Name: Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji jednorodności znakowania białek na poziomie pojedynczej cząsteczki. Technika ta umożliwia dokładną analizę fluorescencyjnie znakowanych populacji białkowych, ujawniając heterogeniczność niewidoczną w pomiarach zbiorczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Masae Ohno i Kazuyi Nishimurze za eksperymentalną pomoc i rady. Prace te były wspierane przez PRESTO (JPMJPR15F7), Japońską Agencję Nauki i Technologii, Grants-in-aid for Young Scientists (A) (24687022), Challenging Exploratory Research (26650055) i Scientific Research on Innovative Areas (23115005), Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki, a także przez granty z Takeda Science Foundation i Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research. S.L. dziękuje za wsparcie ze strony programu RIKEN International Program Associate (IPA).

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Hodować komórki HeLa w 10-centymetrowym naczyniu w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 w zmodyfikowanym pożywce Eagle's firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej.</li>
	<li>Zbieraj wykładniczo rosnące komórki, gdy osiągną 70% konfluencji, postępując zgodnie z instrukcjami ATCC17.
	<ol>
		<li>Przepłukać komórki 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (pH 7,4). Usuń PBS.</li>
		<li>Dodać 1 ml 0,1% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Monitoruj postęp dysocjacji komórek za pomocą mikroskopii.</li>
		<li>Gdy komórki staną się okrągłe i zostaną odłączone od naczynia, dodaj 4 ml pożywki wzrostowej i przerwij aglomerację komórek przez pipetowanie.</li>
		<li>Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek.</li>
		<li>Wirować przy 150 x g przez 10 minut w probówce wirówkowej. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy z 5 ml 1x PBS (pH 7,4).</li>
		<li>Powtórz krok 1.2.6. Ponownie zawiesić komórki w 1x PBS (pH 7,4) do końcowego stężenia 106 komórek/ml, używając liczby liczby w kroku 1.2.5. 
		UWAGA: Zawiesinę komórek można porcjować i przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy. Należy unikać powtarzania cyklu zamrażania/rozmrażania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Liza komórek i znakowanie fluorescencyjne
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml buforu lizującego (0,1 M boranu, 1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 1% Tween 20). Dostosować do pH 12 za pomocą 2 M NaOH. 
	UWAGA: Skoncentrowany NaOH jest. Podczas przygotowywania tego roztworu należy nosić odpowiednie rękawice i okulary. 
	UWAGA: Bufor lizujący może być przechowywany do tygodnia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zmieszać 100 μl buforu lizującego z 1 μl 1 M ditiotreitolu (DTT) i 4 μl 50% 3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonianu (CHAPS).</li>
	<li>Wymieszać 1 μl kultury komórkowej (około 1 000 komórek) z mieszanym buforem lizującym z kroku 2.2. Homogenizować roztwór, powoli pipetując, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 5 minut, delikatnie mieszając. Ponownie homogenizować roztwór, powoli pipetując.</li>
	<li>Dodać 1 μl 2 μg/ml barwnika estrowego Cy3 NHS. Homogenizować roztwór, powoli pipetując, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 5 minut w ciemności w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. 
	UWAGA: Wysokie pH tego buforu powoduje neutralizację reszt lizyny w białkach, co prowadzi do wyższej reaktywności.</li>
	<li>Powtórzyć dodawanie 1 μl 2 μg/ml barwnika estrowego Cy3 NHS. Homogenizować roztwór, powoli pipetując, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. 
	UWAGA: To wielokrotne dodawanie barwnika estrowego NHS może zwiększyć skuteczność znakowania, ponieważ część barwnika estrowego Cy3 NHS jest hydrolizowana i dezaktywowana przez wysokie pH buforu reakcyjnego.</li>
	<li>Doprowadzić do pH 7,2 przez dodanie 100 μl 0,8 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES)-NaOH o pH 7,2 w celu wygaszenia reakcji. Homogenizować roztwór, powoli pipetując, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Dodać 20 μl 19 mg/ml biotyny-(glikolu polietylenowego (PEG))2-aminy i 5 μl 20 mg/ml 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) o stężeniu 20 mg/mL. Homogenizować roztwór, powoli pipetując, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. 
