Określanie szybkości zapłodnienia jaj Bemisia tabaci za pomocą techniki cytogenetycznej
1 kwietnia 2019
Prezentujemy prostą technikę cytogenetyczną z użyciem 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) do określenia wskaźnika zapłodnienia i pierwotnego stosunku płci haplodifidowego szkodnika inwazyjnego Bemisia tabaci.
Protokół, który opracowała Liz, pozwala nam określić tempo nawożenia mączlików. Zastosowanie tej techniki poprawi nasze zrozumienie zachowania i ekologii mączlików. Mączliki są haplodiploidalne, więc szybkość zapłodnienia jest równa stosunkowi płci przy składaniu jaj
.O ile nam wiadomo, ten protokół jest pierwszym opisanym dla mączlików i można go ukończyć w ciągu trzech godzin. Na początek wykonaj zakrywający otwór w pokrywie szalki Petriego, aby włożyć i usunąć dorosłe mączliki. Skonfiguruj komorę wilgotnościową i uformuj sondę, wkładając cienki szpilkę pod wygodnym kątem roboczym do stopionej końcówki pipety, aby uzyskać cienką sondę.
Opcjonalnie wydłużone szklane końcówki pipet z podgrzewaniem dla łatwiejszego obchodzenia się z jajami mączlika. Następnie pozwól samicom mączlika złożyć jaja na czystym liściu, pokrojonym tak, aby pasował do agatora na szalce Petriego. Podczas składania jaj mączlika wyczyść szkiełko mikroskopowe wodą z mydłem.
Dobrze go wysusz i rozciągnij kawałek filmu parafinowego na jednym końcu, aby płyny tworzyły krople, a jajka były lepiej widoczne. Aby usunąć warstwę jajową z komórek jajowych, użyj szklanej pipety Pasteura, aby dodać krople 83% roztworu wybielacza podchlorynu sodu do filmu parafinowego tuż przed usunięciem dorosłych i pobraniem komórek jajowych. Zarówno wybielacz, jak i lodowaty kwas octowy są.
Należyobchodzić się z nimi w rękawiczkach w kapturze lub dobrze wentylowanym miejscu. DAPI jest również drażniący i należy obchodzić się z nim w rękawiczkach. Następnie usuń dorosłe mączliki z liścia i umieść liść pod mikroskopem.
Ostrożnie podnieś każde jajko z podstawy, aż szypułka zostanie usunięta z liścia. Ćwicz na wielu jajach przed wykonaniem tego protokołu. Powoli podnieś jaja z podstawy i całkowicie unieś je z liścia, gdy zobaczysz, że szypułka jaja została usunięta z liścia.
Przenieś dwa do trzech jajek na każdą kroplę wybielacza i pozostaw je na 10 minut. Aby naprawić jajka, użyj szklanej pipety, aby wyrzucić wybielacz. Następnie dodaj krople lodowatego kwasu octowego i odczekaj trzy minuty.
Następnie usuń lodowaty kwas octowy i dodaj krople roztworu Clarke'a. Następnie odczekaj 10 minut, aż większość roztworu wyparuje. Dodaj krople 70% etanolu i odczekaj ponownie 10 minut.
Aby zabarwić jajka, najpierw usuń resztki etanolu. Następnie dodaj krople 1xPBS do jaj, aby uzyskać pH zbliżone do siedmiu. Umieść szkiełko mikroskopowe w komorze wilgotnościowej, aby zapobiec wysuszeniu.
Po 30 minutach wyjmij 1xPBS i dodaj krople 1 mikrograma na mililitr DAPI. Umieść szkiełko mikroskopowe w ciemnej komorze wilgotnościowej i odczekaj co najmniej 15 minut. Aby umyć jajka, najpierw usuń roztwór DAPI.
Następnie dodaj krople 1xTBST do jajek. Po pięciu minutach wyjmij 1xTBST. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania.
Po ostatnim umyciu ostrożnie odpipetować wszystkie jaja z parafilmu na czystą część szkiełka mikroskopowego. Usuń nadmiar TBST i dodaj 20 mikrolitrów podłoża montażowego. Na koniec umieść czyste szkiełko nakrywkowe na jajach, uszczelnij szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci w celu długotrwałego przechowywania i przystąp do obrazowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
Dechorionacja jaj, po której następuje barwienie jądrowe DAPI, pozwoliła na przypisanie zapłodnienia i płci zarodka, gdy obserwowano ją za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Żeńskie przedjądrze znajduje się w pobliżu środka zarówno zapłodnionej żeńskiej komórki jajowej, jak i niezapłodnionej męskiej komórki jajowej, a plemnik jest widoczny jako jasna smuga w pobliżu wierzchołka żeńskiej komórki jajowej. Jednym z zastosowań tej techniki jest ustalenie, czy endosymbionty bakteryjne wpływają na pierwotne proporcje płci mączlików.
Na przykład, pierwotne proporcje płci jaj składanych przez mączliki B.tabici zakażone i niezakażone nie wykazały znaczącej różnicy między stosunkiem płci w obu zabiegach. Jeśli chodzi o jaja hodowane do dorosłości, podobne wyniki zaobserwowano dla dorosłych zakażonych riketsją i niezakażonych, nie dostarczając dowodów, przynajmniej w tym badaniu, na większe wskaźniki zapłodnienia przez samice zakażone riketsją. Korzystając z tego protokołu, można określić, czy plemniki międzygatunkowe mogą zapłodnić komórki jajowe.
