, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. </li>
		<li>Zapakować płytki w worki i inkubować plamistą matrycę 1536-colony agarową do góry w temperaturze 30 °C przez 3 dni, aby użyć jej do etapów krycia (patrz poniżej). Następnie przechowuj płytki w temperaturze pokojowej i kopiuj ponownie po 7 dniach w celu przeprowadzenia nowej rundy badań przesiewowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ekran eY1H
<ol>
	<li>Przygotowanie trawników ze szczepem DNA do krycia
	<ol>
		<li>Na płytce Sc −U −H należy umieścić szczepy przynęty drożdży DNA-H i hodować przez 3 dni w temperaturze 30 °C. </li>
		<li>Rozłóż drożdże na 15 cm płytce Sc −U −H za pomocą sterylnej wykałaczki, tak aby każda płytka pasowała do 12–16 różnych szczepów. Inkubować jeden dzień w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Rozłóż drożdże na 15 cm płytce Sc −U −H za pomocą sterylnej wykałaczki, tak aby każda płytka pasowała do 4 różnych szczepów. Inkubować przez jeden dzień w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Zeskrob drożdże sterylną wykałaczką, uważając, aby nie zeskrobać agaru i dodaj do 1,5 probówki z 500 μl sterylnej wody. </li>
		<li>Dodaj 10–15 sterylnych szklanych kulek na prostokątną płytkę YAPD. Dodaj zawiesinę drożdży na talerz i dokładnie wstrząsaj we wszystkich kierunkach przez 1 minutę, aby upewnić się, że drożdże są rozprowadzone po całej płycie.</li>
		<li>Natychmiast odwróć talerz i postukaj, aby koraliki trafiły do pokrywki. Usuń koraliki i poddaj je recyklingowi. </li>
		<li>Umieścić płytki w worku i inkubować agarem do dołu przez 1–2 dni w temperaturze 30 °C. Następnie przejdź do etapu krycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krzyżowanie drożdży DNA-przynęty i szczepów TF
	<ol>
		<li>Przenieś tablicę TF na prostokątną płytę YAPD za pomocą robota. Wybierz płytkę agarową 1,536 jako źródło i cel oraz 1,536 krótką podkładkę na szpilki. Wybierz program Replikuj wiele. Każda płyta matrycy TF może być używana do przenoszenia na 3–4 płytki YAPD (w zależności od liczby płytek w układzie). Płytki matrycy TF używane do krycia muszą mieć 2-3 dni, ale nie więcej, ponieważ krycie może być nieefektywne.</li>
		<li>Przenieś trawnik szczepu przynęty DNA na płytki YAPD, które już zawierają tablicę TF za pomocą robota. Wybierz płytkę agarową 1,536 jako źródło i cel oraz 1,536 krótką podkładkę na szpilki. Wybierz program Replikuj wiele. Użyj losowego przesunięcia w źródle o promieniu ~0,6 mm, aby uniknąć pobierania drożdży z tego samego miejsca, i wymieszaj na cel, aby ułatwić kontakt między szczepami drożdży. Jako źródło należy użyć trawnika zawierającego szczepy przynęty DNA (sekcja 3.1), a jako celu płytek YAPD zawierających matrycę TF zauważoną w kroku 3.2.1.</li>
		<li>Umieścić płytki w worku i inkubować stroną agarową do góry w temperaturze 30 °C przez 1 dzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybór drożdży diploidalnych
	<ol>
		<li>Przenieś połączone drożdże z płytek YAPD na płytki Sc −U −Trp za pomocą robota. Wybierz płytkę agarową 1,536 jako źródło i cel oraz 1,536 krótką podkładkę na szpilki. Wybierz program Replikuj. Mieszaj u źródła i zgodnie z celem.</li>
		<li>Umieścić płytki w worku i inkubować stroną agarową do góry w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni (dłuższa inkubacja prowadzi do wysokiej aktywności reporterowej w tle).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeniesienie na tabliczki odczytowe
	<ol>
		<li>Przenieść drożdże diploidalne z płytek Sc −U −Trp na odczytane płytki prostokątne Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0,4 mM X-gal za pomocą robota. Wybierz 1,536 płytek agarowych jako źródło i cel oraz 1,536 krótką podkładkę na szpilki. Wybierz program Replikuj.</li>
		<li>Zawinąć płytki w worki i inkubować stroną agarową do góry w temperaturze 30 °C przez okres do 7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie tabliczek odczytowych
	<ol>
		<li>W przypadku szczepów przynęty DNA o wysokiej aktywności reporterskiej w tle, zrób zdjęcia w dniach 2, 3 i 4. W przeciwnym razie rób zdjęcia w 4 i 7 dniu. Pozytywne interakcje są identyfikowane na podstawie wzrostu i niebieskiego koloru kolonii drożdży i można je określić ręcznie lub można je określić za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+transcription+factors%3A+function%2C+expression+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human transcription factors: function, expression and evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).</li>