	UWAGA: Ten etap biotynylacji jest niezbędny do utrwalenia cząsteczek białka na szkiełku nakrywkowym mikroskopu o ustalonej gęstości i bez odchylenia dla gatunków białek.</li>
	<li>Usunąć nieprzereagowane odczynniki do etykietowania i zagęścić próbkę za pomocą kolumny ultrafiltracyjnej z odcięciem 10 kDa, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.</li>
</ol>
3. Separacja i odzyskiwanie proteomu
<ol>
	<li>Dodać 4x bufor próbki SDS (200 mM Tris-HCl pH 6,8, 4% SDS, 4% glicerolu i 0,4% błękitu bromofenolowego). 
	UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia barwnika, próbka białka nie powinna być podgrzewana, jak to ma miejsce w standardowym SDS-PAGE, i powinna być przechowywana w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wykonaj standardową SDS-PAGE dla próbki białka i drabinki molekularnej, używając 20% żelu akrylowego. Migrować próbkę w żelu pod stałym napięciem (160 V), aż front migracji opuści żel.</li>
	<li>Zobrazuj żel, aby zidentyfikować położenie prążków białkowych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Wytnij porcje żelu, w tym interesujące frakcje białkowe, za pomocą ostrego ostrza, w oparciu o lokalizacje pasków. Frakcjonowanie przy pikach 16, 23, 55 i 120 kDa oraz przy 19–25, 25–32, 32–42, 42–54, 54–69, 69–97, 97–136 i 136–226 kDa regiony są pokazane w Rysunek 3.</li>
	<li>Za pomocą dializatora ekstrahować białka metodą elektroelucji o wielkości porów 6–8 kDa, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Wyekstrahowaną próbkę można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.</li>
</ol>
4. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych pod mikroskopem
<ol>
	<li>Przygotować 200 μl buforu awidyny (5 mM HEPES-NaOH pH 7,2, 10 ng/ml awidyny i 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) dla każdej próbki.</li>
	<li>Przygotować szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm i grubości 0,15 mm. Wystaw szkiełka nakrywkowe na działanie plazmy powietrznej za pomocą środka do czyszczenia plazmowego przez 1 minutę, aby oczyścić i aktywować ich powierzchnie.</li>
	<li>Pokryj szkiełka nakrywkowe awidyną, obracając 200 μl buforu awidyny za pomocą powlekarki wirowej przez 5 sekund przy 500 obr./min, a następnie przez 30 sekund przy 1 000 obr./min. Inkubuj szkiełka nakrywkowe przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby wyschły.</li>
	<li>Przygotować szkiełka nakrywkowe do próbki białka.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć próbkę białka (od 3,5) 100 razy w 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.</li>
		<li>Umieścić 100 μl rozcieńczonej próbki na powierzchni pośrodku szkiełka nakrywkowego pokrytego awidyną (od kroku 4.3).</li>
		<li>Inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować kontrolę pozytywną.
	<ol>
		<li>Umieścić 100 μl 10 ng/ml oczyszczonej fluorescencyjnej biotyny w 5 mM HEPES-NaOH o pH 7,2 na środku szkiełka nakrywkowego pokrytego awidyną (od kroku 4.3).</li>
		<li>Inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: To szkiełko nakrywkowe z kontrolą pozytywną zapewnia gęstość plam wiązania awidyny, która służy do obliczania LO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować kontrolę ujemną.
	<ol>
		<li>Oczyszczone plazmowo szkiełko nakrywkowe należy obtoczyć 200 μl 5 mM HEPES-NaOH i 2 mg/ml BSA (bez awidyny).</li>
		<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej do wyschnięcia.</li>
		<li>Dodać 100 μl 10 ng/ml oczyszczonej fluorescencyjnej biotyny w 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.</li>
		<li>Inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: To szkiełko nakrywkowe z kontrolą ujemną zapewnia ilość niespecyficznego wiązania fluorescencyjnej biotyny ze szkiełkiem nakrywkowym bez awidyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepłukać każde szkiełko nakrywkowe 200 μl wody destylowanej, pipetując krawędzie szkiełka nakrywkowego tak, aby nie dotykać końcówką środka szkiełka nakrywkowego. Powtórz to pranie trzy razy. 
