Name: Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizacjęCa2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Poznaj średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu związków na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich. Metody te umożliwiają szybkie badanie funkcji plemników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować laboratorium Timo Strünkera za nadzór nad AR i DLE podczas ich pobytu w jego laboratorium. Ponadto chcielibyśmy podziękować naszym kolegom z Oddziału Wzrostu i Rozrodu Szpitala Uniwersyteckiego w Kopenhadze, Rigshospitalet za pomoc w przygotowaniu tych dwóch testów. Projekt ten był wspierany przez Duńską Agencję Ochrony Środowiska jako projekt w ramach Centrum ds. Substancji Zaburzających Funkcjonowanie Układu Hormonalnego oraz poprzez dotacje z Funduszu Innowacyjnego Danii (granty o numerach 005-2010-3 i 14-2013-4).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test sygnalizacji Ca2 + o średniej przepustowości opiera się na pomiarach fluorescencji z pojedynczych mikrostudzienek, z których każda zawiera około 250 000 plemników. Przechwycony sygnał jest uśredniany ze wszystkich pojedynczych plemników w studzience. Test nie dostarcza zatem żadnych informacji przestrzennych na temat tego, gdzie konkretnie w plemniku [Ca2+]i jest zmieniany, w jak dużym odsetku plemników zachodzi zmiana w [Ca2+]i lub jak niejednorodna jest odpowi...

