Name: Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania i amplifikacji rekombinowanych wirusów RSV oraz zoptymalizowaną płytkową miareczkowanie do ich ilościowego oznaczania. Technika ta umożliwia analizę replikacji wirusa i obserwację ciał wtrętowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Qin Yu z AstraZeneca R&D Boston, MA, USA, za dostarczenie AZD4316 leku. Autorzy są wdzięczni platformie Cymages za dostęp do mikroskopu ScanR Olympus, który został wsparty grantami z regionu Ile-de-France (DIM ONE HEALTH). Autorzy dziękują za wsparcie ze strony INSERM i Uniwersytetu Saint-Quentin w Wersalu.

<ol><li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015%3A+a+systematic+review+and+modelling+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li>
<li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Elderly+and+High-Risk+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).</li>
<li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Oral+ALS-008176+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).</li>
<li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+GS-5806+Activity+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).</li>
<li>Afonso, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales%3A+update+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016.</a> Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).</li>
<li>Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+elongation+factor+of+respiratory+syncytial+virus%2C+a+nonsegmented+negative-strand+RNA+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).</li>
<li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).</li>
<li>Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+expression+redirects+vesicular+stomatitis+virus+RNA+synthesis+to+cytoplasmic+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions.</a> PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958(2010).</li>
<li>Lahaye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+of+Negri+Bodies+%28NBs%29+in+Rabies+Virus-Infected+Cells%3A+Evidence+that+NBs+Are+Sites+of+Viral+Transcription+and+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication.</a> Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).</li>
<li>Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+organization+of+recombinant+Marburg+virus+nucleoprotein%3A+comparison+with+Marburg+virus+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions.</a> Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).</li>
<li>Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marburg+virus+inclusions%3A+A+virus-induced+microcompartment+and+interface+to+multivesicular+bodies+and+the+late+endosomal+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment.</a> European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).</li>
<li>Rincheval, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+cytoplasmic+inclusion+bodies+in+cells+infected+by+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus.</a> Nature Communications. 8 (1), 563(2017).</li>
<li>Santangelo, P. J., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+filamentous+viral+RNPs+prior+to+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).</li>
<li>Lifland, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Nucleoprotein+and+Inclusion+Bodies+Antagonize+the+Innate+Immune+Response+Mediated+by+MDA5+and+MAVS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).</li>
<li>Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+inclusions+of+respiratory+syncytial+virus-infected+cells%3A+formation+of+inclusion+bodies+in+transfected+cells+that+coexpress+the+nucleoprotein%2C+the+phosphoprotein%2C+and+the+22K+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein.</a> Virology. 195 (1), 243-247 (1993).</li>
<li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+association+between+heat+shock+protein+70+and+the+respiratory+syncytial+virus+polymerase+complex+within+lipid-raft+membranes+during+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection.</a> Virology. 338 (1), 69-80 (2005).</li>
<li>Radhakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+analysis+of+purified+respiratory+syncytial+virus+particles+reveals+an+important+role+for+heat+shock+protein+90+in+virus+particle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).</li>
<li>Racaniello, V. R., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloned+poliovirus+complementary+DNA+is+infectious+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells.</a> Science. 214 (4523), 916-919 (1981).</li>
<li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).</li>
<li>Collins, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+infectious+human+respiratory+syncytial+virus+from+cloned+cDNA+confirms+an+essential+role+for+the+transcription+elongation+factor+from+the+5%27+proximal+open+reading+frame+of+the+M2+mRNA+in+gene+expression+and+provides+a+capability+for+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).</li>
<li>Rameix-Welti, M. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+replication+of+respiratory+syncytial+virus+in+cells+and+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice.</a> Nature Communications. 5, 5104(2014).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).</li>
<li>Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+activity+and+molecular+mechanism+of+an+orally+active+respiratory+syncytial+virus+fusion+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).</li>
<li>Derscheid, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+respiratory+syncytial+virus+memphis+37+grown+in+HEp-2+cells+causes+more+severe+disease+in+lambs+than+virus+grown+in+vero+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells.</a> Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).</li>
<li>McKimm-Breschkin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+plaque+assay+for+respiratory+syncytial+virus+-+direct+visualization+of+plaques+without+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining.</a> Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 7, 1-7 (2006).</li>
<li>Novina, C. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNAi+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The RNAi revolution.</a> Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).</li>
<li>Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+inosine+5%27-monophosphate+dehydrogenase+and+the+design+of+novel+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors.</a> Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).</li>
<li>Beaucourt, S., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribavirin%3A+A+drug+active+against+many+viruses+with+multiple+effects+on+virus+replication+and+propagation.+Molecular+basis+of+ribavirin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance.</a> Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).</li>
<li>Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Ribavirin+on+Respiratory+Syncytial+Virus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).</li>
<li>Simões, E. A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past%2C+Present+and+Future+Approaches+to+the+Prevention+and+Treatment+of+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Children%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Diseases+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children.</a> Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).</li>
<li>Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-mediated+silencing+of+the+respiratory+syncytial+virus+nucleocapsid+defines+a+potent+antiviral+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).</li>
<li>DeVincenzo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-comtrolled+study+of+an+RNAi-based+therapy+directed+against+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+CRISPR%2FCas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li>
<li>Nikolic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negri+bodies+are+viral+factories+with+properties+of+liquid+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles.</a> Nature Communications. 8 (1), 58(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule przedstawiono metodę ratowania rekombinowanych wirusów RSV z pięciu plazmidów oraz ich amplifikacji. Możliwość manipulowania genomem wirusów zrewolucjonizowała badania wirusologiczne w celu testowania mutacji i ekspresji dodatkowego genu lub oznakowanego białka wirusowego. RSV, który opisaliśmy i użyliśmy jako przykładu w tym artykule, to wirus wykazujący ekspresję genu reporterowego, RSV-GFP (niepublikowany) i wyrażający białko M2-1 połączone ze znacznikiem GFP12. Ratownictwo z wir...

