Name: Urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Poznaj metodę donosowego podawania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego myszy z wykorzystaniem urządzenia pozycjonującego. Technika ta zwiększa efektywność dostarczania leków i powtarzalność wyników w badaniach nad terapią genową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Koreańskie Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej (HI17C1046) dla S.K.L.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania Uniwersytetu Hanyang. W tym protokole wykorzystano 6-tygodniowe myszy Balb/c o masie 20-25 g (n = 3 na grupę). Zwierzęta trzymano w obiekcie wolnym od patogenów z 12-godzinnymi cyklami światła/ciemności przy kontrolowanym poziomie temperatury i wilgotności ze swobodnym dostępem do wody i pożywienia.
1. Montaż urządzenia
<ol>
	<li>Zmontuj poszczególne części urządzenia pozycjonującego, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1A. 
	UWAGA: Urządzenie dostarczane jest w pojedynczych częściach, które można łatwo zmontować i zdemontować.</li>
</ol>
2. Ustawienia materiału
UWAGA: Podawanie IN leków skroplonych wymaga następujących etapów leczenia wstępnego.
<ol>
	<li>Przygotuj wymagane materiały, w tym urządzenie pozycjonujące, mikropipetę o pojemności 10 μl, końcówki do mikropipet o pojemności 10 μl, roztwór do uzdatniania (np. kompleks RVG9R-siRNA), zegar czasowy i 70% etanolu (patrz <klasa silna = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Podłącz kod zasilania, aby włączyć system ogrzewania urządzenia co najmniej 15-20 minut przed eksperymentem. Optymalna temperatura do eksperymentów na zwierzętach jest automatycznie utrzymywana na poziomie ~37 °C.</li>
	<li>Przygotuj znieczulenie ketamina:ksylazyna:sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) w stosunku 1:0,5:8,5 i znieczulij każdą mysz pojedynczym wstrzyknięciem dootrzewnowym (i.p.) w końcowej objętości 200 μl na 20 g myszy. 
	UWAGA: Należy pamiętać, że można stosować dowolny zoptymalizowany lek zapewniający stan znieczulenia przez okres 30-45 minut.</li>
</ol>
3. Pozycjonowanie myszy
<ol>
	<li>Oceń poziom znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca u nogi), aby utrzymać płaszczyznę operacyjną.</li>
	<li>Umieścić urządzenie pozycjonujące w odpowiedniej odległości i na odpowiedniej wysokości, aby zapewnić wygodny dostęp do wszystkich wymaganych odczynników.</li>
	<li>Gdy myszy zostaną odpowiednio znieczulone, delikatnie podnieś każdą mysz za kark za kark kciukiem i palcem wskazującym i połóż ją na wyznaczonym krześle.</li>
	<li>Na tym etapie bardzo ważne jest odpowiednie ułożenie myszki na krześle. Połóż grzbiet myszy równolegle do oparcia krzesła i pod kątem 90° do siedziska krzesła. Podnieś ręce z myszy i pozwól zwierzęciu ułożyć się naturalnie w pozycji głowy w dół i do przodu, bez pchania lub naciskania, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2B. Upewnij się, że przednie kończyny myszy zapewniają naturalne wsparcie, gdy zwierzę znajduje się w tej zrelaksowanej pozycji, bez żadnego dyskomfortu dla myszy.</li>
	<li>Gdy myszy zostaną prawidłowo ustawione, przypnij je paskiem krzesła i natychmiast rozpocznij szczepienie IN.</li>
</ol>
4. Podanie donosowe
UWAGA: Ten protokół opisuje dostarczanie IN kompleksów RVG9R:siRNA za pomocą urządzenia pozycjonującego myszy. Korzystając z tego protokołu, każdej myszy można łatwo podać maksymalnie 20-30 μl roztworu w kroplach o pojemności 2 μl. Objętość ta jest mniejsza niż w jamie nosowej myszy, która wynosi 0,032cm3, więc zabieg nie powoduje śmiertelnej niedrożności nozdrzy ani uduszenia. Protokół ten pozwala na jednoczesne zaszczepienie co najmniej czterech myszy i maksymalnie ośmiu myszy na urządzenie, co skutkuje optymalizacją czasu i zmniejszoną zmiennością.
<ol>
	<li>Weź mikropipetę o pojemności 10 μl i dostosuj ją do 2 μl.</li>
	<li>Załadować do mikropipety 2 μl roztworu kompleksu RVG9R:siRNA (np. 5,2 μg siCy5 skompleksowanego ze 104 μg RVG9R do eksperymentu dostarczania i 13,5 μg siSOD1 skompleksowanego z 270 μg RVG9R do doświadczenia wyciszającego, w końcowej objętości 25 μl PBS zawierającego 5% glukozy.</li>
	<li>Trzymając pipetę w ręce dominującej, wyreguluj pozycję, kładąc łokieć na blacie stołu. Drugą ręką podeprzyj rękę trzymającą pipetę, aby uniknąć niekontrolowanych ruchów podczas podawania.</li>
	<li>Umieść kroplę o pojemności ~2 μl bardzo blisko jednego nozdrza, aby mysz mogła bezpośrednio wdychać kroplę (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Jeśli niewielka kropla nie jest łatwa do uformowania, wymień końcówkę pipety na nową i powtórz operację. Użyj stopera, aby sprawdzić odstęp czasu między szczepieniami.</li>
	<li>Urządzenie to pozwala na leczenie co najmniej czterech myszy jednocześnie. Jeśli inna grupa myszy musi powtórzyć krok 4.4, ustaw kolejny pasek z czterema krzesłami powyżej lub poniżej pierwszego paska z czterema krzesłami, aby pomieścić do ośmiu myszy jednocześnie na urządzeniu.</li>
	<li>Powtórz krok 4.4 z drugim nozdrzem po 3-4 minutach od pierwszego zaszczepienia. Ten odstęp czasu jest wystarczający, aby mysz zakończyła inhalację pierwszej dawki i przywróciła normalne oddychanie. Jeśli kropla wdychanego roztworu zostanie usunięta z powodu przypadkowego wciągnięcia się z nosa myszy, należy ponownie dodać dodatkowe 2 μl roztworu.</li>
	<li>Powtórz cały proces z naprzemiennymi nozdrzami, aż do zakończenia dawki 20-30 μl. Przeprowadzenie całej procedury inokulacji zajmie ~30-45 minut.</li>
	<li>Nałóż mokrą maść na oczy myszy przed powrotem do wyznaczonych klatek. 
	UWAGA: Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Aby potwierdzić odkładanie się w mózgu znakowanego fluorem RVG9R, znieczul myszy (jak opisano w kroku 2.3) i wyizoluj mózg, a także inne narządy obwodowe, takie jak płuca, wątroba, śledziona i nerki. Umieść każdy narząd na stacji ImageStation i zwizualizuj fluorescencję za pomocą ImageStation.</li>
	<li>Aby uwidocznić fluorescencję spowodowaną znacznikiem Cy5, należy przygotować kriosekcje o grubości 20 μm, współbarwione za pomocą Hoechst 33342 i wykonać skanowanie całego mózgu za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Aby ocenić wyciszenie genów, wyekstrahuj RNA z różnych obszarów mózgu, takich jak opuszka węchowa, kora, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, móżdżek i pień mózgu, za pomocą zestawu do oczyszczania RNA, odwrotnie transkrybowanego na cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA i wykonaj qPCR z parami starterów, jak opisano wcześniej15.</li>
</ol>

