Name: Dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Poznaj metodę dośluzówkowej inokulacji komórek raka płaskonabłonkowego u myszy. Model ten pozwala profilować mikrośrodowisko immunologiczne guza i oceniać odpowiedź na leczenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem instytucjonalnej komisji ds. opieki i użytkowania zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kolorado w Denver (protokół nr 00250).
1. Hodowla komórek nowotworowych
UWAGA: Linie komórkowe B4B8 i LY2 zostały wykorzystane do wytworzenia ortotopowych guzów HNSCC: komórki nowotworowe B4B8 pochodziły z keratynocytów błony śluzowej przekształconych kancerogenami (z myszy BALB/C)11. Komórki nowotworowe LY2 pochodziły z przerzutów do węzłów chłonnych spontanicznie przekształconej linii keratynocytów BALB/C (Pam 212)12,13. Obie linie komórkowe zostały uprzejmie udostępnione przez dr. Nadarajaha Vigneswarana (UTHealth, Houston, TX, USA).
<ol>
	<li>Do utrzymania linii komórkowych należy używać zmodyfikowanej pożywki Eagle'a w wersji Dulbecco (DMEM) F/12 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% odczynnika przeciwdrobnoustrojowego. Linie komórkowe należy hodować w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Komórki powinny zostać wykorzystane do inokulacji przed przekroczeniem 15 pasaży.</li>
	<li>Wysiać od 2 x 106 do 4 x 106 komórek do kolb hodowlanych o powierzchni 175 cm2. 
	UWAGA: Należy upewnić się, że konfluencja komórek nie przekracza 90%, aby uniknąć wywołania odpowiedzi stresowej.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 70% konfluencji (~48 h), wyjąć kolbę z inkubatora i przemyć komórki 3x zimnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).</li>
	<li>Odlepić komórki z kolby, używając 0,25% trypsyny w ilości wystarczającej do pokrycia powierzchni płytki.
	<ol>
		<li>W tym celu do kolby o powierzchni 175 cm2 zawierającej komórki o 70% konfluencji należy wlać 4 mL trypsyny. Inkubować komórki z trypsyną przez 3–4 min w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.</li>
		<li>Sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki zostały odlepione.</li>
		<li>Dodać 12 mL pożywki DMEM F/12 zawierającej FBS, aby zneutralizować aktywność trypsyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odssać zawiesinę komórkową i przelać ją do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.</li>
	<li>Wymieszać komórki w probówce, odwracając ją 3x–4x.</li>
	<li>Opcjonalnie, zmieszać 10 µL alikwot zawiesiny komórkowej z 10 µL błękitu Trypan w probówce do mikrocentryfugi i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Żywotność komórek określić, odejmując liczbę komórek wybarwionych błękitem Trypan od całkowitej liczby komórek, a następnie dzieląc wynik przez całkowitą liczbę komórek.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Resuspendować komórki w pożywce DMEM bez surowicy i antybiotyków w odpowiedniej objętości, tak aby w 50 µL pożywki znajdowało się 1 x 106 komórek. 
	UWAGA: W oparciu o agresywność linii komórkowych in vivo (określoną empirycznie), dawkę 1 x 106 komórek na miejsce wstrzyknięcia na mysz uznano za odpowiednią dla komórek B4B8 i LY2.</li>
	<li>Umieścić probówkę z zawiesiną komórkową na lodzie.</li>
	<li>Umieścić uprzednio rozmrożoną macierz błony podstawnej na lodzie. 
	UWAGA: Macierz błony podstawnej była rozmrażana przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Iniekcja komórek do myszy
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę komórek i macierzy błony podstawnej w proporcji 1:1 (po 50 µL każdego składnika).</li>
	<li>Najpierw dodać komórki, a następnie stopniowo pipetować macierz błony podstawnej. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza. Należy upewnić się, że mieszanina została przygotowana bezpośrednio przed iniekcją u zwierzęcia. Długotrwałe przetrzymywanie komórek w macierzy błony podstawnej może prowadzić do ich osiadania w mieszaninie, co utrudnia jej intensywne wymieszanie. Spowoduje to znaczną zmienność wielkości guza u poszczególnych myszy.</li>
	<li>Wymieszać delikatnie. Wszystkie etapy z użyciem macierzy należy przeprowadzać w lodzie. Macierz błony podstawnej polimeryzuje w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować strzykawki do inokulacji.</li>
	<li>Napełnić strzykawki insulinowe o objętości 0,5 mL (23 G) ilością 100 µL roztworu komórek w macierzy błony podstawnej.</li>
	<li>Przechowywać strzykawki w lodzie, aby zapobiec polimeryzacji macierzy błony podstawnej.</li>
	<li>Zanestetyzować myszy, umieszczając je w komorze z izofluranem i tlenem (2,5%).</li>
	<li>Przed wykonaniem iniekcji upewnić się, że myszy są w głębokiej narkozie (poprzez sprawdzenie braku reakcji na uciśnięcie palca u stopy).</li>
	<li>Wprowadzić igłę w prawy lub lewy obszar policzka. Zabieg ten wykonuje się poprzez dostępną wolną przestrzeń po obu stronach pyska.</li>
	<li>Upewnić się, że język myszy nie blokuje dostępu. 
	UWAGA: Łatwo jest przebić język, co doprowadzi do powstania guzów języka. W razie potrzeby przesunąć język na przeciwną stronę.</li>
	<li>Trzymać strzykawkę równolegle do obszaru policzka podczas jej przebywania w jamie ustnej.</li>
	<li>W momencie gotowości do iniekcji, odsunąć strzykawkę i powoli wprowadzić ją pod kątem 10°.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 µL zawiesiny komórek w macierzy błony podstawnej w czasie 5 s.</li>
	<li>Przytrzymać strzykawkę w miejscu przez kolejne 5 s, aby upewnić się, że cały materiał został wstrzyknięty. 
	UWAGA: W przypadku myszy kontrolnych bez guzów, wstrzyknąć mieszaninę pożywki bez surowicy i macierzy (zgodnie z opisem powyżej) bez dodatku komórek nowotworowych.</li>
	<li>Delikatnie wycofać strzykawkę.</li>
	<li>Powtórzyć powyższą procedurę u pozostałych myszy.</li>
	<li>Odczekać 1 tydzień, aż guzy staną się widoczne makroskopowo (50–200 mm3 dla komórek B4B8 i LY2).</li>