Ludzki wirus RSV jest główną przyczyną hospitalizacji z powodu ostrej infekcji dróg oddechowych u niemowląt na całym świecie1. Ponadto RSV wiąże się ze znacznym obciążeniem chorobowym u dorosłych porównywalnym z grypą, przy czym większość obciążenia hospitalizacją i śmiertelnością występuje u osób starszych2. Nie ma jeszcze dostępnych szczepionek ani specyficznych leków przeciwwirusowych przeciwko RSV, ale trwają prace nad obiecującymi nowymi lekami3,4. Złożoność i ciężar technik ilościowego oznaczania namnażania RSV utrudniają poszukiwanie leków przeciwwirusowych lub szczepionek, pomimo obecnych znacznych wysiłków. Kwantyfikacja namnażania RSV in vitro opiera się na ogół na pracochłonnych, czasochłonnych i kosztownych metodach, które polegają głównie na analizie efektu cytopatycznego za pomocą mikroskopii, barwienia immunologicznego, testów redukcji płytki nazębnej, ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy odwrotnej transkryptazy (qRT) i testów immunoenzymatycznych immunosorbentów. Wirusy ze zmodyfikowanymi genomami i ekspresją genów reporterowych, takie jak te kodujące GFP, są bardziej odpowiednie do takich badań przesiewowych. W połączeniu z wykorzystaniem automatycznych czytników płytek, rekombinowane wirusy reporterowe przenoszące geny mogą sprawić, że testy te będą bardziej odpowiednie do celów standaryzacji i wysokiej przepustowości.
RSV to otoczkowany, niesegmentowany wirus RNA o ujemnym sensie, który należy do rodzaju Orthopneumovirus z rodziny Pneumoviridae, rząd Mononegavirales5. Genom RSV jest jednoniciowym RNA o ujemnym znaczeniu o wielkości około 15 kb, który zawiera niekodujący region na końcach 3' i 5' zwany Leader i Trailer oraz 10 jednostek transkrypcyjnych kodujących 11 białek. Geny są uporządkowane w następujący sposób: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (kodujące białka M2-1 i M2-2) i L-5'. Genomowe RNA jest ciasno upakowane przez nukleoproteinę N. Wykorzystując enkapsynowany genomowy RNA jako matrycę, wirusowa polimeraza RNA zależna od RNA (RdRp) zapewni transkrypcję i replikację wirusowego RNA. Wirusowy RdRp składa się z dużego białka L, które samo w sobie przenosi aktywność polimerazy nukleotydowej, jego obowiązkowego kofaktora, fosfoproteiny P i białka M2-1, które działa jako wirusowy czynnik transkrypcyjny6. W zakażonych komórkach RSV indukuje tworzenie inkluzji cytoplazmatycznych zwanych ciałami inkluzyjnymi (IB). Morfologicznie podobne inkluzje cytoplazmatyczne zaobserwowano dla kilku Mononegavirales7,8,9,10. Ostatnie badania nad wirusem wścieklizny, wirusem pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV), wirusem Ebola i RSV wykazały, że synteza wirusowego RNA zachodzi w IB, które można zatem uznać za fabryki wirusów8,9,11,12. Fabryki wirusów koncentrują RNA i białka wirusowe niezbędne do syntezy wirusowego RNA, a także zawierają białka komórkowe13,14,15,16,17. IB wykazują funkcjonalny podkompartment zwany granulkami związanymi z IB (IBAG), który koncentruje nowo zsyntetyzowane powstające wirusowe mRNA wraz z białkiem M2-1. Genomowe RNA oraz L, P i N nie są wykrywane w IBAG. IBAG to małe dynamiczne kuliste struktury wewnątrz IB, które wykazują właściwości płynnych organelli12. Pomimo centralnej roli IB w namnażaniu się wirusa, bardzo niewiele wiadomo o naturze, strukturze wewnętrznej, powstawaniu i działaniu tych fabryk wirusów.
