Name: Zautomatyzowane pomiary snu i aktywności lokomotorycznej u meksykańskich ryb jaskiniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę pomiaru snu i aktywności lokomotorycznej u meksykańskich ryb jaskiniowych w warunkach socjalnych. To podejście umożliwia badanie zachowań ryb w różnych kontekstach społecznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez nagrodę NIGMS GM127872 ACK, nagrodę NINDS 105072 dla ERD i ACK oraz nagrodę NSF 1656574 dla ACK.

UWAGA: Ustaw systemy śledzenia zachowań u larw i dorosłych.
1. Konstruowanie systemu usypiania dla larw
UWAGA: System monitorowania do śledzenia larw przez młode ryby w wieku 4 dni po zapłodnieniu (dpf) do 30 dpf A. mexicanus wymaga wielu elementów wyposażenia, w tym oświetlenia podczerwonego (IR), akrylowych dyfuzorów światła IR, automatycznych kontroli światła (timerów), komputerów, kamer i materiałów wtórnych, takich jak okablowanie i kontrolery zasilania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Poniższe instrukcje poinformują o tym, jak zbudować system do dokładnego śledzenia zachowań lokomotorycznych w celu badania snu i rytmów okołodobowych u larw A. mexicanus. 
<ol>
	<li>Zbuduj system oświetleniowy składający się z diod elektroluminescencyjnych IR i światła białego (LED): Umieść trzy lampy IR w trójkącie w odległości około 7.62 cm od siebie na cienkim metalowym radiatorze platformy o wymiarach 30.5 cm x 30.5 cm. Połącz światła szeregowo z przewodem elektrycznym i podłącz do źródła zasilania.</li>
	<li>Umieść pojedynczą białą diodę LED pośrodku trzech lamp podczerwieni i podłącz je do źródła zasilania.</li>
	<li>Podłącz źródło zasilania diody LED do zegara świetlnego ustawionego na standardowy czas okołodobowy.</li>
	<li>Zbuduj platformę do systemu śledzenia larw. Użyj białego akrylu o grubości 0,33 cm do wszystkich elementów platformy.</li>
	<li>Umieść platformę nagrywającą na podświetlanym kwadratowym radiatorze, na którym będą znajdować się areny zawierające ryby podczas śledzenia behawioralnego.</li>
	<li>Umieść drugi akryl w pudełku między światłami a zwierzętami, aby rozproszyć podczerwień w celu uzyskania optymalnego oświetlenia i kontrastu. 
	UWAGA: Wymiary kasetonu larwalnego są następujące: Dwie diody LED o wymiarach 18 cm x 8,5 cm i dwie diody LED o wymiarach 17 cm x 8,5 cm, które są chemicznie połączone ze sobą, tworząc kwadrat o wymiarach 18 cm x 18 cm i wysokości 8,5 cm. Dodatkowo akryl można łatwo ciąć lub wiercić przy użyciu odpowiednich narzędzi do niestandardowego rozmiaru.
	<ol>
		<li>Umieść cały etap śledzenia larw i zestaw oświetlenia w dołączonej plastikowej rurce, a następnie umieść kamerę na górze probówki. 
		nuta: Ważne jest, aby odbicia oświetlenia nie pojawiały się na śledzącym wideo, ponieważ pogorszy to dokładność śledzenia. Umieszczenie kamer na rurze otaczającej platformę poprawia oświetlenie i ostrość kamer używanych do tych eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Manipuluj kamerą internetową (patrz tabela materiałów), aby nagrywać w podczerwieni. Zdejmij soczewkę producenta za pomocą narzędzia obrotowego (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wykręć małe srebrne z tyłu aparatu, aby zdjąć wewnętrzną obudowę.</li>
	<li>Wykręć małe czarne wewnątrz korpusu aparatu, aby poluzować pozostałą część obiektywu. Użyj małego śrubokręta, aby usunąć wszelkie części obudowy obiektywu, które pozostały po przecięciu obiektywu.</li>
	<li>Usuń niebieską diodę LED z górnej części obudowy ładowanego sprzężonego urządzenia (CCD).</li>
	<li>Złóż kamerę z powrotem, ustawiając wewnętrzną obudowę z powrotem w pierwotnej orientacji i przykręcając dwie srebrne z powrotem do ich pierwotnej pozycji.</li>
	<li>Poprowadź wnętrze kamery za pomocą małej piły, aby pasowała do zaokrąglonego plastikowego frezu. Wygładź dodatkowy plastik, aż będzie pasował do adaptera obiektywu.</li>
	<li>Zainstaluj filtr podczerwieni wewnątrz kamery jak najbliżej CCD, bez bezpośredniego kontaktu z kamerą. 
	nuta: Uważaj, aby nie uszkodzić chipa CCD w obudowie kamery. Upewnij się, że cięcie jest jak najbardziej równe. Uszczelnij wolną przestrzeń między zewnętrzną częścią filtra podczerwieni a korpusem aparatu, aby światło nie docierało do matrycy CCD bez filtrowania.</li>
	<li>Przymocuj aparat do obiektywu stałoogniskowego 35 mm (patrz tabela materiałów), wkręcając adapter z przodu aparatu z tyłu obiektywu.</li>
	<li>Umieść kamerę i obiektyw w otworze wywierconym w pokrywie na górze rury, w której znajduje się scena i światła, a następnie podłącz USB do komputera, z którego zwierzęta będą nagrywane. 
	nuta: Umieść ryby w pomieszczeniu behawioralnym, które jest oddzielone od miejsca, w którym trzymane są ryby hodowlane, aby zapewnić minimalne zakłócenia podczas nagrań behawioralnych. Zadbaj o to, aby zminimalizować wahania temperatury i wentylacji, które mogą zmylić eksperymenty behawioralne.</li>
</ol>
2. System snu dla dorosłych
<ol>
