Name: Określanie szybkości zapłodnienia jaj Bemisia tabaci za pomocą techniki cytogenetycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Poznaj technikę cytogenetyczną z zastosowaniem barwienia DAPI do określania szybkości zapłodnienia u Bemisia tabaci. Ta metoda pozwala badać dynamikę populacji i zachowania białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane z grantu NSF (DEB-1020460) dla M.S.H. oraz grantu USDA AFRI (2010-03752) dla M.S.H. Autorzy dziękują Brennanowi Zehrowi za barwienie jaj mączlika z dużą wprawą i Zen. Autorzy dziękują Mike'owi Riehle za zgodę na użycie jego mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania. Autorzy dziękują Suzanne Kelly i Marco Gebioli za zdjęcia jaj. Autorzy dziękują Suzanne Kelly i Jimmy'emu Conwayowi za pomoc w kluczowych momentach eksperymentów.

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie prace są wykonywane w temperaturze pokojowej, w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub pod wyciągiem. Wszystkie "krople" w tym protokole są zdefiniowane jako 5–20 μl, w zależności od preferencji operatora.
1. Wstępna konfiguracja
<ol>
	<li>Pozwól samicom mączlików złożyć jaja na czystych liściach. Przykładami aren do składania jaj są klatki z klipsami lub liście przycięte tak, aby pasowały do agatora na szalce Petriego. Zrób zakrywany otwór w klatce z klipsem lub pokrywie szalki Petriego, aby wkładać i wyjmować dorosłe osobniki. Alternatywnie, szybko umieść naczynie z zebranymi dorosłymi osobnikami na lodzie, a następnie umieść je na liściu. Ogranicz czas między złożeniem jaj a utrwaleniem komórki jajowej do nie więcej niż 60 minut, aby zapewnić obserwację przejścia plemników do ojcowskiego przedjądrza w komórkach jajowych. 
	nuta: Jaja, które nie zostały usunięte z liścia, mogą być hodowane do dorosłości, aby zarejestrować proporcje płci dorosłej.</li>
	<li>Przed lub w trakcie składania jaj mączlika przygotuj szkiełko mikroskopowe, czyszcząc je wodą z mydłem, dobrze wysuszając, a następnie rozciągając kawałek filmu parafinowego na jednym końcu, upewniając się, że powierzchnia filmu parafinowego nie pęka (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	nuta: Film parafinowy jest hydrofobowy i półprzezroczysty, dzięki czemu płyny tworzą krople, a jaja są lepiej widoczne.</li>
</ol>
2. Dechorionacja
<ol>
	<li>Za pomocą szklanej pipety Pasteura dodaj krople roztworu wybielacza (0,83% podchlorynu sodu) do filmu parafinowego. 
	nuta: Łatwiej jest śledzić jaja, jeśli w każdej kropli znajdują się tylko 2-3 jaja. Alternatywnie, aby poradzić sobie z dużą liczbą jaj, zbierz jaja w kroplach 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). 
	ostrożność: Wybielacz jest; Podczas obchodzenia się z wybielaczem należy nosić rękawice i nie wdychać.</li>
	<li>Usuń dorosłe mączliki z liścia.</li>
	<li>Umieść liść pod mikroskopem, aby wyraźnie zobaczyć jaja i zbieraj jaja pojedynczo i ostrożnie za pomocą cienkiej sondy. Aby wykonać sondę, włóż maleńki trzpień nadel pod kątem 45° lub pod wygodnym kątem roboczym do stopionej końcówki pipety (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Przenieś jajka do wybielacza lub 1x PBS. Jeśli używasz 1x PBS, usuń 1x PBS za pomocą szklanej pipety Pasteura po zebraniu wszystkich jaj, a następnie dodaj wybielacz do jaj. 
	nuta: Podczas zbierania jaj powoli podnoś jajko z podstawy, aż szypułka zostanie usunięta z liścia. Szypułka jest lepka, a jajko zwykle przykleja się do końcówki sondy, dopóki nie zostanie zanurzone w wybielaczu. 