<li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Transcription+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Human Transcription Factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li>
<li>Arda, H. E., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-centered+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene-centered regulatory networks.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).</li>
<li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).</li>
<li>Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+DNA-protein+interactions+by+double-stranded+DNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays.</a> Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li>
<li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+ORC6%2C+a+component+of+the+yeast+origin+recognition+complex+by+a+one-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system.</a> Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).</li>
<li>Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Options+and+Considerations+When+Using+a+Yeast+One-Hybrid+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-Centered+Yeast+One-Hybrid+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+yeast+one-hybrid+assays+for+high-throughput+gene-centered+regulatory+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network+provides+a+framework+for+functional+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions.</a> Molecular Systems Biology. 12 (10), 884(2016).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gene-centered+transcription+factor+networks+for+enhancers+and+disease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants.</a> Cell. 161 (3), 661-673 (2015).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+one-hybrid+assays+for+gene-centered+human+gene+regulatory+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).</li>
<li>Sahni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+macromolecular+interaction+perturbations+in+human+genetic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders.</a> Cell. 161 (3), 647-660 (2015).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+Bait+Strains+for+Yeast+One-Hybrid+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony+Lift+Colorimetric+Assay+for+beta-Galactosidase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymolyase-Treatment+and+Polymerase+Chain+Reaction+Amplification+from+Genomic+and+Plasmid+Templates+from+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Deplancke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network.</a> Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+rewiring+and+complex+evolutionary+dynamics+in+a+C.+elegans+multiparameter+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network.</a> Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).</li>
<li>Carrasco Pro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+mouse+and+human+cytokine+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).</li>
<li>Whitfield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+in+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters.</a> Genome Biology. 13 (9), R50(2012).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+to+Caenorhabditis+elegans+first+introns+reveals+lack+of+redundancy+with+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).</li>
<li>Hens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+protein-DNA+interaction+screening+of+Drosophila+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements.</a> Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).</li>
<li>Gubelmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+one-hybrid+and+microfluidics-based+pipeline+to+map+mammalian+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks.</a> Molecular Systems Biology. 9, 682(2013).</li>
<li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stele-enriched+gene+regulatory+network+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root.</a> Molecular Systems Biology. 7, 459(2011).</li>
<li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li>
<li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisane tutaj zrobotyzowane podejście do badań przesiewowych w zakresie kojarzenia eY1H znacznie zwiększa przepustowość identyfikacji zestawu TF, które wiążą się z regionem DNA będącym przedmiotem zainteresowania, w porównaniu z poprzednimi badaniami przesiewowymi w bibliotece lub podejściami przesiewowymi w szyku opartymi na transformacji. Co więcej, interakcje TF-DNA wykryte w testach eY1H są wysoce powtarzalne, ponieważ 90% wykrytych interakcji jest dodatnich dla wszystkich czterech kolonii badanych na TF, a 90% inter...