	<li>Zbuduj system oświetlenia w podczerwieni do śledzenia dorosłych ryb, przycinając paski podczerwieni w odstępach około 46 cm. Jeden pasek o długości 46 cm wystarcza na każdy zbiornik o pojemności 10 litrów.</li>
	<li>Połącz ze sobą każdą listwę szeregowo, przylutowując każdą listwę do przewodu elektrycznego prądu stałego i podłącz do źródła zasilania 9 V.</li>
	<li>Przymocuj każdy pasek IR do kawałka aluminium o wymiarach 51 cm x 5.1 cm, który będzie działał jak radiator.</li>
	<li>Umieść arkusz akrylowy o wymiarach 46 cm x 5 cm, grubości 0,32 cm, 9% przepuszczalności światła białego bezpośrednio przed każdym paskiem światła IR, aby rozproszyć światło podczerwone.</li>
	<li>Umieść wszystkie zbiorniki na stojaku, który obsługuje oświetlenie IR montowane z tyłu.</li>
	<li>Użyj nieprzezroczystych plastikowych przegród w szklanych zbiornikach o pojemności 10 litrów, aby stworzyć indywidualne areny. 
	nuta: Wielkość areny można zmieniać w zależności od liczby użytych przegród i wielkości zbiornika. Wielkość areny wpływa na aktywność lokomotoryczną i sen zarówno w jaskini, jak i na powierzchni ryb23.</li>
	<li>Zamontuj kamery w odległości około 4-6 m od czołgów. Każda kamera może zazwyczaj nagrywać z 3 zbiorników jednocześnie, aby zapewnić wystarczającą rozdzielczość do śledzenia. 
	nuta: Nagrania zachowań dorosłych na ogół nie wymagają oddzielnego systemu białego oświetlenia do kontrolowania zmian dnia i nocy. Zwykłe użycie standardowych świateł górnych w pomieszczeniu behawioralnym podłączonym do timera prawdopodobnie będzie wystarczające.</li>
</ol>
3. Rejestrowanie aktywności lokomotorycznej
UWAGA: Wszystkie nagrania zachowań są wykonywane przy użyciu standardowego laptopa lub komputera stacjonarnego z zapasowym źródłem baterii. Ze względu na duży rozmiar pliku nagrania 24 h (60-100 GB), wszystkie nagrania należy zapisać na zewnętrznych dyskach twardych.
<ol>
	<li>Aklimatyzować ryby w wieku 4-30 dpf przez 18-24 godziny przed rozpoczęciem nagrań. Nakarmić larwy żywych krewetek solankowych po pierwszym umieszczeniu w komorze rejestracyjnej i 1 godzinę przed rozpoczęciem zapisu. Dorosłe ryby należy zaaklimatyzować na 4-5 dni przed zarejestrowaniem zachowania i karmić raz dziennie pokarmem w płatkach lub żywymi czarnymi robakami. 
	nuta: Pamiętaj, aby umieścić larwy ryb w słodkiej wodzie przed nagraniem, ponieważ resztki krewetek solankowych spowodują problemy ze śledzeniem podczas późniejszej analizy. Alternatywną opcją jest współhodowla z wrotkami, ponieważ ich niewielkie rozmiary nie przeszkadzają w śledzeniu.</li>
	<li>Umieść ryby w wieku 4-6 dpf na 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych. Ryby domowe w wieku 20-30 dpf w 12-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej do rejestracji.</li>
	<li>Nagrywaj dorosłe osobniki w 10-litrowych zbiornikach wyposażonych w przegrody, aby pomieścić pięć indywidualnie trzymanych ryb, lub bez przegród, aby rejestrować sen i aktywność w otoczeniu społecznym. 
	nuta: Zadbaj o ustawienie ostrości kamery przed rozpoczęciem nagrywania, aby zmaksymalizować dokładność śledzenia. Nie otwieraj zbyt daleko przysłony obiektywu aparatu, ponieważ drastycznie zmniejszy to ostrość obrazu. Istnieje jednak pewna równowaga; Jeśli przysłona zostanie zamknięta zbyt daleko, liczba klatek na sekundę wideo spadnie poniżej 15,00 kl./s. Dla późniejszej analizy istotne jest, aby liczba klatek na sekundę pozostała na poziomie 15,00 klatek na sekundę do użytku z niestandardowym skryptem uśpienia23,24.</li>
	<li>Ustaw oświetlenie/jasność podświetlenia tła.</li>
	<li>Zoptymalizuj oświetlenie przed rozpoczęciem nagrywania. Zawsze utrzymuj kontrast na najwyższym możliwym poziomie i używaj jasności i oświetlenia tła, aby dostosować jasność, aż zwierzęta będą najbardziej wyraźne.</li>
	<li>Rekord ryb przez 24 lub 48 godz. 
	nuta: Awaryjne akumulatory zapasowe, które zasilają całe oświetlenie, komputery i kamery, należy zakupić na wypadek przerw w dostawie prądu. Jeśli to możliwe, wszystkie akumulatory należy również podłączyć do awaryjnych gniazdek elektrycznych. Akumulatory na ogół nie zasilają sprzętu dłużej niż kilka minut do maksymalnie godziny i służą do zniwelowania utraty głównego zasilania a przełączeniem do systemu zasilania awaryjnego.</li>
</ol>
4. Analiza aktywności lokomotorycznej u ryb hodowanych indywidualnie za pomocą oprogramowania do automatycznego śledzenia
<ol>
	<li>Aby rozpocząć analizę zachowania, otwórz oprogramowanie śledzące, wybierz pozycję Nowy eksperyment z szablonu, a następnie wybierz pozycję Zastosuj wstępnie zdefiniowany szablon.</li>
	<li>Ponieważ program zapyta teraz, jaki gatunek śledzić, wybierz Ryba. Użyj listy rozwijanej, aby wybrać larwy danio pręgowanego dorosłego danio pręgowanego, w zależności od paradygmatu eksperymentalnego.</li>
	<li>Ustaw areny, na których każde zwierzę będzie śledzone. W przypadku larw wybierz Płytka studzienna, Studnia okrągła i Szablon bez strefy. W przypadku dorosłych użyj szablonu Open Field, Square with No Zone. Następnie określ odpowiednią liczbę aren, po jednej dla każdego zwierzęcia śledzonego na filmie.</li>