	UWAGA: Zaleca się używanie oddzielnych szklanych pipet Pasteura do wszystkich odczynników, a pipety mogą być modyfikowane pod wpływem ciepła, aby zwęzić końcówki i zmniejszyć ryzyko przypadkowego zassania jaj mączlika. Aby zapobiec pozostałościom i zanieczyszczeniom, po każdym użyciu należy czyścić pipety wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Odczekaj 10 min. Jeśli istnieje zainteresowanie embriogenezą w jajach starszych niż 1 godzina, pozostaw jaja w wybielaczu do 15 minut. 
	nuta: W przypadku jaj, które mają do 1 godziny, wystarczy 10 minut.</li>
</ol>
3. Fiksacja
UWAGA: Te kroki są zaczerpnięte z protokołu błonkoskrzydłych17.
<ol>
	<li>Usuń wybielacz (zawierający fragmenty kosmówki) szklaną pipetą Pasteura i wyrzuć go. Dodać krople lodowatego kwasu octowego za pomocą szklanej pipety Pasteura i odczekać 3 min. 
	ostrożność: Wykonaj ten krok pod wyciągiem. Lodowaty kwas octowy jest; Podczas pracy z lodowatym kwasem octowym należy nosić rękawice i nie wdychać, zwłaszcza w połączeniu z resztkami wybielacza.</li>
	<li>Usunąć lodowaty kwas octowy szklaną pipetą Pasteura i dodać krople roztworu Clarke'a (3:1 absolutnego etanolu: lodowaty kwas octowy) za pomocą szklanej pipety Pasteura. Poczekaj, aż większość roztworu wyparuje (lub maksymalnie 10 minut).</li>
	<li>Dodaj krople 70% etanolu do jaj za pomocą szklanej pipety Pasteura i poczekaj, aż większość etanolu wyparuje (lub maksymalnie 10 minut).</li>
</ol>
4. Barwienie
<ol>
	<li>Usuń resztki etanolu za pomocą szklanej pipety Pasteura i dodaj krople 1x PBS do jaj za pomocą szklanej pipety Pasteura, aby uzyskać pH zbliżone do 7,0. Umieść szkiełko mikroskopowe w komorze wilgotnościowej, aby zapobiec wysuszeniu, na przykład w pustym pudełku z końcówkami do pipet z mokrym ręcznikiem papierowym w środku (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Odczekaj co najmniej 30 min. 
	nuta: Jest to najlepszy moment, jeśli potrzebna jest przerwa, o ile komora wilgotnościowa może zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Usuń 1x PBS za pomocą szklanej pipety Pasteura i dodaj krople 0,1 μg/mL DAPI, barwienia fluorescencyjnego DNA, za pomocą szklanej pipety Pasteura. Umieść szkiełko mikroskopowe w ciemnej komorze wilgotnościowej i odczekaj co najmniej 15 min. 
	ostrożność: DAPI jest środkiem drażniącym, więc należy obchodzić się z nim w rękawiczkach.</li>
</ol>
5. Mycie
<ol>
	<li>Wyjmij DAPI za pomocą szklanej pipety Pasteura.</li>
	<li>Dodaj krople 1x TBST (5x roztwór sporządzony z 30 g Tris, 43,8 g NaCl, 5 ml polisorbatu 20 i 1,0 g NaN3 [pH 7,5] i doprowadź do 1 l wodą klasy PCR) do jaj za pomocą szklanej pipety Pasteura. Odczekaj 5 minut przed wyjęciem 1x TBST za pomocą szklanej pipety Pasteura. Powtórz ten krok 2 razy.</li>
</ol>
6. Montaż
<ol>
	<li>Po ostatnim umyciu ostrożnie odpipetować wszystkie jaja z filmu parafinowego na czystą część szkiełka mikroskopowego. Usuń nadmiar 1x TBST; następnie dodaj 20 μl podłoża montażowego (80% glicerolu i 20% 1x TBST z 2% galusanu n-propylu) i umieść czyste szkiełko przykrywające na wierzchu jaj</li>.
	<li>W celu długotrwałego przechowywania należy uszczelnić szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci, a następnie przechowywać szkiełko w ciemności w temperaturze 2 °C lub natychmiast obejrzeć je pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>

