Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizacjęCa2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich
1 marca 2019
Tutaj opisane są dwa średnioprzepustowe testy do oceny wpływu na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich. Testy te można wykorzystać do szybkiego i łatwego badania przesiewowego dużych ilości związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach.
Nasze testy mogą być wykorzystywane do testowania związków pod kątem ich wpływu na funkcję plemników ludzkich. W szczególności metody te mogą być wykorzystywane do szybkiego i łatwego badania przesiewowego dużej liczby związków pod kątem ich wpływu na sygnalizację wapniową i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach. Wizualne demonstracje tej metody ułatwią innym przeprowadzanie podobnych eksperymentów w ich własnych laboratoriach.
Zacznij od umieszczenia jednej 50-mililitrowej probówki na jeden mililitr próbki surowego nasienia w stojaku na probówki pod kątem 45 stopni i dodaniu czterech mililitrów ludzkiego płynu jajowodowego o temperaturze 37 stopni Celsjusza lub dodatniego podłoża HTF do każdej probówki. Następnie ostrożnie odpipetuj jeden mililitr próbki skroplonego nasienia na dno każdej probówki i umieść probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Pod koniec inkubacji użyj zmodyfikowanej końcówki pipety trzymanej pod kątem 45 stopni, aby delikatnie przenieść jak najwięcej górnej frakcji ruchliwych plemników zawierających pożywkę HTF dodatnią do nowej 15-mililitrowej plastikowej probówki.
Aby policzyć pobrane plemniki, rozcieńczyć podwielokrotność 20 mikrolitrów do współczynnika 10, 20, 30, 50 lub 90 w buforze S100 w okrągłej probówce o pojemności dwóch mililitrów zgodnie z oczekiwanym stężeniem. Wiruj rozcieńczone plemniki przez 10 sekund z prędkością 700 obrotów na minutę. Następnie zanurz kasetę SP1 w próbce i całkowicie wciśnij biały tłok, aby zassać porcję próbki do kasety.
Następnie umieść kasetę w tacce cytometru obrazowego i uruchom test plemników ludzkich barwionych PI zgodnie z zastosowanym współczynnikiem rozcieńczenia. Aby zmierzyć zmiany w swobodnym wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia, delikatnie pipetuj próbkę nasienia w górę iw dół jeden raz, a następnie użyj automatycznej pipety powtarzalnej, aby podsycić 50 mikrolitrów plemników barwionych fluoroforem do 24 dołków w jednym rzędzie płytki mikrodołkowej 384. Umieść płytkę mikrodołkową w czytniku płytek fluorescencyjnych w temperaturze 30 stopni Celsjusza i wybierz odpowiedni protokół dla fluoroforu.
Wybierz studzienkę w rzędzie plemników i dostosuj wzmocnienie do wartości docelowej 20%Następnie rozpocznij pomiar. Po 10 cyklach linii bazowej przerwij eksperyment i wysuń szufladę z płytką mikrodołkową. Za pomocą pipety 12-kanałowej szybko dodaj 25 mikrolitrów przygotowanych roztworów związków i kontroli będących przedmiotem zainteresowania do 12 zduplikowanych studzienek w rzędzie i natychmiast zwróć płytkę do czytnika, aby jak najszybciej kontynuować pomiar.
Wszelkie zmiany we fluorescencji w odpowiedzi na dodanie związków lub kontroli zostaną wychwycone przez instrument. Do analizy reakcji akrosomów, po inkubacji zpojemnościonych plemników z odpowiednimi barwnikami fluorescencyjnymi, związkami lub kontrolami, należy wymieszać próbki przez pipetowanie i dodać 50 mikrolitrów każdej badanej próbki do 100 mikrolitrów roztworu unieruchamiającego. Ponownie wymieszać próbki i naładować komory po jednym szkiełku A2 na próbkę około 30 mikrolitrami próbki na komorę.
Następnie umieść pierwszy załadowany szkiełko na tacy cytometru obrazowego. Wybierz protokół FlexiCyte i naciśnij Uruchom. Tutaj można zaobserwować reprezentatywne wyniki eksperymentu testującego wpływ czterech związków, dodatniej kontroli progesteronu i ujemnej kontroli buforowej przy użyciu testu sygnalizacji wapniowej o przepustowości pożywki, jak wykazano.
Na tym wykresie przedstawiono krzywą dawka-odpowiedź progesteronu wyprowadzoną ze szczytowych zmian procentowych wewnątrzkomórkowego stężenia wolnego wapnia wywołanych przez seryjnie rozcieńczone stężenie progesteronu. Dane te ilustrują wpływ jednej ujemnej lub jednej z dwóch kontroli dodatnich na indukcję reakcji akrosomowej w zpojemnościowanych plemnikach ludzkich w teście reakcji akrosomowej o średniej przepustowości. Aby uniknąć pominięcia szczytów indukowanych sygnałów, bardzo ważne jest szybkie dodanie substancji chemicznych do dołków replikacji i natychmiastowe kontynuowanie pomiaru.