Ekspresja genomu wirusa polio z cDNA umożliwiła produkcję pierwszego zakaźnego klonu wirusa w 1981 roku18. W przypadku jednoniciowych ujemnych wirusów RNA dopiero w 1994 r. doszło do produkcji pierwszego wirusa wścieklizny po transfekcji plazmidów do komórek19. Pierwszy oparty na plazmidzie odwrócony system genetyczny dla RSV został opublikowany w 1995 roku20. Genetyka odwrócona doprowadziła do znacznych postępów w dziedzinie wirusologii. Możliwość wprowadzenia określonych modyfikacji do genomu wirusa dostarczyła krytycznych informacji na temat replikacji i patogenezy wirusów RNA. Technologia ta znacznie ułatwiła również opracowanie szczepionek, umożliwiając określone tłumienie poprzez ukierunkowane serie modyfikacji. Modyfikacje genomu, które umożliwiły szybkie ilościowe określenie namnażania się wirusów, znacznie poprawiły badania przesiewowe leków przeciwwirusowych i badanie ich sposobu działania.
Chociaż wcześniej opisano, uzyskanie genetycznie zmodyfikowanych RSV pozostaje delikatną sprawą. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół tworzenia dwóch typów rekombinowanych HRSV, odpowiednio wyrażających RSV-GFP lub RSV-M2-1-GFP. W tym protokole opisujemy warunki transfekcji potrzebne do uratowania nowych rekombinowanych wirusów, a także ich amplifikację w celu uzyskania szczepów wirusowych o wysokim mianie, odpowiednich do powtarzalnych eksperymentów. Konstrukcja wektorów genetyki odwrotnej per se nie jest tutaj opisana. Opisujemy metody optymalnego zbierania i zamrażania zapasów wirusów. Najdokładniejszą metodą ilościowego oznaczania zakaźnych cząstek wirusa pozostaje test płytki nazębnej. Komórki są zakażane seryjnymi rozcieńczeniami analizowanej zawiesiny i inkubowane z nakładką, która uniemożliwia dyfuzję wolnych cząstek wirusa w supernatancie. W takich warunkach wirus infekuje tylko sąsiadujące ze sobą komórki, tworząc "płytkę" dla każdej początkowej cząsteczki zakaźnej. W konwencjonalnym teście miareczkowania RSV blaszki są ujawniane przez barwienie immunologiczne i zliczane pod obserwacją mikroskopową. Ta metoda jest kosztowna i czasochłonna. Tutaj opisaliśmy bardzo prosty protokół testu blaszek RSV z wykorzystaniem nakładki z celulozy mikrokrystalicznej, która umożliwia tworzenie blaszek widocznych gołym okiem. Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać RSV-GFP do pomiaru replikacji RSV, a tym samym do ilościowego określenia wpływu leków przeciwwirusowych. Łącząc genetykę odwrotną i technologię obrazowania na żywo, pokazujemy, w jaki sposób RSV-M2-1-GFP pozwala naukowcom wizualizować M2-1 w żywych komórkach i śledzić dynamikę wewnątrzkomórkowych struktur wirusowych, takich jak IB.