<ol><li>Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCharnov%2C+EL+%22The+Theory+of+Sex+Allocation%22">The Theory of Sex Allocation</a>. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).</li>
<li>Godfray, H. C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGodfray%2C+HCJ+%22Parasitoids%3A+behavioral+and+evolutionary+ecology%22">Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).</li>
<li>Bourke, A. F. G., Franks, N. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBourke%2C+AFG+%22Social+Evolution+in+Ants%22">Social Evolution in Ants</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).</li>
<li>Pascal, S., Callejas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interspecific+competition+between+biotypes+B+and+Q+of+Bemisia+tabaci+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29+from+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Entomological+Research%22%5BJournal%5D)">Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain.</a> Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).</li>
<li>Liu, S. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+mating+interactions+drive+widespread+invasion+and+displacement+in+a+whitefly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly.</a> Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).</li>
<li>Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+discrimination+in+invasive+whitefly+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Behavior%22%5BJournal%5D)">Mate discrimination in invasive whitefly species.</a> Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).</li>
<li>Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+mating+behaviour+drives+asymmetric+reproductive+interference+in+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies.</a> Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).</li>
<li>Tsueda, H., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+differences+between+Q+and+B+whiteflies%2C+Bemisia+tabaci%2C+on+three+host+plants+and+negative+interactions+in+mixed+cohorts%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).</li>
<li>Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mating+behavioural+interactions+and+life+history+traits+in+the+competition+between+alien+and+indigenous+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Entomological+Research%22%5BJournal%5D)">Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies.</a> Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).</li>
<li>Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reproductive+interference+on+the+competitive+displacement+between+two+invasive+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Entomological+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies.</a> Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).</li>
<li>Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+concepts+as+applied+to+the+whitefly+Bemisia+tabaci+systematics%3A+how+many+species+are+there%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there?</a> Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).</li>
<li>Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php">http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php</a> (2018).</li>
<li>Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+insect+supervectors+Bemisia+tabaci+and+Frankliniella+occidentalis+in+the+emergence+and+global+spread+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses.</a> Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).</li>
<li>Giorgini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+symbionts+cause+parthenogenetic+reproduction+in+the+parasitoid+wasp+Pingala+soemius+%28Hymenoptera%3A+Eulophidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae).</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).</li>
<li>Himler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+a+bacterial+symbiont+in+an+invasive+whitefly+is+driven+by+fitness+benefits+and+female+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias.</a> Science. 332 (6026), 254-256 (2011).</li>
<li>Cass, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+endosymbiont+Rickettsia+in+an+insect+pest%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest.</a> Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).</li>
<li>Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+mechanism+and+genetic+consequences+of+thelytoky+in+the+wasp+Trichogramma+cacoeciae%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae.</a> Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).</li>
<li>Cass, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+fitness+benefits+of+the+Rickettsia+bacterial+symbiont+in+an+insect+pest%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest.</a> Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).</li>
<li>Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+nuclear+genotype+influences+phenotype+of+a+conditional+mutualist+symbiont%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont.</a> Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).</li>
<li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+intracellular+ecosystem%3A+symbiotic+bacteria+share+bacteriocytes+in+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies.</a> FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).</li>
<li>Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+inheritance+of+a+single+somatic+animal+cell+displayed+by+the+bacteriocyte+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci.</a> Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).</li>
<li>Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+generation+effects+of+high+temperature+on+the+development+and+fecundity+of+Bemisia+tabaci+%28Gennadius%29+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29+biotype+B%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B.</a> Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).</li>
<li>Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heat+shock+on+survival+and+reproduction+of+two+whitefly+species%2C+Trialeurodes+vaporariorum+and+Bemisia+tabaci+biotype+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B.</a> Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).</li>
<li>Boykin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bemisia+tabaci+nomenclature%3A+Lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned.</a> Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).</li>
<li>Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+insight+into+reproductive+incompatibility+between+putative+cryptic+species+of+the+Bemisia+tabaci+whitefly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex.</a> Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten jest pierwszym, który rejestruje wskaźnik zapłodnienia lub pierwotny stosunek płci B. tabaci. Wyzwanie związane z tym protokołem polega na tym, że wymaga on od naukowców nauczenia się, jak szybko obchodzić się z jajami mączlika, upewniając się, że nie minęło więcej niż 1 godzina od złożenia jaj do momentu ich utrwalenia. Podczas wstępnych eksperymentów jaja, które zostały utrwalone po 3 godzinach lub więcej po złożeniu jaj, były zbyt stare, aby zaobserwować zapłodnienie, ponieważ nastąpiła syngamia ...