Centralnym problemem w dziedzinie biomedycyny jest określenie mechanizmów, za pomocą których regulowany jest każdy ludzki gen. Transkrypcja jest pierwszym krokiem w kontrolowaniu poziomu ekspresji genów i jest regulowana przez zestawy czynników transkrypcyjnych (TF), które są unikalne dla każdego genu. Biorąc pod uwagę, że ludzie kodują dla >1,500 TFs1,2, zidentyfikowanie pełnego zestawu TF, które kontrolują ekspresję każdego genu, pozostaje otwartym wyzwaniem. 
Do mapowania interakcji TF-DNA można użyć dwóch rodzajów metod: metod skoncentrowanych na TF i skoncentrowanych na DNA3 (Rysunek 1A). W metodach skoncentrowanych na TF bada się TF będący przedmiotem zainteresowania pod kątem wiązania z regionami genomowego DNA lub w celu określenia jego specyficzności wiązania DNA. Metody te obejmują immunoprecypitację chromatyny (ChIP), a następnie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, mikromacierze wiążące białka oraz SELEX4,5,6. W metodach skoncentrowanych na DNA bada się interesującą sekwencję DNA w celu określenia zestawu TF, które wiążą się z sekwencją DNA. Najpowszechniej stosowaną z takich metod są testy drożdży jednohybrydowych (Y1H), w których interakcje między TF a regionami DNA są testowane w środowisku jądra drożdży za pomocą genów reporterowych7,8,9. 
Testy Y1H obejmują dwa komponenty: 'przynętę DNA' (np. promotory, wzmacniacze, tłumiki, itp.) oraz 'TF-prey', która może być przebadana pod kątem aktywacji genu reporterowego9,10 (Rysunek 1B). Przynęta DNA jest klonowana przed dwoma genami reporterowymi (LacZ i HIS3), a oba konstrukty DNA-przynęty są integrowane z genomem drożdży w celu wygenerowania chromatynowych "szczepów przynęty DNA". Ofiara TF, kodowana w plazmidzie, która wyraża TF połączony z domeną aktywacji (AD) drożdży Gal4 TF, jest wprowadzana do szczepu przynęty DNA, aby łowić interakcje TF-DNA. Jeśli ofiara TF zwiąże się z sekwencją przynęty DNA, to AD obecna w zdobyczy TF doprowadzi do aktywacji obu genów reporterowych. W rezultacie komórki z pozytywną interakcją mogą być selekcjonowane do wzrostu na płytkach pozbawionych histydyny, a także do pokonania konkurencyjnego inhibitora, 3-Amino-1,2,4-triazolu (3-AT) i uwidocznione jako niebieskie kolonie w obecności X-gal. Ponieważ używane są silne drożdże Gal4 AD, testy Y1H mogą wykrywać interakcje obejmujące aktywatory transkrypcji, a także represory. Ponadto, biorąc pod uwagę, że TF-prey są eksprymowane przez silny promotor drożdży (ADH1), interakcje można wykryć nawet w przypadku TF o niskim poziomie endogennej ekspresji, które są trudne do wykrycia przez ChIP11,12.
Większość opublikowanych protokołów przeprowadzania testów Y1H opiera się na wprowadzaniu zdobyczy TF do szczepów przynęty DNA drożdży poprzez przekształcanie zbiorczych bibliotek TF-prey, a następnie selekcję, wybieranie kolonii i sekwencjonowanie w celu identyfikacji oddziałujących TF, lub poprzez przekształcanie poszczególnych klonów8,9. Są to czasochłonne protokoły, ograniczające liczbę sekwencji DNA, które mogą być testowane przez jednego badacza. Niedawne ulepszenie testów Y1H, zwane ulepszonym Y1H (eY1H), znacznie zwiększyło przepustowość badań przesiewowych dzięki zastosowaniu platformy robotycznej o wysokiej gęstości (HDA) do kojarzenia szczepów drożdży z DNA-przynętą z kolekcją szczepów drożdży, z których każdy wyraża inną TF-prey10,13 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Ekrany te wykorzystują format 1,536 kolonii, co pozwala na czterokrotne testowanie większości ludzkich TF przy użyciu tylko trzech płytek. Ponadto, biorąc pod uwagę, że interakcje TF-DNA są testowane w sposób parami, podejście to pozwala na porównanie interakcji między przynętami DNA (takimi jak dwa niekodujące warianty pojedynczego nukleotydu) oraz między różnymi TF lub wariantami TF11,12,14.
Korzystając z testów eY1H, nakreśliliśmy największe do tej pory sieci interakcji TF-DNA skoncentrowane na DNA człowieka i Caenorhabditis elegans. W szczególności zidentyfikowaliśmy 2230 interakcji między 246 wzmacniaczami rozwoju człowieka a 283 TFs12. Ponadto zastosowaliśmy testy eY1H, aby odkryć zmienione wiązanie TF ze 109 niekodującymi wariantami pojedynczego nukleotydu związanymi z chorobami genetycznymi, takimi jak wady rozwojowe, rak i zaburzenia neurologiczne. Ostatnio użyliśmy eY1H do nakreślenia sieci obejmującej 21 714 interakcji między 2 576 promotorami genów C. elegans a 366 TFs11. Sieć ta odegrała zasadniczą rolę w odkryciu funkcjonalnej roli dziesiątek TF C. elegans.
Protokoły do generowania barwień DNA i oceny poziomu aktywności reporterów w tle zostały zgłoszone gdzie indziej15,16,17. W tym miejscu opisujemy potok eY1H, który można wykorzystać do badania przesiewowego dowolnego regionu ludzkiego genomowego DNA pod kątem macierzy 1,086 ludzkich TF. Po wygenerowaniu szczepu drożdżowego DNA-przynęty i zauważeniu zestawu TF-prey na odpowiednich płytkach, cały protokół można wykonać w ciągu dwóch tygodni (Tabela 1). Co ważniejsze, protokół może być zrównoleglony, dzięki czemu jeden badacz może jednocześnie badać 60 sekwencji przynęty DNA. Aby zademonstrować protokół, przeprowadziliśmy badania przesiewowe promotorów dwóch genów cytokin CCL15 i IL17F. Ponadto pokazujemy wyniki z nieudanych ekranów, aby zilustrować rodzaje problemów, które mogą wystąpić podczas wykonywania testów eY1H i sposoby ich rozwiązywania.