<table><tbody><tr><td>35 mm i mikro czasza do obrazowania żywych komórek</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591</td><td>FMC BioPolymer</td><td>Avicel RC-591</td><td>Informacje techniczne i inne informacje na temat Avicels są dostępne na stronie http://www.fmcbiopolymer.com. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Protokół w kroku 4 jest zoptymalizowany dla tego odczynnika.</td></tr><tr><td>BSRT7/5</td><td></td><td>niedostępny w handlu</td><td>Patrz odniesienie 22. Buchholz i wsp. 1999</td></tr><tr><td>Roztwór fioletu krystalicznego</td><td>Sigma</td><td>HT90132</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny do obserwacji</td><td>Mikroskop Olympus</td><td>IX73 Mikroskop</td><td></td></tr><tr><td>fluorescencyjny do wideomikroskopii</td><td>Olympus</td><td>ScanR Mikroskop</td><td></td>Olympus</tr><tr><td>HEp-2</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-23</td><td></td></tr><tr><td>FILTRY &ge; 99,5%</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIPOFECTAMINE 2000 ODCZYNNIK</td><td>Protokół 11668019 ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>w kroku 2.3. jest zoptymalizowany dla tego odczynnika.</td></tr><tr><td>MEM (10x), bez glutaminy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11430030</td><td></td></tr><tr><td>MEM, Suplement GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41090-028</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 ReagentPlus, &ge; 99,5%</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowane podłoże w surowicy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>Wodny roztwór paraformaldehydu, 32%,</td><td>Mikroskopia elektronowa klasy EM Sciences</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Plazmidy</td><td></td> ThermoFisher Scientific 15140122 <td></td></tr><tr><td>niedostępne</td><td></td> w handlu <td></td><td>Patrz odniesienie 21. Rameix-Welti i in., 2014</td></tr><tr><td>Zobacz Saw Rocker</td>, <td>VWR</td><td>444-0341</td><td></td></tr>, <tr><td>Si RNA, GAPDH</td>, <td>Dharmacon</td>, <td>ON-TARGETplus, siRNA D-001810-10-05</td><td>SMARTpool i 3 z 4 pojedynczych siRNA zaprojektowanych przez Dharmacon.</td></tr><tr><td>Si RNA IMPDH2</td><td>Dharmacon</td><td>ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005</td><td>SMARTpool 4 indywidualnych siRNA zaprojektowany przez Dharmacon. Indywidualne referencje i sekwencje J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;</td></tr><tr><td>Si RNA RSV N</td><td>Dharmacon</td><td>ON-TARGETplus niestandardowe siRNA</td><td>UUCAGAAGAACUGGCUAU i UUUCAUAAUAUUCACUGGGUUA</td></tr><tr><td>SiRNA NT</td><td>Dharmacon</td><td>ON-TARGETplus Odczynnik</td> do transfekcji SiRNA z puli <td></td>niedocelowej</tr><tr><td></td><td>Dharmacon</td><td>DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03</td><td>Protokół w krokach 5.1 i 5.1.2 są zoptymalizowane dla tego odczynnika.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu 7,5% roztwór</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorometr</td><td>Tecan</td><td>Tecan nieskończony M200PRO</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Użycie rekombinowanych wirusów stało się kluczowe w podstawowej lub stosowanej wirusologii. Udowodniono, że genetyka odwrotna jest niezwykle potężną technologią, zarówno do rozszyfrowywania mechanizmów replikacji wirusa, jak i do badania leków przeciwwirusowych lub zapewnienia platformy rozwojowej dla szczepionek. Budowa i manipulacja odwróconym systemem genetycznym dla wirusa o ujemnej nici RNA, takiego jak syncytialny wirus oddechowy (RSV), pozostaje jednak delikatna i wymaga specjalnego know-how. Genom RSV to jednoniciowy RNA o ujemnym znaczeniu o wielkości około 15 kb, który służy jako matryca zarówno do replikacji, jak i transkrypcji wirusowego RNA. Nasz system genetyki odwrotnej wykorzystuje kopię cDNA ludzkiego genomu długiego szczepu RSV (HRSV). Ten cDNA, jak również cDNA kodujące białka wirusowe kompleksu polimerazy (L, P, N i M2-1), są umieszczane w poszczególnych wektorach ekspresyjnych w sekwencjach kontrolnych polimerazy T7. Transfekcja tych pierwiastków w komórkach BSR-T7/5, które stabilnie eksprymują polimerazę T7, umożliwia cytoplazmatyczną replikację i transkrypcję rekombinowanego RSV, dając początek genetycznie modyfikowanym wirionom. Nowy wirus RSV, który jest obecny na powierzchni komórki i w supernatancie hodowli BSRT7/5, jest gromadzony w celu zakażenia ludzkich komórek HEp-2 w celu amplifikacji wirusa. Potrzebne są dwie lub trzy rundy amplifikacji, aby uzyskać zapasy wirusa zawierające 1 x 106 do 1 x 107 jednostek tworzących płytki (PFU) / ml. Szczegółowo opisano tutaj metody optymalnego zbierania, zamrażania i miareczkowania stad wirusowych. Przedstawiony tutaj protokół ilustrujemy tworząc dwa rekombinowane wirusy wykazujące odpowiednią ekspresję wolnego białka zielonej fluorescencji (GFP) (RSV-GFP) lub wirusa M2-1 połączonego z GFP (RSV-M2-1-GFP). Pokazujemy, jak wykorzystać RSV-GFP do ilościowego określenia replikacji RSV i RSV-M2-1-GFP do wizualizacji struktur wirusowych, a także dynamiki białek wirusowych w żywych komórkach, przy użyciu technik mikroskopii wideo.