Badanie alokacji płci, czyli względnego inwestowania w potomstwo płci męskiej i żeńskiej, jest kamieniem węgielnym ekologii behawioralnej1,2,3. Oprócz możliwości testowania adaptacyjnych modeli zachowań, znajomość strategii alokacji płci organizmu może poprawić modele dynamiki jego populacji. U wielu gatunków przypisanie płci jest kontrolowane przez matki. Aby określić przydział płci, ważne jest określenie pierwotnego stosunku płci lub proporcji samic w momencie składania jaj. Chociaż stosunek płci w momencie pojawienia się dorosłego osobnika może dostarczyć wskazówek co do alokacji płci, zróżnicowana śmiertelność rozwojowa między młodymi samcami i samicami może często znacznie zniekształcić stosunek płci dorosłej. U niektórych gatunków błonkoskrzydłych, rzędu owadów obejmującego mrówki, pszczoły i osy, pierwszorzędowy stosunek płci został określony za pomocą testów cytogenetycznych, barwiących zarodki w celu wyświetlenia genetycznego DNA. Ponieważ błonkoskrzydłe są haplodiploidalne, początkowe jajo męskie jest haploidalne i zawiera tylko żeńskie przedjądrze (n), podczas gdy początkowe jaja żeńskie są diploidalne i zawierają zarówno męskie, jak i żeńskie przedjądrza (2n). Chociaż Aleyrodidae, żywiąca się sokami rodzina prawdziwych owadów (Hemiptera) znanych jako mączliki, jest również haplodiploidalna, nie ma ustalonego testu, aby znaleźć pierwotny stosunek płci u tych owadów. Jest to być może zaskakujące, biorąc pod uwagę intensywność badań nad kilkoma kosmopolitycznymi poważnymi szkodnikami z tej rodziny oraz znaczenie proporcji płci w konkurencyjnych interakcjach mączlików4,5,6,7,8,9,10 i ogólnie w dynamice populacji. Również u owadów haploidalnych proporcje płci nie są ograniczone przez systemy determinacji płci, co pozwala na selektywne zapłodnienie i labilne proporcje płci, które różnią się w zależności od środowiska2. W tym miejscu przedstawiamy technikę określania pierwotnego stosunku płci kompleksu gatunków mączlików znanego zbiorczo jako mączlik ziemniaczany, B. tabaci. Ta jedna nazwa gatunku obejmuje ponad 28 gatunków na całym świecie11i obejmuje niektóre z najbardziej szkodliwych globalnych szkodników inwazyjnych12,13. Zastosowanie tej techniki do określenia wzorców alokacji płci u B. tabaci i innych Aleyrodidae pozwoli na bardziej rygorystyczne badanie zmiennych, w tym temperatury, rośliny żywicielskiej, bakterii endosymbiotycznych lub patogenów roślin/mączlików, które mogą wpływać na pierwotne proporcje płci mączlika i dynamikę populacji mączlików.
Nie znamy żadnych porównywalnych technik barwienia jaj dla B. tabaci. Protokół jest wygodny w porównaniu z metodami barwienia stosowanymi do innych jaj owadów14, ponieważ pomija etap utrwalania przez noc, a zatem może być zakończony w ciągu 3 godzin. Jednym z przykładów zastosowania jest endosymbiotyczna bakteria Rickettsia sp. nr. bellii, jest związany z uprzedzeniami żeńskimi w naszych liniach laboratoryjnych B. tabaci Middle East-Asia Minor 1 (MEAM1)15,16. W jednej linii laboratoryjnej B. tabaci MEAM1 ("MAC1", pobranej z Centrum Rolniczego Maricopa) sprawdzamy, czy samice zakażone riketsją (R+) zapładniają więcej jaj niż samice niezakażone (R-).

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x TBST</td><td>Dowolna</td><td></td><td>5x roztwór wykonany z 30 g Tris, 43,8 g NaCl, 5 ml Tween-20 i 1,0 g NaN3 pH 7,5 i doprowadzony do 1 l wodą klasy PCR</td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>Clorox</td><td></td><td>Każdy domowy wybielacz będzie działał, o ile można go rozcieńczyć do 0,83% Podchloryn sodu</td></tr><tr><td>Bezbarwny lakier do paznokci</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI dilactate</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc300415</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Dowolny</td><td></td><td>Rozcieńczony do 70% EtOH</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon Nikon</td><td></td><td>Eclipse 50i został użyty w tym eksperymencie, ale można użyć dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem wzbudzenia 340/380 nm i co najmniej 4-10-krotnym powiększeniem</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Mallinckrodt</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Dowolny</td> mikroskop Wild Do tego eksperymentu użyto mikroskopu <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Wild M5A, ale można użyć dowolnego mikroskopu, w którym operator wyraźnie widzi jaja mączlika.</td>Osłony szkiełek mikroskopowych Dowolne metody dotyczą pokryw szkiełek o wymiarach 18 mm x 18 mm.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> W przypadku większych pokryw przesuwnych konieczne będzie dodanie większej liczby nośników montażowych.</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szpilki Minuten Nadel</td><td>BioQuip</td><td>1208SA</td><td>Szpilki Minuten nadel są opcjonalne do modelowania jako sondy z końcówkami do pipet</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-galusan propylu</td><td>Sigma/Santa Cruz Biotechnology</td><td>P3130/sc-250794</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pipety Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Fisherbrand Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego 5,75 cala. Palnik Bunsena może być również potrzebny, jeśli operator chciałby wydłużyć i zwęzić pipety Woda</td></tr><tr><td>klasy PCR</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>końcówki do pipet</td><td>Dowolne</td><td></td><td>końcówki do pipet są opcjonalne do modelowania jako sondy z drobnymi szpilkami Nadel Mała</td></tr><tr><td>żarówka z zakraplaczem</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Musi pasować do pipety Pasteura</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