	UWAGA: Po zassaniu wody na szkiełku nakrywkowym, wodę należy natychmiast umieścić z powrotem na szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec jego całkowitemu wyschnięciu.</li>
	<li>Poddać plazmę powietrzną takiej samej liczbie szkiełek nakrywkowych, jak w kroku 4.2.</li>
	<li>Umieścić oczyszczone szkiełko nakrywkowe na szkiełku nakrywkowym związanym z próbką z kroku 4.7, aby uniknąć wyschnięcia.</li>
</ol>
5. Obserwacja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki
<ol>
	<li>Uruchomić mikroskop fluorescencyjny o szerokim polu widzenia lub w polu ulotnym. 
	UWAGA: Bezpośrednie lub rozproszone promieniowanie laserowe może spowodować uszkodzenie oczu lub skóry. Nosić odpowiednie okulary ochronne i osłaniać ścieżkę światła lasera. 
	UWAGA: Aby uzyskać informacje na temat konfiguracji mikroskopu, zapoznaj się z naszą poprzednią publikacją16. Krótko mówiąc, do tego pomiaru można użyć mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu lub pola ulotnego, wyposażonego w wzbudzenie laserowe o dużej mocy 488 nm, obiektyw o dużej aperturze numerycznej i kamerę o wysokiej czułości. Ponadto, w celu zautomatyzowanego pomiaru, zaleca się zainstalowanie sterowanego komputerowo stolika na próbki translacyjne XY, mechanicznych przesłon do wzbudzeń laserowych oraz systemu automatycznego ustawiania ostrości.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na mikroskopie i znajdź ostrość.</li>
	<li>Wykonaj skanowanie kafelków, aby uzyskać co najmniej 100 obrazów. 
	UWAGA: Oświetlenie laserowe powinno być kontrolowane za pomocą mechanicznych przesłon, aby można je było naświetlić próbkę tylko podczas nagrywania obrazów aparatem, aby zminimalizować fotowybielanie. Jeśli próbek jest dużo, zaleca się automatyczny pomiar za pomocą programu komputerowego do sterowania urządzeniami mikroskopowymi. Każdy obraz zazwyczaj zawiera 100–500 plamek pojedynczych cząsteczek w przypadku korzystania z soczewki obiektywowej o powiększeniu 60x.</li>
</ol>
6. Analiza obrazu i ekstrakcja informacji
<ol>
	<li>Jeśli obraz ma nierówności spowodowane wzorem oświetlenia laserowego, przeprowadź przetwarzanie obrazu, aby go poprawić18.
	<ol>
		<li>Uzyskać obraz referencyjny, dokonując pomiaru za pomocą próbki szkiełka nakrywkowego składającej się z równomiernie rozprowadzonych barwników, przy ustawieniu kamery takim samym jak w kroku 5.3.</li>
		<li>Uzyskaj obraz offsetowy, mierząc bez wzbudzenia laserowego przy użyciu tego samego ustawienia kamery.</li>
		<li>Odejmij każdą wartość piksela na każdym przykładowym obrazie i obrazie referencyjnym od wartości obrazu przesuniętego.</li>
		<li>Podziel każdą wartość piksela na odjętych przykładowych obrazach przez wartość na odjętym obrazie referencyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz prawidłowo pozyskane obrazy i usuń tło obrazu.