W niniejszej pracy opisano szczegółowy protokół otrzymywania rekombinowanych wirusów RSV wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego (Rycina 2). W pRSV-GFP gen GFP wprowadzono pomiędzy geny P i M, zgodnie z opisem dla genu Cherry w wcześniej opublikowanej pracy21. W pRSV-M2-1-GFP gen M2 pozostawiono bez zmian, a dodatkowy gen kodujący M2-1-GFP wstawiono pomiędzy geny SH i G12. Pierwszy etap, odpowiadający ra...

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Wykorzystanie wirusów rekombinowanych to potężna technologia, pozwalająca zarówno na rozszyfrowanie mechanizmów replikacji wirusowej, jak i na tworzenie platform do opracowywania szczepionek. Podobnie, wytworzenie wysokiej jakości zapasów wirusa jest kluczowe dla każdego badania wirusologicznego, od najbardziej fundamentalnych badań podstawowych po badania aplikacyjne. Odzyskiwanie wirusów rekombinowanych, optymalne pozyskiwanie, mrożenie i miareczkowanie zapasów RSV są krytycznymi metodami we wszystkich badaniach wirusologicznych. Mogą być one uznane za tradycyjne, lecz pozostają delikatne i wymagają specjalistycznej wiedzy.Dzień przed transfekcją zawiesić komórki BSR-T7/5 w pożywce kompletnej w stężeniu 0,5 miliona komórek na mililitr. Rozdzielić po dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdego dołka w płytce sześciodołkowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 aż do osiągnięcia 80-90% konfluencji następnego dnia. Aby odzyskać każdy wirus, najpierw zmieszać rozmrożone wektory genetyki odwrotnej w probówce, a następnie przeprowadzić transfekcję zgodnie z protokołem producenta odczynnika do transfekcji. Następnie dodać 250 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy do zmieszanych wektorów.W innej probówce rozcieńcz 10 µL odczynnika do transfekcji w 250 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy. Delikatnie wymieszaj obie probówki w wstrząsarze wirowym i odczekaj pięć minut. Połącz zawartość obu probówek i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.W międzyczasie opłucz komórki BSR-T7/5 za pomocą 1 ml pożywki z obniżoną zawartością surowicy i rozprowadź po 1,5 ml minimum essential media wolnego od antybiotyków, uzupełnionego o 10% fetal calf serum, do każdego dołka. W razie potrzeby inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide. Po 20-minutowej inkubacji dodaj 500 µl mieszaniny do transfekcji do każdego dołka. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide przez trzy dni. Aby monitorować wydajność resku, obserwuj fluorescencję GFP pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 20X raz dziennie.Trzeciego dnia po transfekcji wykonaj testy zadrapania (scratch assay) komórek w każdej studzience w sześcio studzienkowej płytce z transfekowanymi komórkami BSR-T7/5.Przenieś komórki i nadsącz z każdej studni do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności dwóch mililitrów. Aby uwolnić odzyskany wirus z błon komórkowych, intensywnie wymieszaj każdą probówkę w wortexie przez co najmniej 30 sekund. W celu przeprowadzenia pierwszej amplifikacji odzyskanych wirusów, najpierw usuń pożywkę hodowlaną z płytki z komórkami HEp-2 wysianymi dzień wcześniej. Następnie szybko dodaj 500 µL świeżej zawiesiny wirusowej z przejścia zero na każdą studnię. Umieść płytkę HEp-2 w temperaturze 37 °C na homogenizatorze typu seesaw w celu delikatnego mieszania przez dwie godziny.Aby uzyskać pierwszy pasaż uratowanych wirusów, należy odpiąć 500 µL inokulum i dodać dwa mililitry MEM z 2% FCS. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez trzy dni. Aby monitorować infekcję pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 20X, należy raz dziennie obserwować fluorescencję GFP w komórkach HEp-2 zainfekowanych zawiesiną z pasażu zero. Pod mikroskopem w świetle przechodzącym należy obserwować pojawienie się małych syncytiów oraz odrywanie się komórek, co odzwierciedla efekt cytopatyczny RSV.Aby namnożyć odzyskane wirusy, najpierw rozcieńczyć zawiesinę wirusową w pożywce MEM bez FCS, aby uzyskać 3 ml zawiesiny o mianie 50 000 PFU/ml, a następnie usunąć pożywkę z kolby z komórkami HEp-2. Szybko dodać 3 ml zawiesiny wirusowej i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C na homogenizatorze typu seesaw w celu łagodnego mieszania przez 2 godziny. Następnie usunąć i odrzucić inokulum oraz dodać 15 ml pożywki MEM z 2% FCS. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 2 do 4 dni.Aby oszacować odpowiedni czas zbioru wirusów, należy sprawdzić morfologię komórek i fluorescencję GFP pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 20X. Należy zauważyć, że zwykle dzieje się to w momencie, gdy od 50% do 80% warstwy komórek HEp-2 oddziela się wskutek cytopatycznego działania RSV, co następuje między 48 a 72 godzinami po infekcji.Następnie zeskrob wszystkie komórki za pomocą skrobaka do komórek. Zbierz komórki wraz z nadsączem i przenieś je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodaj 1/10 objętości 10X roztworu do konserwacji RSV. Intensywnie wymieszaj probówki na wortexie przez pięć sekund, a następnie wiruj przez pięć minut przy 200 ×g, aby sklarować zawiesinę.Przenieś nadsącz do probówki o pojemności 50 ml. Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex, a następnie rozdziel zawiesinę do probówek kriogenicznych oznaczonych etykietami odpornymi na alkohol. Zanurz probówki w schłodzonym alkoholu o temperaturze -80 °C na co najmniej jedną godzinę, a następnie przechowuj je w temperaturze -80 °C.Aby przeprowadzić test miareczkowania plak, najpierw przygotuj 2X minimalne podłoże niezbędne (MEM), rozcieńczając komercyjne 10X MEM w wodzie sterylnej i dodając L-glutaminę, 1 000 jednostek na mililitr penicyliny oraz jeden miligram na mililitr streptomycyny. Energicznie wstrząśnij roztworem i przechowuj go w temperaturze 4 °C, a następnie dodaj 900 µL MEM bez FCS do sześciu probówek. Rozmroź alikwoty wirusa i intensywnie mieszaj je w wirówce vortex przez pięć sekund.Aby przygotować rozcieńczenia seryjne, należy najpierw dodać 100 µL wirusa do 900 µL medium w pierwszej probówce. Zakręcić probówkę i wymieszać jej zawartość, wirując w wstrząsaczu (vortex) przez kilka sekund. Następnie dodać 100 µL z pierwszego rozcieńczenia do 900 µL medium w drugiej probówce. Zakręcić probówkę i zawirować. Powtarzać tę procedurę aż do szóstej probówki. Zapisać nazwę wirusa oraz pełne stopnie rozcieńczeń na 12-dołkowych płytkach z komórkami HEp-2. Oznaczyć płytkę i jej pokrywę w sposób umożliwiający ich dopasowanie, ponieważ mogą one zostać rozdzielone podczas barwienia.Usunąć pożywkę z płytek i rozprowadzić po 400 µL jednego rozcieńczenia na dołek. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez dwie godziny w celu adsorpcji wirusa. W czasie adsorpcji wirusa przygotować nakładkę z celulozy mikrokrystalicznej, dostosowując najpierw pH 2X MEM do wartości około 7,2 za pomocą sterylnego 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu, kierując się wskaźnikiem barwnym.Aby otrzymać 100 ml warstwy nakładkowej, należy dodać 10 ml 2X MEM, 10 ml 2,4% zawiesiny monokrystalicznej celulozy oraz 80 ml MEM uzupełnionego o 2% FCS, a następnie wymieszać energicznie. Po zakończeniu dwugodzinnej inkubacji, do każdego dołka płytek 12-dołkowych należy dodać od dwóch do trzech ml warstwy nakładkowej, nie usuwając wcześniej inokulum. Płytkę inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez sześć dni.Aby zabarwić komórki roztworem fioletu krystalicznego, najpierw delikatnie wstrząśnij płytkami, aby usunąć warstwę nadlewkową z celulozy mikrokrystalicznej. Usuń nadsącz i przemyj komórki dwukrotnie 1X PBS, a następnie dodaj od 1 do 2 ml roztworu fioletu krystalicznego i odczekaj 10–15 minut. Usuń roztwór, który można wykorzystać ponownie do zabarwiania kolejnych płytek. Na koniec oblicz miano wirusa jako ułamek liczby widocznych placków w dołkach suchych płytek, objętości inokulum oraz rozcieńczenia.Przeprowadzenie testu plackowego na kontroli negatywnej, w której dokonano transfekcji jedynie plazmidami ekspresyjnymi N, P, L oraz M2-1, nie wykazało obecności placków przy najniższym rozcieńczeniu. Oczekiwano, że miana uzyskane z transfektowanych komórek przekroczą 100 PFU na mililitr, jeżeli proces ratowania wirusa był wydajny. Miana wzrastały w kolejnych pasażach, osiągając od jednego miliona do 10 milionów PFU na mililitr w pasażu pierwszym lub drugim. Dzięki tym fluorescencyjnym wirusom można łatwo zaobserwować i zmierzyć inhibicję ekspresji RSV przez siRNA celowane w białko N oraz komórkowe białko IMPDH. W przeciwieństwie do tego, silny sygnał GFP zaobserwowano i zmierzono w komórkach kontrolnych transfektowanych niecelującym siRNA oraz w komórkach transfektowanych siRNA przeciwko komórkowemu białku GAPDH.Podobnie wirusy te umożliwiły łatwą obserwację hamowania namnażania się RSV przez związek leku przeciwwirusowego. Śledzenie fluorescencyjnego białka M2-1 w zainfekowanych komórkach HEp-2 wykazało, że ciałka inkluzyjne (IBs) i związane z nimi granulki są strukturami bardzo dynamicznymi. Obserwowano, że IBs są ruchomymi i sferycznymi strukturami zdolnymi do fuzji i tworzenia większych inkluzji sferycznych.Granule związane z ciałkami inkluzyjnymi (IB) przechodziły ciągłe cykle montażu i demontażu, w wyniku których tworzyły się małe granule związane z IB, które następnie rosły, łączyły się w duże granule związane z IB, a ostatecznie znikały. Protokół miareczkowania płytek RSV z wykorzystaniem nakładki z celulozy mikrokrystalicznej można łatwo dostosować do innych komórek i/lub innych wirusów. Będzie to wymagało dostosowania stężenia celulozy mikrokrystalicznej.