	<li>Wybierz model dla optymalnego śledzenia, kliknij punkt środkowy ścieżki i upewnij się, że kolor zwierzęcia jest wybrany tak, aby był ciemniejszy niż tło. Zastosuj liczbę klatek na sekundę, z jaką wideo zostało pobrane. Oprogramowanie śledzące powinno to automatycznie wykryć.</li>
	<li>Narysuj skalę, aby skalibrować rzeczywistą odległość obiektu, aby dokładnie określić zachowanie lokomotoryczne ryb za pomocą ustawień areny.</li>
	<li>Edytuj areny, aby upewnić się, że cały obszar, w którym znajdują się ryby, będzie śledzony; w przeciwnym razie próbki zostaną utracone podczas pozyskiwania. 
	nuta: Zachowaj ostrożność podczas ustawiania obszarów. Larwy ryb są szczególnie wrażliwe na błędy śledzenia, jeśli areny są zbyt duże lub zbyt małe. Złe oświetlenie w eksperymencie może również tworzyć cienie na ściankach płyt studzienek, które program może uznać za zwierzę, tworząc fałszywy alarm.</li>
	<li>Kliknij Zaawansowane. W obszarze Metoda w Ustawienia wykrywania wybierz opcję Odejmowanie dynamiczne, a następnie kliknij Tło i wybierz opcję Rozpocznij naukę. Dostosuj stosunek sygnału do szumu o ciemnym kontraście, aż zwierzęta będą dobrze śledzone, a tło nie spowoduje przeskakiwania śledzenia. 
	nuta: Jakość wideo może się różnić w zależności od eksperymentu, więc każda próba może wymagać użycia odpowiednich ustawień. Korzystanie z funkcji Kontur obiektu i Rozmiar obiektu może znacznie poprawić wyniki śledzenia.</li>
	<li>Wybierz opcję Lista próbna i załaduj odpowiednie parametry przed rozpoczęciem rejestrowania danych do programu.</li>
	<li>Kliknij zakładkę Akwizycja, wybierz opcję Śledź wszystkie planowane próby i kliknij przycisk nagrywania.</li>
	<li>Upewnij się, że w obszarze Analysis Profile (Profil analizy) wybrano opcje Distance (Odległość) oraz Time & Movement (Czas i ruch). 
	nuta: Aby można było przeprowadzić późniejszą analizę snu, bardzo ważne jest, aby te ustawienia były poprawne, ponieważ plik .perl musi odczytywać te dane we właściwej kolejności, aby obliczyć sen.</li>
	<li>W obszarze Eksportuj wybierz pozycję Dane nieprzetworzone, wyeksportuj dane jako tekst Unicode.</li>
</ol>
5. Śledzenie ryb w pomieszczeniach socjalnych
<ol>
	<li>Wykonaj kroki 4.1-4.4, aby skonfigurować eksperyment w oprogramowaniu śledzącym.</li>
	<li>Z menu rozwijanego wybierz, ile zwierząt chcesz śledzić w eksperymencie.</li>
	<li>W ustawieniach Areny narysuj odpowiednią skalę, aby skalibrować rzeczywisty dystans.</li>
	<li>W ustawieniach wykrywania użyj opcji Odejmowanie dynamiczne i dostosuj ciemny kontrast, aby jak najlepiej śledzić zwierzę.</li>
	<li>Dostosuj rozmiar obiektu w ustawieniach wykrywania, tak aby śledzona była tylko bardzo mała część zwierzęcia. 
	nuta: Śledzenie tylko niewielkiej części zwierzęcia zmniejszy ilość przełączania się między zwierzętami, gdy przecinają się one podczas nabycia.</li>
	<li>Po zdobyciu śladów użyj Edytora ścieżek, aby ręcznie ustawić czas, w którym ryby mogą przecinać ścieżki.</li>
</ol>
6. Ekstrakcja danych dotyczących snu z aktywności lokomotorycznej
UWAGA: Behawioralna definicja snu zarówno u larw, jak i dorosłego A. mexicanus to 1 minuta lub więcej spoczynku. Definicja ta została określona na podstawie eksperymentów z progiem pobudzenia, w których do zainicjowania reakcji behawioralnej w stanie snu (>60 s) wymagany jest większy bodziec sensoryczny w porównaniu do jawy14,17. Aby uwzględnić niewielkie ruchy i dryfowanie typowe dla gatunków ryb, stosuje się progi prędkości w celu oddzielenia rzeczywistego ruchu od hałasu lub dryfu. Progi te są obliczane obliczeniowo przez porównanie korelacji między odległością a czasem trwania snu w celu znalezienia najwyższych wartości R-kwadrat; określając w ten sposób najdokładniejszą prędkość ruchu i snu. W przypadku larw ryb górna i dolna granica wynoszą 12 mm/s, ponieważ dryf jest niewielki lub nie ma go wcale. W przypadku ryb dorosłych dolna granica wynosi 2 cm/s, a górna granica wynosi 4 cm/s w celu uwzględnienia dryfu.
<ol>
	<li>Zainstaluj Cygwin na komputerze analitycznym, aby przeprowadzić wykonywanie niestandardowych skryptów w celu wyodrębnienia zachowań lokomotorycznych i sennych.</li>
	<li>Utwórz nowy folder eksperymentu w katalogu domowym Cygwin.</li>
	<li>Zaimportuj surowe dane Unicode z oprogramowania śledzącego i uruchom plik .sh w Cygwin, aby przekonwertować kodowanie z UTF-16 na UTF-8.</li>
	<li>Uruchom plik .perl w Cygwin, aby wyodrębnić dane dotyczące snu.</li>
	<li>Otwórz plik makra i postępuj zgodnie z instrukcjami w arkuszu kalkulacyjnym, aby sfinalizować analizę danych zgodnie z potrzebami. 
	nuta: Do przeprowadzenia tej części analizy niezbędny będzie podstawowy poziom kodowania wiersza polecenia. Wystarczą ogólne polecenia Linuksa. Jeśli występują problemy z prawidłowym odczytem danych przez programy, sprawdź dane z oprogramowania śledzącego w dowolnym swobodnie dostępnym edytorze tekstu, aby upewnić się, że kodowanie i kolejność są poprawne, aby pliki wykonywalne mogły pisać poprawnie.</li>
</ol>