<ol><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%3A+bottleneck+in+brain+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development.</a> NeuroRx. 2, 3-14 (2005).</li>
<li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+%28ICV%29+and+intravenous+%28IV%29+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (56), e2968(2011).</li>
<li>Khan, A. R., Liu, M., Khan, M. W., Zhai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+brain+targeting+drug+delivery+system+by+nasal+route%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Progress in brain targeting drug delivery system by nasal route.</a> Journal of Controlled Release. 268, 364-389 (2017).</li>
<li>Meredith, M. E., Salameh, T. S., Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+proteins+and+peptides+in+the+treatment+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of proteins and peptides in the treatment of neurodegenerative diseases.</a> The AAPS Journal. 17, 780-787 (2015).</li>
<li>Pardeshi, C. V., Belgamwar, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+nose+to+brain+drug+delivery+via+integrated+nerve+pathways+bypassing+the+blood-brain+barrier%3A+an+excellent+platform+for+brain+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Direct nose to brain drug delivery via integrated nerve pathways bypassing the blood-brain barrier: an excellent platform for brain targeting.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 10, 957-972 (2013).</li>
<li>Agrawal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nose-to-brain+drug+delivery%3A+An+update+on+clinical+challenges+and+progress+towards+approval+of+anti-Alzheimer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nose-to-brain drug delivery: An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs.</a> Journal of Controlled Release. 281, 139-177 (2018).</li>
<li>Van Woensel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulations+for+intranasal+delivery+of+pharmacological+agents+to+combat+brain+disease%3A+a+new+opportunity+to+tackle+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Formulations for intranasal delivery of pharmacological agents to combat brain disease: a new opportunity to tackle GBM.</a> Cancers. 5, 1020-1048 (2013).</li>
<li>Kulkarni, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology-mediated+nose+to+brain+drug+delivery+for+Parkinson%27s+disease%3A+a+mini+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology-mediated nose to brain drug delivery for Parkinson's disease: a mini review.</a> Journal of Drug Targeting. 23, 775-788 (2015).</li>
<li>Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+to+the+central+nervous+system%3A+mechanisms+and+experimental+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 1654-1673 (2010).</li>
<li>Hanson, L. R., Fine, J. M., Svitak, A. L., Faltesek, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+administration+of+CNS+therapeutics+to+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intranasal administration of CNS therapeutics to awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e4440(2013).</li>
<li>Merkus, P., Ebbens, F. A., Muller, B., Fokkens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+anatomy+and+head+position+on+intranasal+drug+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22European+Archives+of+Oto-Rhino-Laryngology+and+Head+%26+Neck%22%5BJournal%5D)">Influence of anatomy and head position on intranasal drug deposition.</a> European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head & Neck. 263, 827-832 (2006).</li>
<li>Zeller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+cell-binding+ligands+to+arginine-rich+cell-penetrating+peptides+enables+cytosolic+translocation+of+complexed+siRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Attachment of cell-binding ligands to arginine-rich cell-penetrating peptides enables cytosolic translocation of complexed siRNA.</a> Chemistry & Biology. 22, 50-62 (2015).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+CCR2+in+macrophages+alleviates+adipose+tissue+inflammation+and+the+associated+metabolic+syndrome+in+dietary+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Silencing CCR2 in macrophages alleviates adipose tissue inflammation and the associated metabolic syndrome in dietary obese mice.</a> Molecular Therapy-Nucleic Acids. 5, (2016).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+delivery+of+small+interfering+RNA+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system.</a> Nature. 448, 39(2007).</li>
<li>Beloor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+interfering+RNA-mediated+control+of+virus+replication+in+the+CNS+is+therapeutic+and+enables+natural+immunity+to+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Small interfering RNA-mediated control of virus replication in the CNS is therapeutic and enables natural immunity to West Nile virus.</a> Cell Host & Microbe. 23, 549-556 (2018).</li>
<li>Ullah, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trileucine+residues+in+a+ligand-CPP-based+siRNA+delivery+platform+improve+endosomal+escape+of+siRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Trileucine residues in a ligand-CPP-based siRNA delivery platform improve endosomal escape of siRNA.</a> Journal of Drug Targeting. 25, 320-329 (2017).</li>
<li>Yu, D., Li, G., Lesniak, M. S., Balyasnikova, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+therapeutic+stem+cells+to+glioblastoma+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55845(2017).</li>
<li>Mittal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+direct+nose+to+brain+delivery%3A+current+status+and+future+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Insights into direct nose to brain delivery: current status and future perspective.</a> Drug Delivery. 21, 75-86 (2014).</li>
<li>Renner, D. B., Frey, W. H., Hanson, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+siRNA+to+the+olfactory+bulbs+of+mice+via+the+olfactory+nerve+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of siRNA to the olfactory bulbs of mice via the olfactory nerve pathway.</a> Neuroscience Letters. 513, 193-197 (2012).</li>
<li>Serralheiro, A., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+administration+of+carbamazepine+to+mice%3A+a+direct+delivery+pathway+for+brain+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intranasal administration of carbamazepine to mice: a direct delivery pathway for brain targeting.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 60, 32-39 (2014).</li>
<li>Ruigrok, M. J., de Lange, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+insights+for+translational+pharmacokinetic+and+pharmacokinetic-pharmacodynamic+studies%3A+towards+prediction+of+nose-to-brain+transport+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Emerging insights for translational pharmacokinetic and pharmacokinetic-pharmacodynamic studies: towards prediction of nose-to-brain transport in humans.</a> The AAPS Journal. 17, 493-505 (2015).</li>
</ol>