określanie szybkości zapłodnienia jaj bemisia tabaci za pomocą techniki cytogenetycznej

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Kilka gatunków mączlików wysysających soki to jedne z najbardziej szkodliwych szkodników lądowych na świecie ze względu na szkody w uprawach, które wyrządzają i wirusy roślinne, które przenoszą. Pomimo licznych badań nad biologią tych gatunków w różnych środowiskach, kluczowy parametr historii życia, stosunek płci potomstwa, nie cieszy się dużym zainteresowaniem, a jest ważny dla przewidywania dynamiki populacji. Pierwotny stosunek płci (stosunek płci przy składaniu jaj) Bemisia tabaci nigdy nie został opisany, ale można go znaleźć, określając szybkość zapłodnienia jaj tego haploidalnego owada. Technika ta obejmuje dechorionację jaj za pomocą wybielacza, szereg etapów utrwalania i zastosowanie ogólnego barwienia fluorescencyjnego DNA, DAPI (4′,6-diamidino-2-fenyloindol, barwnik fluorescencyjny wiążący DNA), w celu związania się z żeńskimi i męskimi przedjądrzami. W tym miejscu przedstawiamy technikę i przykład jej zastosowania do sprawdzenia, czy endosymbiotyczna bakteria Rickettsia sp. nr. bellii, wpłynęły na pierwszorzędowy stosunek płci B. tabaci. Metoda ta może pomóc w badaniach populacyjnych mączlików lub w ustaleniu, czy istnieje przypisanie płci do pewnych bodźców środowiskowych.

Aby sprawdzić, czy Rickettsia wpływa na wskaźnik zapłodnienia samic B. tabaci MEAM1, hodowano B. tabaci zainfekowane Rickettsia (R+) lub niezinfekowane (R-) na roślinach vigna unguiculata (Vigna unguiculata) w oddzielnych klatkach w temperaturze 27 °C, przy 70% wilgotności względnej i fotoperiodzie 16 h światła/8 h ciemności. Nimfy czwartego stadium R+ i R- ostroskórek zostały ostrożnie zdjęte z liści...

Prezentujemy prostą technikę cytogenetyczną z użyciem 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) do określenia wskaźnika zapłodnienia i pierwotnego stosunku płci haplodifidowego szkodnika inwazyjnego Bemisia tabaci.

Określanie szybkości zapłodnienia jaj Bemisia tabaci za pomocą techniki cytogenetycznej