<ol><li>Keene, A. C., Duboue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+evolution+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The origins and evolution of sleep.</a> The Journal of Experimental Biology. , (2018).</li>
<li>Joiner, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+Evolutionary+Determinants+of+Sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Unraveling the Evolutionary Determinants of Sleep.</a> Current Biology. 26 (20), R1073-R1087 (2016).</li>
<li>Allada, R., Siegel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unearthing+the+phylogenetic+roots+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%22%5BJournal%5D)">Unearthing the phylogenetic roots of sleep.</a> Current biology. 18, R670-R679 (2008).</li>
<li>Sehgal, A., Mignot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+sleep+and+sleep+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetics of sleep and sleep disorders.</a> Cell. 146, 194-207 (2011).</li>
<li>Campbell, S. S., Tobler, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+sleep%3A+a+review+of+sleep+duration+across+phylogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Animal sleep: a review of sleep duration across phylogeny.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8, 269-300 (1984).</li>
<li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451, 569-572 (2008).</li>
<li>Geissmann, Q., Rodriguez, L. G., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethoscopes%3A+An+Open+Platform+For+High-Throughput+Ethomics%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Ethoscopes: An Open Platform For High-Throughput Ethomics.</a> bioRxiv. , 113647(2017).</li>
<li>Garbe, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-specific+comparison+of+sleep+acquisition+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Context-specific comparison of sleep acquisition systems in Drosophila.</a> Biology Open. 4 (11), (2015).</li>
<li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).</li>
<li>Gilestro, G. F., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PySolo%3A+A+complete+suite+for+sleep+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PySolo: A complete suite for sleep analysis in Drosophila.</a> Bioinformatics. 25, 1466-1467 (2009).</li>
<li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li>
<li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nature Methods. 6, 451-457 (2009).</li>
<li>Rihel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+behavioral+profiling+links+drugs+to+biological+targets+and+rest%2Fwake+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation.</a> Science (New York, N.Y.). 327, 348-351 (2010).</li>
<li>Yoshizawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+genetic+architecture+underlies+the+emergence+of+sleep+loss+and+prey-seeking+behavior+in+the+Mexican+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish.</a> BMC Biology. 13, (2015).</li>
<li>Chiu, C. N., Prober, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+zebrafish+sleep+and+arousal+states%3A+current+and+prospective+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Regulation of zebrafish sleep and arousal states: current and prospective approaches.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7 (April), 58(2013).</li>
<li>Elbaz, I., Foulkes, N. S., Gothilf, Y., Appelbaum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clocks%2C+rhythmic+synaptic+plasticity+and+the+sleep-wake+cycle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Circadian clocks, rhythmic synaptic plasticity and the sleep-wake cycle in zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li>
<li>Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+convergence+on+sleep+loss+in+cavefish+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations.</a> Current Biology. 21, 671-676 (2011).</li>
<li>Beale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+Mexican+blind+cavefish+Astyanax+mexicanus+in+the+lab+and+in+the+field%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field.</a> Nature Communications. 4, 2769(2013).</li>
<li>Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeene%2C+AC+%22Biology+and+Evolution+of+the+Mexican+Cavefish%22">Biology and Evolution of the Mexican Cavefish</a>. , (2015).</li>
<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regressive+evolution+in+Astyanax+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regressive evolution in Astyanax cavefish.</a> Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).</li>
<li>Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+origin+of+Astyanax+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">The complex origin of Astyanax cavefish.</a> BMC Evolutionary Biology. 12, 105(2012).</li>
<li>Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocortin+4+receptor+mutations+contribute+to+the+adaptation+of+cavefish+to+nutrient-poor+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9688(2015).</li>
<li>Jaggard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lateral+line+confers+evolutionarily+derived+sleep+loss+in+the+Mexican+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (2), (2017).</li>
<li>Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocretin+underlies+the+evolution+of+sleep+loss+in+the+Mexican+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish.</a> eLife. , e32637(2018).</li>
<li>Hinaux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Developmental+Staging+Table+for+Astyanax+mexicanus+Surface+Fish+and+Pacho+%C2%B4n+Cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pacho ´n Cavefish.</a> Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., La Schimmenti,, Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).</li>
<li>Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+benefit+of+albinism+in+Astyanax+cavefish%3A+downregulation+of+the+oca2+gene+increases+tyrosine+and+catecholamine+levels+as+an+alternative+to+melanin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis.</a> Plos One. 8 (11), e80823(2013).</li>
<li>Yokogawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+sleep+in+zebrafish+and+insomnia+in+hypocretin+receptor+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants.</a> PLoS Biology. 5, 2379-2397 (2007).</li>
<li>Appelbaum, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep-wake+regulation+and+hypocretin-melatonin+interaction+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sleep-wake regulation and hypocretin-melatonin interaction in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21942-21947 (2009).</li>
<li>Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+is+required+to+promote+wakefulness+and+for+hypocretin-induced+arousal+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish.</a> eLife. 4 (September), (2015).</li>
<li>Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+shift+from+fighting+to+foraging+in+blind+cavefish+through+changes+in+the+serotonin+network%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network.</a> Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Bell, M. A., Foster, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+MA+%22The+evolutionary+biology+of+the+threespine+stickleback%22">The evolutionary biology of the threespine stickleback</a>. 584, Oxford University Press. Available from:
 <a target="_blank" href="http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1">http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1</a> (1994).</li>
<li>Seehausen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((African+cichlid+fish%3A+a+model+system+in+adaptive+radiation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+Biological+Sciences%2FThe+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research.</a> Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).</li>
<li>Basolo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+preference+predates+the+evolution+of+the+sword+in+swordtail+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish.</a> Science. 250, 808-810 (1990).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