P.K. i S.K.L. są współzałożycielami Signet Biotech. P.K. jest współtwórcą patentu PCT/US07/12,152, który częściowo obejmuje zastrzeżenia dotyczące RVG9R. I.U., K.C., P.K. i S.K.L. są wymienieni jako współwynalazcy zgłoszonego patentu (PCT/KR2016/014220), który obejmuje zastrzeżenia dotyczące urządzenia do pozycjonowania myszy.

Opracowaliśmy urządzenie do pozycjonowania myszy do optymalnego pozycjonowania myszy w celu dostarczania leków z nosa do mózgu. Urządzenie wyposażone jest w różne funkcjonalności, zapewniające łatwą jednoczesną obsługę zwierząt. Jest również wyposażony w poduszki grzewcze do utrzymywania fizjologicznej temperatury ciała zwierząt podczas eksperymentów. Znieczulone myszy mogą być utrzymywane w pozycji głowy w dół i do przodu za pomocą specjalnie zaprojektowanych krzeseł, przy minimalnym dyskomforcie dla zwierząt. Wysokość krzeseł pozycjonujących można regulować w taki sposób, aby jak najlepiej uwidocznić nozdrza zwierząt podczas podawania leków.
Dostarczanie IN do mózgu ma kilka wewnętrznych ograniczeń, w tym małą powierzchnię nozdrzy (pozwalającą na maksymalną objętość 20-30 μl na podanie), podrażnienie nosa, uszkodzenie nabłonka i ograniczone wchłanianie przez nabłonek nosa18. Podawanie leków IN myszom umieszczonym w pozycji leżącej na plecach było wykorzystywane do dostarczania mózgu poprzez wrzucanie płynnych leków do naprzemiennych nozdrzy zwierząt za pomocą pipety lub rurki poliuretanowej (24 G x 19 mm) podłączonej do mikrolitrowych strzykawek19,20. Chociaż stosowanie systemów rurek do uwalniania leków w pobliżu nabłonka węchowego jest potencjalnie odpowiednim podejściem, powoduje podrażnienie lub zapalenie błony śluzowej nosa przy wielokrotnym podawaniu. Co więcej, mały rozmiar jamy nosowej ogranicza to podejście, szczególnie u myszy, które można pokonać przez powtarzanie, a także przez preparaty leków, które utrzymują się w błonie śluzowej nosa. Inną opcją jest podawanie leków w celu przebudzenia myszy10. Jednak takie podejście wymaga wykwalifikowanych procedur obchodzenia się ze zwierzętami podczas szczepienia IN. Dodatkowo powoduje stres u zwierząt i dlatego nie jest idealny dla modeli chorób, zwłaszcza modeli chorób zakaźnych. Co więcej, niespójne dawkowanie może łatwo wynikać z drenażu leku do płuc lub żołądka z powodu niedoskonałego chwytania przez zwierzęta. Zaprezentowane tu podejście pozwala naukowcom na pokonanie tych barier technicznych. Pozycja głowy w dół i do przodu zmniejsza możliwość wycieku leku z nosa do płuc podczas wdechu, sprzyjając bezpośredniemu i selektywnemu dostarczaniu siRNA do mózgu. Podawanie za pomocą urządzenia do pozycjonowania za pomocą myszy nie wymaga żadnej specjalistycznej techniki obchodzenia się ze zwierzętami lub chwytania ich podczas szczepienia. Cztery zwierzęta jednocześnie mogą być leczone przez okres co najmniej 30-45 minut. Procedurę można rozszerzyć poprzez dodanie dodatkowego drążka z czterema krzesłami, co pozwala na łatwe zarządzanie maksymalnie ośmioma myszami podczas tej samej sesji eksperymentalnej. W związku z tym, stosując tę metodę, pojedynczy operator może indukować dostarczanie leku do mózgów dużych grup zwierząt przez dłuższy czas.
Budowa anatomiczna jamy nosowej silnie wpływa na poród z nosa do mózgu (jak dokonali przegląd Merkus i wsp.11 oraz Ruigrok i de Lange21). Względna powierzchnia jamy nosowej u myszy jest 15 razy większa niż u ludzi, a względna powierzchnia nabłonka węchowego jest 6 razy większa. Chociaż istnieją znaczące różnice w anatomii jamy nosowej u ludzi i gryzoni, prowadzonych jest około 45 badań klinicznych wykorzystujących podejście IN w leczeniu kilku zaburzeń mózgu (www.clinicaltrials.gov). Przedstawione tutaj badanie wskazuje, że podczas stosowania leków IN naukowcy powinni wziąć pod uwagę kilka czynników, takich jak ułożenie głowy, sen i odpowiednie środki dostarczające.
Wykazaliśmy skuteczne i specyficzne osadzanie znakowanego fluorescencyjnie siRNA w mózgu myszy. Co więcej, znaczny spadek ekspresji genu SOD1 obserwowany po dostarczeniu IN siRNA potwierdził efekty funkcjonalne. Wcześniej wykazaliśmy konsekwentnie, że podawanie IN kompleksów RVG9R-siRNA ukierunkowanych na RNA wirusa Zachodniego Nilu (WNV) wywiera silny efekt terapeutyczny na zapalenie mózgu WNV15. Warto zauważyć, że dostarczanie siRNA z nosa do mózgu wymagało liganda ukierunkowanego na komórkę (RVG) i dodatnio naładowanej cząsteczki (9R) do złożonego siRNA. W przypadku braku tych pierwiastków cząsteczki zostały usunięte przez obwód ogólnoustrojowy i naczynia limfatyczne 48 godzin po leczeniu (ryc. 3A)15. Dlatego w opisanej tutaj konfiguracji eksperymentalnej zbadaliśmy lokalizację peptydów / siRNA 48 godzin po inokulacji, aby zobrazować tylko poziomy zatrzymane specyficznie w mózgu. Podejście to można łatwo wdrożyć do dostarczania innych cząsteczek, takich jak białka, peptydy i nanocząstki, lub innych środków terapeutycznych w leczeniu wielu zaburzeń związanych z mózgiem.