</ol>
3. Monitorowanie myszy
<ol>
	<li>Wykonaj pierwszy pomiar za pomocą suwmiarki w 1. tygodniu po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. W celu obliczenia objętości guza za pomocą zewnętrznych pomiarów suwmiarką, wyznacz największą średnicę podłużną (długość) oraz największą średnicę poprzeczną (szerokość), a następnie zastosuj zmodyfikowany wzór elipsoidalny14,15. 
	<img alt="Wzór na objętość guza, V=1/2(długość×szerokość²), równanie matematyczne do szacowania wielkości guza." src="/files/ftp_upload/59195/59195eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie"></li>
	<li>Kontynuuj regularne pomiary objętości guza suwmiarką (1–2 razy w tygodniu w regularnych odstępach czasu).</li>
	<li>Mierz masę ciała zwierząt, aby ocenić wpływ wzrostu guza na odżywianie.</li>
</ol>
4. Pobieranie guzów
<ol>
	<li>Po osiągnięciu punktu końcowego eksperymentu uśmierć zwierzęta, stosując odpowiednie metody (np. uduszenie CO2, gilotynowanie lub zwichnięcie stawówśrodkowych kręgów szyjnych). 
	UWAGA: W niniejszym badaniu punkt końcowy uznawano za osiągnięty, jeśli myszy znajdowały się w stanie przedagonalnym (utrata masy ciała &gt;15% masy początkowej, brak pielęgnacji ciała, kacheksja) i/lub jeśli wielkość guza osiągnęła 1 000 mm3.</li>
	<li>Rozpocznij sekcję zwierzęcia, wykonując długie cięcie wzdłuż linii środkowej w obszarze szyi.
	<ol>
		<li>Użyj pęsety tępą do uchwycenia skóry i ostrych nożyczek do przecięcia skóry.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie wprowadź nożyczki pod skórę pokrywającą guz i stwórz pęcherze powietrzne, przesuwając nożyczki w poprzek i w głąb skóry.</li>
	<li>Po wystarczającym oddzieleniu skóry od guza zidentyfikuj drenujące węzły chłonne (DLNs) i usuń je, aby uniknąć zanieczyszczenia tkanki guza obecnością węzłów chłonnych. 
	UWAGA: Duże guzy mogą osiągać lub pokrywać DLN. W zależności od rodzaju wykonywanego testu, izolacja nienaruszonych węzłów chłonnych jest niezbędna, aby uniknąć przedostania się komórek odpornościowych do guza, co spowodowałoby zniekształcenie wyników analizy.</li>
	<li>Przecnij brzegi guza, aż cała jego objętość zostanie oddzielona.</li>
</ol>
5. Obróbka guza do dalszych zastosowań
<ol>
	<li>W celu późniejszego badania histologicznego umieścić guzy w 10% formalinie w temperaturze pokojowej. Aby uniknąć nadmiernej fiksacji, należy zastąpić formalinę 70% etanolem. Do analizy cytometrycznej z przepływem przetwarzamy guzy zgodnie z opisem poniżej. 
	UWAGA: Tkankę można przechowywać w formalinie przez 72 h, zanim nadmierna fiksacja stanie się problematyczna dla niektórych rodzajów barwień.</li>
	<li>Pokroić guz na kawałki o wielkości 1–2 mm, używając sterylnego ostrza żyletki lub ostrych nożyczek.</li>
	<li>Umieścić pokrojone kawałki guza w probówce stożkowej 50 mL z kolagenazą III (4 250 jednostek na próbkę), DNazą I (0,1 mg na próbkę) i inhibitorem trypsyny (1 mg na próbkę).</li>
	<li>Inkubować w 37 °C przez 30 min, wstrząsając co 10 min. 
	UWAGA: Próbki można umieścić w szczelnym woreczku, wysterylizować 90% etanolem i włożyć do inkubatora do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Po 30 min dodać 20 mL zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) i wirować przy 300 x g przez 5 min. 
	UWAGA: HBSS składa się z chlorku potasu, chlorku sodu, wodorowęglanu sodu, fosforanu sodu dwzasadowego, fosforanu sodu jednozasadowego i glukozy.</li>
	<li>Odlać nadsącz i resuspender osad w 2–3 mL buforu do lizy erytrocytów (RBC). Pipetować intensywnie. 
	UWAGA: Bufor do lizy RBC składa się z chlorku amonu, wodorowęglanu sodu i dwuwodorowodnorku sodu.</li>
	<li>Inkubować przez 2 min w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Dłuższa inkubacja może być toksyczna dla innych populacji komórek.</li>
	<li>Dodać 20 mL HBSS, aby zneutralizować działanie buforu do lizy.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 min i odlać nadsącz.</li>
	<li>Resuspender osad w 10 mL HBSS.</li>
	<li>Przepuścić roztwór przez nylonowy filtr 70 µm i wirować przy 300 x g przez 5 min. Odlać nadsącz.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 5.8–5.10 i przepuścić zawiesinę komórkową przez nylonowy filtr 40 µm, aby upewnić się, że z zawiesiny usunięto wszelkie dodatkowe zanieczyszczenia.</li>
</ol>
6. Barwienie komórek i akwizycja danych
<ol>
	<li>Resuspenduj osad komórkowy w 1 mL HBSS.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, zgodnie z opisem w kroku 1.7</li>
	<li>Określ całkowitą liczbę komórek i odpowiednie stężenie do barwienia. 
	UWAGA: Idealne stężenie komórek do barwienia w cytometrii przepływowej to 1–2 miliony komórek. Na przykład, jeśli barwienie jest przeprowadzane na płytce 96-dołkowej i dostępnych jest 10 milionów komórek, resuspenduj próbkę w 1 mL i nanieś 100 µL, aby uzyskać 1 milion komórek na dołek.</li>
	<li>Dodaj Fc block (CD16/CD32) w stężeniu 1:100, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu immunoglobulin z receptorami FcγIII i FcγII. Inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Odwiruj i resuspenduj osad komórkowy w 100 µL buforu do barwienia komórek w cytometrii przepływowej (składającego się z roztworu soli fizjologicznej zawierającego 5% FBS, 2% EDTA i 1% HEPES).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź barwienie powierzchniowe komórek zgodnie z instrukcjami dostawcy (dodając każde przeciwciało w odpowiednim rozcieńczeniu). Inkubuj przez 60 min w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Odwiruj i resuspenduj osad komórkowy w 100 µL HBSS. Powtórz 2x, aby usunąć nadmiar przeciwciał.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj próbki na odpowiednim cytometrze przepływowym.
	<ol>