<table><tbody><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazol (3AT) ~95 % TLC</td><td>Sigma</td><td>A8056-100G</td><td>Inhibitor kompetycyjny dla produktów genu HIS3</td></tr><tr><td>Siarczan adeniny (hemisulfan), dihydrat</td><td>US Biologicals</td><td>A0865</td><td>Wymagany do prawidłowego wzrostu drożdży</td></tr><tr><td>Agar o wysokiej wytrzymałości żelu - klasa bakteriologiczna</td><td>American International</td><td>Chemical AGHGUP</td><td>Pożywka do wzrostu drożdży</td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>US Biologicals</td><td>A1450</td><td>Źródło azotu w syntetycznych pożywkach drożdżowych</td></tr><tr><td>D+ Glukoza Bezwodna</td><td>US Biologicals</td><td>G3050</td><td>Wymagana do wzrostu drożdży</td></tr><tr><td>Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp i Uracyl, bogata w adeninę bez drożdżowej bazy azotowej</td><td>US Biologicals</td><td>D9540-02</td><td>Syntetyczne kompletne podłoże wymagane do wzrostu drożdży</td></tr><tr><td>Krawędź Wieloparametrowy pH-metr</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2020-01</td><td>Do pomiaru pH pożywek selektywnych</td></tr><tr><td>Wykałaczki płaskie 750 ct</td><td>Diament</td><td></td><td>Do smug drożdży na szalkach Petrrydisów</td></tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>Walter</td><td>Stern 100C</td><td>Do rozdrabniania drożdży podczas robienia trawników</td></tr><tr><td>Glicerol &ge; 99%</td> <td>miliporów Sigma</td><td>G9012-1L</td><td>Wymagane do produkcji mrożonych zapasów drożdży</td></tr><tr><td>L-histydyna</td><td>US Biologicals</td><td>H5100</td><td>Do selekcji wzrostu drożdży w pożywkach selektywnych</td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>US Biologicals</td><td>L2020-05</td><td>Do selekcji wzrostu drożdży w pożywkach selektywnych</td></tr><tr><td>L-Tryptofan</td><td>Sigma</td><td>T-0254</td><td>Do selekcji wzrostu drożdży w pożywkach selektywnych</td></tr><tr><td>N, N-dimetyloformamid</td><td>Sigma</td><td>319937-1L</td><td>Do sporządzania roztworu X-gal</td></tr><tr><td>Omnipense Elite</td><td>Wheaton</td><td>W375030-A</td><td>Do dozowania dokładnych objętości pożywki do płytek Singera</td></tr><tr><td>Pepton, bakteriologiczny</td><td>American International Chemical</td><td>PEBAUP</td><td>Źródło białka niezbędne do wzrostu drożdży</td></tr><tr><td>Szalka Petriego, 150 mm x15 mm</td><td>VWR</td><td>10753-950</td><td>Do uprawy przynęt drożdżowych do przesiewanie</td></tr><tr><td>PlusPlates</td><td>Singer Instruments</td><td>PLU-003</td><td>Do wykonywania prostokątnych płytek agarowych do użytku z Singer Robot</td></tr><tr><td>Precision Niskotemperaturowy inkubator z chłodzeniem BZT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PR205745R</td><td>Do inkubacji płytek drożdżowych w stałej temperaturze</td></tr><tr><td>RePads 1,536 krótki</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-005</td><td>Aby przenieść tablicę TF-prey, połącz drożdże i przenieś drożdże na diploidalne płytki selekcyjne i odczytowe</td></tr><tr><td>RePads 384 krótkie</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-004</td><td>Aby przenieść tablicę TF-prey z formatu kolonii 384 do 1,536</td></tr><tr><td>RePads 96 long</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-001</td> Aby <td>przenieść matrycę TF-prey z bulionu glicerolowego na płytkę agarową</td></tr><tr><td>RePads 96 short</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-002</td><td>Do przenoszenia macierzy TF-prey z formatu kolonii 96 do 384</td></tr><tr><td>Robot RoToR Singer HDA</td><td>Instrumenty Singer Do</td><td></td><td>przenoszenia drożdży w sposób wysokoprzepustowy</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (granulki/certyfikowany ACS)</td><td>Fisher</td><td>S318-1</td><td>Do regulacji pH pożywek selektywnych</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203402C</td><td>Wymagany do aktywności reporterowej LacZ na X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>Monohydrat fosforanu sodu jednozasadowy</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202342B</td><td>Wymagany do aktywności reporterowej LacZ na X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Do selekcji wzrostu drożdży w selektywnych pożywkach</td></tr><tr><td>X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoksyl-beta-Dgalaktopiranozyd)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>X4281C100</td><td>&beta;-galaktozydaza zmienia kolor na bezbarwny X-gal niebieski w celu wykrycia interakcji białko-DNA</td></tr><tr><td>Ekstrakt</td><td>drożdżowy US Biologicals</td><td>Y2010</td><td>Pożywka do wzrostu i rozmnażania drożdży</td></tr><tr><td>Drożdżowa baza azotowa (w proszku) bez AA, węglowodanów i bez AS&nbsp;</td><td>US Biologicals</td><td>Y2030</td><td>Wymagane do energicznego wzrostu drożdży</td></tr></tbody></table>