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

Protokół, który opracowała Liz, pozwala nam określić tempo nawożenia mączlików. Zastosowanie tej techniki poprawi nasze zrozumienie zachowania i ekologii mączlików. Mączliki są haplodiploidalne, więc szybkość zapłodnienia jest równa stosunkowi płci przy składaniu jaj.O ile nam wiadomo, ten protokół jest pierwszym opisanym dla mączlików i można go ukończyć w ciągu trzech godzin. Na początek wykonaj zakrywający otwór w pokrywie szalki Petriego, aby włożyć i usunąć dorosłe mączliki. Skonfiguruj komorę wilgotnościową i uformuj sondę, wkładając cienki szpilkę pod wygodnym kątem roboczym do stopionej końcówki pipety, aby uzyskać cienką sondę.Opcjonalnie wydłużone szklane końcówki pipet z podgrzewaniem dla łatwiejszego obchodzenia się z jajami mączlika. Następnie pozwól samicom mączlika złożyć jaja na czystym liściu, pokrojonym tak, aby pasował do agatora na szalce Petriego. Podczas składania jaj mączlika wyczyść szkiełko mikroskopowe wodą z mydłem.Dobrze go wysusz i rozciągnij kawałek filmu parafinowego na jednym końcu, aby płyny tworzyły krople, a jajka były lepiej widoczne. Aby usunąć warstwę jajową z komórek jajowych, użyj szklanej pipety Pasteura, aby dodać krople 83% roztworu wybielacza podchlorynu sodu do filmu parafinowego tuż przed usunięciem dorosłych i pobraniem komórek jajowych. Zarówno wybielacz, jak i lodowaty kwas octowy są.Należy obchodzić się z nimi w rękawiczkach w kapturze lub dobrze wentylowanym miejscu. DAPI jest również drażniący i należy obchodzić się z nim w rękawiczkach. Następnie usuń dorosłe mączliki z liścia i umieść liść pod mikroskopem.Ostrożnie podnieś każde jajko z podstawy, aż szypułka zostanie usunięta z liścia. Ćwicz na wielu jajach przed wykonaniem tego protokołu. Powoli podnieś jaja z podstawy i całkowicie unieś je z liścia, gdy zobaczysz, że szypułka jaja została usunięta z liścia.Przenieś dwa do trzech jajek na każdą kroplę wybielacza i pozostaw je na 10 minut. Aby naprawić jajka, użyj szklanej pipety, aby wyrzucić wybielacz. Następnie dodaj krople lodowatego kwasu octowego i odczekaj trzy minuty.Następnie usuń lodowaty kwas octowy i dodaj krople roztworu Clarke'a. Następnie odczekaj 10 minut, aż większość roztworu wyparuje. Dodaj krople 70% etanolu i odczekaj ponownie 10 minut.Aby zabarwić jajka, najpierw usuń resztki etanolu. Następnie dodaj krople 1xPBS do jaj, aby uzyskać pH zbliżone do siedmiu. Umieść szkiełko mikroskopowe w komorze wilgotnościowej, aby zapobiec wysuszeniu.Po 30 minutach wyjmij 1xPBS i dodaj krople 1 mikrograma na mililitr DAPI. Umieść szkiełko mikroskopowe w ciemnej komorze wilgotnościowej i odczekaj co najmniej 15 minut. Aby umyć jajka, najpierw usuń roztwór DAPI.Następnie dodaj krople 1xTBST do jajek. Po pięciu minutach wyjmij 1xTBST. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania.Po ostatnim umyciu ostrożnie odpipetować wszystkie jaja z parafilmu na czystą część szkiełka mikroskopowego. Usuń nadmiar TBST i dodaj 20 mikrolitrów podłoża montażowego. Na koniec umieść czyste szkiełko nakrywkowe na jajach, uszczelnij szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci w celu długotrwałego przechowywania i przystąp do obrazowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.Dechorionacja jaj, po której następuje barwienie jądrowe DAPI, pozwoliła na przypisanie zapłodnienia i płci zarodka, gdy obserwowano ją za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Żeńskie przedjądrze znajduje się w pobliżu środka zarówno zapłodnionej żeńskiej komórki jajowej, jak i niezapłodnionej męskiej komórki jajowej, a plemnik jest widoczny jako jasna smuga w pobliżu wierzchołka żeńskiej komórki jajowej. Jednym z zastosowań tej techniki jest ustalenie, czy endosymbionty bakteryjne wpływają na pierwotne proporcje płci mączlików.Na przykład, pierwotne proporcje płci jaj składanych przez mączliki B.tabici zakażone i niezakażone nie wykazały znaczącej różnicy między stosunkiem płci w obu zabiegach. Jeśli chodzi o jaja hodowane do dorosłości, podobne wyniki zaobserwowano dla dorosłych zakażonych riketsją i niezakażonych, nie dostarczając dowodów, przynajmniej w tym badaniu, na większe wskaźniki zapłodnienia przez samice zakażone riketsją. Korzystając z tego protokołu, można określić, czy plemniki międzygatunkowe mogą zapłodnić komórki jajowe.Jeśli nie obserwuje się zapłodnienia, można cofnąć się i sprawdzić, czy plemniki są przenoszone podczas krycia, patrząc w spermatekę samicy. Jeśli dojdzie do zapłodnienia, można porównać stosunek płci dorosłych do wskaźnika zapłodnienia, aby określić żywotność rozwoju potomstwa hybrydowego.

determining-egg-fertilization-rate-bemisia-tabaci-using-cytogenetic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Różnicowa zdolność konkurencyjna plemników wśród samców Drosophila o różnych genotypach może być stwierdzona poprzez eksperymenty z podwójnym kryciem. Każdy z tych eksperymentów obejmuje jednego z interesujących samców i samca referencyjnego. Łatwe do zidentyfikowania markery w potomstwie pozwalają na wnioskowanie o frakcji osobników spłodzonych przez każdego samca.

