Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Wykorzystanie wirusów rekombinowanych to potężna technologia, pozwalająca zarówno na rozszyfrowanie mechanizmów replikacji wirusowej, jak i na tworzenie platform do opracowywania szczepionek. Podobnie, wytworzenie wysokiej jakości zapasów wirusa jest kluczowe dla każdego badania wirusologicznego, od najbardziej fundamentalnych badań podstawowych po badania aplikacyjne. Odzyskiwanie wirusów rekombinowanych, optymalne pozyskiwanie, mrożenie i miareczkowanie zapasów RSV są krytycznymi metodami we wszystkich badaniach wirusologicznych. Mogą być one uznane za tradycyjne, lecz pozostają delikatne i wymagają specjalistycznej wiedzy.

Dzień przed transfekcją zawiesić komórki BSR-T7/5 w pożywce kompletnej w stężeniu 0,5 miliona komórek na mililitr. Rozdzielić po dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdego dołka w płytce sześciodołkowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 aż do osiągnięcia 80-90% konfluencji następnego dnia. Aby odzyskać każdy wirus, najpierw zmieszać rozmrożone wektory genetyki odwrotnej w probówce, a następnie przeprowadzić transfekcję zgodnie z protokołem producenta odczynnika do transfekcji. Następnie dodać 250 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy do zmieszanych wektorów.

W innej probówce rozcieńcz 10 µL odczynnika do transfekcji w 250 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy. Delikatnie wymieszaj obie probówki w wstrząsarze wirowym i odczekaj pięć minut. Połącz zawartość obu probówek i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

W międzyczasie opłucz komórki BSR-T7/5 za pomocą 1 ml pożywki z obniżoną zawartością surowicy i rozprowadź po 1,5 ml minimum essential media wolnego od antybiotyków, uzupełnionego o 10% fetal calf serum, do każdego dołka. W razie potrzeby inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide. Po 20-minutowej inkubacji dodaj 500 µl mieszaniny do transfekcji do każdego dołka. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide przez trzy dni. Aby monitorować wydajność resku, obserwuj fluorescencję GFP pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 20X raz dziennie.

Trzeciego dnia po transfekcji wykonaj testy zadrapania (scratch assay) komórek w każdej studzience w sześcio studzienkowej płytce z transfekowanymi komórkami BSR-T7/5.

Przenieś komórki i nadsącz z każdej studni do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności dwóch mililitrów. Aby uwolnić odzyskany wirus z błon komórkowych, intensywnie wymieszaj każdą probówkę w wortexie przez co najmniej 30 sekund. W celu przeprowadzenia pierwszej amplifikacji odzyskanych wirusów, najpierw usuń pożywkę hodowlaną z płytki z komórkami HEp-2 wysianymi dzień wcześniej. Następnie szybko dodaj 500 µL świeżej zawiesiny wirusowej z przejścia zero na każdą studnię. Umieść płytkę HEp-2 w temperaturze 37 °C na homogenizatorze typu seesaw w celu delikatnego mieszania przez dwie godziny.

Aby uzyskać pierwszy pasaż uratowanych wirusów, należy odpiąć 500 µL inokulum i dodać dwa mililitry MEM z 2% FCS. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez trzy dni. Aby monitorować infekcję pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 20X, należy raz dziennie obserwować fluorescencję GFP w komórkach HEp-2 zainfekowanych zawiesiną z pasażu zero. Pod mikroskopem w świetle przechodzącym należy obserwować pojawienie się małych syncytiów oraz odrywanie się komórek, co odzwierciedla efekt cytopatyczny RSV.

Aby namnożyć odzyskane wirusy, najpierw rozcieńczyć zawiesinę wirusową w pożywce MEM bez FCS, aby uzyskać 3 ml zawiesiny o mianie 50 000 PFU/ml, a następnie usunąć pożywkę z kolby z komórkami HEp-2. Szybko dodać 3 ml zawiesiny wirusowej i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C na homogenizatorze typu seesaw w celu łagodnego mieszania przez 2 godziny. Następnie usunąć i odrzucić inokulum oraz dodać 15 ml pożywki MEM z 2% FCS. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 2 do 4 dni.

Aby oszacować odpowiedni czas zbioru wirusów, należy sprawdzić morfologię komórek i fluorescencję GFP pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 20X. Należy zauważyć, że zwykle dzieje się to w momencie, gdy od 50% do 80% warstwy komórek HEp-2 oddziela się wskutek cytopatycznego działania RSV, co następuje między 48 a 72 godzinami po infekcji.

Następnie zeskrob wszystkie komórki za pomocą skrobaka do komórek. Zbierz komórki wraz z nadsączem i przenieś je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodaj 1/10 objętości 10X roztworu do konserwacji RSV. Intensywnie wymieszaj probówki na wortexie przez pięć sekund, a następnie wiruj przez pięć minut przy 200 ×g, aby sklarować zawiesinę.

Przenieś nadsącz do probówki o pojemności 50 ml. Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex, a następnie rozdziel zawiesinę do probówek kriogenicznych oznaczonych etykietami odpornymi na alkohol. Zanurz probówki w schłodzonym alkoholu o temperaturze -80 °C na co najmniej jedną godzinę, a następnie przechowuj je w temperaturze -80 °C.