		<li>W przypadku analizy markerów wewnątrzkomórkowych (np. foxp3), przeprowadź permeabilizację i barwienie komórek zgodnie z instrukcjami dostawcy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chaturvedi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worldwide+trends+in+incidence+rates+for+oral+cavity+and+oropharyngeal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Worldwide trends in incidence rates for oral cavity and oropharyngeal cancers.</a> Journal of Clinical Oncology. 31 (36), 4550-4559 (2013).</li>
<li>Ang, K. K., Sturgis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+as+a+marker+of+the+natural+history+and+response+to+therapy+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus as a marker of the natural history and response to therapy of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 128-142 (2012).</li>
<li>Amin, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Eighth+Edition+AJCC+Cancer+Staging+Manual%3A+Continuing+to+build+a+bridge+from+a+population-based+to+a+more+%26%2334%3Bpersonalized%26%2334%3B+approach+to+cancer+staging%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">The Eighth Edition AJCC Cancer Staging Manual: Continuing to build a bridge from a population-based to a more &#34;personalized&#34; approach to cancer staging.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (2), 93-99 (2017).</li>
<li>Salley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+carcinogenesis+in+the+cheek+pouch+of+the+Syrian+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian hamster.</a> Journal of Dental Research. 33 (2), 253-262 (1954).</li>
<li>Morris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+experimental+carcinogensis+in+the+hamster+cheek+pouch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Factors influencing experimental carcinogensis in the hamster cheek pouch.</a> Journal of Dental Research. 40, 3-15 (1961).</li>
<li>MacDonald, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+epithelial+dysplasia+in+hamster+cheek+pouch+carcinogenesis+and+human+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of epithelial dysplasia in hamster cheek pouch carcinogenesis and human oral mucosa.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine. 10 (3), 186-191 (1981).</li>
<li>Hawkins, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4NQO+carcinogenesis%3A+a+mouse+model+of+oral+cavity+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Head+%26+Neck%22%5BJournal%5D)">4NQO carcinogenesis: a mouse model of oral cavity squamous cell carcinoma.</a> Head & Neck. 16 (5), 424-432 (1994).</li>
<li>Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+cavity+and+esophageal+carcinogenesis+modeled+in+carcinogen-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice.</a> Clinical Cancer Research. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).</li>
<li>Vered, M., Yarom, N., Dayan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4NQO+oral+carcinogenesis%3A+animal+models%2C+molecular+markers+and+future+expectations%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">4NQO oral carcinogenesis: animal models, molecular markers and future expectations.</a> Oral Oncology. 41 (4), 337-339 (2005).</li>
<li>Bornstein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad4+loss+in+mice+causes+spontaneous+head+and+neck+cancer+with+increased+genomic+instability+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (11), 3408-3419 (2009).</li>
<li>Thomas, G. R., Chen, Z., Oechsli, M. N., Hendler, F. J., Van Waes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+expression+of+CD80+is+a+marker+for+increased+tumorigenicity+in+a+new+murine+model+of+oral+squamous-cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Decreased expression of CD80 is a marker for increased tumorigenicity in a new murine model of oral squamous-cell carcinoma.</a> International Journal of Cancer. 82 (3), 377-384 (1999).</li>
<li>Yuspa, S. H., Hawley-Nelson, P., Koehler, B., Stanley, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+transformation+markers+in+differentiating+epidermal+cell+lines+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A survey of transformation markers in differentiating epidermal cell lines in culture.</a> Cancer Research. 40 (12), 4694-4703 (1980).</li>
<li>Chen, Z., Smith, C. W., Kiel, D., Van Waes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+variants+derived+following+in+vivo+tumor+progression+of+an+in+vitro+transformed+squamous+cell+carcinoma+line+acquire+a+differential+growth+advantage+requiring+tumor-host+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Metastatic variants derived following in vivo tumor progression of an in vitro transformed squamous cell carcinoma line acquire a differential growth advantage requiring tumor-host interaction.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 15 (5), 527-537 (1997).</li>
<li>Euhus, D. M., Hudd, C., LaRegina, M. C., Johnson, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+measurement+in+the+nude+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor measurement in the nude mouse.</a> Journal of Surgical Oncology. 31 (4), 229-234 (1986).</li>
<li>Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+subcutaneous+tumor+size+in+athymic+%28nude%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemotherapy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).</li>
<li>Yushkevich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((User-guided+3D+active+contour+segmentation+of+anatomical+structures%3A+significantly+improved+efficiency+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability.</a> NeuroImage. 31 (3), 1116-1128 (2006).</li>