Celem dwóch opisanych tutaj testów jest zbadanie wpływu na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w ludzkim plemniku, jak wykazano dla wielu związków w kilku publikacjach wykorzystujących te testy1,2,3,4,5,6,7. Sygnalizacja Ca2+ i reakcja akrosomów są niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania plemników i męskiej płodności.
Ogólnym celem ludzkiej komórki plemnika jest zapłodnienie komórki jajowej. Aby móc skutecznie i naturalnie zapłodnić komórkę jajową, funkcje plemnika muszą być ściśle regulowane podczas podróży plemnika przez żeński układ rozrodczy8,9. Wiele funkcji plemników jest regulowanych przez wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2+ [Ca2+]i (np. ruchliwość plemników, chemotaksja i reakcja akrosomowa)10. Również proces dojrzewania zwany kapacytacją, który sprawia, że plemnik jest zdolny do zapłodnienia komórki jajowej, jest częściowo regulowany przez [Ca2+]i10. Pompy Ca2+-ATPazy wytłaczające Ca 2+ sup class<="xref">11 utrzymują około 20 000 krotny gradient Ca2+ nad błoną ludzkich plemników, z spoczynkowym [Ca2+]i wynoszącym 50-100 nM. Jeśli Ca2+ może przejść przez błonę komórkową (np. Przez otwarcie kanałów Ca2+), następuje znaczny napływ Ca2+, powodując wzrost [Ca2+]i. Jednak plemnik przenosi również wewnątrzkomórkowe zapasy Ca2 +, które mogą uwalniać Ca2 +, a zatem powodować również wzrost [Ca2 +] i12. Co ciekawe, do tej pory stwierdzono, że cały napływ Ca2+ do ludzkich plemników za pośrednictwem kanału zachodzi za pośrednictwem CatSper (Cat ionic channel of Sperm), który ulega ekspresji tylko w plemnikach11. W ludzkich plemnikach CatSper jest aktywowany przez endogenne ligandy progesteron i prostaglandyny poprzez różne miejsca wiązania ligandów13,14,15, co prowadzi do szybkiego napływu Ca2+ do plemnika. Dwa główne źródła w pobliżu jaja zapewniają wysoki poziom tych endogennych ligandów. Jednym z nich jest płyn pęcherzykowy, który zawiera wysoki poziom progesteronu16. Płyn pęcherzykowy jest uwalniany z dojrzałych pęcherzyków wraz z komórką jajową podczas owulacji i miesza się z płynem w jajowodach17. Innym głównym źródłem są komórki wzgórka, które otaczają jajo i uwalniają wysoki poziom progesteronu i prostaglandyn. Wykazano, że indukowany progesteronem napływ Ca2+ do plemników pośredniczy w chemotaksji w kierunku komórki jajowej9,18, kontroluj ruchliwość plemników19,20 i stymuluj reakcję akrosomów21. Wyzwolenie tych indywidualnych [Ca2+]i-regulowanych funkcji plemników we właściwej kolejności i we właściwym czasie jest kluczowe dla zapłodnienia komórki jajowej8. W związku z tym stwierdzono, że nieoptymalny napływ Ca2+ wywołany progesteronem wiąże się ze zmniejszoną płodnością mężczyzn22,23,24,25,26,27,28,29 i funkcjonalny CatSper jest niezbędny dla mężczyzn Fertility26,30,31,32,33,34,35,36.
Gdy plemniki docierają do komórki jajowej, musi zajść sekwencja zdarzeń, aby doszło do zapłodnienia: 1) Plemniki muszą przeniknąć do otaczającej warstwy komórek wzgórka, 2) związać się z osłonką przejrzystą, 3) egzocytoza zawartości akrosomalnej, tak zwana reakcja akrosomowa37, 4) przeniknąć do osłonki przejrzystej, i 5) połączyć się z błoną jajową, aby zakończyć zapłodnienie38. Aby móc przejść przez te etapy i zapłodnić komórkę jajową, plemnik musi najpierw przejść kapacytację11, która rozpoczyna się, gdy plemniki opuszczają płyn nasienny zawierający czynniki "dekapacytujące"39 i wpływają do płynów żeńskiego układu rozrodczego o wysokim poziomie wodorowęglanów i albuminy37. Kapacytacja sprawia, że plemniki są zdolne do hiperaktywacji, formy ruchliwości z energicznym uderzeniem wici i reakcją akrosomalną37. Hiperaktywna ruchliwość jest wymagana do penetracji strefy przejrzystej40, a akrosom zawiera różne enzymy hydrolityczne, które