Ocena różnic w zdolności konkurencyjnej plemników u Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół izolacji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci poprzez preparację i filtrację. Po amplifikacji próbki DNA nadają się do późniejszego sekwencjonowania i badania mutualizmu między endosymbiontami a mączlikiem.

Metody ekstrakcji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci

Tablice życia pozwalają na ilościowe określenie źródeł i wskaźników śmiertelności w populacjach owadów oraz przyczyniają się do zrozumienia, przewidywania i manipulowania dynamiką populacji w agroekosystemach. Przedstawiono metody prowadzenia i analizy kohortowych tablic trwania życia w terenie dla owadów z siedzącymi niedojrzałymi stadiami życia.

Metodyka opracowywania tablic życia owadów siedzących w terenie z wykorzystaniem mączlika (Bemisia tabaci) w układzie bawełnianym jako systemu modelowego

Ten artykuł przedstawia protokół szybkiego testu identyfikacyjnego dla Bemisia tabaci opartego na technologii amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). Protokół wymaga minimalnego przeszkolenia laboratoryjnego i dlatego może być wdrażany na miejscu w punktach wejścia dla importu roślin, takich jak porty morskie i lotnicze.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do szybkiej identyfikacji Bemisia tabaci

W tym protokole, metody przeprowadzania krzyżówek wsobnych i oceny sukcesu tych krzyżówek, są opisane dla mrówki Vollenhovia emeryi. Protokoły te są ważne dla eksperymentów mających na celu zrozumienie genetycznych podstaw systemów determinacji płci u błonkoskrzydłych.

Indukcja i ocena krzyżówek wsobnych z wykorzystaniem mrówki, Vollenhovia emeryi

Opisana to oszczędzająca czas i miejsce metoda liczenia jaj i określania szybkości wylęgu poszczególnych komarów za pomocą 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych, co może znacznie zwiększyć skalę i szybkość testów płodności i płodności.

Ulepszony test płodności i płodności dla Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki EAgaL)

Tutaj prezentujemy protokół badania konkurencyjności godowej samców Aedes aegypti przy użyciu barwnika fluorescencyjnego jako markera. Samice komarów są narażone na kontakt zarówno z oznaczonymi, jak i nieoznaczonymi samcami w celu kopulacji. Po kryciu ich plemniki są badane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia ich partnera godowego.

Wykorzystanie barwnika fluorescencyjnego, rodaminy B, do badania konkurencyjności godowej samców komarów Aedes aegypti

Obecny protokół opisuje metodę hodowli owadów szkodników w laboratoriach. Procedury rozróżniania płci owadów i ekstrakcji kwasów nukleinowych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości są ustalane przy użyciu dwóch szkodników tortricid.

Masowy chów i badania molekularne owadów szkodników Tortricidae

Tutaj prezentujemy ogólną metodę określania żywotności embrionalnej i całkowitej liczby wyprodukowanych zarodków (czerwiu) za pomocą organizmu modelowego C. elegans.

Pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans

Obecny protokół opisuje, jak mierzyć dane dotyczące typowych parametrów życia komarów Aedes aegypti, w tym płodności, rozmiaru skrzydeł, płodności, stosunku płci, żywotności, czasu rozwoju, wkładu samców i długowieczności dorosłych. Pomiary te można wykorzystać do oceny przydatności komarów transgenicznych.

Ilościowe określanie kosztów przystosowania u transgenicznych komarów Aedes aegypti

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Poznaj technikę cytogenetyczną z zastosowaniem barwienia DAPI do określania szybkości zapłodnienia u Bemisia tabaci. Ta metoda pozwala badać dynamikę populacji i zachowania białek.

Określanie szybkości zapłodnienia jaj Bemisia tabaci za pomocą techniki cytogenetycznej

Przeglądaj więcej filmów