Bariera krew-mózg zapobiega przedostawaniu się do mózgu ogólnoustrojowo podawanych cząsteczek >400-600 Da, co stanowi poważne wyzwanie dla dostarczania biomolekuł terapeutycznych dla chorób wpływających na OUN i mózg1. Bezpośrednie dostarczanie leku do mózgu można osiągnąć poprzez wstrzyknięcie stereotaktyczne; Wymaga to jednak specjalistycznej wiedzy chirurgicznej i jest wysoce ograniczone w dostarczaniu do obszarów proksymalnych miejsca wstrzyknięcia, co czyni go nieodpowiednim do rutynowego użytku klinicznego<klasa SUP="xref">2. Dostarczenie IN do mózgu może również skutkować bezpośrednim dostarczeniem do mózgu poprzez ominięcie bariery krew-mózg, co pozwala na bezpośrednie i szybkie przenoszenie różnych substancji do mózgu3,4. Uważa się, że transfer ten zachodzi przez mechanizmy transportowe przez nerwy węchowe i trójdzielne, które łączą przewód nosowy z mózgiem, płyn mózgowo-rdzeniowy i układ limfatyczny5. Ponieważ bezpośrednia droga z nosa do mózgu nie obejmuje narządów i tkanek obwodowych, znacznie zmniejsza ogólnoustrojowe skutki uboczne i poprawia potencję. Podawanie IN jest obiecującą nieinwazyjną alternatywą zarówno dla miejscowych, jak i ogólnoustrojowych dróg dostarczania środków terapeutycznych do mózgu i może stanowić potężne podejście do zwalczania zaburzeń neurologicznych, w tym choroby Alzheimera, choroby Parkinsona i raka mózgu, i jest badane w kilku badaniach klinicznych6,7,8.
Kilka czynników eksperymentalnych, takich jak objętość i metoda inokulacji, a także pH preparatu, silnie wpływa na dostarczanie leku do OUN poprzez szlak nos do mózgu9. W badaniach na myszach powodzenie dostarczania leku IN silnie zależy od prawidłowego ułożenia głowy, co ma kluczowe znaczenie dla efektywnego odkładania się mózgu i uniknięcia drenażu leku do środowiska zewnętrznego lub dróg oddechowych. Warto zauważyć, że większość badań na gryzoniach wykorzystuje pozycję głowa do tyłu (na wznak) z nachyleniem 70°-90° w celu dostarczania leku do nabłonka węchowego, mimo że ustawienie głowy pod kątem 0° może sprzyjać drenażowi do tchawicy9. Podawanie leków myszom, które nie śpią, powoduje zmniejszenie odkładania się krwi w mózgu w porównaniu z jakimkolwiek zastosowaniem w pozycji leżącej, głównie z powodu niezdolności naukowców do utrzymania myszy w pożądanej pozycji przez dłuższy czas. Co więcej, pozycja do góry nogami wymagana przez metodę chwytania skóry stosowaną u obudzonych myszy powoduje odkładanie się leku głównie w nerwie trójdzielnym i opuszce węchowej, a także w narządach obwodowych, takich jak nerki i płuca, w ciągu 30 minut po inokulacji10. Najbardziej odpowiednią pozycją ciała do dostarczania środków terapeutycznych przez nerwy węchowe lub trójdzielne u większych zwierząt, takich jak naczelne inne niż ludzie, w badaniach klinicznych wydaje się być pozycja głowy w dół i do przodu (tj. tak zwana "pozycja modlenia się do Mekki")11. Jednak ta pozycja nie została dobrze zbadana w modelu mysim, a pozycja leżąca na plecach jest szerzej stosowana w badaniach na gryzoniach.
Poprzednio wykazaliśmy, że RVG9R, peptyd zaprojektowany w oparciu o domenę minimalnego wiązania receptora wirusa wścieklizny, wyświetla tropizm w komórkach wyrażających podjednostki nikotynowego receptora acetylocholiny, takie jak neurony i makrofagi, i pośredniczy w wewnątrzkomórkowym dostarczaniu siRNA poprzez mechanizm obejmujący zaangażowanie receptora i tymczasową delokalizację błony plazmatycznej w miejscu agregacji receptora12, 13. Co ważne, ogólnoustrojowe podanie dożylne kompleksów RVG9R-siRNA umożliwia transnaczyniowe dostarczenie siRNA do CNS14. Jednak droga ogólnoustrojowa rozcieńcza ilość siRNA dostarczanego do OUN, a ostatnie dane pokazują, że podawanie IN kompleksów RVG9R: siRNA myszom ustawionym w pozycji głowy w dół i do przodu wywołuje szeroko rozpowszechniony knockdown genu docelowego w wielu regionach mózgu15. Co ważne, ten poziom knockdown został osiągnięty przy zaledwie 13,5 μg siRNA podawanym w schemacie czterodawkowym 2-dniowym, podczas gdy droga dożylna wymaga ~5 razy wyższej dawki na wstrzyknięcie, aby osiągnąć porównywalny knockdown. Jedyną wadą podejścia IN jest to, że jest to żmudna procedura, wymagająca użycia obu rąk podczas podawania roztworu, przy jednoczesnym ciągłym chwytaniu myszy na przemian w głowę w dół i do przodu oraz w zrelaksowanych pozycjach między każdą inhalacją przez znaczny długi okres leczenia (procedura 30-45 minut dla skutecznego pobrania ~20-30 μl objętości na mysz). Korzystanie z przedstawionego tutaj urządzenia do pozycjonowania myszy umożliwia prawidłowe umieszczenie myszy z niewielkim fizycznym przymusem dla zwierząt i personelu wykonującego protokół, a także leczenie wielu kohort myszy w rozsądnym czasie, umożliwiając dogłębne badanie nad zastosowaniem siRNA jako terapii zapalenia mózgu Zachodniego Nilu u myszy w późnych stadiach choroby15.