<li>Dutta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+tumour+necrosis%2C+tumour+proliferation%2C+local+and+systemic+inflammation%2C+microvessel+density+and+survival+in+patients+undergoing+potentially+curative+resection+of+oesophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Britisch+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The relationship between tumour necrosis, tumour proliferation, local and systemic inflammation, microvessel density and survival in patients undergoing potentially curative resection of oesophageal adenocarcinoma.</a> Britisch Journal of Cancer. 106 (4), 702-710 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cell+lines+and+human+tumors%3A+a+rational+approach+to+preclinical+model+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection.</a> Molecular Cancer Research. 12 (4), 571-582 (2014).</li>
<li>Walsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Mouse+Models+of+Clinical+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Humanized Mouse Models of Clinical Disease.</a> Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).</li>
<li>Oweida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+sensitizes+tumors+to+PD-L1+immune+checkpoint+blockade+in+orthotopic+murine+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation sensitizes tumors to PD-L1 immune checkpoint blockade in orthotopic murine head and neck squamous cell carcinoma.</a> OncoImmunology. 6 (10), e1356153(2017).</li>
<li>Ferris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+evaluations+of+nivolumab+%28nivo%29+versus+investigator%E2%80%99s+choice+%28IC%29+chemotherapy+for+recurrent+or+metastatic+%28R%2FM%29+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck+%28SCCHN%29%3A+CheckMate+141%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Further evaluations of nivolumab (nivo) versus investigator’s choice (IC) chemotherapy for recurrent or metastatic (R/M) squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN): CheckMate 141.</a> Journal of Clinical Oncology. 34, (2016).</li>
<li>Ferris, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+for+Recurrent+Squamous-Cell+Carcinoma+of+the+Head+and+Neck%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab for Recurrent Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1856-1867 (2016).</li>
<li>Harrington, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+standard%2C+single-agent+therapy+of+investigator%27s+choice+in+recurrent+or+metastatic+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck+%28CheckMate+141%29%3A+health-related+quality-of-life+results+from+a+randomised%2C+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus standard, single-agent therapy of investigator's choice in recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (CheckMate 141): health-related quality-of-life results from a randomised, phase 3 trial.</a> The Lancet Oncology. 18 (8), 1104-1115 (2017).</li>
<li>Kiyota, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized%2C+open-label%2C+Phase+III+clinical+trial+of+nivolumab+vs.+therapy+of+investigator%27s+choice+in+recurrent+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%3A+A+subanalysis+of+Asian+patients+versus+the+global+population+in+checkmate+141%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">A randomized, open-label, Phase III clinical trial of nivolumab vs. therapy of investigator's choice in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck: A subanalysis of Asian patients versus the global population in checkmate 141.</a> Oral Oncology. 73, 138-146 (2017).</li>
<li>Ling, D. C., Bakkenist, C. J., Ferris, R. L., Clump, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Immunotherapy+in+Head+and+Neck+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Role of Immunotherapy in Head and Neck Cancer.</a> Seminars in Radiation Oncology. 28 (1), 12-16 (2018).</li>
<li>Perri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioresistance+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+Biological+bases+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Head+%26+Neck%22%5BJournal%5D)">Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications.</a> Head & Neck. 37 (5), 763-770 (2015).</li>
<li>Yamamoto, V. N., Thylur, D. S., Bauschard, M., Schmale, I., Sinha, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+radioresistance+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">Overcoming radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncology. 63, 44-51 (2016).</li>
<li>Bonner, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+cetuximab+for+locoregionally+advanced+head+and+neck+cancer%3A+5-year+survival+data+from+a+phase+3+randomised+trial%2C+and+relation+between+cetuximab-induced+rash+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival.</a> The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+EphB4-Ephrin-B2+Signaling+Enhances+Response+to+Cetuximab-Radiation+Therapy+in+Head+and+Neck+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+radiosensitization+in+EphB4+receptor-expressing+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas.</a> Scientific Reports. 6, 38792(2016).</li>
<li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+radiation+and+immunotherapy%3A+a+new+systemic+therapy+for+solid+tumors%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors?</a> Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).</li>
<li>Oweida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+radiotherapy+and+PD-L1+blockade+is+mediated+by+TIM-3+upregulation+and+regulatory+T-cell+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration.</a> Clinical Cancer Research. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rygorystyczna analiza i charakterystyka mikrośrodowiska guza stanowią ważną strategię dla zrozumienia mechanizmów rozwoju, progresji i przerzutów guza oraz dla opracowania skutecznych terapii. Rak głowy i szyi jest złożoną chorobą, która może wywodzić się z wielu miejsc anatomicznych w okolicy głowy i szyi. Główną przeszkodą w zrozumieniu mechanizmów choroby i ulepszeniu terapii jest brak linii komórkowych myszy myszy, które przypominają agresywną i przerzutową naturę ludzkich HNSCC. Ponadto wiele modeli mysich wykorzyst...