ulepszone badania przesiewowe hybryd drożdży w celu identyfikacji powiązania czynnika transkrypcyjnego z sekwencjami ludzkiego dna

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identyfikacja zestawów czynników transkrypcyjnych (TF), które regulują każdy ludzki gen, jest trudnym zadaniem, które wymaga integracji wielu eksperymentalnych i obliczeniowych podejść. Jedną z takich metod jest test jednohybrydowy drożdży (Y1H), w którym interakcje między TF a regionami DNA są badane w środowisku jądra drożdży przy użyciu genów reporterowych. Testy Y1H obejmują dwa składniki: "przynętę DNA" (np. promotory, wzmacniacze, tłumiki itp.) oraz "ofiarę TF", którą można poddać badaniom przesiewowym pod kątem aktywacji genu reporterowego. Większość opublikowanych protokołów wykonywania badań przesiewowych Y1H opiera się na przekształcaniu bibliotek lub tablic TF-prey w szczepy drożdży przynęty DNA. W tym miejscu opisujemy potok, zwany rozszerzonymi testami Y1H (eY1H), w którym interakcje TF-DNA są badane przez kojarzenie szczepów przynęty DNA z uporządkowaną kolekcją szczepów TF-prey przy użyciu platformy robotycznej o wysokiej gęstości (HDA), która umożliwia badania przesiewowe w formacie 1,536 kolonii. Pozwala to na radykalny wzrost przepustowości (60 sekwencji przynęty DNA przeciwko >1000 TF zajmuje dwa tygodnie na badacza) i powtarzalności. Ilustrujemy różne rodzaje oczekiwanych wyników, testując ludzkie sekwencje promotorowe na tablicy 1,086 ludzkich TF, a także przykłady problemów, które mogą wystąpić podczas ekranów i sposobów ich rozwiązywania.

Podczas analizy wyników z testów eY1H należy wziąć pod uwagę trzy główne czynniki: tło aktywności reportera szczepu z przynętą DNA, siłę aktywności reportera odpowiadającą oddziaływaniom TF-DNA oraz liczbę kolonii dodatnich. Tło aktywności reportera (tzn. autoaktywność) szczepu z przynętą DNA odnosi się do całkowitego wzrostu i koloru kolonii drożdży na płytce odczytowej, nawet w przypadku braku TF-ofiary. W idealnym przypadku szczepy nieautoaktywne wykazują biały lub jasnobrązowy kolor tła, natomiast kolonie dla oddział...

Tutaj prezentujemy ulepszony protokół badań przesiewowych drożdży z jedną hybrydą, aby zidentyfikować czynniki transkrypcyjne (TF), które mogą wiązać się z interesującym nas regionem ludzkiego DNA. Ta metoda wykorzystuje potok przesiewowy o wysokiej przepływności, który może badać wiązanie >1 000 TF w jednym eksperymencie.

Ulepszone badania przesiewowe hybryd drożdży w celu identyfikacji powiązania czynnika transkrypcyjnego z sekwencjami ludzkiego DNA