<table><tbody><tr><td>Testy Comercial</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iScript zestaw do syntezy cDNA</td><td>BioRad</td><td>Cat# 1708891</td><td></td></tr><tr><td>RNAiso plus</td><td>TaKaRa Bio</td><td>Cat# 9108</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix ExTaq</td><td>TaKaRa Bio</td><td>Cat# RR420A</td><td></td></tr><tr><td>Dyes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# A30052</td><td></td></tr><tr><td>Mouse szczep</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balb/c</td><td>Orient Bio</td><td>N/A</td><td>6-8 tygodni, 20-30g</td></tr><tr><td>Oligonukleotydy i startery</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human CD4</td><td>ST Pharm</td><td>N/A</td><td>Sens: 5'-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3'</td></tr><tr><td>siSOD1</td><td>ST Pharm</td><td>N/A</td><td>Sens: 5'-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3'</td></tr><tr><td>Podkłady GAPDH</td><td>ST Pharm</td><td>N/A</td><td>F: 5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3' Kr: 5'-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3'</td></tr><tr><td>Podkłady SOD1</td><td>ST Pharm</td><td>N/A</td><td>F: 5'-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3' R: 5'-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3'</td></tr><tr><td>peptides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RVG9R</td><td>Peptron</td><td>N/A</td><td>YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR</td></tr><tr><td>RVM9R</td><td>Peptron</td><td>N/A</td><td>MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRR</td></tr><tr><td>Oprogramowanie, algorytmy i urządzenia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo oprogramowanie 4.3</td><td>FlowJO, LLC</td><td>N/A</td><td>http://docs.flowjo.com/vx/</td></tr> <tr><td>Mouse positioning device</td><td>Signet Biotech</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Prism software</td><td>Graphpad</td><td>N/A</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ Prism software</td><td>Graphpad</td><td>N/A</td><td>https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/</td></tr></tbody></table>

urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania sirna do ośrodkowego układu nerwowego

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

Donosowe (IN) dostarczanie leków do mózgu okazało się obiecującą metodą ominięcia bariery krew-mózg (BBB) dla dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Ostatnie badania wskazują na zastosowanie peptydu RVG9R, zawierającego minimalną domenę wiążącą receptor glikoproteiny wirusa wścieklizny, w wywoływaniu dostarczania siRNA do neuronów w mózgu. W tym protokole preparat peptydowo-siRNA jest podawany donosowo za pomocą pipety w ręce dominującej, podczas gdy znieczulona mysz jest przytrzymywana przez kark ręką niedominującą w "pozycji głowy w dół i do przodu", aby uniknąć drenażu do płuc i żołądka podczas inhalacji. Tego precyzyjnego chwytania myszy można się nauczyć, ale nie jest to łatwe i wymaga praktyki i umiejętności, aby doprowadzić do skutecznego wychwytu przez OUN. Ponadto proces ten jest długotrwały i wymaga około 45 minut na podanie całkowitej objętości ~20-30 μl roztworu w 1-2 μl objętości kropel na inhalację, z 3-4 minutowymi przerwami między każdą inhalacją. Celem tego badania jest ujawnienie urządzenia do pozycjonowania myszy, które umożliwia odpowiednie umieszczenie myszy w celu skutecznego podawania IN preparatu peptyd-siRNA. W konstrukcję urządzenia wbudowano wiele funkcji, takich jak cztery lub osiem krzeseł pozycjonujących z regulowaną wysokością i nachyleniem, które przytrzymują znieczulone myszy w pozycji głowy w dół i do przodu, umożliwiając łatwą wizualizację nozdrzy myszy i wbudowaną poduszkę grzewczą w celu utrzymania temperatury ciała myszy podczas zabiegu. Co ważne, możliwość jednoczesnego leczenia czterech lub ośmiu myszy kompleksami RVG9R-siRNA w ten sposób umożliwia prowadzenie badań w znacznie szybszej skali czasowej w celu przetestowania podejścia terapeutycznego IN siRNA. Podsumowując, urządzenie to pozwala na odpowiednie i kontrolowane ułożenie głowy myszy w celu zastosowania IN RVG9R-siRNA i innych cząsteczek terapeutycznych, takich jak nanocząstki lub przeciwciała, do dostarczania do OUN.

