Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki
19 kwietnia 2019
Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.
Metoda ta demonstruje kalibrację ilościowego oznaczania ilości białka w próbce ciekłej za pomocą procesu liczenia pojedynczej cząsteczki. W szczególności może zilustrować, w jaki sposób populacje białek mogą być znakowane fluorescencyjnie na każdym poziomie cząsteczki. Poprzednie metody wykonywały masowe pomiary w celu analizy stosunków molowych cząsteczek fluorescencyjnych i białkowych, ale nie mogą ujawnić, jak niejednorodnie znakowane są populacje białek.
Nasze metody mogą to zrobić bezpośrednio na poziomie pojedynczej cząsteczki. Nasza metoda może zostać rozszerzona o ultraczułe i zaawansowane testy koncentracji molekularnej, które doprowadzą do przyszłych metod diagnostycznych, umożliwiając skuteczne wykrywanie cząsteczek chorobotwórczych w próbkach. Nasza metoda może być stosowana do analizy pojedynczych gatunków białek przy użyciu przeciwciał fluorescencyjnych, a także do analizy wielu gatunków przy użyciu niespecyficznych znaczników dla wszystkich białek oddzielonych za pomocą elektroforezy lub chromatografii.
Najbardziej krytycznym punktem tej techniki jest uzyskanie powtarzalności danych. Zalecam zachowanie tych samych warunków eksperymentalnych w jak największym stopniu podczas pomiaru wielu próbek. Wizualna demonstracja tej techniki dostarczy, jak sprawić, by każdy krok eksperymentalny był stabilny i powtarzalny.
Pokaże również kilka nietypowych kroków w protokołach biochemicznych, takich jak wirowanie i mycie szkiełek nakrywkowych mikroskopu. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować bufor lizujący i 1%Tween-20 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Użyj wodorotlenku sodu, aby dostosować pH do 12.
Wymieszaj 100 mikrolitrów buforu lizującego z jednym mikrolitrem jednego molowego DDT i czterema mikrolitrami 50% CHAP. Dodać jeden mikrolitr przygotowanej kultury komórkowej i homogenizować roztwór, powoli pipetując, aby uniknąć pęcherzyków. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez pięć minut, delikatnie mieszając.
Następnie ponownie homogenizuj roztwór, powoli pipetując go w górę i w dół. Dodać jeden mikrogram barwnika estrowego Cy3 NHS i homogenizować roztwór, spowalniając pipetowanie, aby uniknąć pęcherzyków. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut, delikatnie mieszając.
Powtórz ten proces, dodając tę samą ilość barwnika i inkubując próbkę jeden raz. Dodać 100 mikrolitrów 0,8 molowego wodorotlenku sodu HEPES, aby dostosować pH roztworu do 7,2 i wygasić reakcję. Powoli pipetować w górę i w dół, aby ujednorodnić roztwór.
Następnie dodaj 20 mikrolitrów biotyny-2-aminy i pięć mikrolitrów EDC. Homogenizować roztwór, powoli pipetując w górę i w dół. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez godzinę z delikatnym mieszaniem.
Następnie należy użyć kolumny ultrafiltracyjnej z odcięciem 10 kilodaltonów, aby usunąć wszelkie nieprzereagowane odczynniki do znakowania i zagęścić próbkę. Po wykonaniu standardowej SDS-PAGE dla próbki białka i drabiny molekularnej, zobrazuj żel, aby zidentyfikować lokalizację prążków białkowych. Użyj ostrego ostrza, aby wyciąć porcje żelu, które zawierają interesujące frakcje białkowe na podstawie lokalizacji pasm.
Najpierw ustaw szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 milimetry na 22 milimetry i grubości 0,15 milimetra. Użyj środka do czyszczenia plazmowego, aby wystawić szkiełka nakrywkowe na działanie plazmy powietrznej przez jedną minutę, aby oczyścić i aktywować ich powierzchnie. Następnie użyj wirówki, aby obrócić szkiełka nakrywkowe 200 mikrolitrami buforu avadin przez pięć sekund przy 500 obr./min, a następnie 30 sekund przy 1000 obr./min.
Inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby wyschły na powietrzu. Aby przygotować szkiełka nakrywkowe dla próbki białka, należy użyć próbki białka, która została rozcieńczona. Umieścić 100 mikrolitrów rozcieńczonej próbki na środku szkiełek nakrywkowych pokrytych awadiną.
Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Aby przygotować kontrolę pozytywną, umieścić 100 mikrolitrów oczyszczonej fluorescencyjnej biotyny w pięciu mikromolowych HEPES-wodorotlenku sodu o pH 7,2 pośrodku szkiełka nakrywkowego pokrytego awadiną. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
Aby przygotować kontrolę ujemną, należy obtoczyć szkiełka nakrywkowe w osocza 200 mikrolitrami pięciu wodorotlenków sodu HEPES z dwoma miligramami na mililitr BSA bez awadyny. Dodać 100 mikrolitrów do oczyszczonej fluorescencyjnej biotyny w pięciu mikromolowych HEPES-wodorotlenku sodu o pH 7,2. Inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie przepłucz każde szkiełko nakrywkowe 200 mikrolitrami wody destylowanej, pipetując krawędzie, uważając, aby nie dotknąć końcówką pipety środka szkiełka nakrywkowego. Powtórz to pranie trzy razy. Następnie należy wystawić taką samą liczbę nowych szkiełek nakrywkowych na działanie plazmy powietrznej przez jedną minutę.
Umieść oczyszczone szkiełko nakrywkowe na wierzchu każdego szkiełka nakrywkowego związanego z próbką, aby uniknąć wyschnięcia. Uruchom mikroskop fluorescencyjny o szerokim polu lub w polu ulotnym. Umieść szkiełko nakrywkowe na mikroskopie i znajdź ostrość.
Następnie wykonaj skanowanie kafelków, aby uzyskać co najmniej 100 obrazów. W tym badaniu jednorodność znakowania każdego znakowanego gatunku białka w komórkach jest określana ilościowo po oddzieleniu za pomocą SDS-PAGE. Surowe dane obrazowe dla różnych frakcji masy cząsteczkowej białek z lizatu komórkowego HeLa, a także kontroli pozytywnej i negatywnej, są widoczne tutaj.
Podczas gdy zarówno próbka białka, jak i kontrola pozytywna wykazują od 100 do 500 plamek na obrazie, kontrola ujemna wykazuje bardzo niewiele lub żadne. Pokazuje to, że proces ten w wystarczającym stopniu hamuje niespecyficzne wiązanie barwników z powierzchnią szkiełka nakrywkowego. Histogramy intensywności plamki dla próbek białek i kontroli pozytywnej prezentują wiele pików, które reprezentują stochastyczne wiązanie barwników z aminami pierwszorzędowymi odpowiednio w białkach i strukturach tetrameru avadin.
Wszystkie plamki wykazywały mruganie i stopniowe fotowybielanie z ciągłym wzbudzeniem laserowym, podkreślając obserwację na poziomie pojedynczej cząsteczki. Zajętość znakowania (LO) jest następnie obliczana na podstawie stosunku liczby plamek w każdej próbce białka do liczby plamek w kontroli pozytywnej. LO mierzone z próbki lizatu komórek HeLa waha się od 50% dla frakcji o mniejszej masie cząsteczkowej do 90% dla frakcji o wyższej masie cząsteczkowej.
Przyjmuje się, że LO dla całej próbki proteomu bez separacji wynosi 72%Bardzo ważne jest, aby używać świeżo przygotowanych odczynników i unikać kurzu, zwłaszcza podczas przygotowywania szkiełek nakrywkowych. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić analizę zliczania pojedynczych cząsteczek w określonej objętości w celu ilościowego określenia stężeń każdego białka. Na przykład można przeprowadzić analizę dowolnego surowca lub produktów elektroforezy żelowej i kapilarnej.
Technika ta toruje drogę do wykorzystania obrazowania fluorescencji pojedynczych cząsteczek w medycynie molekularnej, chemii organicznej i analizie omicznej. Łącząc koncepcję między koncentracją a liczbami. Stężony wodorotlenek sodu jest i podczas obchodzenia się z nim należy nosić odpowiednią ochronę.
Ponadto promieniowanie laserowe o dużej mocy może powodować uszkodzenie oczu, dlatego można nosić okulary ochronne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę oceny jednorodności znakowania gatunków białek w złożonych próbkach na poziomie pojedynczych cząsteczek. Podkreśla on zalety analizy pojedynczych cząsteczek w porównaniu z tradycyjnymi technikami pomiarów objętościowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Analiza białek
- Techniki pojedynczych cząsteczek
- Znakowanie fluorescencyjne
Wstęp
- Tradycyjne metody analizują stosunki molowe cząsteczek fluorescencyjnych i białek.
- Pomiary objętościowe nie pozwalają na ujawnienie heterogeniczności znakowania białek.