Protokół ten opisuje niestandardowy system do ilościowego określania snu i aktywności lokomotorycznej u larw i dorosłych ryb jaskiniowych. Ryby jaskiniowe stały się wiodącym modelem do badania ewolucji snu, który można wykorzystać do zbadania genetycznych i neuronalnych podstaw regulacji snu1. Krytyczne kroki w tym protokole obejmują optymalizację oświetlenia i jakości wideo w celu zapewnienia dokładnego śledzenia, które jest niezbędne do ilościowego określenia snu. Opisany tutaj system akwizycji ...

Sen jest wysoce zachowany w całym królestwie zwierząt na poziomie fizjologicznym, funkcjonalnym i behawioralnym1,2,3. Podczas gdy sen u ssaków laboratoryjnych jest zwykle oceniany za pomocą elektroencefalogramów, zapisy elektrofizjologiczne są mniej praktyczne w małych, genetycznie podatnych systemach modelowych, a zatem sen jest zwykle mierzony na podstawie zachowania3,4. Cechy behawioralne związane ze snem są wysoce konserwatywne w całym królestwie zwierząt i obejmują zwiększony próg pobudzenia, odwracalność po stymulacji i przedłużony spokój behawioralny5. Miary te mogą być wykorzystane do scharakteryzowania snu u zwierząt, począwszy od nicienia C. elegans, a skończywszy na ludziach6.
Wykorzystanie spoczynku behawioralnego do charakteryzowania snu wymaga automatycznego oprogramowania śledzącego. Dzięki oprogramowaniu śledzącemu okresy aktywności i bezruchu są określane w ciągu kilku dni, a długie okresy bezczynności są klasyfikowane jako sleep7,8. W ostatnich latach opracowano wiele systemów śledzenia w celu pozyskiwania danych o aktywności wśród różnych małych genetycznie podatnych systemów modelowych; w tym robaki, muszki owocowe i ryby9,10,11. Programom tym towarzyszy oprogramowanie, które pozwala na automatyczne śledzenie zachowań zwierząt, w tym zarówno freeware open source, jak i oprogramowanie dostępne na rynku7,12,13,14. Systemy te różnią się elastycznością i pozwalają na skuteczne badania przesiewowe i charakterystykę fenotypów snu w wielu modelach modyfikowalnych genetycznie.
Genetyczne badanie snu u danio pręgowanego, Danio rerio, doprowadziło do zidentyfikowania licznych genów i obwodów neuronalnych, które regulują sen15,16. Chociaż dostarczyło to potężnego systemu do badania neuronalnych podstaw snu u kręgowców laboratoryjnych, znacznie mniej wiadomo o tym, jak sen ewoluuje i jak naturalna zmienność przyczynia się do regulacji snu. Meksykańska ryba jaskiniowa, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), wyewoluowały dramatyczne różnice w śnie, aktywności lokomotorycznej i rytmie okołodobowym17,18. Ryby te występują jako ryby powierzchniowe o oczach zamieszkujące rzeki Meksyku i południowego Teksasu oraz co najmniej 29 populacji jaskiniowych wokół regionu Sierra Del Abra w północno-wschodnim Meksyku19,20,21. Co ciekawe, wiele różnic w zachowaniu, w tym utrata snu, wydaje się pojawiać niezależnie w wielu populacjach ryb jaskiniowych14,22. Dlatego ryby jaskiniowe stanowią model do badania zbieżnej ewolucji snu, zachowań okołodobowych i społecznych.
Ten protokół opisuje system pomiaru snu i zachowań lokomotorycznych w A. larwy i osobniki dorosłe meksykański. Specjalnie zbudowany system nagrywania oparty na podczerwieni pozwala na nagrywanie filmów zwierząt w jasnych i ciemnych warunkach. Dostępne na rynku oprogramowanie może być używane do pomiaru aktywności, a niestandardowe makra służą do ilościowego określania kilku aspektów bezczynności i określania okresów snu. Protokół ten opisuje również eksperymentalne modyfikacje do śledzenia aktywności wielu zwierząt w zbiorniku, zapewniając możliwość badania interakcji między snem a zachowaniami społecznymi. Systemy te można zastosować do pomiaru snu, zachowań okołodobowych i aktywności lokomotorycznej u dodatkowych gatunków ryb, w tym danio pręgowanego i ciernika.