Pozycja głowy podczas podawania drogą donosową (IN) ma istotny wpływ na wydajność dostarczania leku do mózgu. W niniejszej pracy opisaliśmy pozycję głowy skierowanej w dół i do przodu z wykorzystaniem urządzenia do pozycjonowania myszy w celu donosowej administracji formulacji peptyd-siRNA celowanej w mózg, aby dostarczyć mieszaninę do ośrodkowego układu nerwowego (CNS) myszy. Aby zweryfikować dostarczenie drogą donosową, zastosowaliśmy peptyd RVG9R, który wcześniej wykazano, że efektywnie wiąże się z komórkami neuronalnymi zarówno in vitro, jak i in vivo14,16.
W pierwszej kolejności przetestowano dostarczenie do mózgu drogą nosową peptydu RVG9R znakowanego Alexa Fluor 488 (RVG9R-A488), wykorzystując opisane tutaj urządzenie do pozycjonowania myszy. 48 h po inokulacji wycięto różne organy, w tym mózg, zatoki, płuca, wątrobę, śledzionę i nerki, aby zmierzyć fluorescencję A488 związaną z tkankami. Jako kontrole negatywne zastosowano sam A488 lub peptyd kontrolny (RVM9R-A488)14, który nie wiąże nAchR. Zgodnie z oczekiwaniami, ani A488, ani RVM9R-A488 nie zostały wykryte w żadnym z organów 48 h po inokulacji (Rysunek 3A, lewa strona). Z kolei silny sygnał fluorescencyjny A488 wykryto wyłącznie w mózgach grupy inokulowanej RVG9R. Ponadto pod kątem skuteczności porównano tę pozycję ustawienia myszy z wcześniej stosowaną metodą pozycji na plecach17 oraz metodą dla zwierząt budzących się. Inokulowano stałą ilość RVG9R-A488 (100 µg) i oceniono biodystrybucję 48 h po inokulacji. Wyniki wskazały, że ustawienie myszy z głową skierowaną w dół i do przodu poprawiło penetrację i depozycję RVG9R-A488 w całej tkance mózgowej (Rysunek 3A, prawa strona). W przeciwieństwie do tego, inokulacja zwierząt w pozycji na plecach doprowadziła do dostarczenia RVG9R-A488 do mózgu, lecz nie była ona tak silna, jak w przypadku zastosowania urządzenia pozycjonującego. Aby dodatkowo potwierdzić dostarczanie siRNA do mózgu, wykonano skanowanie całego mózgu po pojedynczej administracji donosowej (IN) kompleksu RVG9R z 400 pmol (5,2 µg) siRNA znakowanego Cy5. W przeciwieństwie do PBS lub RVM9R, tworzenie kompleksu z RVG9R spowodowało silną akumulację siRNA w głównych obszarach mózgu, w tym w cebulce węchowej, korze, hipokampie, wzgórzu, podwzgórzu, śródmózgowiu i móżdżku (Rysunek 3B).
Na koniec zastosowano analizę RT-qPCR w celu weryfikacji wewnątrzkomórkowej dostawy funkcjonalnego siRNA celującego w gen dysmutazy ponadtlenkowej-1 (SOD1). Myszy poddano trzykrotnej inokulacji donosowej w kolejne dni przy użyciu RVG9R:siSOD1 (13,2 µg siRNA), a ekspresję mRNA SOD1 analizowano 24 h po ostatniej inokulacji. Podanie RVG9R:siSOD1 doprowadziło do znacznego obniżenia ekspresji SOD1 w opłotce węchowej (63%), korze mózgu (47%), hipokampie (61%), wzgórzu (53%), podwzgórzu (55%), śródmózwiu (39%) oraz móżdżku (30%) (Rysunek 4). Podsumowując, zastosowanie urządzenia pozycjonującego umożliwia łatwą inokulację donosową kompleksu RVG9R:siRNA u myszy, co skutkuje specyficznym dla mózgu dostarczeniem siRNA i indukuje funkcjonalne wyciszenie genu docelowego.
<img alt="Schemat montażu urządzenia pozycjonującego z podstawą, krzesłami pozycjonującymi i systemem grzewczym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Prezentacja fotograficzna montażu urządzenia. Krzesła pozycjonujące są montowane na podstawie na odpowiedniej wysokości za pomocą śrub. Po montażu urządzenie zostaje podłączone do zasilania w celu podgrzania do temperatury fizjologicznej podczas inokulacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ do podawania leku zwierzętom z mikropipetą, etanolem, siRNA i urządzeniem pozycjonującym; schemat eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Prezentacja fotograficzna procedury inokulacji donosowej (IN) z użyciem urządzenia pozycjonującego. (A) Sprzęt eksperymentalny wymagany do inokulacji IN. (B) Zwierzęta w pozycji z głową skierowaną w dół i do przodu, umieszczone w urządzeniu (lewo) oraz aplikacja kropli o objętości 2 µL podczas inokulacji IN (prawo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Eksperyment testujący dystrybucję tkankową czynników fluorescencyjnych w organach myszy; obrazy fluorescencyjne mózgu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Dystrybucja znakowanego fluorescencyjnie peptydu i siRNA po podaniu donosowym. (A) Biodystrybucja donosowo podanego peptydu RVG9R 48 h po pojedynczej inokulacji IN. Oceniono obecność fluorescencji w mózgu i innych organach obwodowych u myszy inokulowanych solą fizjologiczną (PBS), A488, RVM-A488 oraz RVG-A488 (lewo). Obrazowanie myszy traktowanych w opisany wyżej sposób w stanie czuwania, w pozycji leżącej na plecach, w urządzeniu pozycjonującym z głową skierowaną w dół i do przodu (prawo). (B) Biodystrybucja kompleksu RVG9R:siRNA w mózgu (n = 3 na grupę). Dystrybucję siRNA znakowanego Cy5 zwizualizowano w pełnych kriosiekcjach mózgu za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowego u zwierząt inokulowanych solą fizjologiczną (PBS), kompleksem siRNA z peptydem kontrolnym (RVM9R-siCy5) lub peptydem ukierunkowanym na mózg RVG9R (RVG9R-siCy5). Pasek skali oznacza 1 mm. Skróty: o.b = opoluchowa cebulka węchowa; ctx = kora mózgowa; hippo = hipokamp; hypo = podwzgórze; tha = wzgórze; m.b = śródmózowie; cer = móżdżek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres porównawczy ekspresji genów; kora, hipokamp, wzgórze; wykres słupkowy; wyniki statystyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Podanie RVG9R:siSOD1 drogą IN indukuje wyciszenie genu docelowego w wielu obszarach mózgu. Analiza qPCR dla mRNA SOD1 myszy w zaznaczonych obszarach mózgu 24 h po ostatniej inokulacji drogą IN soli fizjologicznej (PBS), RVG9R:siCD4 (siCD4), RVM9R:siSOD1 (RVM9R) oraz RVG9R:siSOD1 (RVG9R). Przedstawiono względne wyciszenie SOD1 w opuszce węchowej, korze, hipokampie (góra), wzgórzu, podwzgórzu, móżdżku (środek) i śródmózgowiu (dół). Dane przedstawiają średnią ± SD względem GAPDH po normalizacji z odpowiadającymi danymi myszy traktowanych solą fizjologiczną (n = 3 na grupę). Schemat przedstawiający procent mRNA SOD1 w zaznaczonym obszarze mózgu po inokulacji drogą IN znajduje się w prawym dolnym rogu. **P &lt; 0,01, ***P &lt; 0,001. Skróty: o.b = opuszka węchowa; ctx = kora; hippo = hipokamp; hypo = podwzgórze; tha = wzgórze; m.b = śródmózgowie; cer = móżdżek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący urządzenie do pozycjonowania myszy, który umożliwia odpowiednie rozmieszczenie myszy do donosowego podawania preparatu peptydowo-siRNA ukierunkowanego na mózg, umożliwiając skuteczne wyciszanie genów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...