	<ol>
		<li>Obrazy zawierające duże agregaty fluorescencyjne można usuwać ręcznie.</li>
		<li>Usuń tło obrazu, stosując algorytm toczącej się kuli19 o promieniu kuli 50 pikseli za pomocą ImageJ20.</li>
		<li>Wyostrz obrazy, odejmując rozmyte obrazy za pomocą ImageJ (funkcja wyostrzania obrazu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znajdowanie i analizowanie plam pojedynczych cząsteczek na obrazach.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj plamki pojedynczej cząsteczki za pomocą algorytmu progu Yena21 za pomocą ImageJ.</li>
		<li>Filtruj plamki zawierające mniej niż dwa piksele, aby wykluczyć ciemny szum kamery i plamki większe niż 20 pikseli, aby wykluczyć agregacje białek za pomocą ImageJ (menedżer ROI).</li>
		<li>Policz liczbę plam na każdym obrazie. Korzystając z obrazów z korekcją oświetlenia (krok 6.1.4), przeanalizuj całkowite intensywności w pikselach dla każdego punktu za pomocą ImageJ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz zajętość etykietowania (LO) za pomocą następującego wzoru: 
	LO = (liczba zliczeń w próbce / liczba liczb w kontroli dodatniej) x 100</li>
	<li>Obliczyć średnią liczbę barwników fluorescencyjnych związanych z pojedynczą cząsteczką białka (barwnik n̄).
	<ol>
		<li>Przeanalizuj histogram intensywności każdego punktu. 
		UWAGA: Histogram ma zwykle kilka pików, a każdy pik reprezentuje inną liczbę cząsteczek barwnika związanych z białkiem. Pierwszy, drugi i trzeci pik na histogramie odpowiadają odpowiednio 1, 2 i 3 cząsteczkom.</li>
		<li>Oblicz średnią intensywność na podstawie histogramu. Oblicz również intensywność piku pierwszego piku, stosując dopasowanie Gaussa.</li>
		<li>Oblicz barwnik n̄, dzieląc średnią intensywność przez intensywność szczytową.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li>
<li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Background-free%2C+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li>
<li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain%3A+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li>
<li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li>
<li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On%2Foff+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li>
<li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li>
<li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li>
<li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li>
<li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li>
<li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li>
<li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li>
<li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li>
<li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIan+Freshney%2C+R+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications</a>. , John Wiley & Sons. (2015).</li>
<li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li>
<li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li>
<li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li>
<li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22EuPA+Open+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li>
<li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li>
<li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. igh- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed%2C+Comprehensive%2C+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują następujące konkurencyjne interesy finansowe: RIKEN złożył wniosek patentowy na te wyniki, a S.L. i Y.T. są wymienieni jako współwynalazcy.

W artykule opisano protokół ilościowego oznaczania jednorodności znakowania każdego znakowanego gatunku białka w komórkach po separacji za pomocą SDS-PAGE (krok 3). Metodę rozdzielania można zastąpić innymi metodami, takimi jak chromatografia cieczowa lub elektroforeza kapilarna, które umożliwiają separację i frakcjonowanie białek komórkowych z wysoką rozdzielczością, przy czym wymagają specjalnego sprzętu23. Metoda znakowania przy użyciu estru NHS w obecnym protokole może zostać zastąpiona innymi...

Analiza proteomu, która ma na celu ilościowe określenie całego zestawu cząsteczek białka wyrażanych w komórce, jest cennym podejściem w obecnych badaniach biologicznych i medycznych. Analiza ta zwykle opiera się na spektrometrii mas, która identyfikuje gatunki białek na podstawie widm generowanych przez jonizację białek1,2,3. Alternatywną metodą analizy proteomu jest elektroforeza, w tym elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE), elektroforeza kapilarna oraz dwuwymiarowa (2D) elektroforeza żelowa. Metoda ta polega na niespecyficznym znakowaniu fluorescencyjnym wszystkich cząsteczek białka w analizowanych komórkach, a następnie na separacji elektroforetycznej oraz wykrywaniu i oznaczaniu ilościowym każdego rodzaju białka. Aby osiągnąć wymagane niespecyficzne znakowanie białek, jedną ze strategii jest użycie barwników fluorescencyjnych, które mogą wiązać się z białkami poprzez oddziaływania elektrostatyczne i hydrofobowe, takich jak Coomassie Blue i Sypro-Ruby4,5,6. Alternatywną strategią jest zastosowanie znakowania kowalencyjnego barwnikami zawierającymi ester N-hydroksysukcynimidu (NHS) lub maleimid, które mogą kowalencyjnie wiązać się z białkami poprzez wspólne reszty, takie jak odpowiednio aminy pierwszorzędowe i tiole7,8.
