Urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego
15 sierpnia 2019
Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący urządzenie do pozycjonowania myszy, który umożliwia odpowiednie rozmieszczenie myszy do donosowego podawania preparatu peptydowo-siRNA ukierunkowanego na mózg, umożliwiając skuteczne wyciszanie genów w ośrodkowym układzie nerwowym.
Protokół ten szczegółowo opisuje zastosowanie urządzenia pozycjonującego do donosowego dostarczania biomolekuł do ośrodkowego układu nerwowego myszy. Zastosowanie tego urządzenia znacznie skraca czas pracy z myszami i leczenia, co skutkuje poprawą wydajności i powtarzalności techniki. Aby rozpocząć tę procedurę, oceń poziom znieczulenia myszy za pomocą odruchu pedałowania, aby utrzymać płaszczyznę operacyjną.
Następnie umieść urządzenie pozycjonujące w odpowiedniej odległości i na odpowiedniej wysokości, aby umożliwić wygodny dostęp do wszystkich wymaganych odczynników. Następnie nałóż maść na oczy zwierzęcia. Przypnij jedną mysz pasami krzesła, upewniając się, że przednie kończyny myszy zapewniają naturalne wsparcie, gdy jest w zrelaksowanej pozycji bez żadnego dyskomfortu.
Powtórz procedury dla pozostałych myszy. Delikatnie umieść każdą mysz na wyznaczonym krześle, kładąc ją tyłem równolegle do podparcia oparcia krzesła i pod kątem 90 stopni do siedziska krzesła. Pozwól zwierzęciu leżeć naturalnie w pozycji głowy w dół i do przodu, bez pchania ani naciskania.
Gdy wszystkie myszy zostaną przypięte, natychmiast rozpocznij inokulację donosową. Aby wykonać podanie donosowe, należy załadować mikropipetę dwoma mikrolitrami roztworu kompleksu siRNA RVG9R. Trzymaj pipetę w ręce dominującej i podpieraj ją drugą ręką, aby uniknąć niekontrolowanych ruchów podczas podawania siRNA.
Umieść około dwumikrolitrową kroplę bardzo blisko jednego nozdrza, aby mysz mogła ją bezpośrednio wdychać. Jeśli niewielka kropla nie jest łatwa do uformowania, wymień końcówkę pipety na nową i powtórz operację. Delikatnie popchnij głowę myszy palcem wskazującym w dół przez pięć sekund podczas wdechu i utrzymaj pozycję.
Aby zapobiec wyciekowi leku do płuc, ważne jest, aby spokojnie popychać głowę myszy w dół palcem wskazującym przez pięć sekund, podczas gdy mysz wdycha powietrze. Uruchom stoper, aby odmierzyć czas trzy do czterech minut po tym, aby wprowadzić czas inokulacji do drugiego węzła pierwszej myszy. Ten odstęp czasu jest niezbędny, aby mysz zakończyła inhalację pierwszej dawki i przywróciła normalne oddychanie.
W trzy- lub czterominutowym odstępie czasu między inokulacją naprzemiennych nozdrzy na pierwszej myszy, należy wykonać całkowitą inokulację donosową jednego nozdrza każdej z pozostałych trzech myszy umieszczonych na urządzeniu. Gdy zabrzmi stoper, zaszczepij drugie nozdrze u pierwszej myszy i powtórz procedurę dla pozostałych myszy, jak powyżej. Powtarzaj procedurę, aż 20 do 30 mikrolitrów zostanie dostarczonych dla wszystkich czterech myszy.
Zakończenie całej procedury inokulacji zajmie około 30 do 45 minut. Zwróć zwierzęta z powrotem do wyznaczonych klatek. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżący mostek.
Aby ocenić wyciszanie genów, wyekstrahuj RNA z różnych regionów mózgu za pomocą zestawu do oczyszczania RNA, odwróć transkrypcję do cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA i wykonaj qPCR z parami starterów. Większość dostarczania do mózgu peptydu RVG9R oznaczonego Alexa Fluor 488 została po raz pierwszy przetestowana przy użyciu opisanego tutaj urządzenia do pozycjonowania myszy. Po 48 godzinach od inokulacji wycięto różne narządy w celu zmierzenia fluorescencji A488.