Protokół ten szczegółowo opisuje zastosowanie urządzenia pozycjonującego do donosowego dostarczania biomolekuł do ośrodkowego układu nerwowego myszy. Zastosowanie tego urządzenia znacznie skraca czas pracy z myszami i leczenia, co skutkuje poprawą wydajności i powtarzalności techniki. Aby rozpocząć tę procedurę, oceń poziom znieczulenia myszy za pomocą odruchu pedałowania, aby utrzymać płaszczyznę operacyjną.Następnie umieść urządzenie pozycjonujące w odpowiedniej odległości i na odpowiedniej wysokości, aby umożliwić wygodny dostęp do wszystkich wymaganych odczynników. Następnie nałóż maść na oczy zwierzęcia. Przypnij jedną mysz pasami krzesła, upewniając się, że przednie kończyny myszy zapewniają naturalne wsparcie, gdy jest w zrelaksowanej pozycji bez żadnego dyskomfortu.Powtórz procedury dla pozostałych myszy. Delikatnie umieść każdą mysz na wyznaczonym krześle, kładąc ją tyłem równolegle do podparcia oparcia krzesła i pod kątem 90 stopni do siedziska krzesła. Pozwól zwierzęciu leżeć naturalnie w pozycji głowy w dół i do przodu, bez pchania ani naciskania.Gdy wszystkie myszy zostaną przypięte, natychmiast rozpocznij inokulację donosową. Aby wykonać podanie donosowe, należy załadować mikropipetę dwoma mikrolitrami roztworu kompleksu siRNA RVG9R. Trzymaj pipetę w ręce dominującej i podpieraj ją drugą ręką, aby uniknąć niekontrolowanych ruchów podczas podawania siRNA.Umieść około dwumikrolitrową kroplę bardzo blisko jednego nozdrza, aby mysz mogła ją bezpośrednio wdychać. Jeśli niewielka kropla nie jest łatwa do uformowania, wymień końcówkę pipety na nową i powtórz operację. Delikatnie popchnij głowę myszy palcem wskazującym w dół przez pięć sekund podczas wdechu i utrzymaj pozycję.Aby zapobiec wyciekowi leku do płuc, ważne jest, aby spokojnie popychać głowę myszy w dół palcem wskazującym przez pięć sekund, podczas gdy mysz wdycha powietrze. Uruchom stoper, aby odmierzyć czas trzy do czterech minut po tym, aby wprowadzić czas inokulacji do drugiego węzła pierwszej myszy. Ten odstęp czasu jest niezbędny, aby mysz zakończyła inhalację pierwszej dawki i przywróciła normalne oddychanie.W trzy- lub czterominutowym odstępie czasu między inokulacją naprzemiennych nozdrzy na pierwszej myszy, należy wykonać całkowitą inokulację donosową jednego nozdrza każdej z pozostałych trzech myszy umieszczonych na urządzeniu. Gdy zabrzmi stoper, zaszczepij drugie nozdrze u pierwszej myszy i powtórz procedurę dla pozostałych myszy, jak powyżej. Powtarzaj procedurę, aż 20 do 30 mikrolitrów zostanie dostarczonych dla wszystkich czterech myszy.Zakończenie całej procedury inokulacji zajmie około 30 do 45 minut. Zwróć zwierzęta z powrotem do wyznaczonych klatek. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżący mostek.Aby ocenić wyciszanie genów, wyekstrahuj RNA z różnych regionów mózgu za pomocą zestawu do oczyszczania RNA, odwróć transkrypcję do cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA i wykonaj qPCR z parami starterów. Większość dostarczania do mózgu peptydu RVG9R oznaczonego Alexa Fluor 488 została po raz pierwszy przetestowana przy użyciu opisanego tutaj urządzenia do pozycjonowania myszy. Po 48 godzinach od inokulacji wycięto różne narządy w celu zmierzenia fluorescencji A488.Nie wykryto niczego w żadnym z narządów w kontroli negatywnej. Z drugiej strony, silny sygnał fluorescencyjny A488 wykryto wyłącznie w mózgach grupy zaszczepionej RVG9R. Ponadto pozycję ułożenia myszy porównano z metodą pozycji leżącej na plecach i metodą czuwania pod kątem skuteczności.Wyniki wskazały, że ułożenie myszy głową w dół i do przodu poprawiło penetrację i osadzanie RVG9R A488 w tkance mózgowej. Aby dodatkowo potwierdzić dostarczanie siRNA do mózgu, przeprowadzono pełne skanowanie mózgu po pojedynczym donosowym podaniu RVG9R skompleksowanego do siRNA znakowanego Cy5. W przeciwieństwie do PBS lub RVM9R, kompleksowanie z RVG9R spowodowało silną akumulację siRNA w głównych obszarach mózgu, w tym w opuszce węchowej, korze mózgowej, hipokampie, wzgórzu, podwzgórzu, środkowej części mózgu i móżdżku.Urządzenie pozycjonujące może być używane do dostarczania leków lub cząsteczek do ośrodkowego układu nerwowego myszy. Zastosowania obejmują testowanie środków terapeutycznych, a także badanie mechanizmów komórkowych w OUN. To urządzenie pozycjonujące zostało wykorzystane przez badaczy do wykazania siły działania siRNA w leczeniu choroby wywołanej wirusem Zachodniego Nilu, a także do zbadania terapii innych chorób OUN.