Tymczasem, czułość wykrywania fluorescencji jest idealna do analizy białek o niskiej obfitości i małej liczby komórek. Obrazowanie fluorescencyjne pojedynczej cząsteczki jest jedną z najbardziej czułych metod, która umożliwia wykrywanie pojedynczych barwników fluorescencyjnych i znakowanych białek in vitro i in vivo9,10,11,12,13,14,15. Oczekuje się, że zastosowanie tej metody obrazowania do analizy proteomu opartej na elektroforezie umożliwi wysoce czułe i ilościowe testy poprzez zliczanie pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie. Nie jest jednak jasne, czy znakowanie barwnikami fluorescencyjnymi jest wystarczająco jednorodne we wszystkich cząsteczkach białka i jak na tę jednorodność wpływają różne gatunki białek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Proste pomiary roztworu masowego mogą być wykorzystane do uzyskania stosunku molowego barwników fluorescencyjnych do białek zwanego "wydajnością sprzężenia"8 lub "wydajnością znakowania", ale ta właściwość nie dostarcza informacji na temat jednorodności znakowania między cząsteczkami białka.
Tutaj opisujemy protokół testu do zbadania jednorodności etykietowania dla wszystkich gatunków białek w komórce (Rysunek 2)16. Dwa kluczowe etapy tego testu to oczyszczanie białek i obrazowanie. W pierwszym etapie wszystkie białka w komórkach są znakowane fluorescencyjnie i biotynylowane, a następnie ekstrahowane oddzielnie za pomocą elektroforezy żelowej, a następnie elektroelucji. W drugim etapie oceniane są właściwości fluorescencyjne poszczególnych cząsteczek białek w wyekstrahowanych próbkach na podstawie obrazowania pojedynczych cząsteczek. Na podstawie tych danych można scharakteryzować parametry ważne dla analizy zliczania, takie jak procent białek znakowanych co najmniej jednym barwnikiem, który nazywamy tagowaniem zajętości (LO)16, oraz średnia liczba barwników fluorescencyjnych związanych z pojedynczą cząsteczką białka (barwnik n̄). W protokole jako przykład przedstawiono zoptymalizowaną procedurę znakowania proteomu komórek HeLa barwnikiem cyjaniny 3 (Cy3) na bazie estrów NHS, która może być modyfikowana za pomocą innych procedur znakowania zgodnie z pożądanymi celami badawczymi.

<table><tbody><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 22x22x0,15 mm</td><td>VWR</td><td>470019-004</td><td></td></tr><tr><td>488 nm Laser argonowy</td><td>Coherent</td><td>Innova 70C</td><td></td></tr><tr><td>488 nm lustro dichroiczne</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny 488 nm</td><td>Semrock</td><td>FF02-520/28</td><td></td></tr><tr><td>Filtr dichroiczny 560 nm</td><td>Filtr</td><td></td> emisji Semrock Di02-R561 <td></td></tr><tr><td>560 nm</td><td>Laser światłowodowy Semrock</td><td>FF02-617/73</td><td></td></tr><tr><td>560 nm</td><td>MBP Communications</td><td>F-04306-2 60-krotna</td><td></td></tr><tr><td>soczewka olejowa</td><td>Olympus</td><td>PLAPON 60x</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Nacalai-tesque</td><td>03553-64</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-PEG-amina</td><td>Thermo Scientific</td><td>21346</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowana Alexa Fluor 488</td><td>Nanocs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boran</td><td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9547</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Dojindo</td><td>C008-10</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 NHS-ester dye</td><td>GE Healthcare</td><td>PA13101</td><td></td></tr><tr><td>Dializator&nbsp; - D-tube, 6-8 kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>71507-M</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai-tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>kamera Andor</td><td>IiXon 897</td><td></td></tr><tr><td>Epi mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Przeglądarka żelowa</td><td>GE