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Celem ulepszonych testów jednohybrydowych drożdży jest zidentyfikowanie zestawu czynników transkrypcyjnych, które wiążą się z interesującą sekwencją DNA. Zaletą tej techniki jest to, że ulepszone testy jednohybrydowe drożdży mogą ocenić ponad 1000 czynników transkrypcyjnych w jednym eksperymencie. I odwrotnie, immunoprecypitacja chromatyny ocenia tylko jeden czynnik transkrypcyjny na raz.Metoda ta stanowi kluczowe narzędzie genomiki funkcjonalnej do identyfikacji repertuaru czynników transkrypcyjnych, które wiążą się z promotorami i wzmacniaczami genów oraz do identyfikacji zmienionego wiązania czynnika transkrypcyjnego z wariantami niekodującymi. Procedurę zademonstruje dr Xing Liu, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Rozmrozić na lodze talerze buliołowe z glicerolem drożdży za pomocą zestawu zdobyczy TF.Ponownie zawiesić drożdże za pomocą 12-kanałowej pipety i przejść do następnego kroku w ciągu 1 do 3 minut. Aby dostrzec drożdże w prostokątnych płytkach Sc minus tryptofanu, użyj robota matrycowego o wysokiej gęstości, aby wybrać wielodołkowe 96 płytek jako źródło, 96 płytek agarowych jako cel i 96 długich podkładek na szpilki. Podkładki pod szpilki nie nadają się do wielokrotnego użytku i należy je wyrzucić.Wybierz program Spot Many (Wykrywaj wiele), aby wykonać dwie kopie na płytkę 96-dołkową. Nie korzystaj z opcji recyklingu lub rewizyty, aby uniknąć zanieczyszczenia wstecznego zamrożonych zapasów. Wybierz także opcję wirowania w górę iw dół w źródle, aby wymieszać drożdże.Postępuj zgodnie z instrukcjami, gdzie i kiedy umieścić płytki i pozwól robotowi dostrzec drożdże na prostokątnych płytkach Sc minus tryptofan. Zapakuj nakrapianą tablicę i inkubuj ją agarem do góry w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 2 do 3 dni. Aby wygenerować 384 tablice kolonii w Sc minus prostokątne płytki tryptofanu, wybierz 96 płytek agarowych jako źródło, 384 płytki agarowe jako cel i 96 krótkich podkładek na szpilki.Następnie wybierz program z pojedynczym źródłem z tablicą 1:4. W ten sposób cztery 96 płytek kolonijnych zostaną skonsolidowane w jedną płytkę kolonijną 384. Nie korzystaj z opcji recyklingu lub rewizyty, aby uniknąć zanieczyszczenia między różnymi płytami.Zapakuj płytki i inkubuj nakrapianą matrycę kolonijacyjną 384 stroną z agarem do góry w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 2 dni. Aby wygenerować 1536 tablic kolonijnych w Sc minus prostokątne płytki tryptofanu, wybierz 384 płytki agarowe jako źródło, 1536 płytek agarowych jako cel i 384 krótkie podkładki na szpilki. Następnie wybierz program do oznaczania metodą 1:4 z jednym źródłem.Celem jest skopiowanie każdej kolonii do czterech kolonii, aby uzyskać poczwórne duplikaty. Skorzystaj z opcji recyklingu i ponownej wizyty, ponieważ wiąże się to z 4-krotnym kopiowaniem każdej kolonii. Postępuj zgodnie z instrukcjami robota i pozwól robotowi dostrzec drożdże na płytkach przed zapakowaniem i inkubacją nakrapianej tablicy kolonii 1536 stroną agarową do góry w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 3 dni.Aby wzmocnić tablicę kolonii 1536 w prostokątnych płytkach Sc minus tryptofan, wybierz 1536 płytek agarowych jako źródło, 1536 płytek agarowych jako cel i 1536 krótkich podkładek szpilkowych. Wybierz program Replikuj wiele, aby replikować od 3 do 4 kopii. Użyj opcji recyklingu i ponownej wizyty, ale wyrzuć podkładkę podczas przełączania na inną płytę tablicy, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.Pozwól robotowi wzmocnić tablicę kolonii 1536 w Sc minus prostokątne płytki tryptofanu. Na koniec zapakuj płytki i inkubuj nakrapianą tablicę kolonii 1536 stroną z agarem do góry w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 3 dni, aby użyć do etapów krycia. Aby przygotować trawniki z przynętą DNA do krycia, umieść szczepy przynęty drożdżowej DNA na płytce Sc minus uracyl i histydyna i rosnąć przez 3 dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Rozłóż drożdże na 15-centymetrowej płytce Sc minus uracyl i histydyna za pomocą sterylnej wykałaczki, tak aby każda płytka pasowała do 12 do 16 różnych szczepów. Inkubuj płytkę jednego dnia w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego dnia rozłóż drożdże na 15-centymetrowej płytce Sc minus uracyl i histydyna za pomocą sterylnej wykałaczki, tak aby każda płytka pasowała do 4 różnych szczepów.Inkubuj płytkę przez jeden dzień w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po inkubacji zeskrob drożdże sterylną wykałaczką, uważając, aby nie zeskrobać agaru. Dodaj drożdże do 1,5 mililitrowej probówki z 500 mikrolitrami sterylnej wody.Teraz dodaj 10 do 15 sterylnych szklanych kulek i zawiesinę drożdży na prostokątną płytkę YAPD. Wstrząsaj dokładnie we wszystkich kierunkach przez jedną minutę, aby upewnić się, że drożdże rozprowadzą