a-positioning-device-for-placement-mice-during-intranasal-sirna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano metodę podawania leków drogą donosową u czuwających myszy w celu ukierunkowania ich działania na mózg. Metoda ta umożliwia wielokrotne dawkowanie w długich okresach poprzez podawanie leku donosowo bez znieczulenia, zapewniając transport z nosa do mózgu przy minimalnej ekspozycji systemowej.

Podawanie terapeutyków OUN drogą donosową u czuwających myszy

Ten film demonstruje donosowe dostarczanie terapeutycznych nerwowych komórek macierzystych załadowanych wirusem onkolitycznym do mysiego modelu z guzem mózgu. Nieinwazyjne donosowe podawanie komórek macierzystych omija barierę krew-mózg, ułatwiając ich dostarczenie do miejsca guza w mózgu w celu zastosowania terapeutycznego.

Donosowe dostarczanie terapeutycznych nerwowych komórek macierzystych (NSC) w modelu mysim: procedura ukierunkowanego na nowotwór dostarczania NSC załadowanych wirusem onkolitycznym do mysiego modelu zawierającego guz mózgu

Źródło: Ullah, I., et.al. Urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje precyzyjną technikę podawania donosowego w celu dostarczania ukierunkowanych na neurony kompleksów peptyd-siRNA do mózgu myszy za pomocą specjalistycznego urządzenia pozycjonującego. Znieczulone myszy są zabezpieczone w pozycji głowy w dół i do przodu, aby zoptymalizować wdychanie siRNA, jednocześnie...

donosowe podawanie siRNA do mózgu myszy za pomocą urządzenia pozycjonującego

Źródło: Li, D., et al. Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę dokanałowego wstrzykiwania wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obudzonej myszy, obejmującą przygotowanie strzykawki, wyrównanie kręgosłupa i precyzyjne wprowadzenie igły. Metoda ta weryfikuje celowane dostarczanie genów, potwierdzając jej potencjał w terapiach OUN.

Dokanałowe podawanie wirusów w modelu mysim w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego

Źródło: Kanazawa, T., et al. Nowatorskie metody podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym w celu oceny dostarczania leków z nosa do mózgu. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje donosowe podawanie leków znakowanych radioaktywnie znieczulonej myszy w celu uzyskania dostarczania leku z nosa do mózgu. Wyjaśnia, w jaki sposób leki przenikają przez nabłonek nosa i przemieszczają się szlakami neuronalnymi, aby dotrzeć do mózgu, a także w jaki sposób ruch rzęsek wpływa na zatrzymywanie i usuwanie...

Donosowe podawanie leku myszom za pomocą pipety i odwrotnej kaniulacji w celu dostarczania leku z nosa do mózgu

Opisujemy metodę kierowania leków do ośrodkowego układu nerwowego poprzez wszczepienie cewnika lub wykonanie wstrzyknięcia bolusa do prawej bocznej komory u myszy. Skupiamy się w szczególności na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych. Technika ta można łatwo dostosować do innych leków i szczurów.

Bezpośrednie dokomorowe dostarczanie leków do ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

MikroRNA odgrywają kluczową rolę w mózgu i są potencjalnymi celami do modelowania neurodegeneracji. Jednak zaburzanie poziomów miRNA jest trudne ze względu na krótką długość miRNA i niedostępność tkanki mózgowej. Ten film przedstawia metodę projektowania antagomiru i dostarczania specyficznego dla mózgu przy użyciu neuropeptydu u myszy.

Prosta alternatywa dla wstrzyknięcia stereotaktycznego w celu specyficznego dla mózgu knockdownu miRNA

Celem tego protokołu jest użycie kationowych/anionowych liposomów z peptydem neurotargetującym jako systemu dostarczania OUN, aby umożliwić siRNA przejście przez BBB.  Optymalizacja systemu dostarczania leków, takich jak siRNA, pozwoliłaby na więcej opcji leczenia prionów i innych chorób neurodegeneracyjnych.

Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych

Tutaj opisujemy dwie nowatorskie metody stabilnego podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym przy minimalnym wysiłku fizycznym dla zwierząt doświadczalnych. Opisano również metodę ilościowej oceny poziomów dystrybucji leków w mózgu poprzez szlak nos-mózg przy użyciu znakowanej radioaktywnie [14C]-inuliny jako modelowego substratu rozpuszczalnych w wodzie makrocząsteczek.

Nowe metody podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym w celu oceny dostarczania leków z nosa do mózgu

Tutaj opisujemy metodę dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego szczura poprzez wszczepienie cewnika w śródoponową przestrzeń lędźwiową kręgosłupa. Koncentrujemy się na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych, chociaż ta metoda nadaje się również do dostarczania innych metod terapeutycznych.

Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura

Poznaj metodę donosowego podawania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego myszy z wykorzystaniem urządzenia pozycjonującego. Technika ta zwiększa efektywność dostarczania leków i powtarzalność wyników w badaniach nad terapią genową.

Urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego

Przeglądaj więcej filmów