Healthcare</td><td>ImageQuant LAS 4000</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka penicyliny, streptomycyny i amfoteryny</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myjka plazmowa</td><td>Diener Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Wako</td><td>NC0792960</td><td></td></tr><tr><td>Rozmiar kolumny oczyszczającej 10K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteomy komórek są często charakteryzowane za pomocą testów elektroforezy, gdzie wszystkie gatunki białek w komórkach są niespecyficznie znakowane barwnikiem fluorescencyjnym i są wykrywane przez fotodetektor po ich rozdzieleniu. Obrazowanie fluorescencyjne pojedynczej cząsteczki może zapewnić ultraczułe wykrywanie białek dzięki możliwości wizualizacji pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych. Jednak zastosowanie tej potężnej metody obrazowania do testów elektroforetycznych jest utrudnione ze względu na brak sposobów scharakteryzowania jednorodności znakowania fluorescencyjnego każdego rodzaju białka w proteomie. W tym miejscu opracowaliśmy metodę oceny jednorodności znakowania w całym proteomie w oparciu o test obrazowania fluorescencji pojedynczej cząsteczki. W naszym pomiarze z wykorzystaniem próbki komórek HeLa, proporcja białek znakowanych co najmniej jednym barwnikiem, który nazwaliśmy "zajmowaniem znakowania" (LO), została określona na zakres od 50% do 90%, co potwierdza wysoki potencjał zastosowania obrazowania pojedynczej cząsteczki do czułej i precyzyjnej analizy proteomu.

Rysunek 4 przedstawia surowe dane obrazowe dla różnych frakcji białek o różnej masie cząsteczkowej z lizatu komórek HeLa, a także kontrolę pozytywną i negatywną. Podczas gdy zarówno próbka białka, jak i kontrola pozytywna wykazują od 10 do 50 plamek na obrazie, kontrola negatywna nie wykazuje żadnych lub tylko kilka plamek, co dowodzi, że protokół w wystarczającym stopniu hamuje niespecyficzne wiązanie barwników z powierzchnią szkiełka nakrywkowego. Histogram...

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Metoda ta demonstruje kalibrację ilościowego oznaczania ilości białka w próbce ciekłej za pomocą procesu liczenia pojedynczej cząsteczki. W szczególności może zilustrować, w jaki sposób populacje białek mogą być znakowane fluorescencyjnie na każdym poziomie cząsteczki. Poprzednie metody wykonywały masowe pomiary w celu analizy stosunków molowych cząsteczek fluorescencyjnych i białkowych, ale nie mogą ujawnić, jak niejednorodnie znakowane są populacje białek.Nasze metody mogą to zrobić bezpośrednio na poziomie pojedynczej cząsteczki. Nasza metoda może zostać rozszerzona o ultraczułe i zaawansowane testy koncentracji molekularnej, które doprowadzą do przyszłych metod diagnostycznych, umożliwiając skuteczne wykrywanie cząsteczek chorobotwórczych w próbkach. Nasza metoda może być stosowana do analizy pojedynczych gatunków białek przy użyciu przeciwciał fluorescencyjnych, a także do analizy wielu gatunków przy użyciu niespecyficznych znaczników dla wszystkich białek oddzielonych za pomocą elektroforezy lub chromatografii.Najbardziej krytycznym punktem tej techniki jest uzyskanie powtarzalności danych. Zalecam zachowanie tych samych warunków eksperymentalnych w jak największym stopniu podczas pomiaru wielu próbek. Wizualna demonstracja tej techniki dostarczy, jak sprawić, by każdy krok eksperymentalny był stabilny i powtarzalny.Pokaże również kilka nietypowych kroków w protokołach biochemicznych, takich jak wirowanie i mycie szkiełek nakrywkowych mikroskopu. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować bufor lizujący i 1%Tween-20 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Użyj wodorotlenku sodu, aby dostosować pH do 12.Wymieszaj 100 mikrolitrów buforu lizującego z jednym mikrolitrem jednego molowego DDT i czterema mikrolitrami 50% CHAP. Dodać jeden mikrolitr przygotowanej kultury komórkowej i homogenizować roztwór, powoli pipetując, aby uniknąć pęcherzyków. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez pięć minut, delikatnie mieszając.Następnie ponownie homogenizuj roztwór, powoli pipetując go w górę i w dół. Dodać jeden mikrogram barwnika estrowego Cy3 NHS i homogenizować roztwór, spowalniając pipetowanie, aby uniknąć pęcherzyków. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut, delikatnie mieszając.Powtórz ten proces, dodając tę samą ilość barwnika i inkubując próbkę jeden raz. Dodać 100 mikrolitrów 0,8 molowego wodorotlenku sodu HEPES, aby dostosować pH roztworu do 7,2 i wygasić reakcję. Powoli pipetować w górę i w dół, aby ujednorodnić roztwór.Następnie dodaj 20 mikrolitrów biotyny-2-aminy i pięć mikrolitrów EDC. Homogenizować roztwór, powoli pipetując w górę i w dół. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez godzinę z delikatnym mieszaniem.Następnie należy użyć kolumny ultrafiltracyjnej z odcięciem 10 kilodaltonów, aby usunąć wszelkie nieprzereagowane odczynniki do znakowania i zagęścić próbkę. Po wykonaniu standardowej SDS-PAGE dla próbki białka i drabiny molekularnej, zobrazuj żel, aby zidentyfikować lokalizację prążków białkowych. Użyj ostrego ostrza, aby wyciąć porcje żelu, które zawierają interesujące frakcje białkowe na podstawie lokalizacji pasm.Najpierw ustaw szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 milimetry na 22 milimetry i grubości 0,15 milimetra. Użyj środka do czyszczenia plazmowego, aby wystawić szkiełka nakrywkowe na działanie plazmy powietrznej przez jedną minutę, aby oczyścić i aktywować ich powierzchnie. Następnie użyj wirówki, aby obrócić szkiełka nakrywkowe 200 mikrolitrami buforu avadin przez pięć sekund przy 500 obr./min, a następnie 30 sekund przy 1000 obr./min.Inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby wyschły na powietrzu. Aby przygotować szkiełka nakrywkowe dla próbki białka, należy użyć próbki białka, która została rozcieńczona. Umieścić 100 mikrolitrów rozcieńczonej próbki na środku szkiełek nakrywkowych pokrytych awadiną.Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Aby przygotować kontrolę pozytywną, umieścić 100 mikrolitrów oczyszczonej fluorescencyjnej biotyny w pięciu mikromolowych HEPES-wodorotlenku sodu o pH 7,2 pośrodku szkiełka nakrywkowego pokrytego awadiną. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Aby przygotować kontrolę ujemną, należy obtoczyć szkiełka nakrywkowe w osocza 200 mikrolitrami pięciu wodorotlenków sodu HEPES z dwoma miligramami na mililitr BSA bez awadyny. Dodać 100 mikrolitrów do oczyszczonej fluorescencyjnej biotyny w pięciu mikromolowych HEPES-wodorotlenku sodu o pH 7,2. Inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie przepłucz każde szkiełko nakrywkowe 200 mikrolitrami wody destylowanej, pipetując krawędzie, uważając, aby nie dotknąć końcówką pipety środka szkiełka nakrywkowego. Powtórz to pranie trzy razy. Następnie należy wystawić taką samą liczbę nowych szkiełek nakrywkowych na działanie plazmy powietrznej przez jedną minutę.Umieść oczyszczone szkiełko nakrywkowe na wierzchu każdego szkiełka nakrywkowego związanego z próbką, aby uniknąć wyschnięcia. Uruchom mikroskop fluorescencyjny o szerokim polu lub w polu ulotnym. Umieść szkiełko nakrywkowe na mikroskopie i znajdź ostrość.Następnie wykonaj skanowanie kafelków, aby uzyskać co najmniej 100 obrazów. W tym badaniu jednorodność znakowania każdego znakowanego gatunku białka w komórkach jest określana ilościowo po oddzieleniu za pomocą SDS-PAGE. Surowe dane obrazowe dla różnych frakcji masy cząsteczkowej białek z lizatu komórkowego HeLa, a także kontroli pozytywnej i negatywnej, są widoczne tutaj.Podczas gdy zarówno próbka białka, jak i kontrola pozytywna wykazują od 100 do 500 plamek na obrazie, kontrola ujemna wykazuje bardzo niewiele lub żadne. Pokazuje to, że proces ten w wystarczającym stopniu