wspomagają ten proces penetracji41. Dodatkowo, reakcja akrosomowa sprawia, że plemniki są zdolne do łączenia się z komórką jajową poprzez odsłonięcie specyficznych białek błonowych na powierzchni plemnika, niezbędnych do fuzji plemnika z jajem42. W związku z tym zdolność do ulegania hiperaktywacji i reakcji akrosomowej jest wymagana do pomyślnego zapłodnienia jaja40,42. W przeciwieństwie do tego, co zaobserwowano w przypadku plemników myszy43,44,45, tylko ludzkie plemniki, które są nienaruszone pod względem akrosomu, mogą wiązać się z osłoną przejrzystą46. Kiedy ludzkie plemniki są związane z osłonką przejrzystą, muszą przejść reakcję akrosomalną, zarówno w celu przeniknięcia do osłonki przejrzystej41, jak i w celu odsłonięcia specyficznych białek błonowych, które są potrzebne do fuzji z jajem38. Czas reakcji akrosomów w plemnikach ludzkich ma zatem kluczowe znaczenie dla zajścia zapłodnienia.
Jak opisano powyżej, sygnalizacja Ca2+ jest niezbędna dla prawidłowego funkcjonowania plemników8, a zatem bardzo interesujące jest możliwość badania dużej liczby związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2+ w ludzkich plemnikach. Podobnie, ponieważ tylko ludzkie plemniki, które przechodzą reakcję akrosomową we właściwym czasie i miejscu, mogą przeniknąć do osłonki przejrzystej i zapłodnić komórkę jajową46,47, bardzo interesująca jest również możliwość testowania związków pod kątem ich zdolności do wpływania na reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach. W tym celu opisano dwa średnioprzepustowe testy przesiewowe: 1) test wpływu na sygnalizację Ca2 + w ludzkich plemnikach oraz 2) test zdolności do indukowania reakcji akrosomów w plemnikach ludzkich.
Test 1 jest średnioprzepustowym testem sygnalizacyjnym Ca2+. Ta technika oparta na czytniku płytek fluorescencyjnych monitoruje zmiany fluorescencji w funkcji czasu jednocześnie w wielu studzienkach. Wrażliwy na Ca2+ barwnik fluorescencyjny, Fluo-4 ma Kd dla Ca2 + ≈ 335 nM i jest przenikany komórkowo w postaci estru AM (acetoksymetylowego). Za pomocą Fluo-4 można zmierzyć zmiany w [Ca2+]i w czasie i po dodaniu do plemników interesujących ich związków. Test został opracowany przez laboratorium Timo Strünkera w 2011 roku13 i od tego czasu został wykorzystany w kilku badaniach przesiewowych do badań przesiewowych związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2+ w ludzkim nasieniu1,2,3,4,5. Podobna metoda została również wykorzystana do przesiewania wielu kandydatów na leki48. Ponadto test ten jest również przydatny do oceny farmakologicznego sposobu działania1,2,3,4,5, krzywe dawka-odpowiedź1,2,3,4,5, Inhibicja rywalizacji1,2, additivity1,2, and synergism3 związków będących przedmiotem zainteresowania.
Test 2 to średnioprzepustowy test reakcji akrosomalnej. Ta technika oparta na cytometrze obrazowym mierzy ilość żywotnych plemników reagujących na akrosom w próbce przy użyciu trzech barwników fluorescencyjnych: jodku propidyny (PI), lektyny Pisum sativum sprzężonej z FITC (FITC-PSA) i Hoechst-33342. Test został zmodyfikowany na podstawie podobnej metody opartej na cytometrii przepływowej przez Zoppino et al.49 i był używany w kilku badaniach6,7. Jeśli chodzi o test sygnalizacji Ca2 +, ten test reakcji akrosomów można również wykorzystać do oceny krzywych dawka-odpowiedź, hamowania, addytywności i synergizmu interesujących związków.