Nie wykryto niczego w żadnym z narządów w kontroli negatywnej. Z drugiej strony, silny sygnał fluorescencyjny A488 wykryto wyłącznie w mózgach grupy zaszczepionej RVG9R. Ponadto pozycję ułożenia myszy porównano z metodą pozycji leżącej na plecach i metodą czuwania pod kątem skuteczności.
Wyniki wskazały, że ułożenie myszy głową w dół i do przodu poprawiło penetrację i osadzanie RVG9R A488 w tkance mózgowej. Aby dodatkowo potwierdzić dostarczanie siRNA do mózgu, przeprowadzono pełne skanowanie mózgu po pojedynczym donosowym podaniu RVG9R skompleksowanego do siRNA znakowanego Cy5. W przeciwieństwie do PBS lub RVM9R, kompleksowanie z RVG9R spowodowało silną akumulację siRNA w głównych obszarach mózgu, w tym w opuszce węchowej, korze mózgowej, hipokampie, wzgórzu, podwzgórzu, środkowej części mózgu i móżdżku.
Urządzenie pozycjonujące może być używane do dostarczania leków lub cząsteczek do ośrodkowego układu nerwowego myszy. Zastosowania obejmują testowanie środków terapeutycznych, a także badanie mechanizmów komórkowych w OUN. To urządzenie pozycjonujące zostało wykorzystane przez badaczy do wykazania siły działania siRNA w leczeniu choroby wywołanej wirusem Zachodniego Nilu, a także do zbadania terapii innych chorób OUN.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie urządzenia do pozycjonowania myszy w celu donosowego podania formulacji peptyd-siRNA celowanej w mózg, co umożliwia efektywne wyciszanie genów w ośrodkowym układzie nerwowym. Metoda ta zwiększa wydajność i powtarzalność, jednocześnie minimalizując konieczność manipulowania zwierzętami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Terapia genowa
- Dostarczanie biomolekuł
Wstęp
- Podawanie donosowe jest obiecującą drogą dla terapii celowanych w OUN.
- Efektywne techniki podawania są kluczowe dla uzyskania powtarzalnych wyników.
- Pozycjonowanie myszy może wpływać na skuteczność dostarczania leku.
- Wyciszanie genów za pomocą siRNA jest cennym narzędziem w badaniach z zakresu neuronauki.
Cel badania
- Opracowanie protokołu skutecznego podawania siRNA drogą donosową do OUN myszy.
- Ocena wpływu ułożenia myszy na efektywność dostarczania leku.
- Wykazanie użyteczności urządzenia do pozycjonowania w zastosowaniach terapii genowej.
Zastosowane metody
- Ocena stopnia znieczulenia myszy przed pozycjonowaniem.
- Wykorzystanie urządzenia pozycjonującego do unieruchomienia myszy w pozycji rozluźnionej.
- Inokulacja donosowa roztworu kompleksu siRNA.
- Izolacja RNA i qPCR w celu oceny skuteczności wyciszania genów.
Główne wyniki
- Zaobserwowano znaczne wyciszanie genów w obszarach mózgu po inokulacji.
- Zwiększona wydajność dostarczania siRNA przy użyciu urządzenia pozycjonującego w porównaniu z innymi metodami.
- W mózgach traktowanych myszy wykryto silną fluorescencję, co wskazuje na skuteczne dostarczenie preparatu.
- Upozycjonowanie głowy w dół poprawiło penetrację i depozycję formulacji siRNA.
Wnioski
- Urządzenie do pozycjonowania myszy jest skuteczne w dostarczaniu leków do OUN.
- Metodę tę można zastosować w różnych kontekstach terapeutycznych i badawczych.