hamuje niespecyficzne wiązanie barwników z powierzchnią szkiełka nakrywkowego. Histogramy intensywności plamki dla próbek białek i kontroli pozytywnej prezentują wiele pików, które reprezentują stochastyczne wiązanie barwników z aminami pierwszorzędowymi odpowiednio w białkach i strukturach tetrameru avadin.Wszystkie plamki wykazywały mruganie i stopniowe fotowybielanie z ciągłym wzbudzeniem laserowym, podkreślając obserwację na poziomie pojedynczej cząsteczki. Zajętość znakowania (LO) jest następnie obliczana na podstawie stosunku liczby plamek w każdej próbce białka do liczby plamek w kontroli pozytywnej. LO mierzone z próbki lizatu komórek HeLa waha się od 50% dla frakcji o mniejszej masie cząsteczkowej do 90% dla frakcji o wyższej masie cząsteczkowej.Przyjmuje się, że LO dla całej próbki proteomu bez separacji wynosi 72%Bardzo ważne jest, aby używać świeżo przygotowanych odczynników i unikać kurzu, zwłaszcza podczas przygotowywania szkiełek nakrywkowych. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić analizę zliczania pojedynczych cząsteczek w określonej objętości w celu ilościowego określenia stężeń każdego białka. Na przykład można przeprowadzić analizę dowolnego surowca lub produktów elektroforezy żelowej i kapilarnej.Technika ta toruje drogę do wykorzystania obrazowania fluorescencji pojedynczych cząsteczek w medycynie molekularnej, chemii organicznej i analizie omicznej. Łącząc koncepcję między koncentracją a liczbami. Stężony wodorotlenek sodu jest i podczas obchodzenia się z nim należy nosić odpowiednią ochronę.Ponadto promieniowanie laserowe o dużej mocy może powodować uszkodzenie oczu, dlatego można nosić okulary ochronne.

proteome-wide-quantification-labeling-homogeneity-at-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Postępy w spektrometrii mas umożliwiły wysokoprzepustową analizę ekspresji i modyfikacji białek w wielu tkankach. W połączeniu z frakcjonowaniem subkomórkowym i modelami chorób, ilościowa spektrometria mas oraz bioinformatyka mogą ujawnić nowe właściwości systemów biologicznych. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu analizuje białka związane z chromatyną w kontekście chorób serca i jest łatwo stosowalna w innych modelach in vivo chorób ludzkich.

Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to szybka, tania strategia dla dokładnej proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas. W tym miejscu demonstrujemy solidną metodę przygotowania i analizy mieszanin białkowych przy użyciu podejścia ReDi, którą można zastosować do prawie każdego rodzaju próbki.

Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.

Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Prezentujemy zoptymalizowany protokół etykietowania tandemowego znacznika masy (TMT), który zawiera szczegółowe informacje dla każdego z następujących etapów: ekstrakcja białka, kwantyfikacja, wytrącanie, trawienie, etykietowanie, przesyłanie do ośrodka proteomicznego i analiza danych.

Przygotowanie próbki TMT do przedłożenia przez placówkę proteomiczną i późniejszej analizy danych

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Tutaj opisujemy proces proteomiki do charakterystyki proteomu powierzchni komórki różnych typów komórek. Ten przepływ pracy obejmuje wzbogacanie białek na powierzchni komórki, późniejsze przygotowanie próbki, analizę przy użyciu platformy LC-MS/MS oraz przetwarzanie danych za pomocą specjalistycznego oprogramowania.

Przepływ pracy "Cell Surface Capture" do ilościowego oznaczania proteomu powierzchni komórki bez znaczników

Poznaj metodę kwantyfikacji jednorodności znakowania białek na poziomie pojedynczej cząsteczki. Technika ta umożliwia dokładną analizę fluorescencyjnie znakowanych populacji białkowych, ujawniając heterogeniczność niewidoczną w pomiarach zbiorczych.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Przeglądaj więcej filmów