<table><tbody><tr><td>Zasilacz 12 V</td><td>Oświetlenie środowiskowe</td><td>Zasilacz 24 W 12 VDC</td> Przekładki akrylowe (dorośli)TAP Plastik Zamów arkusze w rozmiarach według potrzeb Źródło zasilania światłem podczerwonym dla dorosłych Oświetlenie środowiskowe 24 W Zasilacz 12 VDC Akumulator CyberPower CP850PFCLCD Obiektyw kamery (dla dorosłych)<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Navitar Zoom 7000</td><td>Zoom 7000</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw aparatu (larwalny)</td><td>Fujian 35mm f/1.7</td><td>B01CHX7668</td><td>Kup na Amazon</td></tr><tr><td>Adapter obiektywu</td><td>aparatu d</td><td>1524219</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do kamery</td><td>CowboyStudio Super Clamp</td><td>B002LV7X1K</td><td>Kup na Amazon</td></tr><tr><td>Akwarium</td><td>Deep Blue Professional</td><td>ADB11006</td><td></td></tr><tr><td>Radiator (dla dorosłych)</td><td>M-D Produkty budowlane</td><td>SKU: 61085</td><td>Przycięte na pas</td></tr><tr><td>Radiator (larwalny)</td><td>M-D Produkty budowlane</td><td>SKU: 57000</td><td>Przycięte na miarę</td></tr><tr><td>Światła podczerwone (dorośli)</td><td>Światła środowiskowe Taśma LED na podczerwień 850 nm 5050</td><td>irrf850-5050-60-reel</td><td>Przycięte na miarę</td></tr><tr><td>Światła podczerwone (larwalne)</td><td>LED World</td><td>B00MO9H7H4</td><td>Kup na Amazon</td></tr><tr><td>Dyfuzyjny akryl</td><td>TAP Plastik</td><td></td><td>Zamów arkusze w rozmiarach według potrzeb</td></tr><tr><td>Laptop/komputer</td><td>NIE DOTYCZY</td><td></td><td>Nie dotyczy Każdy laptop będzie działał.</td></tr><tr><td>Światło LED</td><td>Chanzon 10 High Power Led Chip 3W Biały (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt)</td><td>B06XKTRSP7</td><td>Do użytku z Chanzon 25 sztuk 1 W, 3 W, 5 W Radiator LED (2 pin) Aluminiowa płyta podstawy Panel</td></tr><tr><td>świetlny</td> zegar <td>Century 24-godzinny wtykowy zegar mechaniczny z uziemieniem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy uchwyt ścienny do IR</td><td>Everbilt Plastikowa tablica perforowana</td><td>Model # 17961</td><td></td></tr><tr><td>zasilający</td><td>Drut silikonowy BNTECHGO o grubości</td><td>22 B01K4RPE0Y</td><td></td></tr><tr><td>Źródło zasilania</td><td>Rapid LED</td><td>MOONLIGHT DRIVER (350MA)</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkanek</td><td>Fisherbrand</td><td>12-dołkowy (FB012928) 24-dołkowy (FB012929)Statyw</td><td></td></tr> <tr><td>Głowica kulowa</td><td>Demon DB-44</td><td>B00TQ54CZO</td><td>Kup na Amazon</td></tr><tr><td>USB Hardrive</td><td>Seagate 3TB kopia zapasowa</td><td>STDT3000100</td><td></td></tr><tr><td>USB Kamera internetowa</td><td>Microsoft LifeCam</td><td>Q2F-00014</td><td>Kup na Amazon</td></tr><tr><td>Uchwyt ścienny do kamery</td><td>LDR Industries 1/2" Rura stalowa</td><td>307 12X36</td><td>Zamontowana na ścianie z kołnierzem i kolankiem rurowym 90&deg; . Może również użyć statywu do trzymania aparatu.</td></tr></tbody></table>

zautomatyzowane pomiary snu i aktywności lokomotorycznej u meksykańskich ryb jaskiniowych

Automated Measurements of Sleep and Locomotor Activity in Mexican Cavefish

We wszystkich typach, sen charakteryzuje się wysoce konserwatywnymi cechami behawioralnymi, takimi jak podwyższony próg pobudzenia, odbicie po braku snu i skonsolidowane okresy zastoju behawioralnego. Meksykańska ryba jaskiniowa, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), jest modelem do badania ewolucji cech w odpowiedzi na perturbacje środowiskowe. A. mexicanus występuje w postaci form żyjących na powierzchni i wielu ślepych populacji żyjących w jaskiniach, które mają silne różnice morfologiczne i behawioralne. Utrata snu nastąpiła w wielu, niezależnie wyewoluowanych populacjach ryb jaskiniowych. Protokół ten opisuje metodologię ilościowego określania snu i aktywności lokomotorycznej u ryb jaskiniowych i powierzchniowych A. mexicanus. Ekonomiczny system monitoringu wizyjnego pozwala na obrazowanie behawioralne larw lub dorosłych ryb trzymanych w indywidualnych pomieszczeniach przez okres tygodnia lub dłużej. System może być stosowany u ryb w wieku 4 dni po zapłodnieniu do wieku dorosłego. Podejście to można również zaadaptować do pomiaru wpływu interakcji społecznych na sen poprzez rejestrowanie wielu ryb na jednym obszarze. Po nagraniach behawioralnych dane są analizowane za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego, a analiza snu jest przetwarzana za pomocą niestandardowych skryptów, które określają ilościowo wiele zmiennych snu, w tym czas trwania, długość i liczbę napadów. System ten można zastosować do pomiaru snu, zachowań okołodobowych i aktywności lokomotorycznej u prawie wszystkich gatunków ryb, w tym danio pręgowanego i ciernika.

Larwy w wieku 4-30 dpf mogą być niezawodnie rejestrowane w specjalnie zbudowanym systemie zamkniętym opisanym w Rysunek 1. System obejmuje zarówno oświetlenie w podczerwieni, jak i światło widzialne, aby umożliwić nagrywanie w jasnych i ciemnych warunkach, w różnych warunkach światła widzialnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Filmy są następnie analizowane za pomocą oprogramowania śledzącego (Rysunek 1B,C) i p...