HNSCC jest piątym najczęściej występującym nowotworem złośliwym na świecie, z ponad 600 000 pacjentów diagnozowanych rocznie1. Pomimo agresywnego leczenia obejmującego chemioterapię i radioterapię (RT), wskaźnik całkowitego przeżycia (OS) dla pacjentów z HNSCC bez zakażenia wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) utrzymuje się poniżej 50% po 5 latach2. Jest to w dużej mierze przypisywane bardzo złożonemu mikrośrodowisku guza, ponieważ guzy mogą pochodzić z kilku różnych miejsc anatomicznych w okolicy głowy i szyi, w tym błony śluzowej policzka, języka, dna jamy ustnej, jamy nosowej, jamy ustnej, gardła, części ustnej i gardła dolnego. Ponadto obszar głowy i szyi jest silnie unaczyniony i zawiera prawie połowę wszystkich węzłów chłonnych w ciele3. Większość badań dotyczących biologii nowotworów głowy i szyi opiera się na modelach guzów w okolicy boku. Takie modele mogą zapewnić wgląd w mechanizmy wewnętrzne nowotworu, ale brak natywnego mikrośrodowiska głowy i szyi może znacząco wpłynąć na potencjał translacyjny takich odkryć. Jedną z metod, która została zastosowana do wywołania nowotworów jamy ustnej, jest narażenie na rakotwórczy 9,10-dimetylo-1,2-benzantracen (DMBA)4. Jednak metoda ta wiąże się z długotrwałym procesem, indukuje nowotwory u szczurów i chomików, ale nie u myszy, a powstałe guzy nie posiadają wielu cech histologicznych zróżnicowanych SCCs5,6. Wprowadzenie czynnika rakotwórczego-1-nitrochinoliny (4-NQO), rozpuszczalnej w wodzie pochodnej chinolonu, spowodowało nowotwory jamy ustnej myszy po podaniu doustnym, ale cierpiało również z powodu długich czasów ekspozycji (16 tygodni) i ograniczonego wskaźnika przyjmowania w obrębie i między partiami myszy7,8,9. W celu opracowania klinicznie istotnych modeli, kilka grup wykorzystało genetycznie zmodyfikowane modele obejmujące manipulację onkogenami napędowymi lub genami supresorowymi nowotworów, w tym TP53, TGFB, KRAS, HRAS i SMAD410. Modele te mogą oferować wgląd w nowotwory ze znanymi genami sterującymi, ale nie podsumowują złożonej heterogeniczności ludzkich HNSCC.
W tej pracy pokazujemy możliwość przeprowadzenia dośluzówkowej inokulacji komórek raka płaskonabłonkowego u myszy. Zaszczepione komórki przekształcają się w agresywne guzy w ciągu 1 tygodnia od wstrzyknięcia. Podobnie jak w przypadku ludzkich HNSCC, guzy dają przerzuty do regionalnych węzłów chłonnych. Charakteryzujemy histologiczne i kliniczne cechy choroby oraz zapewniamy wgląd w mikrośrodowisko immunologiczne guza. Proponujemy, aby ten ortotopowy model HNSCC miał zastosowanie w biologii nowotworów, immunologii nowotworów i badaniach przedklinicznych. Mechanizmy unikania odpowiedzi immunologicznej, progresji nowotworu, oporności na leczenie i przerzutów reprezentują obszary o znaczeniu klinicznym, które można rozwiązać za pomocą proponowanego modelu.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza III</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS004183</tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS006328</tr><tr><td>Blok Fc (CD16/32)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>&nbsp; Klon 2.4G2&nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor do barwienia cytometrii przepływowej</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175079</td><td>bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenoczerwonej</td></tr><tr><td>cytometru masowego Helois</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel membrana</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CB-40234B</td><td></td></tr><tr><td>Skaner MRI</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td>7.4 Tesla</td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS002830</tr></tbody></table>

dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC) jest wyniszczającą i śmiertelną chorobą z dużą częstością nawrotów i niepowodzeniem leczenia. Aby opracować lepsze strategie terapeutyczne, ważne jest zrozumienie czynników mikrośrodowiskowych guza, które przyczyniają się do oporności na leczenie. Główną przeszkodą w zrozumieniu mechanizmów choroby i ulepszeniu terapii jest brak mysich linii komórkowych, które przypominają agresywną i przerzutową naturę ludzkich HNSCC. Ponadto większość modeli mysich wykorzystuje podskórne implantacje guzów, które nie mają ważnych cech fizjologicznych okolicy głowy i szyi, w tym dużej gęstości naczyń, rozległego unaczynienia limfatycznego i rezydentnej flory śluzówkowej. Celem pracy jest opracowanie i scharakteryzowanie ortotopowego modelu HNSCC. Wykorzystujemy dwie genetycznie odrębne linie komórek mysich i ustalone guzy w błonie śluzowej policzka myszy. Optymalizujemy metody trawienia guzów oparte na kolagenazie w celu optymalnego odzyskiwania pojedynczych komórek z powstałych guzów. Przedstawione tutaj dane pokazują, że u myszy rozwijają się silnie unaczynione guzy, które dają przerzuty do regionalnych węzłów chłonnych. Analiza wieloparametrycznej cytometrii masowej pojedynczej komórki wykazuje obecność różnych populacji immunologicznych, przy czym komórki szpikowe stanowią większość wszystkich komórek odpornościowych. Model zaproponowany w tym badaniu ma zastosowanie w biologii nowotworów, immunologii nowotworów i przedklinicznym rozwoju nowych terapii. Podobieństwo modelu ortotopowego do klinicznych cech choroby u ludzi dostarczy narzędzia do lepszego przekładu i poprawy wyników leczenia pacjentów.