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; m filtr porowy</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>296-4545</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder miarowy 1 L</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>3662-1000</td><td></td></tr><tr><td>1, 4 i 2 ml probówki plastikowe</td><td>Eppendorf, Niemcy</td><td>30120086 i 0030120094</td><td></td></tr><tr><td>pipeta 12-kanałowa</td><td>Eppendorf, Niemcy</td><td>4861000813</td><td></td></tr><tr><td>384 płytki wielodołkowe</td><td>Greiner Bio-One, Niemcy</td><td>781096</td><td></td></tr><tr><td>Probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 15 i 50 ml</td><td>Eppendorf, Niemcy</td><td>0030122151 i 30122178</td><td></td></tr><tr><td>Suwak A2</td><td>ChemoMetec, Dania</td><td>942-0001</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna pipeta powtarzalna</td><td>Eppendorf, Niemcy</td><td>4987000010</td><td></td></tr> <tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czysta, z szerokim otworem plastikowy pojemnik na próbkę</td><td></td><td></td><td></td>nasienia</tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lektyna Pisum sativum sprzężona z FITC (FITC-PSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>L0770</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych FLUOstar OMEGA</td><td>BMG Labtech, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td></td><td></td><td></td>bezwodna</tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>ChemoMetec, Dania</td><td>910-3015</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej (HSA)</td><td>Irvine Scientific</td><td>9988</td><td>Do dodania do HTF+</td></tr><tr><td>Roztwór unieruchamiający zawierający 0,6 M NaHCO3 i 0,37% (v/v) formaldehydu w wodzie</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>destylowanejInkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło</td><td></td><td></td><td></td>magnetyczne</tr><tr><td>MgSO4Na-mleczan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO<subCytometr obrazowy >3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NC-3000</td><td>ChemoMetec, Dania</td><td>970-3003</td><td></td></tr><tr><td>Pipety i końcówki</td><td></td><td></td><td></td>do pipetowania</tr><tr><td>jodku propidyny (PI)</td><td>ChemoMetec, Dania</td><td>910-3002</td><td></td></tr> Stojak na <tr><td>wodę</td><td></td><td></td><td></td>oczyszczoną</tr><tr><td>do umieszczania plastikowych probówek o pojemności 50 ml pod kątem</td><td></td><td></td><td></td> 45 stopni</tr><tr><td>Bufor S100</td><td>ChemoMetec, Dania</td><td>910-0101</td><td></td></tr><tr><td>SP1-kaseta</td><td>ChemoMetec, Dania</td><td>941-0006</td><td></td></tr><tr><td>Kolby miarowe o odpowiednich rozmiarach</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizacjęca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-sygnalizacja jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania plemników i męskiej płodności. Podobnie reakcja akrosomowa jest niezbędna dla zdolności ludzkiego plemnika do przenikania przez osłonę przejrzystą i zapłodnienia komórki jajowej. Dlatego bardzo interesujące jest testowanie związków (np. chemikaliów środowiskowych lub kandydatów na leki) pod kątem ich wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w nasieniu ludzkim, albo w celu zbadania potencjalnego niekorzystnego wpływu na funkcję plemników ludzkich, albo w celu zbadania możliwej roli jako środka antykoncepcyjnego. W tym miejscu opisano dwa testy średnioprzepustowe: 1) test oparty na fluorescencji do oceny wpływu na sygnalizację Ca2 + w nasieniu ludzkim oraz 2) test cytometrii obrazowej do oceny reakcji akrosomów w nasieniu ludzkim. Testy te mogą być stosowane do badań przesiewowych dużej liczby związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach. Ponadto testy mogą być wykorzystywane do generowania wysoce specyficznych krzywych dawka-odpowiedź poszczególnych związków, określania potencjalnej addytywności/synergizmu dla dwóch lub więcej związków oraz do badania farmakologicznego sposobu działania poprzez eksperymenty z hamowaniem konkurencyjnym z inhibitorami CatSper.