Zmieniając rodzaj fluoroforów i barwników, nasze testy można łatwo modyfikować, aby odpowiadały na różne pytania naukowe. Testy te zostały już wykorzystane w kilku badaniach do testowania dużych grup związków pod kątem ich wpływu na funkcję ludzkich plemników.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu przedstawiono dwa testy o średniej przepustowości, zaprojektowane w celu oceny wpływu różnych związków na sygnalizację wapniową oraz reakcję akrosomalną w ludzkich plemnikach. Testy te umożliwiają szybki screening dużych liczb związków, dostarczając informacji na temat funkcjonowania komórek plemnikowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia rozrodu
- Sygnalizacja komórkowa
- Opracowywanie testów
Wstęp
- Sygnalizacja wapniowa odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu plemników.
- Reakcja akrosomalna jest niezbędna dla interakcji plemnika z komórką jajową.
- Niezbędne są efektywne metody przesiewowe do identyfikacji związków wpływających na ten proces.
Zastosowane metody
- Analiza sygnalizacji wapniowej o średniej przepustowości
- Ludzkie komórki plemników
- Analizy z użyciem barwienia fluoroforami i cytometria obrazowa
Główne wyniki
- Wykazano wpływ związków na wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia.
- Przedstawiono zależności dawka-odpowiedź z wykorzystaniem kontroli pozytywnej i negatywnej.
- Potwierdzono powtarzalność testu w celu przesiewania różnych związków.
Wnioski
- Analizy te stanowią cenną platformę do oceny funkcji plemników.
- Metody te mają zastosowanie w szerszym zakresie pytań biologicznych w badaniach nad rozrodczością.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Testy o średniej przepustowości dotyczące sygnalizacji Ca2+ i reakcji akrosomalnej w plemnikach ludzkich umożliwiają szybką, ilościową ocenę wpływu związków na kluczowe mechanizmy płodności. Platformy te wspierają wczesną selekcję związków, ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz prognostyczną ocenę potencjalnych zaburzeń rozrodczych lub właściwości antykoncepcyjnych. Ich integracja usprawnia podejmowanie decyzji w zakresie portfela badawczego poprzez dostarczenie wiarygodnych i skalowalnych danych na temat wpływu związków w systemie istotnym z punktu widzenia patologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie wpływu związków na specyficzne dla plemników szlaki sygnalizacyjne oraz punkty końcowe funkcji.
- Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez wyjaśnianie mechanizmów leżących u podstaw modulacji płodności lub toksyczności.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w zakresie oddziaływania na cel oraz oceny ryzyka efektów poza-celowych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych, ilościowych testów do przesiewowego badania związków o średniej przepustowości.
- Dostarcza powtarzalnych danych o zależności między dawką a odpowiedzią zarówno dla punktów końcowych sygnalizacji Ca2+, jak i reakcji akrosomalnej.
- Umożliwia skalowalną ocenę dużych bibliotek związków pod kątem wpływu na układ rozrodczy lub aktywności antykoncepcyjnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica testy funkcji plemników in vitro ze strategiami biomarkerów translacyjnych w celu oceny bezpieczeństwa rozrodczego.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania po przedkliniczną ocenę toksykologii rozrodczej.
- Dostarcza danych mechanistycznych pozwalających na dostosowanie rozwoju cząsteczek kandydackich do poziomu ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Testy te są stosowane na etapie od wczesnego odkrywania do identyfikacji wiodących związków, umożliwiając szybką weryfikację hipotez oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przypadku związków o potencjalnym działaniu na układ rozrodczy.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie zmian w sygnalizacji Ca2+ i reakcji akrosomalnej indukowanych przez związki w celu wyjaśnienia szlaków biologicznych.
- Przesiewanie: Zapewnienie standaryzowanych platform o średniej przepustowości dla powtarzalnej oceny związków.
- Analityka: Generowanie ilościowych danych dotyczących zależności dawka-odpowiedź oraz addytywności/synergizmu w celu podejmowania rzetelnych decyzji.
- Badania translacyjne: Łączenie wyników in vitro z przedklinicznymi ocenami bezpieczeństwa rozrodczego, gdy jest to właściwe.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferowanie adaptacyjnych formatów analiz dla różnorodnych klas związków i pytań mechanistycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad bezpieczeństwem rozrodczym i antykoncepcją.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje przesiewowe badanie związków pod kątem punktów końcowych funkcji plemników.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz alokację kapitału poprzez dostarczenie wczesnych, ilościowych danych o ryzyku.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w przypadku substancji obciążonych toksycznością rozrodczą lub posiadających potencjał antykoncepcyjny.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu biologii plemników, testów fluorescencyjnych oraz cytometrii obrazowej.
- Konieczny jest dostęp do fluorescencyjnych czytników płytek oraz cytometrów obrazowych w celu uzyskania ilościowych wyników pomiarów.
- Wymagana jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności testów i porównywalności danych.
- Możliwa może być konieczność adaptacji testu dla różnych klas związków lub punktów końcowych mechanizmu działania.
- Szybkie dodawanie związków i przeprowadzanie pomiarów są kluczowe dla uchwycenia przejściowych zdarzeń sygnalizacyjnych.