generation-amplification-titration-recombinant-respiratory-syncytial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Generowanie, wzmacnianie i miareczkowanie rekombinantowych wirusów syncytialnych dróg oddechowych

Ten film przedstawia test do pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV). Wstępna inkubacja z surowicą zawierającą przeciwciała neutralizujące RSV neutralizuje cząsteczki wirusa, zmniejszając infekcję komórkową i tworzenie się blaszek miażdżycowych. Komórki zakażone wirusem są następnie poddawane utrwalaniu, blokowaniu i znakowaniu przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem w celu wizualizacji płytki nazębnej. Proces ten umożliwia identyfikację...

Test do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących specyficznego dla syncytialnego wirusa oddechowego

Ludzki syncytialny wirus oddechowy (HRSV) może powodować ciężkie zapalenie oskrzelików u małych niemowląt. Część patogenezy ciężkiej choroby HRSV jest spowodowana odpowiedzią immunologiczną gospodarza. Stymulacja pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych za pomocą HRSV zapewnia szybki i powtarzalny system modelowy do badania aktywacji szlaków zapalnych i infekcji.

Model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego

To badanie opisuje wysokoprzepustowy, oparty na obrazowaniu test mikroneutralizacji w celu określenia miana przeciwciał neutralizujących specyficznych dla syncytialnego wirusa oddechowego (RSV). Ten format testu został przetestowany na różnych typach próbek.

Ulepszony i wysokoprzepustowy test mikroneutralizacji syncytialnego wirusa oddechowego (RSV)

Tutaj prezentujemy metody poprawy badań nad wtórnym bakteryjnym zapaleniem płuc poprzez zapewnienie nieinwazyjnej drogi wkraplania do dolnych dróg oddechowych, po której następuje odzyskiwanie patogenów i analiza transkryptów. Zabiegi te są powtarzalne i mogą być wykonywane bez specjalistycznego sprzętu, takiego jak kaniule, druty doprowadzające czy światłowodowe.

Precyzyjny system dostarczania i odzyskiwania patogenów dla mysich modeli wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc

Dla dogłębnej analizy mechanistycznej syntezy RNA syncytialnego wirusa oddechowego (RSV), przedstawiamy protokół wykorzystania fosfoproteiny opiekuńczej (P) do koekspresji nukleoproteiny wolnej od RNA (N0) do późniejszego składania in vitro specyficznych dla wirusa nukleokapsydów (NC).

Wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

Opisano wydajny system analizy struktury i funkcji genu w kulturze ex vivo limfocytów B śledziony. Metoda ta wykorzystuje produkcję rekombinowanych retrowirusów w wolnej od komórek pomocniczych (helper-free), ekotropowej linii komórkowej pakującej. Osiągnięto stabilną, dziedziczną ekspresję badanego genu w pierwotnych limfocytach, co prowadzi do generowania przeciwciał powierzchniowych na komórkach B przechodzących rekombinację zmiany klasy.

Produkcja rekombinowanych retrowirusów i infekcja limfocytów B

Cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek (PMCA) jest testem in vitro służącym do badania konwersji prionów oraz barier szczepowych i gatunkowych. Może być również wykorzystywana jako test detekcji prionów.

Cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek prionów

Wnioski zawarte w tym raporcie są ustaleniami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy Centrów Kontroli i Prewencji Chorób.

Ustanowienie pokrytej cieczą hodowli spolaryzowanych ludzkich komórek nabłonka nabłonka dróg oddechowych Calu-3 w celu zbadania odpowiedzi komórek gospodarza na patogeny układu oddechowego in vitro

Ratowanie rekombinowanych arenawirusów ze sklonowanych cDNA, podejście określane jako genetyka odwrotna, pozwala badaczom badać rolę określonych produktów genowych wirusa, a także wkład ich różnych specyficznych domen i reszt, w wielu różnych aspektach biologii arenawirusa. Podobnie, techniki genetyki odwrotnej w zatwierdzonych przez FDA liniach komórkowych (Vero) do opracowywania szczepionek zapewniają nowe możliwości generowania skutecznych i bezpiecznych szczepionek do zwalczania ludzkich...

Generowanie rekombinowanego arenawirusa do opracowania szczepionki w komórkach Vero zatwierdzonych przez FDA

Poznaj metodę wytwarzania i amplifikacji rekombinowanych wirusów RSV oraz zoptymalizowaną płytkową miareczkowanie do ich ilościowego oznaczania. Technika ta umożliwia analizę replikacji wirusa i obserwację ciał wtrętowych w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Przeglądaj więcej filmów