Reprezentatywne wyniki eksperymentu badającego wpływ 4 związków (A, B, C i D) wraz z kontrolą pozytywną (progesteron) i negatywną (bufor) na [Ca2+]i w ludzkich plemnikach przy użyciu średnioprzepustowego testu sygnalizacji Ca2+ przedstawiono na Rysunku 4a. Na Rysunku 4b pokazano krzywą zależności dawka-odpowiedź dla progesteronu, wyprowadzoną z danych szczytowego ΔF/F0 (%) indukowanego ...

Tutaj opisane są dwa średnioprzepustowe testy do oceny wpływu na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich. Testy te można wykorzystać do szybkiego i łatwego badania przesiewowego dużych ilości związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach.

Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizacjęCa2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Nasze testy mogą być wykorzystywane do testowania związków pod kątem ich wpływu na funkcję plemników ludzkich. W szczególności metody te mogą być wykorzystywane do szybkiego i łatwego badania przesiewowego dużej liczby związków pod kątem ich wpływu na sygnalizację wapniową i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach. Wizualne demonstracje tej metody ułatwią innym przeprowadzanie podobnych eksperymentów w ich własnych laboratoriach.Zacznij od umieszczenia jednej 50-mililitrowej probówki na jeden mililitr próbki surowego nasienia w stojaku na probówki pod kątem 45 stopni i dodaniu czterech mililitrów ludzkiego płynu jajowodowego o temperaturze 37 stopni Celsjusza lub dodatniego podłoża HTF do każdej probówki. Następnie ostrożnie odpipetuj jeden mililitr próbki skroplonego nasienia na dno każdej probówki i umieść probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Pod koniec inkubacji użyj zmodyfikowanej końcówki pipety trzymanej pod kątem 45 stopni, aby delikatnie przenieść jak najwięcej górnej frakcji ruchliwych plemników zawierających pożywkę HTF dodatnią do nowej 15-mililitrowej plastikowej probówki.Aby policzyć pobrane plemniki, rozcieńczyć podwielokrotność 20 mikrolitrów do współczynnika 10, 20, 30, 50 lub 90 w buforze S100 w okrągłej probówce o pojemności dwóch mililitrów zgodnie z oczekiwanym stężeniem. Wiruj rozcieńczone plemniki przez 10 sekund z prędkością 700 obrotów na minutę. Następnie zanurz kasetę SP1 w próbce i całkowicie wciśnij biały tłok, aby zassać porcję próbki do kasety.Następnie umieść kasetę w tacce cytometru obrazowego i uruchom test plemników ludzkich barwionych PI zgodnie z zastosowanym współczynnikiem rozcieńczenia. Aby zmierzyć zmiany w swobodnym wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia, delikatnie pipetuj próbkę nasienia w górę iw dół jeden raz, a następnie użyj automatycznej pipety powtarzalnej, aby podsycić 50 mikrolitrów plemników barwionych fluoroforem do 24 dołków w jednym rzędzie płytki mikrodołkowej 384. Umieść płytkę mikrodołkową w czytniku płytek fluorescencyjnych w temperaturze 30 stopni Celsjusza i wybierz odpowiedni protokół dla fluoroforu.Wybierz studzienkę w rzędzie plemników i dostosuj wzmocnienie do wartości docelowej 20%Następnie rozpocznij pomiar. Po 10 cyklach linii bazowej przerwij eksperyment i wysuń szufladę z płytką mikrodołkową. Za pomocą pipety 12-kanałowej szybko dodaj 25 mikrolitrów przygotowanych roztworów związków i kontroli będących przedmiotem zainteresowania do 12 zduplikowanych studzienek w rzędzie i natychmiast zwróć płytkę do czytnika, aby jak najszybciej kontynuować pomiar.Wszelkie zmiany we fluorescencji w odpowiedzi na dodanie związków lub kontroli zostaną wychwycone przez instrument. Do analizy reakcji akrosomów, po inkubacji zpojemnościonych plemników z odpowiednimi barwnikami fluorescencyjnymi, związkami lub kontrolami, należy wymieszać próbki przez pipetowanie i dodać 50 mikrolitrów każdej badanej próbki do 100 mikrolitrów roztworu unieruchamiającego. Ponownie wymieszać próbki i naładować komory po jednym szkiełku A2 na próbkę około 30 mikrolitrami próbki na komorę.Następnie umieść pierwszy załadowany szkiełko na tacy cytometru obrazowego. Wybierz protokół FlexiCyte i naciśnij Uruchom. Tutaj można zaobserwować reprezentatywne wyniki eksperymentu testującego wpływ czterech związków, dodatniej kontroli progesteronu i ujemnej kontroli buforowej przy użyciu testu sygnalizacji wapniowej o przepustowości pożywki, jak wykazano.Na tym wykresie przedstawiono krzywą dawka-odpowiedź progesteronu wyprowadzoną ze szczytowych zmian procentowych wewnątrzkomórkowego stężenia wolnego wapnia wywołanych przez seryjnie rozcieńczone stężenie progesteronu. Dane te ilustrują wpływ jednej ujemnej lub jednej z dwóch kontroli dodatnich na indukcję reakcji akrosomowej w zpojemnościowanych plemnikach ludzkich w teście reakcji akrosomowej o średniej przepustowości. Aby uniknąć pominięcia szczytów indukowanych sygnałów, bardzo ważne jest szybkie dodanie substancji chemicznych do dołków replikacji i natychmiastowe kontynuowanie pomiaru.Zmieniając rodzaj fluoroforów i barwników, nasze testy można łatwo modyfikować, aby odpowiadały na różne pytania naukowe. Testy te zostały już wykorzystane w kilku badaniach do testowania dużych grup związków pod kątem ich wpływu na funkcję ludzkich plemników.

medium-throughput-screening-assays-for-assessment-effects-on-ca2

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oceniono sygnały [Ca2+]i wywołane bodźcem w pojedynczych ludzkich plemnikach. Ruchome komórki obciążono fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na Ca2+ (metodą estru AM) i unieruchomiono w komorze przepływowej. Obrazowanie komórek przeprowadzono za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, a stymulację wykonano poprzez medium perfuzyjne. Odpowiedzi pojedynczych komórek (lub obszarów) przeanalizowano offline przy użyciu programu Excel.