Ocena in vitro proliferacji komórek LY2 i B4B8 wykazała, że obie linie komórkowe mają podobny czas podwojenia (odpowiednio 21 h i 23 h). In vivo obie linie komórkowe utworzyły pojedynczą, widoczną i wyczuwalną masę w ciągu 1 tygodnia od inokulacji (Ryc. 1A). U myszy z guzami LY2 w 3. tygodniu doszło do przemieszczenia żuchwy z powodu obciążenia nowotworowego (Ryc. 1A). Myszy kontrolne, które nie otrzymały komórek nowotworowych, z...

Tutaj prezentujemy powtarzalną metodę tworzenia ortotopowego mysiego modelu raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Guzy wykazują klinicznie istotne cechy histopatologiczne choroby, w tym martwicę, słabe różnicowanie, przerzuty węzłowe i naciek immunologiczny. U myszy z guzem rozwijają klinicznie istotne objawy, w tym dysfagię, przemieszczenie szczęki i utratę wagi.

Dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Nowotwory okolicy głowy i szyi stają się coraz bardziej powszechne. Jednak wiedza na temat mikrośrodowiska guza i mechanizmów oporności na leczenie w tym regionie jest ograniczona. Technika ta może być wykorzystana do podsumowania natywnego mikrośrodowiska nowotworów głowy/szyi w przystępny sposób i wywołuje objawy kliniczne podobne do tych obserwowanych u ludzi.Gdy hodowla komórek nowotworowych osiągnie 70% konfluencji, przemyj komórki trzy razy zimnym PBS na płukanie i dołącz komórki wystarczającą ilością 0,25% trypsyny, aby pokryć dolną powierzchnię kolby hodowlanej. Po trzech do czterech minutach w inkubatorze do hodowli komórkowych potwierdź odłączenie pod mikroskopem świetlnym i zneutralizuj trypsynę za pomocą 12 mililitrów pożywki DMEM F12, uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą. Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i wymieszaj komórki trzy do czterech razy przez inwersję.Następnie zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w surowicy i DMEM bez antybiotyków w ilości od 10 do szóstych komórek nowotworowych na 50 mikrolitrów średniego stężenia na lodzie. Bezpośrednio przed wstrzyknięciem należy wymieszać komórki w stosunku zawiesiny komórek nowotworowych jeden do jednego do macierzy błony podstawnej na lodzie. Załaduj jedną strzykawkę o pojemności 0,5 mililitra wyposażoną w igłę o rozmiarze 23 z 100 mikrolitrami komórek na zwierzę biorcy.Umieścić strzykawki na lodzie i potwierdzić brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy. Następnie włóż igłę do prawej lub lewej okolicy policzkowej przez dostępną otwartą przestrzeń po obu stronach jamy ustnej, trzymając strzykawkę równolegle do obszaru policzkowego, gdy znajduje się ona w jamie ustnej, aby ułatwić wstrzyknięcie pełnej objętości 100 mikrolitrów zawiesiny macierzy błony podstawnej komórki w ciągu pięciu sekund. Trzymaj strzykawkę na miejscu przez dodatkowe pięć sekund, aby upewnić się, że cały materiał został wstrzyknięty przed delikatnym wyjęciem strzykawki.Guzy staną się rażąco widoczne za około tydzień. Tydzień po wstrzyknięciu należy użyć suwmiarki do zmierzenia długości i szerokości każdego guza, aby określić objętość guza raz do dwóch razy w tygodniu. I zmierz wagę każdego zwierzęcia, aby ocenić wpływ wzrostu guza na karmienie.W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym użyj ostrych nożyczek i kleszczy, aby wykonać nacięcie skóry przez linię środkową szyi. I delikatnie włóż nożyczki pod skórę pokrywającą guz, aby utworzyć kieszenie powietrzne, wciskając nożyczki w poprzek i w skórę. Gdy skóra zostanie wystarczająco oderwana od guza, należy wyciąć drenujące węzły chłonne, aby uniknąć zamieszania tkanki nowotworowej przez obecność tkanki limfatycznej i przeciąć granice guza, aż cała objętość zostanie oderwana.Aby przetworzyć guz do dalszej analizy, pokrój guz na kawałki o wielkości od jednego do dwóch milimetrów i umieść je w 50-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej kolagenazę trzy, DNA jeden i inhibitor trypsyny. Po inkubacji kawałków guza w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, z wytrząsaniem co 10 minut, dodaj 20 mililitrów HBSS do probówki i przepuść zawiesinę zawierającą kawałki guza przez nylonowe sitko o średnicy 70 mikrometrów. Użyj pięciomililitrowego tłoka strzykawki, aby zetrzeć kawałki guza w sitku i dodaj dodatkowe 10 mililitrów HBSS przez sitko.Odwiruj komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w dwóch do trzech mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek z rygorystycznym pipetowaniem, neutralizując lizę za pomocą 20 mililitrów świeżego HBSS po dwóch minutach w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić komórki w dodatkowych 20 mililitrach HBSS do kolejnego odwirowania i przecedzić komórki przez filtr nalewany o średnicy 40 mikrometrów, aby usunąć wszelkie końcowe zanieczyszczenia z zawiesiny komórek nowotworowych.Guzy LY2 rosną szybciej w porównaniu z guzami B4B8. A myszy, które wykazują przemieszczenie szczęki, szybko tracą na wadze z powodu dysfagii. Mediana przeżycia u myszy LY2 jest również o ponad połowę mniejsza niż obserwowana u myszy z guzem B4B8.Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego myszy z guzem pokazuje dobrze odgraniczone guzy rozciągające się do wewnętrznej warstwy błony śluzowej policzka, ale nie do języka ani innych pobliskich narządów. Badanie histologiczne wskazuje, że u wszystkich myszy z guzem LY2 rozwija się słabo zróżnicowany rak płaskonabłonkowy, podczas gdy u myszy z guzami B4B8 rozwija się umiarkowanie zróżnicowany rak płaskonabłonkowy. Wszystkie myszy z guzem LY2 mają również histologicznie potwierdzoną martwicę, przy czym większość wykazuje umiarkowaną lub ciężką martwicę.W tym reprezentatywnym eksperymencie guz LY2 został pobrany i przetworzony trzy tygodnie po wstrzyknięciu komórek nowotworowych okolicy policzkowej, jak wykazano. Komórki odpornościowe CD45-dodatnie stanowiły 7,3% całkowitej populacji komórek nowotworowych. Komórki szpikowe CD11b-dodatnie stanowiły 37,8% wszystkich komórek CD45-dodatnich, z których większość określono jako makrofagi F480-dodatnie, z niewielkimi populacjami neutrofili i komórek supresorowych pochodzących z mieloidu.Limfocyty T stanowiły 15,9% populacji komórek odpornościowych CD45-dodatnich, z czego 53,4% stanowiły limfocyty T regulatorowe FoxP3-dodatnie CD4-dodatnie. Komórki NK stanowiły mniej niż 2% wszystkich komórek CD45-dodatnich. Ważne jest, aby ćwiczyć wstrzykiwanie, aby rozwinąć pewność i komfort podczas trzymania igły i myszy biorcy oraz odsłaniania pyska zwierzęcia.Po pomyślnym przeprowadzeniu zabiegu można przeprowadzić eksperymenty polegające na ocenie odpowiedzi guza na terapię lub ocenie czynników wewnętrznych i mikrośrodowiskowych guza. Technika ta utorowała drogę do zaprojektowania zainicjowanego przez badaczy badania klinicznego, oceniającego efekty połączenia radioterapii z terapią anty-PL1 u pacjentów z rakiem głowy i szyi.