Ten protokół szczegółowo opisuje metodologię ilościowego określania zachowań lokomotorycznych i snu u meksykańskich ryb jaskiniowych. Poprzednie analizy zostały rozszerzone o pomiar tych zachowań u ryb trzymanych społecznie. System ten może być szeroko stosowany do badania snu i aktywności innych gatunków ryb.

Zautomatyzowane pomiary snu i aktywności lokomotorycznej u meksykańskich ryb jaskiniowych

Across phyla, sleep is characterized by highly conserved behavioral characteristics that include elevated arousal threshold, rebound following sleep ...

Protokół ten może być wykorzystany do ilościowego określenia snu i aktywności w dowolnej populacji ryb i ma potencjał do rozszerzenia liczby systemów modelowych wykorzystywanych do badania regulacji snu. Zaletą tej techniki jest jej elastyczność. Na przykład ryby mogą być śledzone na arenach o różnych rozmiarach lub w eksperymentach z pojedynczymi lub grupowymi pomieszczeniami.Mocną stroną pomiaru snu w tym systemie jest możliwość zastosowania metody do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków lub badań genetycznych. Zastosowaliśmy tę metodę do badania ewolucji snu w dwóch różnych populacjach ryb jaskiniowych, które wykazują dramatycznie różne fenotypy snu. Chociaż ustanowienie systemu obrazowania behawioralnego może być trudne, nasz system zapewnia opłacalną metodę badania larw i dorosłych ryb.Aby zbudować system do dokładnego śledzenia zachowań lokomotorycznych w celu badania snu i rytmów okołodobowych u larw A.mexicanus, użyj białego akrylu o grubości 0,33 centymetra do skonstruowania platformy dla systemu śledzenia larw. Umieść platformę rejestrującą na oświetlonym kwadratowym radiatorze, na którym będą znajdować się areny zawierające ryby podczas eksperymentów ze śledzeniem behawioralnym, i umieść drugi akryl wewnątrz pudełka między światłami w obudowie dla zwierząt, aby rozproszyć podczerwień w celu uzyskania optymalnego oświetlenia i kontrastu. Umieść cały etap śledzenia larw i zestaw oświetleniowy w zamkniętej plastikowej rurce.Użyj narzędzia obrotowego, aby zdjąć obiektyw z eksperymentalnie odpowiedniej kamery internetowej. Wykręć małe z tyłu aparatu, aby zdjąć wewnętrzną obudowę, i wykręć małe wewnątrz korpusu aparatu, aby poluzować pozostałą część obiektywu. Użyj małego śrubokręta, aby usunąć wszelkie części obudowy obiektywu, które pozostały po przecięciu obiektywu.I usuń niebieską diodę elektroluminescencyjną z górnej części urządzenia sprzężonego z ładunkiem lub obudowy CCD. Następnie przywróć obudowę wewnętrzną do pierwotnej orientacji przed wkręceniem dwóch zewnętrznych z powrotem do ich pierwotnych pozycji. Użyj małej piły, aby poprowadzić wnętrze aparatu, aby umożliwić wyposażenie aparatu w zaokrąglony plastikowy frez, który wygładza dodatkowy plastik, aż będzie mógł towarzyszyć adapterowi obiektywu.Zainstaluj filtr podczerwieni przepustowej wewnątrz aparatu jak najbliżej CCD, bez bezpośredniego kontaktu z kamerą, a następnie przykręć adapter 35-milimetrowego obiektywu stałoogniskowego z przodu aparatu z tyłu obiektywu. Następnie umieść kamerę i obiektyw w otworze wywierconym w pokrywie w górnej części rury, w której mieści się scena i światła, a następnie podłącz USB do komputera, na którym będą nagrywane zwierzęta. Aby zbudować system snu dla dorosłych ryb, najpierw przytnij paski podczerwieni w odstępach około 46 centymetrów.I umieść arkusz akrylowy o wymiarach 46 na pięć na 0,32 centymetra i 9% przepuszczania światła bezpośrednio przed każdym paskiem światła podczerwonego, aby rozproszyć światło podczerwone. Następnie umieść wszystkie zbiorniki na stojaku, który obsługuje oświetlenie podczerwone zamontowane z tyłu i użyj nieprzezroczystych plastikowych przegród i 10-litrowych szklanych zbiorników, aby stworzyć indywidualne areny. Aby zarejestrować aktywność lokomotoryczną meksykańskiej tetrary, umieść ryby od czwartego do szóstego dnia po zapłodnieniu w indywidualnych studzienkach 24-dołkowej płytki tkankowej, a dni od 20 do 30 dni po zapłodnieniu w pojedynczych dołkach sześciodołkowej płytki tkankowej.Aby rejestrować sen i aktywność dorosłych osób w domu towarzyskim do pięciu osób dorosłych na 10-litrowy zbiornik z przegrodami lub bez. W tym reprezentatywnym eksperymencie larwy ryb z trzech niezależnych populacji ryb jaskiniowych wykazywały znaczne skrócenie snu w porównaniu z rybami powierzchniowymi. Ta produkcja snu jest spójna we wszystkich badanych grupach wiekowych, ponieważ sen był również znacznie zmniejszony u dorosłych ryb jaskiniowych Pachon, Molino i Tinaja w porównaniu z rybami powierzchniowymi.Warto zauważyć, że budownictwo socjalne znacznie ograniczyło sen ryb powierzchniowych, nie wpływając na sen ryb jaskiniowych Pacho, prawdopodobnie z powodu efektu piwnicy w populacjach ryb jaskiniowych. Podczas nagrywania ryb należy zwrócić uwagę, aby upewnić się, że oświetlenie kamery jest optymalne, aby wzmocnić sygnał ryby w stosunku do tła. Dla tego protokołu wymagane jest podstawowe kodowanie wiersza poleceń, które jest w pełni opisane w tekście i powinno być dostosowane do dowolnych ustawień laboratoryjnych.Protokół ten doprowadził do wielu pytań dotyczących ewolucji snu i jest obecnie używany do badań przesiewowych leków, śledzenia zachowań związanych ze snem i zrozumienia, jak zachowania społeczne wpływają na sen.