się po całej płycie. Natychmiast odwróć talerz i postukaj, aby koraliki trafiły do pokrywki.Usuń koraliki i poddaj je recyklingowi. Zapakuj płytki i inkubuj je stroną agarową do dołu przez 1 do 2 dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnie przejdź do etapu krycia.Aby połączyć przynętę DNA drożdży i szczepy macierzy TF, przenieś macierz TF na prostokątną płytkę YAPD za pomocą robota. Wybierz płytkę agarową 1536 jako źródło i cel oraz krótką podkładkę z 1536. Wybierz program Replikuj wiele.Wybierz 4 płyty źródłowe oraz opcje recyklingu i ponownego przeglądu. Każda płyta matrycy TF może być używana do przenoszenia od 3 do 4 płyt YAPD. Płytki matrycowe TF używane do krycia muszą mieć od 2 do 3 dni, ale nie więcej, ponieważ krycie może być nieefektywne.Aby przenieść trawnik szczepu przynęty DNA na płytki YAPD już zawierające matrycę TF, wybierz płytkę agarową 1536 jako źródło i cel oraz krótką podkładkę 1536. Wybierz program Replikuj wiele. Użyj losowego przesunięcia w źródle o promieniu około 0,6 milimetra, aby uniknąć pobierania drożdży z tego samego miejsca i wybierz opcję Mix on Target, aby ułatwić kontakt między szczepami drożdży.Użyj trawnika zawierającego szczepy przynęty DNA jako źródła oraz płytek YAPD zawierających nakrapianą matrycę TF jako celu przed zapakowaniem płytek i inkubacją ich stroną agarową do góry w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jeden dzień. Aby wybrać drożdże diploidalne, wybierz płytkę agarową 1536 jako źródło i cel, a następnie wybierz krótką podkładkę z 1536. Wybierz program Replikuj.Wybierz opcję Mix on Source (Mieszaj) i on Target (Mieszaj w miejscu) i On Target (Celowe). Pozwól robotowi przenieść połączone drożdże z płytek YAPD na płytki Sc minus uracyl i tryptofan przed zapakowaniem płytek i inkubacją ich agarem do góry w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 2 do 3 dni. Teraz wybierz płytki agarowe 1536 jako źródło i cel oraz krótką podkładkę z 1536 szpilkami.Wybierz program Replikuj. Przenieść diploidalne drożdże z płytek Sc minus uracylu i tryptofanu na prostokątne płytki zawierające 3-AT i X-gal do odczytu za pomocą robota. Zapakuj płytki i inkubuj je stroną agarową do góry w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez okres do 7 dni.W przypadku szczepów przynęty DNA o wysokiej aktywności reporterowej tła zrób zdjęcia w dniach 2, 3 i 4. W przeciwnym razie rób zdjęcia w 4 i 7 dniu. Przechowuj płytki matrycy TF w temperaturze pokojowej i skopiuj ponownie po 7 dniach w celu przeprowadzenia nowej rundy badań przesiewowych.Aby zilustrować rodzaj wyników, które można uzyskać za pomocą ulepszonych testów jednohybrydowych drożdży, regiony promotorowe genów CCL15 i IL17F zostały przebadane pod kątem macierzy 1086 ludzkich TF. Promotor CCL15 jest przykładem nieautoaktywnej przynęty DNA, w której interakcje, nawet słabe, można łatwo wykryć. Promotor IL17F jest przykładem autoaktywnej przynęty DNA z nierównomierną aktywnością reporterową tła, w której można wykryć pewne interakcje, podczas gdy w przypadku kilku TF nie jest pewne, czy aktywność reporterowa jest wyższa niż tło.Istnieje kilka problemów, które mogą wystąpić podczas wykonywania ulepszonych testów jednohybrydowych drożdży. W takim przypadku kolonie są zbyt małe i nie można ich przenieść. Zazwyczaj około 95% kolonii ofiar TF wykazuje normalny wzrost.W tym przykładzie nie ma wzrostu drożdży w części talerza. Ten problem jest ogólnie związany z awarią na etapie krycia, jeśli podkładka z kołkiem 1536 nie ma kontaktu z drożdżami na trawniku z przynętą DNA, w układzie TF lub na płytce współpracującej. W tych dwóch przykładach nie wykryto żadnych interakcji.Problem ten jest często związany albo z niezamierzonymi mutacjami inaktywującymi w genach reporterowych, w szczególności LacZ, albo ze zbyt wysoką autoaktywnością, która maskuje interakcje. W tym przypadku na płytce pojawiają się losowe niebieskie plamki, które często są związane z zanieczyszczeniem bakteryjnym. Najważniejszą rzeczą do rozważenia jest odpowiednie przygotowanie talerza.Upewnij się, że wszystkie składniki są dodane i że wysokość agaru jest jednolita, ponieważ od tego zależą wszystkie kolejne kroki. Chociaż większość odczynników nie jest niebezpieczna, ważne jest, aby przez cały czas nosić rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek i płytek. Podobnie jak w przypadku każdego testu wiązania DNA, ważne jest, aby zweryfikować interakcje zidentyfikowane za pomocą testów funkcjonalnych, takich jak testy reporterowe, knockdown lub knockout czynnika transkrypcyjnego, a następnie pomiar ekspresji docelowego genu.Metoda ta pozwoliła na identyfikację czynników transkrypcyjnych, które regulują geny zaangażowane w poszczególne procesy biologiczne, a także czynników transkrypcyjnych wiążących się naprzemiennie z niekodującymi wariantami związanymi z chorobą.