Jeśli nie obserwuje się zapłodnienia, można cofnąć się i sprawdzić, czy plemniki są przenoszone podczas krycia, patrząc w spermatekę samicy. Jeśli dojdzie do zapłodnienia, można porównać stosunek płci dorosłych do wskaźnika zapłodnienia, aby określić żywotność rozwoju potomstwa hybrydowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowatorską technikę cytogenetyczną z wykorzystaniem DAPI do oceny wskaźnika zapłodnienia oraz pierwotnego stosunku płci u haplodiploidalnego inwazyjnego szkodnika Bemisia tabaci. Protokół został opracowany w celu pogłębienia wiedzy na temat zachowania i ekologii mączlika.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Cytogenetyka
- Ekologia
- Entomologia
Wstęp
- Mączliki są owadami haplodiploidalnymi.
- Wskaźnik zapłodnienia koreluje z proporcją płci podczas składania jaj.
- Technika ta jest pierwszą tego rodzaju metodą opisaną dla mączlików.
- Zrozumienie wskaźników zapłodnienia może pomóc w opracowaniu strategii zwalczania szkodników.
Cel badania
- Opracowanie metody określania wskaźników zapłodnienia mączlików.
- Poszerzenie wiedzy na temat ekologii i zachowania mączlików.
- Dostarczenie szybkiego i wydajnego protokołu dla badaczy.
Zastosowane metody
- Wykonanie otworu z możliwością zakrycia w szalce Petriego do manipulacji mączczykami białymi.
- Przygotowanie komory wilgotnościowej w celu zapewnienia optymalnych warunków.
- Wykonanie cienkiej sondy do precyzyjnej manipulacji.
- Zastosowanie barwienia DAPI w celu oceny wskaźnika zapłodnienia.
Główne wyniki
- Protokół można ukończyć w ciągu trzech godzin.
- Pozwala on na dokładne określenie wskaźników zapłodnienia.
- Wyniki mogą pogłębić zrozumienie dynamiki populacji mączlików.
- Stanowi podstawę do przyszłych badań nad zwalczaniem szkodników.
Wnioski
- Technika ta stanowi znaczący postęp w badaniach nad mączlikami.
- Oferuje ona niezawodną metodę oceny parametrów rozrodczych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole w celu zbadania skutków ekologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe oznaczenie wskaźników zapłodnienia jaj u Bemisia tabaci z wykorzystaniem cytogenetycznego barwienia DAPI umożliwia bezpośredni pomiar pierwotnych proporcji płci, co jest kluczowym parametrem w modelowaniu dynamiki populacji szkodników. Możliwość ta zwiększa pewność prognoz w fazie wczesnego odkrywania i walidacji celów dla interwencji wpływających na biologię rozrodu. Metoda ta zapewnia standaryzowany schemat postępowania w celu oceny wpływu czynników genetycznych lub środowiskowych na alokację płci, co dostarcza podstaw do podejmowania decyzji uwzględniających ryzyko w procesach biotechnologii rolniczej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę mechanizmów rozrodczych i szlaków alokacji płci u szkodników haplodiploidalnych.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnienie wpływu endosymbiontów lub czynników genetycznych na wyniki zapłodnienia.
- Ułatwia modelowanie predykcyjne struktury populacji w celu walidacji celów w strategiach zwalczania szkodników.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalny test cytogenetyczny do ilościowego określania wskaźników zapłodnienia i pierwotnych proporcji płci.
- Standaryzuje przygotowanie próbek i obrazowanie na potrzeby dalszych badań porównawczych.
- Umożliwia rzetelną ocenę zmiennych eksperymentalnych wpływających na sukces reprodukcyjny.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie wyników laboratoryjnych z dynamiką populacji w warunkach terenowych poprzez zestawienie wskaźników zapłodnienia z proporcjami płci osobników dorosłych.
- Zapewnia ciągłość przejścia od odkryć mechanistycznych do badań translacyjnych nad metodami zwalczania szkodników.
- Zmniejsza ryzyko związane z wdrażaniem strategii biologicznej kontroli lub modyfikacji genetycznych, dostarczając ilościowych punktów końcowych w zakresie reprodukcji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta technika cytogenetyczna integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych w biotechnologii rolniczej, wspierając testowanie hipotez oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przypadku celów reprodukcyjnych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określenie zapłodnienia i alokacji płci w celu wyjaśnienia ścieżek reprodukcyjnych oraz przetestowania hipotez środowiskowych lub genetycznych.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowanych, ilościowych odczytów do analizy porównawczej traktowań eksperymentalnych.
- Analityka: Zapewnia pomiary oparte na barwieniu jąder komórkowych w celu wsparcia statystycznego porównania wskaźników zapłodnienia i proporcji płci.
- Badania translacyjne: Łączy testy laboratoryjne z efektami na poziomie populacyjnym, istotnymi dla zwalczania szkodników.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje protokół z możliwością ponownego wykorzystania, który można dostosować do badań nad innymi gatunkami haplodiploidalnymi lub szkodnikami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w biologii rozrodu oraz walidację celów w zwalczaniu szkodników.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybki, ustandaryzowany i powtarzalny schemat postępowania w analizie cytogenetycznej.
- Wartość strategiczna: Stanowi podstawę do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu interwencji celujących w mechanizmy rozrodcze.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację strategii biologicznej i genetycznej z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe punkty końcowe rozrodu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu cytogenetyki, mikroskopii fluorescencyjnej oraz przygotowania próbek.
- Niezbędny jest dostęp do odczynników do barwienia DAPI, infrastruktury do obrazowania fluorescencyjnego oraz zaplecza do bezpiecznego obchodzenia się z chemikaliami.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do innych gatunków haplodiploidalnych lub szkodników po optymalizacji protokołu.
- Ograniczenia obejmują konieczność starannego przygotowania próbek oraz potencjalną zmienność w obchodzeniu się z jajami.