automated-measurements-sleep-locomotor-activity-mexican

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Opisujemy procedury rejestracji dobowych rytmów aktywności lokomocyjnej Drosophila oraz późniejszej analizy danych. Rytmy aktywności lokomocyjnej są wiarygodnym behawioralnym wskaźnikiem zegarów okołodobowych zwierząt i są wykorzystywane jako standardowy odczyt funkcji zegara podczas badania mutantów okołodobowych lub analizowania wpływu środowiska na regulację systemu okołodobowego.

Oznaczanie aktywności lokomotorycznej w celu badania rytmów okołodobowych i parametrów snu u Drosophila

Opisano procedurę optogenetycznej manipulacji aktywnością neuronów piramidowych kory mózgowej przy jednoczesnym monitorowaniu elektroencefalogramu, elektromiogramu oraz stężenia mleczanu w mózgu. Rejestracje eksperymentalne są przeprowadzane u myszy z podłączonymi przewodami podczas spontanicznych cykli snu i czuwania. Sprzęt do optogenetyki został zbudowany w naszym laboratorium; sprzęt pomiarowy jest dostępny w sprzedaży.

Symultaniczna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni

Ten film demonstruje protokół wszczepienia elektrody elektroencefalogramu (EEG) i elektromiogramu (EMG) znieczulonej myszy. Proces polega na zabezpieczeniu myszy na stereotaktycznej ramie, wykonaniu nacięcia w linii środkowej czaszki, wywierceniu otworów na elektrody i zamocowaniu zespołu elektrod do nagrywania sygnału. Po powrocie do zdrowia zachowanie myszy podczas snu i czuwania jest analizowane przy użyciu zarejestrowanych sygnałów.

Analiza zachowań związanych ze snem u myszy za pomocą elektroencefalogramu i zapisów elektromiogramu

Tutaj prezentujemy eksperymentalne i analityczne procedury opisujące dynamikę czasową zmiennych neuronalnych i sercowych snu nie-REM u myszy, które modulują reakcję snu na bodźce akustyczne.

Kwantyfikacja dynamiki mocy widmowej i tętna w podczerwieni u śpiących myszy

Opisujemy wysokoprzepustową metodę pomiaru snu za pomocą monitorowania w domowej klatce opartej na aktywności. Ta metoda ma przewagę nad tradycyjnymi metodami opartymi na EEG. Jest dobrze zwalidowany do określania całkowitego czasu trwania snu i może być potężnym narzędziem do monitorowania snu w modelach chorób ludzkich u gryzoni.

Nieinwazyjne, wysokoprzepustowe określanie czasu trwania snu u gryzoni

Ten artykuł przedstawia nieinwazyjny system biomonitoringu do ciągłego rejestrowania i analizowania aktywności serca i lokomotoryki raków. System ten składa się z czujnika optycznego bliskiej podczerwieni, modułu śledzenia wideo oraz oprogramowania do oceny bicia serca raków, które odzwierciedla ich stan fizjologiczny i charakteryzuje zachowanie raków podczas wahań bicia serca.

Ciągły nieinwazyjny pomiar czynności serca i zachowania raków

W tym protokole pokazujemy, jak hodować dorosłe osobniki Astyanax mexicanus, hodować larwy i przeprowadzać immunohistochemię na rybach po larwie, aby porównać fenotypy morfotypów powierzchniowych i jaskiniowych.

Hodowla meksykańskiego Tetra Astyanax mexicanus w celu analizy fenotypów postlarwalnych i immunohistochemii całego wierzchowca

Opisujemy podejścia do manipulacji genami w systemie modelu ewolucyjnego Astyanax mexicanus. Opisano trzy różne techniki: transgenezę za pośrednictwem Tol2, ukierunkowaną manipulację genomem za pomocą CRISPR/Cas9 oraz knockdown ekspresji za pomocą morpholinos. Narzędzia te powinny ułatwić bezpośrednie badanie genów leżących u podstaw zmienności między formami zamieszkującymi powierzchnię i jaskinie.

Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

Tutaj prezentujemy metody wysokoprzepustowego badania szeregu zachowań meksykańskich ryb jaskiniowych i istotnego barwienia systemu mechanosensorycznego. Metody te wykorzystują wolne oprogramowanie i niestandardowe skrypty, zapewniając praktyczną i opłacalną metodę badania zachowań.

Śledzenie behawioralne i obrazowanie neuromastu meksykańskich ryb jaskiniowych

Aktywność lokomotoryczna (LMA) to prosty i łatwy do wykonania pomiar zachowania u myszy. Sprzężenie oprogramowania do śledzenia wideo (VTS) i LMA pozwala na poprawę swoistości i czułości, zwłaszcza w porównaniu z ręczną metodą analizy LMA polegającą na przekraczaniu linii. Dodatkowo VTS umożliwia długoterminowe śledzenie LMA myszy.

Krótko- i długoterminowa aktywność ruchowa myszy analizowana przez oprogramowanie do śledzenia wideo

Poznaj zautomatyzowaną metodę pomiaru snu i aktywności lokomotorycznej u meksykańskich ryb jaskiniowych w warunkach socjalnych. To podejście umożliwia badanie zachowań ryb w różnych kontekstach społecznych.

Zautomatyzowane pomiary snu i aktywności lokomotorycznej u meksykańskich ryb jaskiniowych

Przeglądaj więcej filmów