enhanced-yeast-one-hybrid-screens-to-identify-transcription-factor

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym opracowaniu opisujemy badanie przesiewowe nadekspresji plazmidowej w Saccharomyces cerevisiae, z wykorzystaniem ułożonej w matrycy biblioteki plazmidów oraz wysokoprzepustowego protokołu transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy.

Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

Zmodyfikowaliśmy konwencjonalny screening dwuhybrydowy drożdżowy, który jest skutecznym narzędziem genetycznym w identyfikacji oddziaływań białkowych. Modyfikacja ta znacznie skraca cały proces, zmniejsza nakład pracy i, co najważniejsze, redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich. Ponadto podejście to jest powtarzalne i wiarygodne.

Zmodyfikowany system dwuhybrydowy drożdżowy do identyfikacji białek oddziałujących z czynnikiem wzrostu progranuliną

W tym filmie demonstrujemy zmodyfikowany test hybrydowy drożdży, który wykrywa wiele białek oddziałujących z docelowym DNA. Przekształcone komórki drożdży zawierają docelową sekwencję DNA przed genem reporterowym. Dodatkowo wykazują ekspresję białek czynnika transkrypcyjnego. Kiedy białka tworzą kompleksy i wiążą się z docelowym DNA, gen reporterowy ulega ekspresji i może być wykryty enzymatycznie.

Zmodyfikowany test hybrydowy drożdży i jeden do wykrywania interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę szybkiej budowy sztucznych czynników transkrypcyjnych (ATF) z pokrewnymi reporterami GFP oraz ilościowe określenie zdolności ATF do stymulowania ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej.

Szybka synteza i badania przesiewowe chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych za pomocą reporterów opartych na GFP

Bakteryjne białka efektorowe są ważne dla skutecznego leczenia infekcji. Protokół ten opisuje eksperymentalną identyfikację białkowych partnerów wiążących bakteryjne białko efektorowe w jego naturalnym żywicielu roślinnym. Identyfikacja tych oddziaływań efektorowych za pomocą dwuhybrydowych badań przesiewowych drożdży stała się ważnym narzędziem w odkrywaniu strategii patogenności molekularnej.

Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Przedstawiono strategię generowania mutacji w genach histonów w ich endogennym położeniu u Saccharomyces cerevisiae.

Ukierunkowana mutageneza in situ genów histonów u pączkujących drożdży

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Opisany tutaj zmodyfikowany test na jedną hybrydę drożdży jest rozszerzeniem klasycznego testu na hybrydę drożdży (Y1H) do badania i walidacji interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA w systemie heterologicznym dla dowolnego funkcjonalnego badania genomicznego.

Zmodyfikowany system hybrydowy drożdż-jeden do badań interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego i DNA

Przetwarzanie wsadowe drożdżowych 2-hybrydowych ekranów pozwala na bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty z wysoce złożonym zestawem białek fuzyjnych ofiar. W tym miejscu opisujemy udoskonalone metody, nowe odczynniki oraz sposób ich zastosowania w takich badaniach przesiewowych.

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Głębokie sekwencjonowanie populacji drożdży wybranych do pozytywnych interakcji drożdży z hybrydami 2 potencjalnie dostarcza wielu informacji na temat oddziałujących białek partnerskich. W tym miejscu opisujemy działanie konkretnych narzędzi bioinformatycznych i dostosowanego zaktualizowanego oprogramowania do analizy danych sekwencyjnych z takich ekranów.

Analiza informacyjna danych sekwencyjnych z przesiewów drożdżowych 2-hybrydowych

Przedstawione są tutaj cztery protokoły do konstruowania i wykorzystywania szczepów reporterowych drożdży Saccharomyces cerevisiae do badania potencjału transaktywacji ludzkiego P53, wpływu różnych mutacji związanych z rakiem, współekspresji białek oddziałujących oraz efektów określonych małych cząsteczek.

Drożdże jako podwozie do opracowywania testów funkcjonalnych do badania ludzkiego p53

Poznaj ulepszoną metodę hybryd drożdży do identyfikacji czynników transkrypcyjnych wiążących DNA ludzkie. Technika umożliwia przesiewanie ponad 1000 TF jednocześnie w genomice funkcjonalnej.

Ulepszone badania przesiewowe hybryd drożdży w celu identyfikacji powiązania czynnika transkrypcyjnego z sekwencjami ludzkiego DNA (Wideo) | JoVE Journal

Ulepszone badania przesiewowe hybryd drożdży w celu identyfikacji powiązania czynnika transkrypcyjnego z sekwencjami ludzkiego DNA

Przeglądaj więcej filmów