- Analiza pojedynczych cząsteczek zapewnia dokładniejszą reprezentację populacji białek.
- Metodę tę można zastosować zarówno do pojedynczych, jak i wielu gatunków białek.
Cel badania
- Opracowanie protokołu oceny jednorodności znakowania białek.
- Wykazanie zalet ilościowej analizy pojedynczych cząsteczek.
- Umożliwienie rozwoju przyszłych metod diagnostycznych wykrywania cząsteczek patogennych.
Zastosowane metody
- Fluorescencyjne znakowanie populacji białek.
- Techniki liczenia pojedynczych cząsteczek.
- Elektroforeza lub chromatografia w celu rozdzielenia białek.
- Zastosowanie przeciwciał fluorescencyjnych do analizy pojedynczych białek.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia bezpośrednią obserwację heterogeniczności znakowania.
- Demonstruje ona kalibrację ilościowego oznaczania zawartości białek.
- Analiza pojedynczych cząsteczek dostarcza informacji nieosiągalnych przy użyciu metod zbiorczych.
- Podejście to można rozszerzyć na zaawansowane testy stężenia cząsteczkowego.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie znakowania białek na poziomie pojedynczych cząsteczek.
- Otwiera ona możliwości dla przyszłych zastosowań diagnostycznych.
- Techniki pojedynczych cząsteczek mogą znacząco usprawnić analizę białek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe określenie jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczych cząsteczek pozwala na wypełnienie krytycznej luki w analityce białek w fazie odkrywania w badaniach biofarmaceutycznych.&D. Metoda ta umożliwia bezpośrednią ocenę stopnia zajęcia miejsc znakowania, co zwiększa pewność prognostyczną w dalszych analizach proteomicznych i ułatwia rzetelną walidację celu. Integracja ilościowego oznaczania pojedynczych cząsteczek usprawnia podejmowanie decyzji w zakresie portfela badań poprzez redukcję niejednoznaczności w detekcji i pomiarze białek.
Strategiczne zastosowania w badaniach nad biofarmaceutykami&D
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę heterogeniczności znakowania białek w całym proteomie.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez kwantyfikację stopnia zajętości znakowania dla każdego gatunku białka.
- Zwiększa pewność predykcyjną odczytów proteomicznych w badaniach opartych na hipotezach.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ułatwia przygotowanie powtarzalnie znakowanych próbek białek do analiz o wysokiej czułości.
- Umożliwia standaryzację protokołów znakowania, co poprawia powtarzalność i porównywalność analiz.
- Zapewnia dane ilościowe niezbędne do oceny gotowości do przesiewu oraz skalowalności platformy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie ilościowej analizy proteomicznej do układów istotnych dla danej choroby poprzez zapewnienie ultrasensytywnej detekcji gatunków białek.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej dzięki zastosowaniu niezawodnej analityki pojedynczych cząsteczek.
- Minimalizuje ryzyko przy opracowywaniu biomarkerów translacyjnych poprzez zapewnienie dokładnego oznaczania ilości białek.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, zapewniając ilościowe podstawy dla analiz proteomicznych, od wczesnego testowania hipotez, po identyfikację związków wiodących i badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ilościowe określanie stopnia zajętości znakowania na poziomie pojedynczych cząsteczek.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe dane dotyczące znakowania do rozwoju testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia wiarygodne odczyty z poziomu pojedynczych cząsteczek oraz wyniki statystyczne do porównywania znakowania białek w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Umożliwia dostosowanie pomiarów proteomicznych do modeli chorób i strategii biomarkerowych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do ilościowego oznaczania całego proteomu w różnorodnych procesach badawczo-rozwojowych (R&D).
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w analizach proteomicznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły znakowania i kwantyfikacji w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez poprawę niezawodności testów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów badawczych i translacyjnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu fluorescencyjnym pojedynczych cząsteczek oraz w analizie ilościowej.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej aparatury do mikroskopii i elektroforezy.
- Konieczne jest rygorystyczne ujednolicenie protokołów znakowania i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych gatunków białek i typów próbek poprzez optymalizację protokołu.
- Powtarzalność wyników zależy od świeżości odczynników oraz kontroli zanieczyszczeń.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:33
Cell Lysis and Fluorescent Labeling
3:26
Proteome Separation and Recovery
3:51
Microscope Coverslip Preparation
5:46
Observation with Single Molecule Fluorescence Microscopy
6:07
Results: Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level
7:33
Conclusion