intramucosal-inoculation-squamous-cell-carcinoma-cells-mice-for-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Aby zbadać wzrost guza oraz mikrośrodowisko nowotworowe in vivo, zastosowaliśmy syngeniczny i ortotopowy model raka jajnika u immunokompetentnych myszy. Przetransdukowaliśmy linię komórkową nowotworu mysiego (MOV1) białkiem fluorescencyjnym Katushka (MOV1KAT), a w niniejszej pracy przedstawiamy sposób jej ortotopowej implantacji do jajnika oraz obrazowanie in vivo.

Ortotopowy model surowiczego raka jajnika u immunokompetentnych myszy do obrazowania guzów in vivo i monitorowania odpowiedzi immunologicznych guza

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

W tym filmie rozwijamy ortotopowy model mysiego raka głowy i szyi poprzez dośluzówkowe inokulację linii komórkowej raka płaskonabłonkowego. Mysz z nowotworem wykazywałaby podobieństwo do klinicznie istotnych objawów choroby u ludzi, a zatem może być wykorzystana do badania progresji raka i odkrywania nowych strategii terapeutycznych.

Dośluzówkowa inokulacja komórek rakowych w modelu mysim: procedura mająca na celu ustalenie ortotopowego mysiego modelu raka głowy i szyi

Ten film demonstruje test szczepienia nowotworów na bazie komórek. Mysz, której śródskórnie wstrzyknięto komórki czerniaka B16-F10 w celu powstania guza, jest szczepiona komórkami B16-F10 wydzielającymi cytokinę Flt3L w pobliżu rozwiniętego guza. Wydzielany Flt3L ze szczepionki wspomaga dojrzewanie i proliferację komórek dendrytycznych, które następnie prezentują antygeny nowotworowe limfocytom T w węzłach chłonnych, wywołując ukierunkowaną przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną.

Implantacja guza i wstrzyknięcie szczepionki przeciwnowotworowej w modelu mysim

Model raka pęcherza moczowego wywołanego N-butylo-N-(4-hydroksybutylo)nitrozoaminą został opracowany u transgenicznych myszy ludzkich mucyny 1 (MUC1) w celu przetestowania immunoterapii ukierunkowanej na MUC1.  Po podaniu szczepionki peptydowej ukierunkowanej na MUC1 potwierdzono odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T na MUC1 poprzez pomiar poziomu cytokin w surowicy i aktywności specyficznej dla limfocytów T.

Indukcja inwazyjnego raka przejściowokomórkowego pęcherza moczowego u nienaruszonych immunologicznie ludzkich myszy transgenicznych MUC1: model rozwoju immunoterapii

Ten protokół opisuje powstawanie mysich ortotopowych guzów pęcherza moczowego u samic myszy C57BL/6J oraz monitorowanie wzrostu guza.

Mysi ortotopowy model guza pęcherza moczowego i system wykrywania guzów

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu guza do charakterystyki limfocytów naciekanych nowotworem w modelu guza myszy w intruzie naturalnym i pochodzącym z obwodu limfocytach. Specyficzne śledzenie napływu komórek odpornościowych pochodzących od biorcy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia dynamikę zmian fenotypowych i funkcjonalnych tych komórek podczas przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych.

Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy

Tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej jest utrudnione ze względu na jego płytką głębokość penetracji w tkanki. W tym miejscu opisujemy mysi model komory z oknem grzbietowym, który umożliwia jednoczesną rejestrację mikroskopii przyżyciowej i klinicznie stosowanych metod obrazowania (np. CT, MRI) w celu bezpośredniej korelacji przestrzennej, potencjalnie usprawniając kliniczne tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej.

Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego do połączonej mikroskopii przyżyciowej i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego w translacyjnych badaniach nad rakiem

Niniejsze badanie koncentruje się na indukcji in vivo podskórnej indukcji luminescencyjnych komórek raka jelita grubego w modelu mysim oraz na późniejszym pomiarze luminescencji za pomocą systemu obrazowania. Procedura ma na celu stworzenie powtarzalnego modelu wzrostu guza do monitorowania w czasie rzeczywistym i oceny terapeutycznej.

Podskórne zastrzyki ludzkich komórek raka jelita grubego u athymicznych nagich myszy w celu oceny skuteczności przeciwnowotworowej

Unikalna metoda chirurgicznej resekcji raka płaskonabłonkowego jamy ustnej powstałych w jamie ustnej została przedstawiona tutaj.

Translacyjnie istotny model resekcji guza dla przedklinicznych modeli myszy raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Wraz ze wzrostem zainteresowania immunoterapią wnętrznowrzodową, wybór modeli nowotworów, które są dostępne i praktyczne, jest niezbędny. Guzy podskórne są łatwe do ustanowienia, ale trudne do wizualizowania i manipulowania. W tym protokole opisujemy metody generowania guzów śródskórnych, które zapewniają lepszą widoczność i dostępność.

Wszczepienie nowotworu śródskórnego jako solidny model badań nad immunoterapią guzów mysich wewnątrzguzikowych

Poznaj metodę dośluzówkowej inokulacji komórek raka płaskonabłonkowego u myszy. Model ten pozwala profilować mikrośrodowisko immunologiczne guza i oceniać odpowiedź na leczenie.

Dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie (Wideo) | JoVE Journal

Dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie

Przeglądaj więcej filmów