- Dalsze badania mogą zgłębić możliwości jej wykorzystania w leczeniu chorób OUN.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wydajne podawanie drogą donosową terapeutyków celowanych w OUN pozostaje krytycznym wąskim gardłem w przedklinicznych badaniach z zakresu neuronauki oraz w rozwoju terapii genowych. To urządzenie pozycjonujące umożliwia zestandaryzowane, wysokoprzepustowe podawanie biomolekuł, takich jak siRNA, peptydy lub nanocząsteczki, do mózgu myszy, co poprawia powtarzalność i zmniejsza zmienność w badaniach nad angażowaniem celu. Poprzez zapewnienie spójnego ułożenia głowy skierowanej w dół i do przodu, urządzenie zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wchłaniania do OUN i zmniejsza ryzyko związane z przełożeniem kandydatów na terapię donosową na etapy translacyjne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia precyzyjną weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez zapewnienie powtarzalnego dostarczania związków aktywnych w OUN, takich jak kompleksy RVG9R-siRNA.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność dawkowania zależną od operatora, co wspiera wiarygodną ocenę zaangażowania celu i modulacji szlaków.
- Pewność prognostyczna: Poprawia spójność odczytów biomarkerów, takich jak wyciszanie genów lub knockdown białek, w różnych grupach terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje ustandaryzowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez zapewnienie jednorodnego dostarczania związków do OUN.
- Wartość operacyjna: Umożliwia powtarzalność testów dzięki kontrolowanemu pozycjonowaniu zwierząt i ograniczeniu stresu związanego z manipulacją.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Wspiera ocenę różnych modalności, w tym siRNA, nanocząsteczek i przeciwciał, w celu dostarczenia ich do OUN.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność w kontekście choroby poprzez umożliwienie spójnego dostarczania substancji do kluczowych obszarów mózgu zaangażowanych w modele neurodegeneracji lub infekcji wirusowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia szybkie testowanie kandydatów terapeutycznych dzięki równoległemu przetwarzaniu do ośmiu myszy podczas jednej sesji.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go poprzez zwiększenie pewności danych dotyczących ekspozycji w OUN oraz modulacji celu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Urządzenie integruje się z procesem badawczym, od wczesnej walidacji celu po optymalizację wiodącej cząsteczki, wspierając wiarygodne oceny dostarczania do OUN przed badaniami umożliwiającymi złożenie wniosku IND.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez, umożliwiając spójne dostarczanie siRNA lub terapeutyków peptydowych w celu walidacji modulacji celu in vivo.
- Przesiewanie: Poprawia gotowość i powtarzalność testów poprzez standaryzację ułożenia zwierząt podczas donosowego podawania związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie wchłaniania do OUN za pomocą fluorescencji, qPCR lub odczytów biomarkerów w różnych grupach terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez poprawę niezawodności wskaźników dostarczania do OUN stosowanych w badaniach nad zakresem dawek i skutecznością.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma do oceny wielu modalności celowanych w OUN w różnych projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie dostarczania do OUN i angażowania celu poprzez ograniczenie zmienności proceduralnej.
- Wartość operacyjna: Poprawia przepustowość i standaryzację, redukując czas pracy manualnej oraz zależność od technika.
- Wartość strategiczna: Wspiera lepsze podejmowanie decyzji go/no-go poprzez poprawę jakości danych i redukcję wyników fałszywie ujemnych w testach dostarczania do OUN.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na terapeutyki podawane donosowo z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o powtarzalne dane dotyczące wchłaniania do OUN.
Kwestie implementacyjne
- Wymaga przeszkolenia w zakresie oceny znieczulenia oraz prawidłowego unieruchomienia zwierzęcia, aby zapewnić jego komfort i właściwe ułożenie.
- Zależne od dostępu do sprzętu do podawania doustnego, takiego jak mikropipety i sterylne końcówki, w celu zapewnienia powtarzalnego tworzenia się kropel.
- Wymaga standaryzacji między zespołami, aby zapewnić jednolite ułożenie głowy (skierowanej w dół i do przodu) oraz zachowanie stałych odstępów czasowych między inokulacjami w nozdrzach.
- Musi zostać dostosowane do różnych szczepów lub wielkości myszy poprzez wykorzystanie funkcji regulacji wysokości i nachylenia krzesła.
- Ograniczone do procedur wymagających precyzyjnego podawania donosowego; nieodpowiednie dla dróg podania dożylnego lub doustnego.