Aby przeprowadzić test miareczkowania plak, najpierw przygotuj 2X minimalne podłoże niezbędne (MEM), rozcieńczając komercyjne 10X MEM w wodzie sterylnej i dodając L-glutaminę, 1 000 jednostek na mililitr penicyliny oraz jeden miligram na mililitr streptomycyny. Energicznie wstrząśnij roztworem i przechowuj go w temperaturze 4 °C, a następnie dodaj 900 µL MEM bez FCS do sześciu probówek. Rozmroź alikwoty wirusa i intensywnie mieszaj je w wirówce vortex przez pięć sekund.

Aby przygotować rozcieńczenia seryjne, należy najpierw dodać 100 µL wirusa do 900 µL medium w pierwszej probówce. Zakręcić probówkę i wymieszać jej zawartość, wirując w wstrząsaczu (vortex) przez kilka sekund. Następnie dodać 100 µL z pierwszego rozcieńczenia do 900 µL medium w drugiej probówce. Zakręcić probówkę i zawirować. Powtarzać tę procedurę aż do szóstej probówki. Zapisać nazwę wirusa oraz pełne stopnie rozcieńczeń na 12-dołkowych płytkach z komórkami HEp-2. Oznaczyć płytkę i jej pokrywę w sposób umożliwiający ich dopasowanie, ponieważ mogą one zostać rozdzielone podczas barwienia.

Usunąć pożywkę z płytek i rozprowadzić po 400 µL jednego rozcieńczenia na dołek. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez dwie godziny w celu adsorpcji wirusa. W czasie adsorpcji wirusa przygotować nakładkę z celulozy mikrokrystalicznej, dostosowując najpierw pH 2X MEM do wartości około 7,2 za pomocą sterylnego 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu, kierując się wskaźnikiem barwnym.

Aby otrzymać 100 ml warstwy nakładkowej, należy dodać 10 ml 2X MEM, 10 ml 2,4% zawiesiny monokrystalicznej celulozy oraz 80 ml MEM uzupełnionego o 2% FCS, a następnie wymieszać energicznie. Po zakończeniu dwugodzinnej inkubacji, do każdego dołka płytek 12-dołkowych należy dodać od dwóch do trzech ml warstwy nakładkowej, nie usuwając wcześniej inokulum. Płytkę inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez sześć dni.

Aby zabarwić komórki roztworem fioletu krystalicznego, najpierw delikatnie wstrząśnij płytkami, aby usunąć warstwę nadlewkową z celulozy mikrokrystalicznej. Usuń nadsącz i przemyj komórki dwukrotnie 1X PBS, a następnie dodaj od 1 do 2 ml roztworu fioletu krystalicznego i odczekaj 10–15 minut. Usuń roztwór, który można wykorzystać ponownie do zabarwiania kolejnych płytek. Na koniec oblicz miano wirusa jako ułamek liczby widocznych placków w dołkach suchych płytek, objętości inokulum oraz rozcieńczenia.

Przeprowadzenie testu plackowego na kontroli negatywnej, w której dokonano transfekcji jedynie plazmidami ekspresyjnymi N, P, L oraz M2-1, nie wykazało obecności placków przy najniższym rozcieńczeniu. Oczekiwano, że miana uzyskane z transfektowanych komórek przekroczą 100 PFU na mililitr, jeżeli proces ratowania wirusa był wydajny. Miana wzrastały w kolejnych pasażach, osiągając od jednego miliona do 10 milionów PFU na mililitr w pasażu pierwszym lub drugim. Dzięki tym fluorescencyjnym wirusom można łatwo zaobserwować i zmierzyć inhibicję ekspresji RSV przez siRNA celowane w białko N oraz komórkowe białko IMPDH. W przeciwieństwie do tego, silny sygnał GFP zaobserwowano i zmierzono w komórkach kontrolnych transfektowanych niecelującym siRNA oraz w komórkach transfektowanych siRNA przeciwko komórkowemu białku GAPDH.

Podobnie wirusy te umożliwiły łatwą obserwację hamowania namnażania się RSV przez związek leku przeciwwirusowego. Śledzenie fluorescencyjnego białka M2-1 w zainfekowanych komórkach HEp-2 wykazało, że ciałka inkluzyjne (IBs) i związane z nimi granulki są strukturami bardzo dynamicznymi. Obserwowano, że IBs są ruchomymi i sferycznymi strukturami zdolnymi do fuzji i tworzenia większych inkluzji sferycznych.

Granule związane z ciałkami inkluzyjnymi (IB) przechodziły ciągłe cykle montażu i demontażu, w wyniku których tworzyły się małe granule związane z IB, które następnie rosły, łączyły się w duże granule związane z IB, a ostatecznie znikały. Protokół miareczkowania płytek RSV z wykorzystaniem nakładki z celulozy mikrokrystalicznej można łatwo dostosować do innych komórek i/lub innych wirusów. Będzie to wymagało dostosowania stężenia celulozy mikrokrystalicznej.