Techniki obrazowania sygnalizacji Ca2+ w ludzkich plemnikach

Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca2+ jest bardzo ważna w fizjologii plemników, a barwniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2+ stanowią wszechstronne narzędzie do ich badania. Eksperymenty populacyjne (fluorometria i fluorometria zatrzymanego przepływu) oraz eksperymenty z pojedynczymi komórkami (cytometria przepływowa i obrazowanie pojedynczych komórek) są wykorzystywane do śledzenia zmian czasoprzestrzennych [Ca2+] w plemnikach ludzkich.

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy metodologie oceny integralności błony plemników, cechy komórkowej związanej z kompetencją zapłodnienia plemników. Opisujemy trzy techniki fluorymetrycznej oceny błon plemników: jednoczesne barwienie za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych, mikroskopię fluorescencyjną oraz zaawansowaną cytometrię przepływową dedykowaną plemnikom. Przedstawiono również przykłady łączenia metodyk.

Techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników

Opisujemy zastosowanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do monitorowania zmian w czasie rzeczywistym w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji nasienia myszy.

Używanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru zmian w glikolizie i fosforylacji oksydacyjnej podczas kapacytacji plemników myszy

Protokół ten opisuje, jak przeprowadzać rejestracje elektryczne z komórek plemników ssaków w konfiguracji całej komórki, z celem bezpośredniego rejestrowania aktywności kanałów jonowych. Metoda ta odegrała kluczową rolę w opisie elektrofizjologicznych profili kilku kanałów jonowych plemników i pomogła ujawnić ich tożsamość molekularną oraz regulację.

Rejestrowanie prądów elektrycznych przez błonę plazmatyczną plemników ssaków

Obecny protokół dostarcza praktycznego rozwiązania, które pozwala na pomiar apoptozy, potencjału błony mitochondrialnej i uszkodzeń DNA w plemnikach ludzkich za pomocą pojedynczego cytometru.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów do wykrywania wad funkcjonalnych plemników ludzkich

Opisany tutaj model myszy AcroSensE i metody obrazowania żywych komórek dostarczają nowego podejścia do badania dynamiki wapnia w subkomórkowym przedziale akrosomu plemnika i jak regulują one etapy pośrednie prowadzące do fuzji błony i egzocytozy akrosomów.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym akrosomalnej dynamiki wapnia i egzocytozy w żywych plemnikach myszy

fMRI i monitorowanie fizjologiczne są wykorzystywane do badania wpływu akupunktury na centralny i obwodowy układ nerwowy. Akupunktura aktywuje sieć limbiczno-paralimbiczno-neokortykalną, wykazując duży stopień nakładania się na sieć stanu spoczynkowego (default mode network), aby modulować aktywność neurologiczną, co może być powiązane z jej efektem autonomicznym w obwodowym układzie nerwowym.

Monitorowanie wpływu akupunktury na ludzki mózg za pomocą fMRI

Komórki jajowe oraz otaczające je powłoki pozakomórkowe często uwalniają peptydy, białka i małe cząsteczki, które komunikują się z plemnikami, by prowadzić je do jaja, wspomagając tym samym zapłodnienie. Wykorzystując plemniki żaby, opisujemy i porównujemy dwie klasy testów służących do wykrywania chemotaksji plemników – testy akumulacji plemników oraz testy śledzenia trajektorii plemników.

Dwa rodzaje testów do wykrywania chemoatrakcji plemników żaby

Opisano wydajną metodę pozwalającą na wizualizację indukcji sygnalizacji Ca2+ w komórkach śródbłonka wywołanej przez pochodne parakrynne ROS. Metoda ta wykorzystuje pomiar mobilizacji Ca2+ wyzwalanej przez pochodne parakrynne ROS w komórkach śródbłonka naczyniowego w modelu kokultury.

Wizualizacja sygnalizacji wazkularnego Ca2+ wywołanej przez ROS pochodzenia parakrynnego

Poznaj średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu związków na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich. Metody te umożliwiają szybkie badanie funkcji plemników.

Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizację^Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich

Przeglądaj więcej filmów